JP2002516064A - ヒトシグナル伝達セリン／スレオニンキナーゼ - Google Patents

ヒトシグナル伝達セリン／スレオニンキナーゼ

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Abstract

(57)【要約】 ヒト免疫系の組織中に特に高レベルで発現されるヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドが記載されている。シグナル伝達セリン／スレオニンキナーゼポリペプチドをコード化する完全長さのｃＤＮＡおよび本来の生物学的分子の内部構造領域およびアミノ酸残基配列が記載されている。ヒトＳｔｅ２０−類似セリン／スレオニン伝達キナーゼの生物学的活性を変調する化合物を同定する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明は、新規のヒトシグナル伝達セリンスレオニンタンパク質キナーゼに関
係する核酸およびアミノ酸配列、およびこれらの配列を本来の生体分子のシグナ
ル伝達活性を変調する化合物を同定するために使用することに関する。本発明は
、シグナル伝達に関連している病理生態学的障害の診断、研究、予防および治療
にも関する。
【０００２】 発明の背景 ストレスに対する細胞応答メカニズムは、ヒト免疫系にとって根本的に重要で
ある。ストレス応答は、進化の早期時点で発達した注意深く工夫された細胞防御
メカニズムを意味し；ストレス応答に関わりあっている生体分子は、動物界に渡
って顕著な類似性を示す事実により証明されている。Welch, W. J., et al., Th
e Stress Response and the Immune System, Inflammation; Basic Principles
and Clinical Correlates, Raven Press, Gallin,J. I. et al., Eds., Second
Edition, 41: 841 (1992) 。
【０００３】 リンパ球活性化、帰巣性、ターゲット細胞溶解に対する抵抗、腫瘍抗原性、癌
原遺伝子転移の調節および免疫監査は、ストレス活性化されたシグナル伝達分子
により介在または変調されて現れる免疫学的機能の例である。Siegelman, M., e
t al., Science, 231:823(1986); Kusher, D. I., et al., J. Immunol., 145:2
925(1990); Ullrich, S., J., et al., PNAS,83:3121(1986); Colotta,F., et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun., 168:1013(1990); Haire, R. N., et al.
, J. Cell Biol. 106:883(1988);Born, W., et al., Immunol. T., 11:40(1990)
。例えばリュウマチ性関節炎を有する患者の末梢血液中の前活性化され、かつ、
ＭＨＣクラスＩＩ−制限された自己反応性Ｔ−リンパ球の数は、健康な個体中の
レベルに比べて著しく増加する。同様に、炎症性関節炎を有する患者からの末梢
血液Ｔ−リンパ球は、外因性の抗原およびマイトジェンの不存在下に著しく増殖
する。Welch, W. J., et al., The Stress Response and the Immune System, I
nflammation; Basic Principles and Clinical Correlates, Raven Press, Gall
in,J. I. et al., Eds., Second Edition, Chapter 41, 841 (1992) 。更に、滑
膜炎は、酸素誘導遊離ラジカルを生成し、これは組織損傷を永続させる作用をす
ることが明らかにされている。Blake,D. R., et al., Hypoxic-Reperfusion Inj
ury in the Inflamed Human Joint, Lancet, 2:2889(1989) 。
【０００４】 造血作用のコントロールは人体中での生理学的刺激の数に応答する高度に調節
されるプロセスである。血液細胞の分化、増殖、成長停止またはアポト−シスは
、適当なサイトカインおよびそのレセプター並びに相応する細胞シグナル伝達カ
スケードの存在に依存する。Hu,Mickey C. T., et al., Genes & Development,
10:2251(1996) 。例えば成熟白血球の生成は、種々の環境および生理学的刺激に
応答する高度に調節されたプロセスである。サイトカインは、細胞増殖、分化ま
たは排除を起こさせ、これらプロセスのそれぞれは、適当なサイトカインレセプ
ターおよび相応するシグナル伝達要素の存在に依存する。更に、静止−Ｂ−およ
びＴ−リンパ球の刺激は、サイトカインレセプターに対して顕著な相同性を示す
抗原レセプターを介して起こる。Grunicke, Hans H., Signal Transduction Mec
hanisms in Cancer, Springer-Verlag (1995) 。Suchard,S.J., et al., Mitoge
n-Activated Protein Kinase Activation During IgG-Dependent Phagocytosis
in Human Neutrophils, J. Immnol., 158:4961(1997) も参照 。
【０００５】 それぞれキナーゼの中央カスケードを含有する明確にシグナリングするカセッ
トは、正または負の種々の細胞外刺激に応答し、哺乳動物細胞中の転写因子活性
および翻訳後タンパク質装飾での変化をもたらす。Kiefer,F., et al., EMBO,Vo
l. 5,24:7013(1996)。マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）カ
スケードとして公知であるようなプロテインキナーゼカスケードは、種々の刺激
に対するリンパ球の応答における早期現象として活性化される。この経路の刺激
は、成長因子−誘導ＤＮＡ合成、分化、分泌およびメタボリズムの間に観察され
ている。ＭＡＰＫ経路は、レセプター発生シグナルの膜から細胞質および核への
伝達で重要な役割を有する。Graves,J.D.,et al., Protein Serine/Threonine K
inase of the MAPK Cascades,Annals New York Academy of Sciences, 766:320(
1995) 。ＭＡＰＫカスケードの持続された活性化が必要であるだけでなく、これ
がいくつかの細胞の増殖および他の分化を引き起こすのに充分であることが確立
されている。Cohen, P.,Dissection of Protein Kinase Cascade That Mediate
Cellular Response to Cytokines and Cellular Stress, Advances in Pharmaco
logy, Academic Press,Hidaka, H., et al., Eds., Vol. 36,15(1996); Marshal
l,C.J., Cell,80:179(1995) 。いくつかの相互に依存する生化学的経路は、抗原
レセプターを介しての残留Ｔ−リンパ球の刺激またはインターロイキン−２（Ｉ
Ｌ−２）レセプターを介しての活性化Ｔ−リンパ球の刺激により活性化される。
これらのレセプターのどちらかの嵌入の後に生じるいくつかの現象は、質的に類
似であり、例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活
性化および特殊な成長関連遺伝子の発現をもたらす転写因子の先在である。Symm
etry of the Activation of Cyclin-dependent Kinase in Mitogen and Growth
Factor-stimmulated T Lymphocytes,Jaime F. Modiano, et al., Annals New Yo
rk Academy of Sciences,766:134(1995) 。
【０００６】 最近の証拠は、ストレスに対する細胞応答が、先ず血漿膜のところで起こる現
象を介してコントロールされ、マイトジェン応答を起こさせるこれらの重要性と
著しく重なりあっていることを示している。生物学的、化学的または物理的スト
レス手段に細胞を露呈すると、転写因子および他の遺伝子生成物（これも迅速か
つ高度にマイトジェン刺激に対する応答で誘導される）を包含する広範な群の遺
伝子の活性化をもたらす一連の現象を喚起する。マイトジェン活性化プロテイン
キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路は、多くの系中でのマイトジェン応答のために重要で
あることが明らかにされている。Qin,Y.et al.,J. Cancer Res. Clin. Oncol.,1
20:519(1994)参照。更に、大抵の癌原遺伝子は、成長因子、成長因子レセプター
または細胞内ポストレセプターシグナル伝達機構の要素をコード化する事実に基
づき、成長因子シグナル伝達経路が、他の形質転換関連経路からの正および負の
交差調節インプットの精巧なネットワークに従属されることが明らかになってき
ている。Grunicke, Hans H.,Signal Transduction Mechanismus in Cancer, Spr
inger-Verlag (1995)。MAPKカスケードの分類体系的構成は、内在的なプロテイ
ンキナーゼメンバーを特にこのような「クロストーク」に関する特に良好なター
ゲットとする。Protein Serine/Threonine Kinase of the MAPK Cascade,J. D.
Graves, et al., Annals New York Academy of Sciences,766:320(1995) 。
【０００７】 炎症の開始誘因には、物理的および化学的手段、細菌およびウイルス感染およ
び抗原、超抗原またはアレルゲンへの露呈が包含され、これらの全ては反応性酸
素（ＲＯＳ）を発生し、この際、第二のメッセンジャーシグナル伝達分子を活性
化する能力を有する。Storz, G., et al., Transcriptional Regulators of Ox
idative Stress-Inducible Genes in Prokaryotes and Eukaryote, in: Stress-
Inducible Cellular Responses, Feige,U., et al., Eds., Birkhauser Verlag
(1996) 。反応性酸素ラジカル（これによりＤＮＡをも包含する多くの細胞成分
を損傷する）は、細胞死をもたらすことがあり得るか、またはより重大でない場
合でも、成長相チェックポイントで細胞サイクルを阻止する。ストレス損傷は、
チェックポイントコントロールを活性化するのみならず、ストレス活性化プロテ
インキナーゼ（ＳＡＰＫs）、ｃ−Ｒａｆ−１およびＥＲＫｓ（これらは細胞質
顆粒シグナル伝達（ＭＡＰＫ）カスケードの内在性成分である）を包含するプロ
テインキナーゼをも活性化させる。Pombo,C. M., et al., EMBO ,Vol. 15, 17:
4537(1996) ;Russo, T. et al., J. Biol. Chem. ,270:29386(1995) 。特にスト
レスは、オキシダント障害、アテローム性動脈硬化症、神経発生プロセスおよび
老化にも関係しているので、哺乳動物ストレス誘導経路の成分の解明は、治療性
を発展させることのできる、より詳細なターゲットを提供するはずである。N. J
. Holbrook, et al., Stress Inducible Cellular Responses, 273,U. Feige, e
t al., Eds., Birkhauser Verlag(1996) 。
【０００８】 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびストレス活性化プ
ロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）シグナル伝達経路は、次の疾病により表示される
症状を包含する広範な種々の病態生理学的条件にわたる生物学的効果の誘因に関
与する：不全性の白血球、Ｔ−リンパ球、急性および慢性炎症疾患、自己免疫障
害、リウマチ性関節炎、骨関節炎、移植拒絶反応、マクロファージ調節、内皮細
胞調節、脈管形成、アテローム性動脈硬化症、線維芽細胞調節、病原性線維症、
喘息、アレルギー反応、ＡＲＤＳ、アテローム、骨関節炎、心不全、癌、糖尿病
、肥満症、悪液質、アルツハイマー症、敗血症および神経変性。ＭＡＰキナーゼ
は、ストレスに対する細胞応答を介在するシグナル現象での中心的役割を演じる
ので、その不活性化はこの応答を減衰させるための鍵である。N. J. Holbrook,
et al., Stress-Inducible Cellular Responses, 273, Feige,U., et al., Eds.
, Birkhauser Verlag (1996) 。
【０００９】 新規治療剤を開発する多くの努力にも関わらず、例えば成人呼吸切迫症候群
（ＡＲＤＳ）（肺内での反応性酸素（ＲＯＳ）の多量の発生により特徴付けられ
る急性肺炎症）では、羅病患者の約５０％の死亡率が残っている。Polla. B. S.
Stress Proteins in Inflammation , in: Stress Inducible Cellular Respons
es,Feige, U., et al., Eds., Birkhauser Verlag(1996) 。更に、慢性の炎症性
疾病、例えばリウマチ性関節炎は、滑膜に浸潤し、一連の炎症性プロセスを起こ
させる活性化Ｔ−リンパ球により介在されると信じられている。Panayi,G. S.,
et al., The Importance of the T-Cell in Initiating and Maintaining the
Chronic Ｓynovitis of Rheumatoid Arthritis, Arthritis Rheum, 35:728(1992
) 。蓄積証明は自己免疫疾患多発性硬化症（ＭＳ）が自己反応性Ｔ−リンパ球に
より介在されることをも示している。Stinissen, P., et al., Crit. Rev. Immu
nol., 17 (1): 33( 1997) 。自己反応性Ｔ−リンパ球は、ＭＳを有する患者に
おける生体内活性化およびクローン拡張を経験することが示されている。Zhang.
J., et al., J. Mol. Med. 74(11): 653 (1996) 。真性糖尿病では、自己反応
性Ｔ−リンパ球が組織的に膵臓島細胞を破壊して、それがインスリンを生産でき
なくする。過剰活性Ｔ−細胞の関係において推進されている最近の他の開発は、
Ｔ−リンパ球の特定の部分集合が、見かけ上は害のない侵入者に対する不適切な
活性で応答することにより、喘息および他のアレルギー疾患での主犯であること
を明らかにしている（開発途上の世界の首都の喘息の割合は、過去数十年間に著
しく増加している：１９８０年の米国の二倍である）。New Clues to Asthma Th
erapies:Vogel, G., science ,276:1643(1997) 。
【００１０】 最近、ストレスに対する細胞応答を介在するシグナル伝達経路の定義において
多くの進展がなされた。例えば、Pombo,C.M.,et al., は、ヒトＳｔｅ２０−類
似オキシダントストレス応答キナーゼ、ＳＯＫ−１のクローニングおよび特徴付
けを報告している。このキナーゼは、リン酸化により正に調節され、そのＣ−末
端非触媒領域により負に調節される。報告データは、ＳＯＫ−１が酸化性および
環境ストレスに応答してシグナルを伝達することを示している。ＥＭＢＯ，Vol.
15,17:4537(1996)。更に、Schinkmann,Ｋ．等は、最近、ヒトＳＴＥ−２０−類似
キナーゼｍｓｔ−３のクローニングおよび特徴付けを報告した。このｍｓｔ−３
転写産物は、至る所に発現されると報告されている。更に、ｍｓｔ−１は、自己
リン酸化により正に調節されることが報告されている。J. Biol. Chem..,272(45
):28695(1997) 。他のストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）、ＭＡＰ
Ｋファミリーのメンバーは、その場で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインター
ロイキン−１を包含する炎症性刺激により活性化されることが明らかにされた。
Kyriakis,J.M.,et al., Nature, 369:156(1994); Derijard,B.,et al., Cell, 7
6:025(1994); Sanchez, I., et al., Nature, 372:794(1994) 。更にKiefer,F.,
et al., EMBO,Vol.5,24:7013(1996); Creasy,C.L., et al., J.Biol. Chem.,27
1:No. 35,21049(1996); Creasy,C.L., et al., Gene, 167:303( 1995); Manser,
E., et al., Nature, 367:40(1994); Hu,Mickey C.Ｔ., et al., Genes & Devel
opment, 10:2251(1996); Katz, P., et al., J. Biol. Chem.,(1994); Pombo,C.
M., et al., Nature, 377:750(1995) も参照。
【００１１】 治療開発のためのターゲットとしての細胞シグナル化経路の内在性メンバーは
例えば多くの調査の課題であった。例えばLevitzki,A., Signal Transduction T
herapy: A Novel Approach to Disease Management,Eur. J.Biochem, 226:1(199
4); Powis G., The Potential for Molecular Oncology to Define New Drug Ta
rgets, in: New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy, Workman, P., K
err D.J., eds.,CRC Press,Boca Raton FL(1994) 参照。多くの実験室の努力の
結果として、キナーゼの著しい特異的阻害剤の印象的なリストが得られるように
なった。例えば Levitzki,A.,Tyrphostins:Tyrosine Kinase Blockers as Novel
Antiproliferative Agents and Dissectors of Signal Transduction,FASEB; 6
:3275(1992); Workman P., et al., Discovery and Desighn of Inhibitors of
Oncogenic Tyrosine Kinases , in: New Approaches in Cancer Pharmacology:
Drug Design and Development, Springer,Berlin 55( 1994) 参照。
【００１２】 新規群のピリミジニルイミダゾール、例えばＣＳＡＩＤＳ［ＳＫＢ］が開発さ
れ、これは単核細胞中でのサイトカインインターロイキン−１（ＩＬ−１）およ
び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の製造を阻害する。この薬剤は、特異的に単核細
胞中のタンパク質に結合することが立証され、ＣＳＢＰ（ＣＳＡＩＤ−結合タン
パク質）と称され、これは単離され、クローニングおよびシーケンシングされ、
ＭＡＰＫ同族体として表示された。Lee, J. C., et al., Differential Effects
of the Bicyclic Imidazoles on Cytokine Synthesis in Human Monocytes an
d Endothelial Cells, Agents Actions, 41:C191 (1994); A Protein Kinase In
volved in tha Regulation of Inflammatory Cytokine Biosynthesis, Nature,
372:739(1994) 。更に、ｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化の特異的阻害剤としてのラ
パマイシンの同定およびＥＧＦレセプタープロテインキナーゼを非常に有効に阻
害し、かつＭＡＰキナーゼの活性化をブロックする化合物の同定により立証され
ているように、キナーゼはプロテインキナーゼの特異的阻害剤が実際に開発でき
ることが立証された。Alessi,D., et al., A Specific Inhibitor of the Activ
ation of MAP Kinase Kinase-1 in vitro and in vivo, J. Biol. Chem., 279:2
7489(1995); Fry,D., et al., A Specific Inhibitor of the Epidermal Growth
Factor Receptor Tyrosine Kinase,Science, 265:806(1994); Cohen, P., Diss
ection of Protein Kinase Cascades That Mediate Cellular Response to Cyto
kines and Cellular Stress, Intracellular Signal Transduction, Advances i
n Pharmacology, Hidaka ,H., et al., Eds., Academic Press, 36:17(19969)。
【００１３】 特異的な細胞内経路に必要な特異的シグナル伝達分子の活性を変調することが
できる化合物は、下流の生理学的応答をコントロールまたは弱めることのできる
ための重大な能力を有することが期待されている。不幸にも、過去３０年間の多
くの新規薬剤の採用にも関わらず、より有効で、より毒性の少ない新規化合物が
必要である。従って、このような化合物を同定する能力は極めて重要である。
【００１４】 発明の概要 本発明は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３：に記載のようなシグナル伝達キナ
ーゼのポリペプチドまたはその薬物学的に活性なまたは生物学的に活性な機能性
誘導体をコード化する核酸配列を有する、単離され、精製されたポリヌクレオチ
ド分子に関する。しかしながら、本発明の単離され、精製されたポリヌクレオチ
ドには、限定的ではないが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（新規ヒトシグナル伝達キ
ナーゼｃＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ネズミ変体）およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２（新規ヒトシグナル伝達キナーゼ構造コード領域）が包含される。
【００１５】 単離され、精製された本発明のポリヌクレオチドには、限定的ではないが、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有する配列が包含される
。
【００１６】 この発明は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているようなアミノ
酸配列を有する精製されたポリペプチドに関する。
【００１７】 本発明の有利な１態様は、本発明のシグナル伝達分子の核酸コード領域の転写
／翻訳を変調するる能力を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から誘導されたアン
チセンス核酸を含有する、単離され、精製された生物学的に有効なポリヌクレオ
チド分子である。
【００１８】 本発明は、本発明のシグナル伝達生分子の生物学的活性及び／又は薬物学的活
性を変える能力を有する、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているよ
うな生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異ポリペプチドをコード化す
る核酸配列を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から誘導され、単離されかつ精製
されたポリヌクレオチド分子にも関する。
【００１９】 本発明のもう一つの有利な態様は、本発明の本来のシグナル伝達ポリペプチド
の生物学的活性および/または薬物学的活性を変調する能力を有するＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３から誘導された、単離されかつ精製された生物学的に有効なドミナ
ントネガテイブ突然変異ポリペプチドである。
【００２０】 更に、本発明は、組み換え宿主細胞中のシグナル伝達ポリペプチドの発現のた
めの発現ベクターに関し、ここで記載のベクターは、実質的にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３に記載されているような配列を有するポリペプチドまたはその薬物学的及
び／又は生物学的に活性のまたは生物学的に有効な誘導体をコード化する核酸配
列を有するポリヌクレオチドを含有する。
【００２１】 更に、本発明は、本発明のシグナル伝達分子の核酸コード領域の転写／翻訳を
変調する能力を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から誘導されるアンチセンス核酸
配列を有する生物学的に有効なポリヌクレオチド分子の発現のための発現ベクタ
ーに関する。
【００２２】 更に、本発明は、シグナル伝達ポリペプチドの発現のための発現ベクターに関
し、ここで、記載のベクターは、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のよう
な配列を有するシグナル伝達ペプチドのポリペプチドまたはその薬物学的及び／
又は生物学的活性のまたは生物学的に有効な誘導体をコード化する核酸配列を有
するポリヌクレオチドを含有する。
【００２３】 更に、本発明は、シグナル伝達分子の生物学的活性及び／又は薬物学的活性を
変調する化合物を同定する方法に関し、これは、次の工程よりなる： （ａ）シグナル伝達活性の候補化合物モジュレーターを、実質的にＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３に記載されているような配列を有するポリペプチドと一緒にし、かつ
（ｂ）実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているようなポリペプチド配
列の生物学的及び／又は薬物学的活性上への候補化合物モジュレーターの効果を
測定する。
【００２４】 更に、本発明は、シグナル伝達分子の生物学的及び／又は薬物学的活性を変調
する化合物を同定する方法に関し、これは次の工程よりなる： （ａ）シグナル伝達活性の候補化合物モジュレーターを、実質的にＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３に記載されているような配列を有するシグナル伝達ポリペプチドを発
現する宿主細胞と一緒にし、かつ （ｂ）このシグナル伝達ポリペプチド生物学的及び／又は薬物学的活性上へのこ
の候補化合物モジュレーターの効果を測定する。
【００２５】 本発明は、前記の方法の一つにより同定された化合物にも関し、ここで記載の
化合物は、シグナル伝達分子の生物学的及び／又は薬物学的活性を変調する。
【００２６】 更に、本発明は、前記方法の１つにより同定された化合物を含有する薬剤学的
組成物に関し、ここで、記載の化合物は、シグナル伝達分子の生物学的及び／又
は薬物学的活性を変調する。
【００２７】 付加的に、本発明は、前記の１方法により同定される化合物（ここで、記載の
化合物はシグナル伝達分子の生物学的及び／又は薬物学的活性を変調する）の有
効量を適用するか；または実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているよ
うな生物学的活性なドミナントネガテイブ突然変異体またはその機能性誘導体の
有効量を適用することよりなる、シグナル伝達分子により介在される病態生理学
的状態の治療を必要とする患者の治療法に関する。
【００２８】 加えて、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から誘導される生物学的に有効な
アンチセンス核酸分子の有効量を適用するか、または実質的にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：３に記載されているような生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異
体をコード化する核酸またはその機能性誘導体の有効量を適用することよりなる
、シグナル伝達分子により介在される病態学的状態を治療することが必要な患者
を治療する方法に関する。
【００２９】 この発明は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているようなアミノ
酸配列を有する精製されたポリペプチドに関して特異的な抗体並びに実質的にＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているようなアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド配列の同定のための診断組成物にも関する。
【００３０】 本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から誘導されたＰＣＲプライマー並びに実
質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されているよ
うな核酸分子を製造する方法にも関する。
【００３１】 図面の簡単な説明 図１は、ここに記載の新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化
する３２０１塩基ｃＤＮＡ核酸配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を開示してい
る。
【００３２】 図２は、ここに記載の新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化
するｃＤＮＡ核酸配列の１２５１塩基翻訳構造領域ＡＴＧ〜ＴＡＡである、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２を開示している。
【００３３】 図３は、ここに記載の新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドの４１６ア
ミノ酸残基配列であるＳＥＱＩＤ ＮＯ：３を開示している。
【００３４】 図４は、ＳＯＫ−１、最近記載されたヒトオキシダントストレス活性化キナー
ゼの４２６アミノ酸残基配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を示している。Pomb
o,C.M., et al., EMBO, vol. 15,17:4537( 1996) 。
【００３５】 図５は、ｍｓｔ−３、最近記載されたヒトシグナル伝達キナーゼの４３１アミ
ノ酸残基配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を示している。Schinkmann,K.,et a
l., J.Biol. Chem. , 272(45):28695(1997) 。
【００３６】 図６は、ここに記載の新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドのアミノ酸
残基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ＴＥＮ−１と称される）とシグナル伝達
キナーゼポリペプチドのネズミ変体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）（ｖｘ２１ｄ
０４と称される）およびＳＯＫ−１ストレス活性化キナーゼのアミノ酸残基配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）およびｍｓｔ−３シグナル伝達キナーゼのアミノ酸
残基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）との比較を示している。ダッシュは、配列
の至適化のために導入されたギャップを表している。この図中に示されている配
列は、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（DNASTAR Ｉｎｃ．Madison WI)のマルチ配
列整列プログラムを用いて製造された。
【００３７】 図７は、新規ヒトキナーゼに関係している完全長核酸配列アンプリコンを製造
するために使用されるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーであるＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を開示している。
【００３８】 図８は、センス、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６およびアンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７、オリゴヌクレオチドを用いて製造された１３５３塩基ＰＣＲアンプリ
コンであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８を開示している。
【００３９】 図９は、新規キナーゼの発現を示している２８９ｂｐアンプリコンのＰＣＲ製
造のためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を示している。
【００４０】 図１０は、ノーザンブロット分析を示しており、ここで、約３.５ｋｂの長さ
の一次転写産物は新規ヒトシグナル伝達キナーゼに関係している。顕著な転写産
物は癌細胞系からと同様に免疫組織中に支配的である。
【００４１】 図１１は、ＧＳＴ−ＴＥＮ１が自己リン酸化および基質リン酸化が可能である
（ミエリン塩基性タンパク質）ことを示しているキナーゼ検定データを開示して
いる。
【００４２】 図１２は、ここに記載のシグナル伝達キナーゼポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３）のネズミ４１６アミノ酸残基変体態様であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
１を開示している。
【００４３】 図１３は、ここに記載のシグナル伝達キナーゼポリペプチドのネズミ４１６ア
ミノ酸残基変体態様をコード化する２０２８塩基ｃＤＮＡ核酸配列であるＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２を示している。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、下方ケース
中に、オープンリーデイングフレームは、上方ケース中に示されている。開始お
よび停止コドンに下線が付されている。
【００４４】 図１４は、シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３による２９３細胞中
のＮＦκＢ、ＡＰ−１およびＳＲＦの活性化を説明している（ＴＥＮ−１はシグ
ナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す）。
【００４５】 図１５は、シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によるＨｅＬａ細胞
中のＡＰ−１およびＳＲＦの活性化を説明している（ＴＥＮ−１はシグナル伝達
キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３）を示す）。
【００４６】 図１６は、ＥＣＶ３０４細胞中の基底レベルおよびＴＮＦα−介在ＮＦκＢ活
性化へのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アンチセンス分子の発現の作用を説明している
。
【００４７】 発明の詳細な説明 他に規定のない限り、ここで使用されている全ての技術的および化学的用語は
、本発明の属する技術分野の当業者に一般的に理解されていると同じ意味を有す
る。ここに参照されている全ての刊行物および特許は参考文献として編入されて
いる。
【００４８】 本発明のシグナル伝達セリンスレオニンプロテインキナーゼに関連してここで
使用されているような生物学的活性は、限定的ではないが、基質を自己リン酸化
及び／又はリン酸化能力をも包含する細胞シグナルを伝達するための生体分子の
能力を指す。
【００４９】 本発明のシグナル伝達セリンスレオニンプロテインキナーゼに関連してここで
用いられている様な薬物学的活性は、限定的ではないが、細胞分化、増殖、原癌
性形質転換、マクロファージ調節、内皮細胞調節、線維芽細胞調節、細胞骨格調
節、突然変異生成、細胞凝集、細胞運動性、細胞分裂、急性および慢性炎症性疾
患、自己免疫障害、アレルギー性応答、分泌、アポト−シス、神経障害、末梢血
管疾患、アテローム性動脈硬化症および喘息を包含する生理学的状態の任意の１
以上を介在する能力を指す。
【００５０】 ここで使用されているようなドミナントネガテイブ突然変異体とは、相応する
野生型バージヨンに対して相対的に配列中の少なくとも１位置に関して、有利に
は、この際、突然変異ペプチドをコード化するために本来のペプチド中の生物学
的及び／又は薬物学的活性のために要求される活性部位でのアミノ酸残基位置を
変じる位置で変更された核酸コード領域配列を指す。この詳細な関連において、
活性部位には、限定的ではないが、触媒作用キナーゼドメイン、ＣＲＩＢドメイ
ンまたはｐ２１結合ドメインおよびＳＨ３結合ドメインが包含される。ここで使
用されているようなドミナントネガテイブ突然変異体は、同様に突然変異ペプチ
ドを指すために用いることもできる。
【００５１】 アンチセンス核酸分子、同様にドミナントネガテイブ突然変異核酸コード領域
およびドミナントネガテイブ突然変異ペプチドに関連してここで用いられている
生物学的活性は、これらの分子が本発明の新規シグナル伝達プロテインキナーゼ
の生物学的活性及び／又は薬物学的活性を及び／又は本発明の新規シグナル伝達
プロテインキナーゼの核酸コード領域の転写／翻訳を変調する能力を有すること
を指している。
【００５２】 ここで用いられている「実質的に記載されているような」とは、変化を有する
が実質的に同様な方法で実質的に同様な生物学的または薬物学的機能を行うこと
ができる様に定義されている、機能性誘導タンパク質および機能性誘導核酸配列
を指すが、ここで用いられている「実質的に記載されているような」とは、生物
学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異体をも指し、ここで定義されている
様な生物学的に有効なアンチセンス分子を包含することが意図されている。
【００５３】 ここで使用されているように、ここに記載されている生体分子の機能性誘導体
は、ここでＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３から誘導さ
れると定義されているような機能性の生物学的活性及び／又は薬物学的活性を有
するもの、例えば切除バージヨン、欠失を有するバージヨン、機能性フラグメン
ト、置換基を有するバージヨン、挿入または突出末端を有するバージヨン、また
は生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異体、同様に生物学的に有効な
アンチセンス分子である。
【００５４】 ここで用いられている用語「変調」は、本発明のシグナル伝達分子の生物学的
活性及び／又は薬物学的活性を増加するまたは阻害する能力または本発明の核酸
コード領域の機能特性を増加または阻害する能力を指す。ここで用いられている
生理学を変調するとは、細胞及び／又は組織の生理学的調節およびこれに関連す
る病態生理学的障害の治療を指す。
【００５５】 ここで使用されている「直接適用」とは、本発明の態様及び／又は機能性誘導
体（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を有する核酸分
子、ペプチドまたは化合物の直接適用を指す。しかしながら、直接適用には、限
定的ではないが、遺伝子治療も包含される。
【００５６】 ここで用いられている「精製された」とは、天然環境から取り出され、かつ天
然ではそれらに結合している少なくとも１種の他の成分から単離または分離され
た分子、核酸またはアミノ酸配列を指す。
【００５７】 ここで使用されている「発現ベクター」とは、宿主細胞中の核酸領域の転写を
命令する核酸ベクター構造を指す。発現ベクターには、限定的ではないが、プラ
スミド、レトロウイルス、ウイルスおよび合成ベクターが包含される。
【００５８】 ここで使用されている「形質転換された宿主細胞」は、本発明の核酸または機
能性誘導体を持つ細胞を指す。
【００５９】 キナーゼを介してのシグナル伝達 カスケードシグナル伝達メカニズムは、実質的に、刺激に対する応答で遺伝子
発現の明確なパターンを誘因するために細胞核へ外部刺激を伝達するためのコン
ジットである。細胞外シグナルは、増幅され、かつ一連の独立遂次共有装飾によ
り、独立特異性同族細胞質生体分子の独特のリン酸化を経て、血漿膜から核へ導
入される。タンパク質リン酸化は、真核生物細胞中のタンパク質機能、シグナル
伝達および遺伝子発現の急性調節の最も重要な手段と認められている。特異的キ
ナーゼを介しての細胞内生体分子リン酸化は、１状態から他への細胞活性のスイ
ッチイングに関与する。これは、細胞が細胞外信号、例えばマイトジェン刺激、
生物学的、化学的および物理的ストレス、ホルモンおよび成長因子に対して応答
する主要なメカニズムである。Protein Phosphorylation ,Hardie,D.G., Oxford
Press ( 1993) 。
【００６０】 プロテインキナーゼは、酵素の大きい１ファミリーである。保存された構造モ
テイーフは、このキナーゼがいかにしてプリンヌクレオチド三リン酸のγ−ホス
フェートをそれらタンパク質基質のヒドロキシル基へ移行するかの明確な指示を
提供する。このスーパーファミリー内には２つの主要亜族がある：プロテイン−
セリン／スレオニンキナーゼおよびプロテイン−チロシンキナーゼ。プロテイン
キナーゼを定義するこのキナーゼドメインは、いくつかのの酵素の３次元構造に
より具現化されるような、１つの共通の触媒作用コア構造中にフォールデイング
された１２の保存されたサブドメイン（Ｉ−ＸＩＩ）を有する。この触媒作用ド
メインの中心核、高度に保存された残基の最大頻度を有する領域は、サブドメイ
ンＶＩ〜ＩＸよりなる。アミノ酸特異性の最も顕著なインジケーターはサブドメ
インＶＩ中に認められ、この領域中のコンセンサスは、セリン／スレオニン特異
性の強力なインジケーターである。Hanks,S.K., et al., The Protein Kinase F
amily : Conserved Features and Deduced Phylogeny of the Catalytic Domain
s, Science, 241:42( 1988); Hanks,S.K., et al., The Eukaryotic Protein K
inase Superfamily: Kinase (Catalytic ) Domain Structure and Classificati
on, FASEB, Ser. Rev., 9:576(1995) 参照。
【００６１】 触媒作用ドメインに密接に関連しており、従ってそのようにファミリーを定義
するプロテインキナーゼは、比較的最近に展開された分岐を受けた遺伝子の製品
を意味する。クラステリングは、新規プロテインキナーゼの特性および機能の決
定において予言的価値を有することを明らかにしている。従って、記載のファミ
リーのメンバーは、関連機能を分担する傾向もある。これは、全体の構造トポロ
ジイ、調節のモードおよび基質特異性における類似性により表明される。一般に
、Hardie,D.G., et al., The Protein Kinase Factsbook,Academie Press,Londo
n( 1995) 参照。
【００６２】 マイトジェン刺激により開始されるシグナリング経路を定義する中の多くのｌ
ａｂｓにより進展がなされた。Blenis, J., Signal Transduction via the MAP
Kinases, PNAS, 90:5889( 1993) 。酵素のＭＡＰキナーゼファミリーは、多様な
マイトジェン刺激により誘導されるシグナリング経路の共通および主要な成分と
して関連している。いったん活性化されると、ＭＡＰキナーゼは、実質的に成長
応答のために必要な遺伝子発現を開始させるために重要な転写因子を包含する多
くの基質をリン酸化する。従って、ＭＡＰキナーゼは、成長因子シグナリング経
路内の潜在的に有用な薬物学的ターゲットであると考えられている。Hidaka,H.,
et al., Intracelular Signal Transduction,Advances in Pharmacology,Acade
mic Press (1996) 。
【００６３】 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）およびその上流調節キ
ナーゼは、上流インプットシグナルを種々のアウトプットに結合する機能ユニッ
トを成す。ＭＡＰＫカスケードは、進化で著しく保存されている。このカスケー
ドのコアは、MAPK−細胞外シグナル調節キナーゼキナーゼ（ＭＥＫＫ）、ＭＥＫ
およびＭＡＰＫまたは細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）よりなる３輪モジ
ュールである。このモジュールの定義的特徴は、ＭＡＰＫそれ自体である。細胞
外シグナル調節キナーゼ経路（ＥＰＫ）として知られている典型的な経路は、マ
イトジェンおよび成長因子により活性化される。ＥＲＫは、活性化のために必要
な調節キナーゼ、ＭＡＰＫキナーゼまたはＭＥＫを有する。この酵素それ自体は
、Ｒａｆとして公知の他のＭＡＰＫＫキナーゼにより調節される。典型的なＭＡ
ＰＫモジュールを有する類縁体は、サイトカインおよび細胞ストレスにより活性
化され、ストレスキナーゼ経路として知られている２つの他のモジュールである
。それら経路の明白なＭＡＰＫｓは、ＪＮＫ（ＳＡＰＫ）およびＰ３８である。
ＪＮＫは、上流ＳＥＫ−１（ＭＫＫ４）により活性化され、これはＭＥＫＫ１ま
たはＭＬＫ３により活性性化され、他方、Ｐ３８はＭＫＫ３およびＭＫＫ６によ
り活性化される。
【００６４】 酵母中でＭＡＰＫモジュールは線状で結合する細胞外シグナルを機能的に応答
するように作用するが、哺乳動物細胞中では、モジュール間の「クロストーク」
がいくつかの場合（例えばＴ−リンパ球によるＩｌ−２生産）に必須であり得る
。末端ＭＡＰＫｓによる転写因子（例えばＡＰ−１、ＮＦ−ｋＢ、ＥＬＫ−１、
ＡＴＦ−２）のリン酸化は、炎症性鍵遺伝子の発現を調節するために役立つ。細
胞タイプ間の種々のキナーゼの発現および疾病のプロセスに対する応答での相違
は、生理学的および病理学的状態下での細胞外刺激に細胞が如何に応答するかに
主に影響する。これが、おそらく、それらの関連生理学的役割を得るためのこれ
らの種々異なるキナーゼの特異的阻害剤に関する選択性および治療介入のための
好機が存在する理由である。
【００６５】 末端ＭＡＰＫｓによる転写因子（例えばＡｐ−１、ＮＦ−ｋＢ、ＥＬＫ−１、
ＡＴＦ−２）のリン酸化は、炎症性鍵遺伝子の発現を調節することに役立つ。疾
病のプロセスに応答する細胞タイプ間の種々異なるキナーゼの発現の相違は、生
理学的および病理学的状態における細胞外刺激に如何に細胞が応答するかに主要
な影響を有する。これが治療介入のための好機を提供する。
【００６６】 発芽酵母および核分裂酵母、サッカロマイセス・セレビジアエおよびシゾサッ
カロマイセス・ポンベの研究は、プロテインキナーゼの認識において特に成功し
ている。Hanks,S.K., et al., The Eukaryotic Protein Kinase Superfamily,FA
SEB Ｓer. Rev., 9:476(1995) 。細胞表面レセプターを哺乳動物細胞中のＭＡＰ
Ｋスーパーファミリーの各メンバーと連結しているシグナル伝達経路は、発芽酵
母サッカロマイセス・セレビジアエのそれ（これ中での遺伝学的研究は、少なく
とも３個の明確なＭＡＰＫ−関連キナーゼの活性化をもたらすパラレルシグナリ
ングカスケードを示している）と非常に類似している。Hu,Mickey C.T., et al.
, Genes & Development, 10:2251(1996); 例えば、Herskowitcz, I. et al., Ce
ll, 80:187( 1959）参照。
【００６７】 発芽酵母中のフェロモン−応答経路の成分Ｓｔｅ−２０は、セリン／スレオニ
ンプロテインキナーゼの新規ファミリーの最初に同定されたメンバーを意味した
。Leberer,E., et al., EMBO,11:4815( 1992); Ramer, S. Ｗ., et al., PNAS,
90:452(1993) 。Ｓｔｅ−２０に対する哺乳動物のいくつかの同族体が同定され
、それには、ＭＳＴ１（Creasy, C.L., et al., J.Biol. Chem., 271:No.35, 21
049(1996)) 、ＭＳＴ２（Ｇene,167:303( 1995)) 、ＨＰＫ１（Kiefer,F., et a
l., EMBO, Vol. 5, 24:7013( 1996)) が包含される。最近、ｐ２１−活性化プロ
テインキナーゼ（ＰＡＫ１）（Manser,E., et al., Nature, 367:40 ( 1994))
およびジャーミナルセンターキナーゼ（ＧＣキナーゼ）（Katz, P. et al., J.
Biol. Chem.,(1994)) を包含する哺乳動物Ｓｔｅ−２類似キナーゼが哺乳動物Ｍ
ＡＰＫカスケードを活性化できることが明らかにされた。Pombo, C.M., et al.,
EMBO, Ｖol.15, 17:4537( 1996) 。１９９７年２月２５日発行Ｕ．Ｓ．特許Ｎ
ｏ．５６０５８２５、ヒトＰＡＫ６５も参照されたし。Ｕ．Ｓ．特許５６０５８
２５に記載の方法は、ここに参考文献として編入されている。
【００６８】 ＭＡＰキナーゼは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ活性化キナーゼ（ＭＥＫ）による活性化
を要求する。この二重特異性キナーゼは、タンパク質中のチロシンおよびセリン
／スレオニン残基の双方をリン酸化することができる。例えば、原癌遺伝子ｃＲ
ａｆ−１は、ＭＥＫキナーゼとして作用するタンパク質をコード化することが明
らかにされ、かつ経路Ｒａｆ→ＭＥＫ→ＭＡＰＫは、成長因子の主要シグナル伝
達経路として良好に確立されている。活性化されたＭＡＰＫは、核への転座をう
け、ここで、これは、直接、ｃ−Ｍｙｅ、Ｃ／ＥＢＰβ、ｐ６２TCF／Ｅｌｋ−
１、ＡＴＦ−２およびｃ−Ｊｕｎを包含する種々の転写因子をリン酸化し、かつ
活性化することができる。Grunicke,Hans H., Signal Transduction Mechanisms
in Cancer,Springer-Verlag (1995) 。
【００６９】 このＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードは、いくつかの細胞内作用の介在
において重要である。１経路で、一連のタンパク質−タンパク質相互反応が，Ｇ
ＴＰ−結合タンパク質Ｒａｓの活性化で完結する血漿膜のところで惹起される。
次いで、ＧＴＰ−ＲａｓはプロテインキナーゼＲａｆと相互に反応して、これを
血漿膜に補充し、ここで、それは活性化される。Ｒａｆの活性化に引き続き、３
種の付加的キナーゼ：ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰＫおよび
ＭＡＰＫ−活性化プロテイン（ＭＡＰＫＡＰ）キナーゼ−１の引き続く活性化を
行う。ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１の活性化は、サイトゾルから核
へのそれらの転座をもたらし、ここで、それらは転写因子の活性化を調節する。
Cohen, P.,Dissection of Protein Kinase Cascades That Mediate Cellular Re
sponse to Cytokines and Cellular Stress,Advances in Pharmacology, Academ
ic Press, Hidaka,H., et al., Eds., Vol. 36, 15( 1996); Marshall ,C. J.,
Cell, 80: １７９（１９９５）。
【００７０】 最近の証拠は、ストレスに対する細胞応答は、最初に血漿膜のところで起こる
現象によりコントロールされ、マイトジェン応答を開始する重要性と重なること
を示している。ｓｕｐｒａと称されるストレス試剤への細胞の露呈は、転写因子
およびマイトジェン刺激に応答して迅速および高度に誘発される他の遺伝子生成
物を包含する広範囲の遺伝子群の活性化をもたらす一連の現象を喚起する。細胞
応答の介在に関連する経路は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、ストレ
ス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮ
Ｋ）およびｐ３８／ＰＫ／ＣＳＢＰキナーゼを包含するマイトジェン活性化プロ
テインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化に依存している。これらのキナーゼは、転
写因子および活性化遺伝子発現に付随する他の調節タンパク質を活性化する鍵役
割を演じる。リン酸化は、コンプレックス形成およびストレス応答遺伝子、例え
ばｃ−ｆｏｓのプロモーター中に局在する血清応答要素を増強する。他の調節さ
れたタンパク質には、ｐ９０RSK、活性化転写因子−２（ＡＴＦ−２、ｃＡＭＰ
応答要素−結合タンパク質）、ＮＦＬ−ＩＬ６（インターロイキン６の活性化の
ための核因子）およびｃ−Ｍｙｃが包含される。Davis, R.J.,The Mitogen-Acti
vated Protein Kinase Signal Transduction Pathway, J. Biol. Chem.,268:155
3(1993);N,J.Holbrook, et al., Stress Inducible Cellular Responses,273, i
n: Stress-Inducible Cellular Responses ,Feige,U., et al., Eds., Birkhaus
er Verlag ( 1996) 。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経
路は、多くの系中のマイトジェン応答のために重要であることが明らかにされて
いる。例えば、Qin,Y.,et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 120:519( 1994)
。更に大抵の発癌因子は成長因子、成長因子レセプターまたは細胞内ポストレ
セプターシグナル伝達機構をコード化する事実に基づき、成長因子シグナル伝達
経路は他の形質転換関連経路からの正または負の交差調節性のインプットの入念
なネットワークを得るための対象であることが明らかになってきている。Grunic
ke,Hans H., Signal Transduction Mechanisms in Cancer,Springer -Verlag(19
95) 。ＭＡＰＫカスケードの組織機構体系は、内在性プロテインキナーゼメンバ
ーを特に「クロストーク」のための特に良好なターゲットにする。Protein Seri
ne/Threonine Kinase of the MAPK Cascade,J.D.Graves, et al., Annals New Y
ork Academy of Sciences, 766:320( 1995) 。
【００７１】 炎症の初期誘因体には、物理的および化学的手段、細菌およびウイルス感染、
同様に抗原、スーパー抗原またはアレルゲンへの露呈が包含され、これらの全て
は反応性酸素種（ＲＯＳ）を発生させ、その際、第二のメッセンジャーシグナル
伝達分子を活性化する能力を有する。反応性酸素種には、酸素分子から発生され
、遊離ラジカルスーパーオキシド（・Ｏ2 -）3、ヒドロキシル（・ＯＨ）および
酸化窒素（ＮＯ・）、同様に非ラジカル性中間体、例えば過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）
および一重項酸素（1Ｏ2）が包含される。正常な細胞呼吸の間には、真核生物お
よび原核生物の双方中で低い割合でＲＯＳが耐えず生産される。この低い濃度で
ＲＯＳは第二メッセンジャーとして作用することができ、細胞増殖を刺激し、か
つ、細胞活性化のためのメデイエーターとして作用する。しかしながら、食細胞
活動、感染または炎症の間には、ＲＯＳは毒性レベルまで集積することができ、
これが酸化性ストレスをもたらし、殆ど全ての細胞成分を損傷する。全ての組織
は、オキシダントを脱酸無害化するかまたはスーパーオキシドジスムターゼ、カ
タラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオン、チオレドキシンおよび熱ショック
タンパク質を包含するＲＯＳにより惹起された損傷を修復する機能を有する。こ
れらタンパク質をコードする遺伝子（酸化性ストレス遺伝子）の発現は、ＲＯＳ
の濃度の変化により誘発され、このことは細胞がＲＯＳを感じるメカニズムを顕
現されたことを示している。Storz, G., et al., Transcriptional Regulators
of Oxidative Stress-Inducible Genes in Prokaryotes and Eukaryote, in: St
ress-Inducible Cellular Responses, Feige,U., et al.,Eds., Birkhauser Ver
lag (1996) 。
【００７２】 アイソザイム一般 アイソザイムの研究は、細胞分化および形態学の分子ベースの研究で根本的に
重要になってきている。アイソザイムは、臓器中、種々のタイプの細胞または単
一細胞中にすら生じる所定の酵素または酵素サブユニットの多形の参加により達
成される調節の１タイプである。多くの場合に、特定の酵素の全ての形は、同様
な全体的な反応、例えばリン酸化に触媒作用をするが、それらの基質、基質濃度
、活性化剤、共因子および細胞状態へのそれらの依存性で異なっている。特別な
組織中のアイソザイムの相対的割合は、特に疾病の診断においては重要である。
【００７３】 アイソザイムは、多くの異なる酵素に対して公知である。多くのアロステリッ
ク酵素は、それらのアロステリックモジュレーターに対する感受性で異なる２以
上のアイソザイムとして生じる。従って、異なるアイソザイムは、生化学的状態
への機能的応答として展開され、従ってそれらの存在は、正常な生理学的または
対照的に、病態生理学的状態を示す確かな因子である。
【００７４】 ＳＯＫ−１ Ｐｏｍｂｏ等は、最近、ヒトＳｔｅ２０／オキシダントストレス応答キナーゼ
、ＳＯＫ−１（これはＮ−末端触媒作用ドメインを有するＳｔｅ２０−類似キナ
ーゼのＳｐｓＩ／ＧＣキナーゼ群に属する）のクローニングおよび特徴付けを報
告した。このキナーゼは、リン酸化により正に調節され、かつそのＣ−末端非触
媒作用領域により負に調節される。ＳＯＫ−１は、オキシダントストレスにより
比較的特異的に活性化される。報告データは、ＳＯＫ−１がストレス応答経路中
に存在し、これが環境ストレスに応答してシグナルを伝達する酵母Ｓｔｅ２０ｓ
に機能的に似ていることを示している。EMBO,Vol. 15, 17:4537( 1996) 。オー
プンリーデイングフレームが４２６アミノ酸のタンパク質をコード化することが
報告されており、４８０４１Ｄａの予想されたＭｒを有する。このキナーゼドメ
インはタンパク質のＮ−末端半体中に局在している。報告されたペプチドは、セ
リン／スレオニンキナーゼの１１サブドメインの全てを含有する。Ｓｔｅ２０関
連ストレス活性化キナーゼは、シグナリングカスケード中の膜に接近しているこ
とが証明され、従って、シグナル伝達の選択的変調のための大きいターゲット機
会を提供することができる。
【００７５】 ＭＳＴ−３ Ｓｉｎｋｍａｎｎ等は、最近、ヒトＳＴＥ−２０類似キナーゼｍｓｔ−３のク
ローニングおよび特徴付けを報告している。このｍｓｔ−３転写産物は至る所で
発現することが報告されおり、ＳＯＫ−１に最も密接に関連しており、更に自己
リン酸化により正に調節されることが報告されている。１９７６塩基からなるｃ
ＤＮＡ分子が、４８ＫＤａの分子量を有する４３１アミノ酸ペプチド（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５）をコード化するオープンリーデイングフレームと同様に記載さ
れている。このｍｓｔ−３キナーゼは、Ｎ−末端キナーゼドメインおよび１４２
−アミノ酸Ｃ−末端調節ドメインよりなることが報告されている。このｍｓｔ−
３分子は、ＳＯＫ−１と６８.８％の総アミノ酸相同性を共有する。J.Biol. Che
m., 272(45):28695( 1997) 。
【００７６】 新規ヒトシグナル伝達セリン/スレオニンキナーゼ 新規ヒトシグナル伝達セリン/スレオニンプロテインキナーゼ分子および例え
ばそれをコード化する核酸配列をここに記載する。
【００７７】 ｃＤＮＡ配列が供給され（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）図１、これは本来のヒト
シグナル伝達キナーゼの構造コード領域を有する（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）図
２。３２０１ｂｐＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１隣接ｃＤＮＡ配列は、開始メチオニン
のところにＫｏｚａｋ開始配列を有する１２５１ｂｐオープンリーデイングフレ
ーム（ＯＲＦ）を含有する。図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、停止コドンを
包含する１２５１塩基オープンリーデイングフレームを示している。Ｓｔｅ２０
−類似シグナル伝達キナーゼの本来のヒト同族体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を
配列図３に示す。新規タンパク質の４１６アミノ酸残基配列は、Ｓｔｅ２０−キ
ナーゼを包含する真核生物タンパク質キナーゼ中に認められる１１サブドメイン
全てを含有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、Pombo 等により記載されたＳｔｅ
２０／オキシダントストレス応答キナーゼ−１（ＳＯＫ−１）（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）およびSchinkmann等により記載された哺乳動物Ｓｔｅ２０−類似キナ
ーゼ（ＭＳＴ−３）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）に対してそれぞれ６５.７％お
よび７１％の相同性を有する（図６に比較して示されている）。EMBO , Vol. 15
, 17:4537( 1996); J. Biol. Chem., 272(45):28695(1997) 。新規キナーゼは、
４６５２７.８３ダルトンの明確な分子量、５.０９７の等電点およびｐＨ７.０
での正味電荷−１３を有する。
【００７８】 マイトジェン活性化されたプロテインキナーゼカスケードは、進化で著しく保
存されている。例えば、図４は、ＳＯＫ−１の４２６アミノ酸残基配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４）を示しており、これは、最近記載されたヒトＭＡＰＫ−経路
オキシダント（ストレス）活性化キナーゼである。ＳＯＫ−１は、ＭＡＰＫ−経
路酵母ストレス−活性化キナーゼＳｔｅ２０のヒト同族体として特徴付けられて
いる。Pombo, C.M., et al., EMBO,Vol. 15, 17:4537( 1996) 。Pombo等は、ヒ
トＳｔｅ２０/オキシダントストレス応答キナーゼとしてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：４を報告した。Ｓｔｅ２０関連ストレス活性化キナーゼは、明確な特徴により
、シグナリングカスケード中の血漿膜に接近して現れ、従ってシグナル伝達の選
択的変調のための大きなターゲット機会を提供する重大な能力を有しうる。EMBO
,Vol. 15, 17: 4537( 1996) 。
【００７９】 ｃＤＮＡ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のいくつかの特徴は例えば次のとおりであ
る：塩基１−１８１は５’ＵＴＲを表し、塩基１７６−１８６はＫｏｚａｋ配列
を表し、塩基１８２−１４３２はＣＤＳを表し、塩基１４３３−３２０１は３’
ＵＲＴを表し、塩基３１９４−３１９９はポリアデニル化シグナルを表す。
【００８０】 ４１６残基ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のいくつかの特徴は、例
えば：分子量４６５２７.８３ダルトン、５１強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ
）、６５強酸性（-）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、１３８疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ 、
Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）、１０３極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｏ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、等電点＝
５.０９７、ｐＨ７.０での電荷＝−１３.０１７。
【００８１】 真核生物プロテインキナーゼは、それぞれ、酵素のホスホトランスフェラーゼ
活性に関与する２５０−３００アミノ酸残基の保存された触媒作用ドメイン領域
を含有する。ここに記載の新規シグナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
）の触媒作用ドメインは、それぞれｍｓｔ−３（ＳＥＱ ＩＤＦ ＮＯ：５）お
よびＳＯＫ−１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）と８９％および８７.５％の類似性
を有する。触媒作用ドメインは、更に不変かつ保存された残基のストリングによ
り定義された１２のサブドメインに分割することができる。例えばこの新規シグ
ナル伝達キナーゼの残基位置３１−３８は、コンセンサスキナーゼサブドメイン
Ｉ ＧｘＧｘｘＧｘＶに相当する。サブドメインＩＩは、ホスホトランスファー
反応で必要であり、トリペプチド配列ＡｘＫ中の不変のリシンで同定される。新
規キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に関連して、サブドメインＩＩが残基５１−
５３中に認められる。高度に保存された多数の残基により特徴付けられるサブド
メインＶＩ〜ＩＸは、触媒活性の中心核を形成する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３は
、サブドメインＶＩ中に不変のまたは殆ど不変の残基Ａｓｐ144およびＡｓｎ149 を有し、サブドメインＶＩＩ中にＡｓｐ162、Ｐｈｅ163およびＧｌｙ1164を有し
；これらの全てはＡＴＰ結合で関わり合っている。領域ＶＩＢは、コンセンサス
配列ＨＲＤＬｘｘｘＮを、不変のＡｓｐ144であるＤと共に含有する。この領域
内のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、ＨＡＲＤＩＫＡＡＮ（この中で、ＩｌｅのＬｅ
ｕへの置換は保存性である）である。更に、新規シグナル伝達キナーゼは、サブ
ドメインＶＩＩの保存されたＤＦＧを含有する。Ａｓｐは転移のためのＡＴＰの
γ−ホスフェートの方向へ機能する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のサブドメインＶ
ＩＩＩは、高度に保存されたＡＰＥ配列を、不変のＧｌｕ189に相当するGｌｕと
共に含有する。このサブドメインは、基質結合の認識に重要な役割を演じると考
えられる。加えて、多くのキナーゼがサブドメインＶＩＩＩ中の残基のリン酸化
により活性化されることが公知である。サブドメインＩＸの配列ＤｘＷＳ／Ａｘ
Ｇは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸位置２０１〜２０６（ＤＩＷＳＬＧ）
で表される。この領域は、大きいα−ヘリックスを形成し、コンセンサス配列の
開始Ａｓｐは水素結合による触媒ループを安定化に作用する。
【００８２】 免疫組織中の発現 ノーザンブロット分析は、約３.５ｋｂの長さの新規シグナル伝達キナーゼに
関係する一次転写産物を同定する。顕著な転写産物が最初に免疫組織中に現れ（
ヒト免疫系の組成物中、例えばリンパ節、末梢血液白血球、脾臓、胎児肝臓、骨
髄、胸腺および胎盤中に特に高いレベルで発現される）、同様に胎盤および癌−
細胞系からも現れる。図１０、例Ｖ参照。この新規キナーゼの発現は、ｍｓｔ−
３転写産物（これは偏在し発現されることが報告されている）に対して非常に対
照的に現れる。J.Biol.Chem., 272(45):28695(1997) 。
【００８３】 ＴＮＥ−１キナーゼによる転写因子の活性化 ここでは、シグナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）がＮＦκＢ、Ａ
Ｐ１およびＳＲＦを活性化することが明らかにされ、この際、細胞系（例えばＨ
ＥＫ２９３、ＨｅＬａ）中に過剰発現される。加えて、アンチセンスｃＤＮＡの
発現が、ＥＣＶ３０４細胞中のＮＦκＢの基本およびＴＮＦａ−介在活性の双方
を阻害することを明らかにしている。例ＸＩＶ中には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
が特定のトランスファクターを活性化するか否かを測定するために使用される転
写活性化レポーター検定の一般的フォーマットが示されている。PathDetectTMSy
stem(レポーター構成および正のコントロール構成を包含する）が、この検定を
実施するために使用された。Stratagene, La Jolla,CA. 。全ての検定を三重に
実施し、別の時点で数回繰り返した。
【００８４】 シグナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、ＮＦκＢ、ＡＰ１およ
びＳＲＦを活性化し、その際、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞中に過剰発現し
た。加えて、ＥＣＶ３０４−細胞中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アンチセンスｃＤ
ＮＡ発現は、ＮＦκＢの基本およびＴＮｆａ刺激誘導の双方をそれぞれ約６６％
および５０％阻害することが可能である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、プロ-炎
症サイトカイン、ケモカイン、炎症酵素、付着分子および炎症レセプターを包含
する多くの炎症遺伝子の転写を開始させることが公知である転写因子（例えばＮ
ＦκＢ、ＡＰ１）を生体内で活性化させることができる。加えて、ＮＦκＢはＡ
Ｐ１と相乗的に作用して、遺伝子転写を促進する。炎症シグナルにより活性化さ
れるこのＮＦκＢと他の転写因子との間の共同作用は、多くの種々の疾病におけ
る炎症応答の特異性の基礎となっている。
【００８５】 図１４は、シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３による２９３細胞中
のＮＦκＢ、ＡＰ１およびＳＲＦの活性化を説明している（ＴＥＮ １はシグナ
ル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す）。ＭＥＫＫは、ＮＦκＢの
公知アクチベーターであり、Stratagene PathDetectTMSystem の部分として提供
されている。図１５は、シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ID ＮＯ：３によるＨｅ
Ｌａ細胞中のＡＰ−１およびＳＲＦの活性化を説明している（ＴＥＮ １はシグ
ナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す）。ＭＥＫＫは、ＡＰ−１
の公知アクチベーターであり、Stratagene PathDetectTMSystem の部分として提
供されている。ＰＫＡ（プロテインキナーゼＡ）は、ＳＲＦの公知アクチベータ
ーであり、Stratagene PathDetectTMSystem の部分として提供されている。図１
５は、ＥＣＶ３０４細胞中の基本レベルのおよびＴＮＦα−介在ＮＦκＢ活性化
へのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アンチセンス分子の発現の作用を説明している。
【００８６】 変形物 本発明は、新規シグナル伝達キナーゼおよびその変形物および機能性誘導体の
核酸（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびア
ミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびこのシグナル伝達分子の生物学的
及び／又は薬物学的活性を変調する化合物を同定するためのこの配列の使用に関
する。更に、本発明は、生物学的に有効なアンチセンス核酸分子およびシグナル
伝達キナーゼの生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異体バージョンを
コード化する核酸および新規ペプチド生体分子の生物学的に有効なドミナントネ
ガテイブ突然変異体バージョンに関する。本発明は、このような治療を必要とす
る患者、即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３シグナル伝達キナーゼにより介在される病
態に羅病している患者を治療する方法をも提供し、これは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：１から誘導された生物学的に有効なアンチセンス核酸分子の有効量を適用する
か；またはシグナル伝達キナーゼの生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然
変異体バージョンをコード化する核酸の有効量を適用するか；またはＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３の生物学的及び／又は薬物学的活性を変調する化合物（これはここ
に記載の方法で同定される）を適用することよりなる。
【００８７】 本発明は、シグナル伝達キナーゼ分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の変体をも包含
する。実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているような有利な変体は、
例えばキナーゼ分子アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対して少なくと
も８０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、より有利な変体は少なくと
も９０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、最も有利な変体は、少なく
とも９５％の類似性を有するものであるか、またはその生物学的に活性のフラグ
メントである。
【００８８】 この発明の１態様は、以後に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１として記載されてお
り、これは、キナーゼ分子アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に対して９
８.１％のアミノ酸配列相同性を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のネズミ相同体
である。
【００８９】 例えば、ドミナントネガテイブ／不活性キナーゼ突然変異体は、ここに例示さ
れている１態様を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の５３位のリシンをアルギニンに変
換することにより例示されている更なる１態様を製造するためにここに提供され
ているツールを用いて容易に製造することができる。例ＸＩＩ参照。ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３のドミナントネガテイブ突然変異体は、生体内でのＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３の生物学的活性に拮抗する化合物を用いる治療により提供することので
きる病態生理学的状態を治療するための遺伝子治療を介して交付することができ
る。
【００９０】 ここに存在する実質的に記載されているような配列態様を包含する変体には、
アンチセンス分子および生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異体が包
含される。
【００９１】 実質的に記載されているような本発明のヒトキナーゼ分子の変体は、１以上の
アミノ酸置換により異なっているアミノ酸配列を有していてよい。この変体は保
存性変換（ここで置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンで置換
したような類似の構造的または化学的特性を有する）を有することができる。変
体は、非保存性変換、例えばグリシンのトリプトファンでの置換を有することも
できる。類似の小数の変体は、アミノ酸欠失または挿入または双方を包含するこ
ともできる。生物学的または免疫学的活性を破壊することなしに、どのおよび如
何に多くのアミノ酸残基が置換され、挿入され、または欠失されるかを決定する
概要は、文献中に周知の、コンピュータプログラム、例えばＤＮＡソフトウエア
を用いて見つけることができる。
【００９２】 ヒトシグナル伝達分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３またはその機能性誘導体をコー
ド化するポリヌクレオチド配列は、本発明に従って使用することができ、これは
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の欠失、挿入または置換よりなる。本発明のキナーゼ
分子の生物学的活性の変体は、ＳＥＱ ID ＮＯ：３アミノ酸残基の欠失体、挿
入体または置換体よりなっていてもよい。実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記
載のような配列を有するポリペプチドをコード化する核酸配列を有する精製され
たポリヌクレオチドまたはその生物学的及び／又は薬物学的に活性のそのフラグ
メントは、本発明の特に有利な１態様である。生物学的に有効なアンチセンス分
子およびＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変
異体をコード化する核酸またはそれらの誘導体は本発明の有利な態様である。
【００９３】 例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸置換体は、この分子の生物学的活性
及び／又は薬物学的活性が保留されている限りにおいて、残基の極性、電荷、溶
解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似性に基づき製造することができ
る。例えば、負に帯電されたアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸
が包含され；正に帯電されたアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが包含され
；類似の親水性値を有する非帯電極性ヘッド基を有するアミノ酸には、ロイシン
、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セ
リン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが包含される。しかしなが
ら、生物学的に有効なドミナントネガテイブ突然変異体の構成においては、本来
のペプチド中の生物学的及び／又は薬物学的活性が要求される活性部位の少なく
とも１個のアミノ酸残基位置は、減少された活性を有する試剤または実体を製造
するように変換されているか、またはこれは検査可能な本来の野生型活性を欠い
ている。
【００９４】 アミノ酸の好適な置換には、非誘導体化残基の代わりに化学的誘導体化残基の
使用を包含する。Ｄ−異性体は公知誘導体と同様に、天然に由来するアミノ酸で
置換されていてもよい。例えば、U．S．Patent No. 5652369, Amino Acid Deriv
atives, issued July 29,1997 参照。 置換基の例を次の第１表中に記載する：
【００９５】
【表１】
【００９６】 本発明のヌクレオチド配列は、種々の理由からコード配列を変更するように設
計されていてもよく、これには、限定的ではないが、遺伝子生成物のクローニン
グ、処理及び／又は発現を変調する変更が包含される。例えば、文献に周知の技
術、例えば新規制限部位を挿入するため、グリコシル化パターンを変えるため、
コドン優先性を変じるため等の部位方向付けられた突然変異生成を用いて突然変
異を起こさせることができる。
【００９７】 本発明の範囲内には、本発明のヒトシグナル伝達キナーゼの対立遺伝子が包含
される。ここで用いられているような「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」
は、ここに記載のキナーゼ分子の１変形である。対立遺伝子は、その構造および
機能を変えることができる、または変えることができないポリペプチドを生産す
る核酸突然変異体およびｍＲＮＡスプライス変体から生じる。記載の遺伝子は１
個以上の対立遺伝子形を有することができるかまたは有することができない。対
立遺伝子を生じさせる共通の突然変異変更は、一般にアミノ酸の天然の欠失、付
加または置換を原因としている。このタイプの変更の各々は、所定配列中で単独
でまたは他との組み合わせで、１回または数回起こることができる。
【００９８】 本発明は部分的に、宿主細胞または組織を形質転換するために使用することの
できる表現ベクター中の新規ヒトシグナル伝達キナーゼ分子をコード化するポリ
ヌクレオチドの封入に関する。このようなトランスジェニック宿主は、このプロ
テインキナーゼの産生のために有用である。
【００９９】 核酸配列は、白血球、内皮細胞および腫瘍細胞または癌細胞を包含する細胞中
のゲノミックヌクレオチド配列の発現のダウン調節、消失または排除で有用であ
るアンチセンス分子のデザインをも提供する。
【０１００】 本発明のヒトシグナル伝達キナーゼ分子は、基質と結合または競合するまたは
他の場合は生体分子を不活性化するまたはそれと競合する拮抗剤または阻害剤を
同定するスクリーニング検定で使用することもできる。新規キナーゼは生体内ま
たは試験管内でその分子の製造またはその寿命の延長を誘導するアゴニストを同
定するためのスクリーニング検定で使用することもできる。
【０１０１】 本発明は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のようなキナーゼ分子また
はそのフラグメント、天然由来の遺伝子の発現を破壊することのできるアンチセ
ンス分子および本来のシグナル伝達キナーゼのアゴニスト、抗体、拮抗剤または
阻害剤を含有する薬物学的化合物または組成物にも関する。これらの組成物は、
下記のようなシグナル伝達分子の異常発現と関連している症状の予防または治療
のために有用である。 薬物学的意義 特定の分子内経路に必要な特定のシグナル伝達分子の活性を変調することので
きる化合物は、下流の生理学的応答をコントロールまたは減衰させる有意義な能
力を有することが期待されている。有意義な現象は、ストレスキナーゼ活性化経
路が広範囲な疾病領域にわたる生物学的作用に関与しうることを立証している。
ＭＡＰキナーゼはストレスに応答する細胞を介在するシグナル現象で中心的役割
を演じるので、特定のインテグラルシグナル伝達分子を変調するまたは失活させ
る化合物、即ちここに記載の新規ヒトストレス活性化セリン／スレオニンシグナ
ル伝達キナーゼ分子、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびそれをコードする核酸配列
、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤＮＯ：２は、病態生理学的
応答を減衰させる有意義な能力を有する。従って、ここに記載の本来のヒトスト
レス−活性化セリン／スレオニンシグナル伝達キナーゼの活性を変調する拮抗剤
およびアゴニストをスクリーニングする能力は、治療剤の同定および開発のため
に非常に有用である。
【０１０２】 ここに記載のヒトＳｔｅ２０−類似シグナル伝達セリン／スレオニン／キナー
ゼのモジュレーターにとって、有効な診断および治療用途は、容易に明らかであ
る。特に治療研究の必要な疾病に共通である領域には、限定的ではないが、機能
不全性の白血病、Ｔ−細胞活性化、急性および慢性炎症性疾病、自己免疫障害、
リュウマチ性関節炎、変形性関節炎、移植拒絶、マクロファージ調節、内皮細胞
調節、脈管形成、アテローム性動脈硬化症、線維芽細胞調節、病的線維症、喘息
、アレルギー応答、ＡＲＤＳ、アテローム、変形性関節炎、心不全、癌、糖尿病
、肥満症、悪液質、アルツハイマー、敗血症、神経変性および関連障害で現れる
病態生理学的障害を包含する。
【０１０３】 オキシダント、機械的ストレス、ＵＶ照射線および免疫学的メデイエーターは
、プロ炎症性遺伝子生成物、アポト−シス−関連遺伝子および急性相応答遺伝子
の活性化をもたらす。これらの応答は、脈管損傷および炎症の基礎原因である。
最近の文献をみると、例えば、ＳＡＰＫ／ＪＮＫおよびｐ３８キナーゼ経路を包
含するＭＡＰＫ経路は、化学的、機械的および前炎症性攻撃に対する細胞の応答
における中心成分であると認識されている。細胞活性化におけるこのような顕著
な役割を有して、ストレスキナーゼは同様に、限定的ではないが、発作（虚血性
再灌流）、ＡＲＤＳ、敗血症、神経変性および炎症を包含する疾病領域で重要な
役割を演じる。例えば虚血組織の再灌流の間に、ｃ−Ｊｕｎ／ＡＴＦ−２活性化
もたらすストレス活性化プロテインキナーゼ活性が著しく増加して、アポト−シ
スまたは分化および細胞回復をもたらす遺伝子転写を増強する。炎症応答で、Ｔ
ＮＦ−αおよびＩＬ−１βは、より多くのＴＮＦおよびＩＬ−１の生産を引き起
こすｐ３８を活性化し、これは炎症性応答を増幅させる。このプロセスは、敗血
症ショックおよびアテローム性動脈硬化性プラークの形成の双方で重要な役割を
演じると考えられている。ＳＡＰＫsは、内皮細胞中のＥ−選択発現および炎症
細胞のマトリックスメタロプロテイナーゼの誘発に役割を演じると考えられてお
り、これは、虚血後傷および組織再成形におけるＳＡＰＫsの役割を示している
。更に、ＳＡＰＫ−ｐ４６β1、脳特異性キナーゼは、プロミネントアルツハイ
マー病マーカー、ＡＬＺ−５０と共に局在し、タウタンパク質のプロリン方向過
リン酸化がこのキナーゼにより促進されることを示している。
【０１０４】 ここに記載のシグナル伝達キナーゼ同族体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）は、プ
ロ炎症遺伝子生成物の活性化をもたらすストレッサーに応答する細胞を形質導入
すると信じられている。ＲＯＳおよびサイトカインを包含する炎症のメデイエー
ターの有害な作用は、独創的な抗炎症治療の開発のための新しい達成法を開く。
ＭＡＰキナーゼはストレスに対する細胞応答を仲介するシグナリング現象で中心
的役割を演じるので、それらの失活または拮抗はこの応答の減衰のための鍵であ
る。例えば、ＥＲＫおよびＪＮＫ経路がＩＬ−２産生と強く結びついていること
が明らかに示されている。ＥＲＫおよびＪＮＫ経路は、ＩＬ−２遺伝子転写およ
びＴ−細胞増殖をもたらすＴ−リンパ球活性化のために必要であることが明らか
に確立されている。従って、選択的キナーゼ阻害によるシグナリングプロセスの
中断は、ＩＬ−２産生およびＴ−リンパ球増殖を低減させることが期待されてお
り、これが慢性炎症性疾病での治療に有利でありうる。ストレス活性化キナーゼ
を包含するＭＡＰＫｓは、限定的ではないが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、変形
性関節炎（ＯＡ）および多発性硬化症（ＭＳ）を包含する自己免疫疾患の病理学
において鍵役割を演じることが予期されている。従って、ここに記載の新規ヒト
セリン／スレオニンストレス活性化キナーゼシグナル伝達分子（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３）およびそれをコードする核酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１お
よびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、限定的ではないが、機能不全Ｔ−リンパ球を包
含する機能不全白血球のコントロールのための診断および治療に利用できる特定
のターゲットとして、かつリュウマチ性関節炎（ＲＡ）および変形性関節炎（Ｏ
Ａ）を包含する自己免疫疾患の治療で、かつ限定的ではないが、喘息およびＡＲ
ＤＳおよびリンパ球機能不全により惹起される他の疾病を包含する急性および慢
性の炎症の研究、診断および治療において重要な能力を有する。
【０１０５】 オキシダントの過剰生産は、ＭＡＰＫ経路の活性化に関与する。オキシダント
の過剰生産は、アテローム性動脈硬化症の主要な危険因子および虚血性再灌流傷
に共通している。細胞膜、細胞質顆粒遊離ラジカル中での酸化性ストレスと一緒
の過酸化脂質生成は、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性化をもたらす。ＪＮＫ経
路は確立されており、同様にＲａｓの活性化はこの応答中に包含されることが明
らかである。ＬＰＳまたはＴＮＦ／ＩＬ−１によるマクロファージおよび内皮細
胞の刺激は、結果としてＭＡＰＫ、ＪＮＫおよびｐ３８経路の活性化を行う。例
えば、選択的ｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０は、ＬＰＳ−刺激マクロファージに
よるＴＮＦおよびＩＬ−１の生産を、同様にＴＮＦ−刺激ＨＵＶＥＣｓによるＴ
ＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−８の生産を阻害することが明らかに示されている。
Philip Cohen, Dissection of Protein Kinase Cascades That Mediate Cellul
ar Response to Cytokinases and Cellular Stress, in:Intracellular Signal
Transduction, Advances in Pharmacology,Vol. 36, Academic Press( 1996)
。ＭＡＰＫ経路は、剪断ストレスによっても活性化されうる。アテローム性動脈
硬化症障害は、低くかつ不安定な剪断ストレスの領域中で発生し、かつ進行し、
定常の剪断に露呈される領域ではそうではない。剪断ストレスの急激な変化は、
ＭＡＰＫ経路を活性化し、慢性ストレスは、ＭＡＰＫおよびＮＦκＢ経路の感度
を低め、この経路が活性化されていることを示している。一過性の剪断ストレス
は、ＥＲＫ経路も活性化されるが、ＪＮＫ経路およびＡＰ−１の活性化により部
分的に炎症遺伝子を活性化することができる。成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）
（肺内での反応性酸素（ＲＯＳ）の多量発生により特徴付けられる急性肺炎）の
新規治療法を開発する多くの努力にも関わらず、羅病患者の約５０％の致死率が
残っている。Polla, B.S., et al., Stress Proteins in Inflammation, in:Str
ess Inducible Cellular Responses, Feige, U., et al., Eds., Birkhauser Ve
rlag(1996) 。従って、ここに記載の新規ヒトセリン／スレオニンストレス−活
性化キナーゼシグナル伝達分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびこれをコード
する核酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は
、炎症、機能不全マクロファージ、機能不全内皮細胞および限定的ではないがア
テローム性動脈硬化症、喘息、アレルギー応答、ＡＲＤＳ、心不全、アテローム
を包含する関連炎症性疾病およびこれら関連障害に関連する病態生理学のコント
ロールのための診断および治療的に利用することができる特異的ターゲットとし
て重要な能力を有する。
【０１０６】 細胞の分化、増殖、成長停止またはアポト−シスは、適当なサイトカインおよ
びそのレセプターおよび相応する細胞シグナル伝達カスケードの存在に依存する
。ストレスキナーゼ経路は、形質転換のために重大な貢献をなすことが明らかで
ある。ｒａｓのｒａｆ−ＭＥＫ１−Ｅｒｋ１／２下流の位置決定の観点で、ＭＡ
Ｐキナーゼ経路中のシグナル伝達を阻害する抗増殖性生物学的作用は、例えば、
限定的ではないが、原癌性ｒａｓを隠し持つ腫瘍に適用可能な重大な治療能力を
有する。更に、ストレス経路キナーゼの活性化がモデル系中のＴＮＦのような試
剤でのアポト−シスの介在に密接に関係している。細胞生存の保持における細胞
内シグナリング経路の関わり合いに関する現象は、生存およびマイトジェンシグ
ナルが分離可能であり、これらシグナル間のバランスが形質転換された細胞の運
命の決定に鍵役割を演じることを示している。このバランスの動揺が選択的アポ
ト−シスを提供することをも示している。腫瘍細胞中のアポト−シス促進を達成
するためには、経路間の最適選択性を達成することが重要であろう。
【０１０７】 不幸にも、過去３０年間の多くの新薬の導入にも関わらず、抗腫瘍剤で治療さ
れた癌患者の治癒率および生存率に関して非常に緩慢な進歩が記録されているだ
けである。従って、より有効でより少ない毒性の新規化合物が必要になっている
。現在使用されている主要な抗腫瘍剤は、核酸の生合成またはそれらの細胞内機
能を妨害している。マイトジェンシグナル伝達を妨害することによる無制限成長
を阻害する化合物は、細胞毒薬剤としてよりも静細胞剤として作用することがで
きる。更に、細胞増殖の減衰は、屡々組織分化を起こさせることが明らかにされ
ている。最後に細胞中のマイトジェン刺激の遮断は、結果として細胞アポト−シ
スまたはプログラムされた細胞死を誘導することがありうる。従って、ここに記
載の新規ヒトセリン／スレオニンストレス−活性化キナーゼシグナル伝達分子（
ＳＥＱ ＩＤ の：３）およびそれをコードする核酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、癌および腫瘍細胞の増殖をコント
ロールする診断および治療で用いることのできる特異的ターゲットとしての重大
な能力を有する。
【０１０８】 ＭＡＰＫ経路の個々のメンバーの活性化は、種々のタイプの繊維芽細胞症の内
皮、血清、ＰＤＧＦおよびＴＧＦβへの応答で示されている。ＥＲＫ１およびＲ
ａｃのドミナントネガテイブは、例えばＴＧＦβ−刺激３Ｔ３繊維芽細胞中のコ
ラーゲンプロモーター／レポーター遺伝子の発現を阻害することで立証されてい
る。更に、星状肝臓細胞中では、例えばＲａｆおよびＪＮＫ経路が相互に作用し
て細胞増殖およびコラーゲン発現をコントロールする現象が明らかにされている
。そのいくつかが細胞中のＳＡＰＫｓを活性化することが知られている多くのサ
イトカインは、悪液質に関連している。従って、ここに記載の新規ヒトセリン／
スレオニンストレス−活性化キナーゼシグナル伝達分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）およびそれをコードしている核酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およ
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、限定的ではないが、病理的線維芽細胞症および悪
液質および線維芽細胞機能不全により証明される他の疾病を包含する線維芽細胞
機能不全のコントロールでの診断および治療において利用できる特異的ターゲッ
トとして重要な可能性を有する。
【０１０９】 血管の形成および再成形は、パラクリンシグナル（この多くはトランスメンブ
ランレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）の活性を結合および変調するタン
パク質リガンドである）によりコントロールされる。ＲＴＫシグナリングの基本
的観点は、分枝Ｒａｓ経路のリガンド依存性自己リン酸化（多くは線維芽細胞中
で実施される）および活性化の研究から得られている。結果は、大抵のＲＴＫｓ
が同様に細胞内シグナル伝達カスケード中に同様に結合され、細胞増殖を誘導す
ることができることを暗示している。Hanahan,D.,Signaling Vascular Morphoge
nesis and Maintenance,Science, 227:48(1997) 。血管内皮の脈管形成応答、内
皮細胞増殖は、吸気内酸素欠乏により誘発されることが明らかに示されている脈
管形成プロセスの最初のステップの一つである。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＥＧ
Ｆの全ては、ＨＵＶＥＣ細胞中のＭＡＰＫを無秩序化することが証明されている
。従って、ここに記載の新規ヒトセリン／スレオニンストレス−活性化キナーゼ
シグナル伝達分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびこれをコードする核酸配列
、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、脈管形成お
よび他の線維芽細胞機能不全の出現をコントロールする診断および治療で使用す
ることのできる特異的なターゲットとしての重要な可能性を有する。
【０１１０】 ストレス−活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫ）、ＥＲＫファミリーのメン
バーは、その場で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を包含する炎症性刺激により活性化
される。ＴＮＦは、肥満症に関連するインスリン抵抗の発症に関与していると信
じられている。ＴＮＦαへの培養細胞の露呈は、タイプＩＴＮＦαレセプターお
よび細胞内シグナリングメカニズムにより介在されると信じられているインスリ
ン抵抗を誘発する。ＴＮＦαがストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫｓ
）の活性化と密接に関連していることが明らかである観点から、ここに記載の新
規ヒトセリン／スレオニンストレス−活性化キナーゼシグナル伝達分子（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３）およびそれをコードする核酸配列、例えばＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、糖尿病およびこれに関連する疾病をコ
コントロールするために診断および治療で使用できる特異的ターゲットとしての
重要な可能性を有する。
【０１１１】 レプチンレセプターは、そのいくつかのメンバーがＳＡＰＫ経路中に供給され
ることが明らかにされているサイトカインレセプタースーパーファミリーに属す
る。レプチンにより利用される細胞内シグナリング経路および他のシグナリング
経路との「クロストーク」によりレプチンレセプターの調節のための可能性が、
肥満症の治療のための新規治療法の設計をもたらすと期待されている。従って、
ここに記載の新規ヒトセリン／スレオニンストレス−活性化キナーゼシグナル伝
達分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびそれをコードする核酸配列、例えばＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、肥満症およびそれに関
連する障害をコントロールするための診断および治療で使用することのできる特
異的ターゲットとしての重大な可能性を有する。
【０１１２】 特異的サイトゾル経路に必要である特異的シグナル伝達分子を変調または不活
性化する化合物は、一般に、下流生理学的応答を変調または減衰する可能性を得
るための重大な能力を有する。従って、ここに記載の本来のヒトストレス−活性
化セリン／スレオニンシグナル伝達キナーゼ分子の活性を変調する化合物をスク
リーニングする可能性は治療剤を開発するために非常に重要である。
【０１１３】 機能的構成 本発明のキナーゼに関するｃＤＮＡは、薬剤スクリーニング検定及び／又は生
体内での使用のために有用な組み換えタンパク質を提供するまたはこのキナーゼ
の生理学的役割の例としていくつかの発現ベクター中にサブクローニングされて
いる。発現研究は、哺乳動物細胞系中での構成性、誘導されたまたは組織特異性
発現系を用いて実施される。ここに記載の構成は、例えば哺乳動物細胞系、例え
ばＵ９３７または他の周知細胞系を、薬剤スクリーニング検定での使用のために
好適な組み換えタンパク質を提供するようにトランスフェクトするために用いら
れる態様例である。構成は、活性化刺激、シグナル伝達経路の同定、タンパク質
−タンパク質反応の同定、および至適薬剤候補の確認を包含するその生理学的役
割を特徴付けるための本発明の野生型及び／又はドミナントネガテイブキナーゼ
を過剰発現するように企図されている。
【０１１４】 新規キナーゼをコード化する核酸配列は、遺伝子機能の遺伝子ノックアウト研
究を得るためのツールを提供するためのアンチセンス方向での発現ベクター中に
サブクローニングすることができる。ここに記載の本来のシグナル伝達キナーゼ
分子の下流調節もアンチセンス発現を用いて企図されている。
【０１１５】 図７は、新規ヒトストレス活性化キナーゼに属する完全長核酸配列アンプリコ
ンを製造するために使用されるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーであるＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を開示している。新規シグナ
ル伝達キナーゼの核酸コード化領域を含有するシャトル構成が、下記のｐＣＲ２
.１ベクター（Invitrogen,Carlsbad,CA)中へのＰＣＲアンプリコン（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：８）のＴＡクローニングにより製造された。
【０１１６】 Ｎ−末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ｐＧＥＸ５ｘ
１，Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey を用いて製造された）
を発現するようにデザインされたＧＳＴ−キナーゼ融合発現ベクターは、ｐＣＲ
２.１ベクターからのシグナル伝達キナーゼｃＤＮＡをｐＧＥｘ５ｘ１ベクター
中にサブクローニングすることにより構成された。シグナル伝達キナーゼｃＤＮ
Ａは、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＩＣＲＩを用いる制限消化によりｐＣＲ２.１ベ
クターから摘出された。このフラグメントをゲル精製し、次いでｐＧＥＸ５ｘ１
中に挿入し、これをＲｃｏＲＩおよびＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて
消化させ、ゲル精製した。シグナル伝達キナーゼｃＤＮＡのｐＧＥＸ５ｘ１中へ
の挿入は、キメリックＥｃｏＩＣＲＩ：ＳｍａＩ部位を生じさせ、これはもはや
制限酵素によっては認識不能であった。連結されたＤＮＡをＤＨ５αコンピテン
トＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換させるために使用した（Life Technologies,Gait
hesburg,MD) 。形質転換され単離された単一Ｅ．Ｃｏｌｉコロニーを選択的媒体
（ＬＢブイヨン、カルベニシリン）中で、３７℃で一晩成長させ、引き続きプラ
スミドＤＮＡの製造のために使用した（Qiagen Plasmid DNA 調製キット）。ク
ローンをシーケンシングして（ABI PRISMTMDye Terminator Cycle sequencing o
n ABI PRISMTM377 automated sequencer) 、正しく挿入されたｃＤＮＡを同定し
た。正しくクローニングされた構成を選択し、発現のためのＢＬ２１コンピテン
トＥ．Ｃｏｌｉ細胞（Novages,Inc.) を形質転換させるために使用した。ＧＳＴ
／ヒトキナーゼ融合タンパク質の発現および精製は、後の例ＩＸに記載されてい
る。
【０１１７】 キナーゼ活性 キナーゼ活性検定を、新規シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３が機
能的キナーゼであることを証明するために使用した。組み換えＧＳＴ−ＴＥＮ１
を、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞中に発現させ、例ＩＸに記載のように
精製した。この組み換えキナーゼを例ＩＩに記載のように触媒活性に関して試験
した。図１１参照。ＧＳＴ−ＴＥＮ１キナーゼの代わりにＧＳＴを含有するレー
ンは、リン酸化を示しておらず、ＴＥＮ１の存在下でのリン酸化は、そのキナー
ゼ活性に依るのであり、共−精製された汚染物に依るのではないこと示している
。
【０１１８】 Ｈｉｓ6−Ｘｐｒｅｓｓエピトープタグ付き新規ヒトシグナル伝達キナーゼ哺
乳動物発現ベクターを構成するために、新規シグナルキナーゼプロテインコード
領域をＥｃｏＲＩ（５’）およびＥｃｏＩＲＩ（３’）を用いてｐＣＲ２.１構
造から摘出して、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣベクター（Invitrogen) 中にＥｃｏ
ＲＩ（５’）およびＥｃｏＲＶ（３’）部位で挿入した。ｐＣＲ２.１構成から
のＥｃｏＲＩＣＲＩ部位をｐｃＤＮＡ３.１ＨｉｓＣベクターからのＥｃｏＲＶ
部位と一緒にすると、平滑末端連結に基づき双方の部位が消失する。生じる構成
は、６ヒスチジン残基およびＸｐｒｅｓｓ抗体エピトープを新規キナーゼタンパ
ク質のＮ−末端に含有するエピトープタッグ付きキナーゼタンパク質をコード化
する。真核細胞中のエピトープタッグ付き新規シグナル伝達キナーゼの発現は、
新規キナーゼコード領域を含有する発現ベクターで一時的にまたは安定的に哺乳
動物細胞系をトランスフェクトすることにより行なわれる。例えば、例Ｘおよび
ＸＩ参照。形質転換された細胞は、特に候補化合物モジュレーターをスクリーニ
ングするためのキナーゼの源として役立つ。
【０１１９】 一般に認容できるベクター 本発明によれば、新規キナーゼ、ポリペプチドのフラグメント、融合タンパク
質またはその機能的均等物をコード化するポリヌクレオチド配列が、適当な宿主
細胞中でのシグナル伝達分子の発現を指令する組み換えＤＮＡ分子中で使用する
ことができる。遺伝子コードのインヒレントな縮重に基づき、実質的に同様なま
たは機能的に均等なアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列を、新規ヒトシ
グナル伝達キナーゼをクローニングおよび発現させるために使用することができ
る。当業者により理解できるように、非天然由来のコドンを有する新規キナーゼ
コード化ヌクレオチド配列を製造することが有利であり得る。
【０１２０】 シグナル伝達キナーゼ配列の有効な翻訳のために、特異的な開始シグナルも要
求されうる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が包含さ
れる。新規キナーゼ、その開始コドンおよび上流配列が適当な発現ベクター中に
挿入されている場合には、付加的な翻訳コントロールシグナルは必要でない。し
かしながら、コーデイング配列またはその一部のみが挿入されている場合には、
ＡＴＧ開始コドンを包含する外因性転写コントロールシグナルが提供されるべき
である。更に、完全な挿入の転写を確保するために、開始コドンが正しいリーデ
イングフレーム中に存在すべきである。外因性転写要素および開始コドンは、天
然および合成の双方の種々の起源のものであってよい。
【０１２１】 ここに記載の方法により得られたクローニングされたシグナル伝達キナーゼｃ
ＤＮＡは、分子クローニングにより、適当なプロモーターおよび他の適当な転写
調節要素を含有する発現ベクター中に組み換え発現させることができ、キナーゼ
ポリペプチドを生産するために原核生物または真核生物宿主細胞中に転移させる
ことができる。このような操作法は、Sambrook,J., et al., Molecular Cloning
Second Edition, Cold Spring Harbor Press(1990) に完全に記載されており、
文献に公知である。
【０１２２】 発現ベクターは、ここで、遺伝子のクローニングされたコピーの転写および適
当な宿主細胞中でのそのｍＲＮＡｓの翻訳のためのＤＮＡ配列として記載されて
いる。このようなベクターは、種々の宿主、例えば細菌、藍藻植物、植物細胞、
昆虫細胞、真菌細胞、ヒトおよび動物細胞中に核酸配列を発現させるために使用
することができる。特別にデザインされたベクターは、宿主間の、例えば細菌−
酵母、または細菌−動物細胞または細菌−真菌細胞または細菌−無脊椎動物細胞
のＤＮＡのシャトリングを許容する。
【０１２３】 種々の哺乳動物発現ベクターが、ここに記載の組み換えヒトキナーゼ分子を哺
乳動物細胞中で発現させるために使用することができる。組み換え発現のために
好適である市場で入手可能な哺乳動物発現ベクターには、限定的ではないが、次
のものが包含される：ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen)、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagen
e) 、ｐＸＴ１(Stratagene)、 ｐＳＧ５(Stratagene)、 ＥＢＯ-ｐＳＶ２-ｎｅ
ｏ(ATCC 37593)、ｐＢＰＶ-１(8-2)(ATCC 37110)、ｐｄＢＰＶ-ＭＭＴｎｅｏ(3
42-12)（ATCC 37224)、ｐＲＳＶｇｐｔ(ATCC 37199)、 ｐＲＳＶｎｅｏ(ATCC 37
198)、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ
３７４６０）および１ＺＤ３５（（ＡＴＣＣ ３７５６５）、ｐＬＸＩＮおよ
びｐＳＩＲ(CLONTECH)、ｐＩＲＥＳ-ＥＧＦＰ(CLONTECH) 。INVITROGEN 社は、
本発明で有効に使用できる広範囲な種々の市販の哺乳動物発現ベクター／系を提
供している。INVITROGEN,Carlsbad,CA 。PHARMINGEN Products ,vectors and s
ystems,CAも参照。
【０１２４】 生物学的活性タンパク質の高収率を得るために、本発明でバキュロウイルス発
現系を使用することもできる。ベクター、例えばＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＢａｃＰａ
ｋTMBaculovirus発現系およびプロトコルは、市場で有利に入手可能である。 C
LONTECH, Palo Alto, CA.Miller,L.K., et al., Curr. Op.Genet.Dev.3: 97(199
3); O'Reilly,D.R., et al., Baculovirus Expresion Vectors; A Laboratory M
anual, 127。ベクター、例えばINVITROGEN,MaxBacTMBaculovirus 発現系、昆虫
細胞およびプロトコルも、有利に市場で入手可能である。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ
，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ。
【０１２５】 宿主細胞の例 本発明のヒトキナーゼをコード化する核酸配列で形質転換された宿主細胞を、
細胞培養からのコード化タンパク質の発現および回収のために好適な条件下に培
養することができる。本発明の特に有利な態様は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：３に記載されているような配列を有するポリペプチドまたはその生物学的に活
性のフラグメントをコード化する核酸配列を有する精製されたポリヌクレオチド
で形質転換された宿主細胞である。このタイプの細胞またはこれらから製造され
た製剤は、新規ヒトシグナル伝達キナーゼ活性の薬物学的活性モジュレーターを
スクリーニングするために使用することができる。
【０１２６】 真核性物組み換え宿主細胞が特に有利である。その例には、限定的ではないが
、酵母、限定的ではないがヒト、牛、豚、サルおよび喫歯動物の細胞系を包含す
る哺乳動物細胞、および限定的ではないがショウジョウバエおよびカイコの細胞
系から誘導された細胞を包含する昆虫細胞が包含される。市場で入手可能な好適
である哺乳動物種から誘導された細胞系には、限定的ではないが、次のものが包
含される：Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１.３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １.２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａ
ｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ
−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５
１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（
ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）。
【０１２７】 発現ベクターは、限定的ではないが、形質転換、トファンスフェクシヨン、リ
ポフェクシヨン、プロトプラスト融合および電気穿孔を包含する多くの技術の任
意の一つを用いて、新規キナーゼを発現する宿主細胞中に導入することができる
。良好に特徴付けられたベクター、トランスフェクシヨン試薬および条件および
細胞培養物質を包含する非相同発現のために本発明で使用できる市場で入手可能
なキットは、良好に確立されており容易に入手可能である。CLONTECH,Palo Alto
, CA; INVITROGEN,Carlsbad, CA;PHARMINGEN,San Diego,CA; STRATAGENE, LaJol
la,CA 。発現ベクター含有細胞は、クローニングにより繁殖され、個々に分析さ
れて新規キナーゼタンパク質生産のレベルが測定される。新規キナーゼを発現さ
せる宿主細胞クローンの同定は、限定的ではないが、ここに記載の抗体との免疫
学的反応性及び／又は宿主細胞関連特異性キナーゼ活性の存在及び／又は新規キ
ナーゼに対する特異基質と２官能性交叉結合試薬ジスクシンイミジルスベラート
または類似交叉結合試薬とを共有的交叉結合する能力を包含するいくつかの手段
により実施することができる。
【０１２８】 本発明のシグナル伝達分子は、タンパク質精製を促進するように付加的なポリ
ペプチドドメイン１以上が添加されて有する組み換えタンパク質として発現させ
るることもできる。このような精製促進ドメインには、限定的ではないが、金属
キレート化ペプチド、例えば固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン
−トリプトファンモジュール（Porath,J., Protein Exp. Purif. 3:263(1992))
、固定されたイムノグロブリン上での精製を許容するプロテインＡドミナントお
よびＦＬＡＧＳ拡張／アフィニテイ精製系中で使用されるドメイン（Immunex Co
rp, Seattle WA) が包含される。分断可能なリンカー配列、例えば精製ドメイン
とＴＭＰとの間のファクターＸＡまたはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Die
go CA)の封入は、精製を促進するために有用である。
【０１２９】 本来の条件およびプロトコル下で、６ｘＨｉｓータグタンパク質を精製するた
めのＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＴＡＬＯＮTM非変性タンパク質精製キットのような系が
有利に市場で入手可能である。CLONTECH,Palo Alto,CA。
【０１３０】 加えて、宿主菌株は、挿入された配列の発現を変調し、または発現されたタン
パク質を所望の方式で処理することができるような能力を選択することができる
。このようなポリペプチドの変性には、限定的ではないが、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が包含される。タン
パク質の初期形を分断する翻訳後処理も、正しい挿入、フォールデイング及び／
又は機能のために重要でありうる。種々異なる宿主細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬ
ａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＨＥＫ２９３等は、このよ
うな翻訳後活性のための特別な細胞機能および特徴的メカニズムを有し、導入さ
れた異種タンパク質の正しい装飾および処理を確保するために選択することがで
きる。
【０１３１】 組み換えタンパク質の長期間高収率生産を得るためには、安定な発現が有利で
ある。例えば、安定に新規キナーゼ発現する細胞系は、複製のウイルス性起点ま
たは内因性発現要素および選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを
用いて形質転換することができる。このベクターの導入に引き続き、細胞は、そ
れが選択性培地に切り替えられる前に高栄養培地中で１〜２日成長させることが
できる。選択可能なマーカーの目的は、選択性に対する抵抗を与え、その存在は
導入された配列を好結果で発現させる細胞を成長および回復させる。安定に形質
転換された細胞の抵抗クランプは、このタイプの細胞に適切な組織培養法を用い
て増殖させることができる。
【０１３２】 ヒトキナーゼは、異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を意図するように
デザインされた発現ベクター中に至適ｃＤＮＡシストロンを挿入することに従っ
て、酵母Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で製造することができる。細胞内発現の場
合には、ベクター、例えばＥｍＢＬｙｅｘ４または類似物がベータサブユニット
シストロンに連結される。例えば、Rinas,U., et al., Biotechnology, 8:543(
1990); Horowitz,B., et al., J.Biol. Chem., 265:4189(1989) 参照。細胞外
発現のためには、キナーゼシストロンが任意の一連のウエル−特徴分泌シグナル
を使用することのできる酵母発現ベクター中に連結される。発現された新規キナ
ーゼのレベルは、ここに記載の検定により測定される。
【０１３３】 このタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いて
新規キナーゼの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、文献中に公
知である。例には、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が包含される。２個の非
干渉性エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる２部位モノクロ
ーナルベースイムノアッセイを使用することができる。周知の競合的結合技術を
使用することもできる。例えば、Hampton,R., et al.,(1990), Serological Met
hods -a Laboratory Manual, APS Press, St Paul Minn., Maddox, D.E., et al
., J.Exp. Med. 158:1211 参照。
【０１３４】 スクリーニング検定 本発明は、新規キナーゼポリペプチドをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡの発
現及び生体内でのシグナル伝達キナーゼポリペプチドの機能を変調する化合物を
スクリーニングするための方法にも関する。これらの活性を変調する化合物は、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または非タンパク性有機分子である。化
合物は、シグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡ
の発現またはその機能を増加または弱めることにより変調することができる。
【０１３５】 シグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡの発現
及びこのポリペプチドの機能を変調する化合物は、種々の検定により検出するこ
とができる。この検定は、発現または機能に変化があったか無いかを検査するた
めの単純な「イエス／ノー」検定であってよい。この検定は、テスト試料の発現
または機能を標準試料中の発現または機能のレベルと比較することにより定性的
に行うことができる。
【０１３６】 ここに記載のシグナル伝達キナーゼ、その免疫原性フラグメントまたはオリゴ
ペプチドは、任意の種々の薬剤スクリーニング法で治療化合物をスクリーニング
するために使用することができる。このようなテストで使用されるフラグメント
は、溶液中で遊離していてよく、固体に付着され、細胞表面上に担持され、また
は細胞内中に局在されていてよい。活性の廃止またはシグナル伝達キナーゼポリ
ペプチドと試験される試剤との間の結合コンプレックスの形成を測定することが
できる。従って、本発明はシグナル伝達キナーゼポリペプチドまたはそのフラグ
メントとの特異的結合親和性に関する複数の化合物のスクリーニングのための方
法を提供し、これは、複数の化合物を用意し；本発明のシグナル伝達キナーゼま
たはそのフラグメントを各々の複数の化合物と一緒にし、適当な条件下に結合す
るまでの充分な時間放置し；このキナーゼポリペプチドまたはそのフラグメント
が複数の各々の化合物へ結合することを検査し、この際、特異的にシグナル伝達
キナーゼポリペプチドを結合する化合物を同定することよりなる。
【０１３７】 シグナル伝達キナーゼポリペプチドの活性を変調する化合物を同定する方法は
一般に有利であり、これは、シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合物モジュレー
ターを実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような配列を有するシグナル伝
達キナーゼのポリペプチドと一緒にし、かつ、キナーゼ活性上へのこの候補化合
物モジュレーターの作用効果を測定することよりなる。
【０１３８】 シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化合物を同定する方法は、シグナル伝
達キナーゼ活性の候補化合物モジュレーターを、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３に記載のような配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子のポリペプチドを発現
させる宿主細胞と一緒にし、かつこのキナーゼ活性上への候補化合物モジュレー
ターの作用効果を測定することよりなる。
【０１３９】 このキナーゼの阻害剤に関する有利な細胞検定は、２つの一般的カテゴリーに
入る：１）キナーゼ活性の直接測定及び２）シグナリングカスケード中の下流現
象の測定である。これらの方法は、内因性キナーゼまたは過剰発現された組み換
えキナーゼを使用することができる。
【０１４０】 シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合物モジュレーターを実質的にＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３に記載されているような配列を有するシグナル伝達キナーゼのポリ
ペプチドと一緒にし、かつ生物学的活性上へのこの候補化合物モジュレーターの
作用効果を測定することよりなる、シグナル伝達キナーゼの生物学的活性を変調
する化合物の同定法が一般に有利である。シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合
物モジュレーターを実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されているような配
列を有するシグナル伝達キナーゼのポリペプチドと一緒にし、かつ生物学的活性
上へのこの候補化合物モジュレーターの作用効果を測定することよりなる、シグ
ナル伝達キナーゼの薬物学的活性を変調する化合物の同定法も有利である。
【０１４１】 シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合物モジュレーターを実質的にＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３に記載されているような配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子の
ポリペプチドを発現させる宿主細胞と一緒にし、かつ生物学的活性上へのこの候
補化合物モジュレーターの作用効果を測定することよりなる、シグナル伝達キナ
ーゼの活性を変調する化合物の同定法が特に有利である。シグナル伝達キナーゼ
活性の候補化合物モジュレーターを実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載され
ているような配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子のポリペプチドを発現させ
る宿主細胞と一緒にし、かつ生物学的活性上へのこの候補化合物モジュレーター
の作用効果を測定することよりなる、シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化
合物の同定法も特に有利である。
【０１４２】 ここに記載され、意図され、かつ関連されている方法に従って一般に同定され
、実質的にＳＥＱＩＤ ＮＯ：３に記載されているような配列のシグナル伝達分
子の生物学的及び／又は薬剤学的活性を変調する化合物は、本発明の特に有利な
１態様である。
【０１４３】 本発明の殊に有利な１態様は、ここに記載の、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
のヒトシグナル伝達分子により介在される症状の治療が必要であるような患者の
治療法であり、これは、ここに意図されている方法で薬物学的ターゲットとして
実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のよ
うな配列を用いて同定されるヒトシグナル伝達を変調する化合物を治療上有効量
で適用することよりなる。
【０１４４】 キナーゼの細胞活性を測定するために、その源は、標準プロテアーゼの存在に
おける１〜３凍結−解凍サイクルで製造された総細胞リゼートであってよい。こ
のキナーゼは、標準タンパク質精製法により部分的にまたは完全に精製されてい
てもよい。最後に、このキナーゼは、ここに記載のＣ末端調節ドメインに関する
特異的な抗体を用いる親和性クロマトグラフィにより、または更にここに記載の
組み換えキナーゼ中へ設計されたエピトープタグに関して特異的なリガンドによ
り精製することができる。次いで、このキナーゼ調製物は、例えば、例ＩＩに記
載のように活性に関して検定することができる。
【０１４５】 Reuter et al. (1995) のプロトコルに基づくフィルター検定も、ここに記載
の新規キナーゼの活性を変調する化合物をスクリーニングするために使用され：
ＭＢＰコーテイングされた９６−ウエル フラッシュプレート(R)(ＮＥＮ(TM)Li
fe Science Product）を用いて開始して、反応緩衝液（３×キナーゼ反応緩衝液
（ＫＲＢ）は；６０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.５）、３０ｍＭ酢酸マグネシウム
、０.１５ｍＭＡＴＰ、３ｍＭＤＴＴ、０.０３ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム
を含有する）を添加し、ヒトキナーゼの１μｇ／ｍｌより大きくない濃度（ヒト
キナーゼの１時間にわたる動的測定を許容する濃度を、個々の酵素調製物の滴定
により測定）で、［γ35Ｐ］−ＡＴＰ０.２５μＣｉを各ウエルに添加し、テス
ト化合物１０μＭの存在または不存在下に、３０℃で１時間インキュベートする
。総反応量は１００μｌである。８０ｍＭの最終濃度までＥＤＴＡ（ｐＨ７.０
）を添加することにより反応を停止させる。サンプルを遠心分離し、上澄みの５
０μｌをｐ８１カチオン−交換濾紙（Whatman,No.3698915）上に点滴した。次い
で、濾紙を１８０ｍＭＨ3ＰＯ4 ２００ｍｌ中で３回（各回５〜１０分）及び９
６％エタノール２００ｍｌ中で１回洗浄する。濾紙を空気乾燥した後に、シンチ
レーシヨンカウンター中でのクレノフカウンテイングにより放射能を測定する。
１０μＭでキナーゼ活性を≧５０％を阻害する化合物は、シンチレーシヨンカウ
ントで＞５０％減少で示される。ＩＣ50（または比較のための文献中に周知の他
の標準量）を測定するための阻害化合物の滴定により、およびこの検定での他の
キナーゼの置換により、特異性及び選択性研究を行う。例えば、類似の方法で発
現され、かつ単離され、類似の条件下に検定される組み換えＳＯＫ−１及び／又
はｍｓｔ−３と比較したこのキナーゼの相対的阻害活性の測定は、選択的データ
を提供する。Reuter,C,W.M.,Catling, A.D. and Weber,M.J., Immune Complex K
inase Asseys for Mitogen-Activated Protein Kinase and MEK, Methods In En
zymology, 255:245 (1995).。例ＶＩ及びＶＩＩ参照。
【０１４６】 ヒト腫瘍成長を抑制する他の候補試剤の能力を評価するために、ヒト腫瘍細胞
をＳＣＩＤマウス(severe combined Immunodeficiency)中に注入して明瞭な腫瘍
塊を形成させる。腫瘍成長を抑制する候補試剤の作用効果は、次の様にして測定
することができる。ＣＣＬ２２１細胞系（ＡＴＣＣ、Rockville、Md）の細胞約１
×１０7、ヒトｒａｓ−依存結腸悪性腺癌細胞系をＤＭＥＭ１００μｌ中に懸濁
させ、ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射してマウス１匹当たり２個の腫瘍を形成させ
る。ＳＣＩＤマウスは、ＣＣＬ２２１細胞を与え、腫瘍を処置せずに７日間成長
させ：７日（０日）目に腫瘍最大直径及び動物体重を記録し、かつマウスの平均
腫瘍寸法を測定する。１日目に（腫瘍細胞注入の後８日）に、候補試剤またはベ
ヒクルのみでのマウスの処置を開始する。マウスの１群（対照）には、腹腔内に
ベヒクル０.２ｍｌを、第２群のマウスには試剤を腹腔内適用する。マウスの別
群で試剤の種々の用量を試験することができる。７日目及び１４日目に動物体重
及び最大腫瘍直径を測定する。０日、７日及び１４日の各群の平均最大腫瘍寸法
を１４日と比較し、高用量の動物で引き続き試剤が腫瘍成長の用量依存性抑制を
起こすかどうかを測定した。毒性効果は、マウス体重の選別及び組織染色のため
の動物の肺、肝臓及び脾臓の採取により試験することができる。
【０１４７】 一般にここに記載及び参照されている方法に従って同定され、実質的にＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３に記載されるような配列よりなるヒトシグナル伝達キナーゼの
活性を変調する化合物が本発明の特に有利な態様である。
【０１４８】 本発明の殊に有利な１態様は、ここに記載のヒトシグナル伝達キナーゼにより
介在される症状の治療が必要であるような患者の治療のための方法であり、これ
は、ヒトシグナル伝達キナーゼ変調化合物を治療上有効な量で適用することより
なる。
【０１４９】 酵母２−ハイブリッド系 本発明のもう一つの態様では、実質的にＳＥＱＩＤ ＮＯ：３に記載されるよ
うなヒトシグナル伝達キナーゼ分子をコード化する核酸配列またはその生物学的
に活性なフラグメントを非相同配列にリゲートさせて融合タンパク質をコード化
することができる。例えば、生物学的活性の変調のための化合物をスクリーニン
グするために、異種宿主細胞中に発現するためのここに記載の様なキメラキナー
ゼ分子をコード化することが有用であり得る。キメラ構造は、ここに記載の新規
ヒトシグナル伝達キナーゼ分子と関連しうる補助的本来ペプチドを同定するため
に、酵母２−ハイブリッド系を用いる周知の方法に従って”ｂａｉｔ”を発現さ
せるために使用することもできる。Fields,S.,et al., Trends Genet., 10:286(
1994) ;Allen,J.B.,et al., TIBS., 20:511(1995) 。酵母２−ハイブリッド系が
記載されており、ここでは、タンパク質：タンパク質相互反応が転写アクチベー
タの再構成を介する酵母−ベース遺伝学的アッセイを用いて検出することができ
る。Fields,S., Song, O., Nature 340:245(1989) 。この２−ハイブリッド系は
、１対の相互作用タンパク質の転写活性化ドメインをＤＮＡ−結合部位に密に接
近させる能力（これは隣接レポーター遺伝子の発現を調節する）を用いている。
本発明では、市場で入手できる系、例えばＣＬＯＮＴＥＣＨ，MatchmakerTMsyst
ems およびプロトコルを使用することができる。 ＣＬＯＮＴＥＣＨ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ．Mendelsohn,A.R.,Brent,R.,Curr.Op. Biotech.,5:482(1994)
; Phizicky.E.M.,Fields,S.,Microbiological Rev.,59(1):94(1995); Yang,M.,
et al., Nucleic Acids Res., 23(7):1152(1995); Fields,S., Sternglanz,R, T
IG, 10(8):286(1994); およびＵＳ特許５２８３１７，System to Detect Protei
n-Protein Interactions および同５４６８６１４も参照（これらは、ここに参
考文献として編入されている）。
【０１５０】 抗体 本発明のシグナル伝達キナーゼポリペプチドに対する単一特異性抗体は、この
ポリペプチドに対して反応性の抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製されるか
、またはシグナル伝達キナーゼポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体とし
て、Kohler and Milstein,Nature, 256:495(1975) の技術を用いて製造される。
ここで用いられているような単一特異性抗体は、新規シグナル伝達キナーゼに関
する均一結合特徴を有する単一抗体種または複抗体種として定義される。ここで
使用されているような均一結合は、特定の抗原またはエピトープ、例えば新規シ
グナル伝達キナーゼと記載のように関連しているものに結合する抗体種の能力を
指す。動物、例えばマウス、ラッテ、モルモット、ウサギ、山羊、馬等を適当な
濃度のヒトシグナルキナーゼを有し、ヒトアジュバントを有するまたは有しない
ウサギで免疫化することにより、新規シグナル伝達キナーゼ特異性抗体が生じさ
せられる。
【０１５１】 前免疫血清を第１免疫化の前に集める。各動物に受け入れ可能な免疫アジュバ
ントと関連するシグナル伝達キナーゼポリペプチド約０.１ｍｇ〜約１０００ｍ
ｇを与える。このような認容できる可能なアジュバントには、限定的ではないが
、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿物、コリネバクテリウム
・パルブムおよびｔＲＮＡを含有する油中水エマルジヨンが包含される。初免疫
化は、腹腔（ＳＣ）、皮下（ＩＰ）の一方または双方の複数部位での有利にフロ
イント完全アジュバント中のシグナル伝達キナーゼポリペプチドよりなる。抗体
力価を測定するために各動物を規則的間隔で、有利に１週間間隔で採血する。動
物は初免疫化の後にブースター注入をしてもしなくてもよい。ブースター注入を
受けている動物に、同じルートで、一般に、フロイント不完全アジュバント中の
同量の抗原を与える。ブースター注入を約３週間間隔で最大力価が得られるまで
与える。各ブースター免疫化の後約７日または単一免疫化の後、約１週間毎に動
物から採血し、血清を集め、アリコートを約２０℃で貯蔵する。
【０１５２】 シグナル伝達キナーゼポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）
は、同血統マウス、有利にＢａｌｂ／ｃをシグナル伝達ポリペプチドで免疫化さ
せることにより製造される。このマウスを、ＩＰまたはＳＣルートで、前記のよ
うな同量の認容できるアジュバント中に導入された緩衝液または食塩水約１.５
ｍｌ中のシグナル伝達キナーゼポリペプチド約０.１〜約１０ｍｇ、有利に約１
ｍｇを用いて免疫化させる。フロイント完全アジュバントが有利である。マウス
は０日に初免疫化させ、約３〜約３０週間休養させる。免疫化されたマウスに静
注（ＩＶ）ルートで、緩衝液、例えばリン酸塩緩衝食塩液中のシグナル伝達キナ
ーゼポリペプチド約０.１〜約１０ｍｇのブースター免疫化１回以上を行う。抗
体ポジチブマウスからのリンパ球、有利に脾臓リンパ球は、免疫化されたマウス
から文献に記載の標準法で脾臓を取りだすことにより得られる。ハイブリドーマ
細胞は、安定なハイブリドーマの形成を許す条件下に、脾臓リンパ球を、適当な
融合パートナー、有利にミエリン細胞と混合することにより製造される。融合パ
ートナーには、限定的ではないが、マウスミエリンＰ３／ＮＳＩ／Ａｇ４−１；
ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４ＰおよびＳｐ２／０が包含され、Ｓｐ２／０が有利で
ある。抗体生成細胞およびミエリン細胞を約１０００の分子量のポリエチレング
リコール中で、約３０〜約５０％の濃度で融合させる。融合されたハイブリドー
マ細胞を、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたデウルベ
ッコス変性イーグルス媒体（ＤＭＥＭ）中での文献中に公知の方法での成長によ
り選択される。約１４日、１８日および２１日に成長ポジチブウエルから上澄液
を集め、イムノアッセイ、例えば抗原としてのヒトシグナル伝達キナーゼポリペ
プチドを用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）により、抗体生成に関
してスクリーニングをする。培養液をｍＡｂのアイソタイプを測定するためにオ
クタロニー沈殿検定でも試験する。抗体ポジチブウエルからのハイブリドーマ細
胞をMacPherson のソフト寒天法のような技術でクローニングさせる。Soft Ager
Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications,Kruse and Paters
on, Eds.,Academic Press, 1973。
【０１５３】 モノクローナル抗体は、プリスタンプライムドＢａｌｂ／ｃマウスに、初回免
疫化の後約４日に約２×１０6〜約６×１０6ハイブリドーマ細胞をマウス１匹当
たり０.５ｍｌを注入することにより、生体内で生成される。細胞転移の後約８
〜１２日に腹水を集め、このモノクローナル抗体を文献に公知の方法で精製する
。
【０１５４】 抗ヒトキナーゼポリペプチドｍＡｂの試験管内生産は、ハイブリドーマを牛胎
児血清約２％を含有するＤＭＥＭ中で成長させて、充分な量の特異性ｍＡｂを得
ることにより実施される。このｍＡｂは文献に公知の方法で精製される。
【０１５５】 診断検定 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定的ではないが、沈殿、受
動凝集、固体酵素疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオアムノアッセイ（ＲＩＡ
）法を包含する種々の血清学的または免疫学的検定により測定される。体液また
は組織および細胞抽出物中の新規シグナル伝達キナーゼポリペプチドの存在を検
出するために、類似の診断的検定が使用される。
【０１５６】 ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチド特異性抗体を用いる診断検定は、シグ
ナル伝達キナーゼポリペプチドの異常発現または異常細胞成長と関連している遺
伝子の発現により特徴付けられる症状、障害または疾病の診断のために有用であ
る。本発明のシグナル伝達キナーゼポリペプチドの診断検定には、ヒト体液、細
胞、組織またはそのような組織の部分または抽出物中のヒトキナーゼポリペプチ
ドを検出する抗体およびラベルを用いる方法を包含する。本発明のポリペプチド
および抗体は、修飾してまたはしないで用いることができる。屡々、ポリペプチ
ドおよび抗体は、それらを共有的または非共有的に、文献に周知の無数のリポー
ター分子のひとつと一緒にすることによりラベルされる。
【０１５７】 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル
抗体を用いてキナーゼポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが文献中
に公知である。その例には、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が包含される。
ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに対して反
応性のモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナルベース免疫検定が有利
であるが、競合結合検定も使用できる。これらの検定は、特に次の文献に記載さ
れている：Maddox,D.E.et al., J.Exp.Med.158:1211( 1983);Sites,D.P., et al
., Basic and Clinical Immunology, Ch. 22,4th Ed.,Lange Medical Publicati
ons, Los Altos, C A.(1982); U.S. Patents No. 3654090, No. 3850752; およ
び No. 4016043 。
【０１５８】 これらの疾患の診断のための基礎を提供するために、ヒトシグナル伝達キナー
ゼポリペプチド発現の正常または標準値を確立すべきである。これは、動物また
はヒトの正常検体から取られた体液または細胞抽出物を、文献に周知のコンプレ
ックス形成に好適な条件下に、ヒトキナーゼポリペプチドに対する抗体と一緒に
することにより遂行される。標準コンプレックス形成の量は、これと陽性対照の
一連の希釈と比較することにより定量することができ、ここでは、既知量の抗体
を既知濃度の精製ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドと一緒にする。次いで
、正常試料から得られた標準値を、ヒトキナーゼポリペプチド発現に関連してい
る障害または疾病に羅病している被検者からの試料から得られた値と比較するこ
とができる。標準と被験者値の間の差が疾病状態の存在を立証する。
【０１５９】 ヒトストレス活性化シグナル伝達キナーゼ核酸、キナーゼポリペプチドに対す
る抗体またはタンパク質を含有するキットを製造することができる。このような
キットは、キナーゼ核酸にハイブリダイジングする異種核酸を検出するため、ま
たは試料中のタンパク質またはペプチドフラグメントの存在を検出するために使
用される。このような特徴付けは、限定的ではないが、法医学的分析および疫学
的研究を包含する種々の目的のために有用である。
【０１６０】 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組み換えタンパク質および抗体は、新規キ
ナーゼＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質をスクリーニングまたは濃度測定のため
に使用することができる。組み換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および
抗体は、それら自体、ヒトシグナル伝達キナーゼの検出および型分けのために好
適なキットの形成のために役立つ。このようなキットは、少なくとも１つのコン
テナー中に閉じこめて保持するために好適な区画付けされたキャリアを含有しう
る。更にこのキャリアは、試薬、例えば新規キナーゼを検出するのに好適な組み
換えヒトキナーゼまたは抗キナーゼ抗体を含有する。このキャリアは、検出用の
手段、例えばラベルされた抗原または酵素基質または類似物を含有していてもよ
い。
【０１６１】 新規キナーゼをコード化するポリヌクレオチド配列は、新規ヒトストレス活性
化キナーゼの発現と関連している症状または疾病の診断のために使用できる。例
えば、シグナル伝達分子をコード化するポリペプチド配列は、キナーゼの発現を
検査するための生体組織検査からの液体または組織のハイブリダイゼーシヨンま
たはＰＣＲ検定で使用されうる。定性または定量的方法の形には、サザンまたは
ノーザン分析、ドットブロットまたは他の膜ベース法；ＰＣＲ法；デイップステ
イック、ピン、チップおよびＥＬＩＳＡ法を包含することができる。これらの全
ての技術は文献中に公知であり、多くの市場で入手しうる診断キットの基礎であ
る。このような検定は、動物研究、臨床試験または個々の患者の治療のモニタリ
ングでの特別な治療体制の効果を評価するためにも使用できる。疾病が確認され
れば、治療薬剤が適用され、治療プロフィルが得られる。このような検定は、こ
のプロフィルにおける値が正常にまたは標準パターンの方向に進行または回復し
ているか否かを評価するために規則的ベースで繰り返すことができる。連続的治
療プロフィルを、数日間または数週間にわたる治療の効果を示すために使用する
ことができる。
【０１６２】 新規キナーゼをコード化するポリヌクレオチド配列も染色体位置をマッピング
する分析、例えば疾病マーカーとの機能関連に関するスクリーニングで使用する
こともできる。更に、ここに記載の配列は、ヒト配列多形成および疾病との可能
な関連性を同定するための使用、および生物学的活性を変調する化合物のデザイ
ンのための可能な多形成性配列から至適配列を選択するための分析のために企画
されている。更に、この配列は、治療的臨床試験のための適当な被検者および患
者の同定で使用するためのスクリーニングツールとして企画されている。
【０１６３】 アフィニテイカラムを介しての精製 抗体を製造するための方法はヒトキナーゼポリペプチドフラグメントまたは完
全長さの新生ヒトキナーゼポリペプチドに関して特異的な抗体を製造するために
使用することができることは当業者にとっては容易に明らかである。殊に、当業
者にとっては、完全機能レセプターまたはそのフラグメントに関して特異的であ
る抗体が発生されうることは容易に明らかである。
【０１６４】 抗体を、Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Biorad)、抗体がアガロ−スゲルビーズサポ
−トと共有連鎖を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルで活性
化されているゲルサポートに添加することにより、キナーゼポリペプチド抗体ア
フィニテイカラムを製造する。次いで、この抗体をスペーサーアームを有するア
ミド結合を介してゲルに結合させる。次いで、残っている活性化されたエステル
を１ＭエタノールアミンＨＣｌ（pH８）で急冷させる。カラムを水、次いで０.
２３ＭグリシンＨＣｌ（pH２.６）で洗浄して、共有結合しなかった抗体または
外来タンパク質を除去する。次いで、このカラムを適当な界面活性剤を有する燐
酸緩衝食塩水（pH７.３）中でで平衡化させ、かつ、適当な膜溶解化界面活性剤
を用いて製造されたヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドを含有する細胞培養
上澄みまたは細胞抽出物を、このカラムにゆっくり通す。次いで、このカラムを
、光学密度がバックグラウンドに低下するまでリン酸塩緩衝食塩水／界面活性剤
で洗浄し、次いでタンパク質を０.２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（pH２.６）／界面活
性剤で溶離させる。次いで、精製されたヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチド
を、燐酸塩緩衝食塩水／界面活性剤に対して透析させる。
【０１６５】 組み換えキナーゼ分子は、完全長新生ヒトキナーゼポリペプチドまたはこのキ
ナーゼのポリペプチドフラグメントに関して特異的なモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体で製造された免疫アフィニテイカラムを用いて他の細胞タンパク
質から分離することができる。
【０１６６】 ここに記載のヒトキナーゼポリペプチドは、本来の生物学的物質、例えば疾病
組織からの生物学的エフェクターをアフィニテイ精製するために使用することが
できる。アフィニテイクロマトグラフィ法は、当業者に周知である。ここに記載
のヒトシグナル伝達キナーゼペプチドまたはその有効フラグメントは、固体マト
リックス、例えば供給者（Pharmacia,Pisctaway,NJ) のプロトコルに従ってＣＮ
Ｂｒ活性化されたセファロースに固定され、かつ当該の可能な分子を含有するホ
モジナイズド／緩衝細胞溶液がこのカラムに通される。洗浄の後に、このカラム
は生物学的エフェクターのみを保留し、これは、引き続き、例えば０.５Ｍ酢酸
またはＮａＣｌ勾配溶液を用いて溶離される。
【０１６７】 アンチセンス分子 ここで供給されるｃＤＮＡ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、アンチセンス構成
を用いて内因性遺伝子をノッキングアウトすることにより、細胞、殊に造血組織
の細胞中の新規ヒトシグナル伝達キナーゼの生理学的関係を研究するための本発
明のもう一つの態様で使用することができる。
【０１６８】 １２−２１ヌクレオチドのオリゴマー、特に１２−１８ヌクレオチドのオリゴ
マーは、本発明の実際においては最も有利である。オリゴは原則的に転写の翻訳
を阻害するために有効であり、この中に記載された作用を誘導させることが可能
である。翻訳は、この開始コドンの部位で、またはその近くでｍＲＮＡをブロッ
キングすることにより最も有効に阻害される。従って、ヒトキナーゼｍＲＮＡ転
写産物の５’−末端領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドが有利である。ハ
イブリダイゼーシヨンを干渉することのできる第二および第三の構造は、この領
域中では最小である。更に、開始部位から３’方向で離れすぎている配列は、「
リードスルー」現象（この際、リボソームがこのメッセージの翻訳を許容するた
めにアンチセンス／センス二重鎖を解くらしい）の故に、ｍＲＮＡ転写産物のハ
イブリダイジングでは有効性が低い。新規ヒトシグナル伝達キナーゼｍＲＮＡの
任意の位置と相補的またはそれとハイブリダイズ可能であるオリゴヌクレオチド
が、治療用途に期待されている。
【０１６９】 ここで参照として、Ｕ.Ｓ.特許Ｎｏ．５６３９５９５（Identification of No
vel Drugs and Reagents, １９９７年６月１７日発行）（ここに、生体内で活性
を示すオリゴヌクレオチド配列を同定する方法が充分に記載されている）を示す
。予め既知のポリペプチドから誘導されたランダムオリゴヌクレオチド配列を有
する発現ベクターを細胞内に形質転換／形質導入させる。次いで、この細胞をこ
のオリゴヌクレオチドの所望の活性から生じる表現型に関して検定する。所望の
表現型を有する細胞が同定されたら、この所望活性を有するオリゴヌクレオチド
の配列が同定できる。同定は、ベクターの再生またはポリメラーゼチェーンリア
クシヨン（ＰＣＲ）増幅および挿入された核酸物質を含有する領域をシーケンシ
ングすることにより達成することができる。
【０１７０】 ポリヌクレオチド配列をコード化する新規シグナル伝達キナーゼポリペプチド
に対して相補的であるヌクレオチド配列は、アンチセンス治療のために合成する
ことができる。これらのアンチセンス分子は、DＮＡ、ＤＮＡの安定誘導体、例
えばホスホロチオエートまたはメチルホスホネート、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定誘導
体、例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡまたは他のオリゴヌクレオチドミメテイク
スであってよい。参考のために、生理学的に安定なアンチセンス分子の合成およ
び作用効果を記載しているＵＳ特許Ｎｏ．５６５２３５５（Hybrid Oligonucleo
tide Phosphorothioates, １９９７年７月２９日発行）およびＵＳ特許Ｎｏ．
５６５２３５６（Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides, １９９７
年７月２９日発行）を示す。シグナル伝達キナーゼアンチセンス分子は、マイク
ロインジェクシヨン、リポソームカプセル化によりまたはアンチセンス配列を潜
有しているベクターからの発現により細胞中に導入することができる。アンチセ
ンス治療は、特に、シグナル伝達キナーゼ活性を低減することが有利である疾病
の治療のために有用でありうる。
【０１７１】 遺伝子治療 ここに記載のヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドは、遺伝子治療により対
象に適用することができる。更に、本発明のポリペプチドは、このようにしてタ
ーゲット臓器の細胞に引き渡すことができる。逆に、シグナル伝達キナーゼポリ
ペプチドアンチセンス遺伝子治療を、ターゲット臓器の細胞中のこのポリペプチ
ドの発現を減少させるために使用することができる。このヒトシグナル伝達キナ
ーゼポリペプチドコード領域は、受容体宿主細胞の感染によりこのキナーゼポリ
ペプチドＤＮＡの転移を介在するウイルスベクター中にリゲートさせることがで
きる。好適なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が包
含される。例えば、ＵＳ特許Ｎｏ．５６２４８２０（Episomal Expression Vect
or for Human Gene Therapy, １９９７年４月２９日発行）参照。本発明の核酸
コード領域は、有効な真核細胞発現ベクター中に導入され、これが遺伝子治療用
の体細胞中に直接適用または導入される（コード領域を有する核酸フラグメント
、有利にｍＲＮＡ転写産物は体細胞中に直接適用または導入することができる）
。例えば、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５５８９４６６（１９９６年１２月３１日発行）
参照。このような核酸およびベクターは、エピソームで残ることができるか、ま
たは宿主染色体ＤＮＡ中に、プロウイルとしてまたはその部分（それには、遺伝
子融合および適当な真核生物転写および翻訳シグナル、即ち、転写開始部位に対
して有効な位置のＲＮＡポリメラーゼプロモーター５’および遺伝子融合のＡＴ
Ｇ翻訳開始コドンおよび終止コドンおよびコード領域に対して有効に３’位置の
転写産物ポリアデニル化シグナルを包含する）として導入することができる。こ
のヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡコンジュ
ゲートまたはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲート、リポフェクシ
ヨン膜融合または直接的マイクロインジェクシヨンを用いるレセプター介在ター
ゲットＤＮＡ移入を包含する非ウイルス的方法による遺伝子治療のために細胞中
に移入させることもできる。これらの方法およびその変法は、この分野で確立さ
れた方法に従がう生体外/生体内および生体内ヒトシグナル伝達キナーゼポリペ
プチド遺伝子治療のために好適である。
【０１７２】 ＰＣＲ診断学 新規シグナル伝達キナーゼ分子の発現レベルを検出するために、核酸配列、そ
のオリゴヌクレオチド、フラグメント、その部分またはアンチセンス分子が体液
または生体組織検査組織の診断検定で使用することができる。例えば、ｃＤＮＡ
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からデザインされた配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：２中に含まれる配列が、患者中のｍＲＮＡ転写産物の存在を検出するため、ま
たは治療の間の転写産物の変調をモニターするために使用することができる。
【０１７３】 ターゲット核酸の増幅またはハイブリダイゼーシヨンアッセイによる後者の分
析の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＰＣＲ法として公知である
。このＰＣＲ法は、それぞれ相互に離され、遺伝子配列、即ち前記のＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる容疑試料中の本発
明の配列の検出のために適用することができる。このプライマーは、二本鎖ＤＮ
Ａ分子の対向鎖に対して相補的であり、典型的に約５０〜４５０ヌクレオチド以
上（通常は２０００ヌクレオチドを越えない）で分離されている。この方法は、
必然的に、特異的オリゴヌクレオチドプライマーの製造、引き続くプライマース
ペーシングに基づく期待長さのＤＮＡフラグメントを得るためのターゲットＤＮ
Ａ変性の繰り返しサイクル、プライマー結合およびＤＮＡポリメラーゼでの拡張
の繰り返しサイクルをその内容とする。本発明の態様の１例は、実質的にＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２に記載のような配列を有するポリヌクレオチド配列の同定のた
めの、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に記載の
ようなＰＣＲプライマーを有する診断組成物である。ターゲット配列の増幅の度
合いは、実行されるサイクルの数によりコントロールされ、理論的には、単純な
式： ２ｎ （ここで、ｎはサイクルの数である）により計算される。例えば、
Perkin Elmer ,PCR Bibliography,Roche Molecular Systems, Branchburg, New
Jersey; CLONTECH produts , Palo Alto, CA; U.S. Patent No. 5629158, Soli
d Phase Diagnosis of Medical Conditions, １９９７年５月１３日発行。実施
例ＶＩＩＩ参照。
【０１７４】 組成物 新規ヒトキナーゼポリペプチドＤＮＡ、ヒトキナーゼポリペプチドＲＮＡ、ア
ンチセンス配列またはヒトキナーゼポリペプチドまたはヒトキナーゼ活性または
その活性を変調する変体または類縁体を含有する薬剤学的に有用な組成物は、公
知方法に従い、例えば薬剤学的に認容しうる担持剤との混合により処方すること
ができる。このような担持剤および処方の例は、Remington's Pharmaceutical S
ciences( Maack Publishing Co,Easton, PA) 中に見出すことができる。有効な
適用のために好適な薬剤学的に認容しうる組成物を形成するために、このような
組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ またはモジュレーターを含有
しうる。
【０１７５】 本発明の治療または診断組成物は、ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチド関
連疾病を治療または診断するために充分な量で個々に適用される。この有効量は
、種々の要因、例えば個々の症状、体重、性および年齢に従って変動することが
できる。
【０１７６】 「化学的誘導体」なる用語は、通常は、この基本分子の一部ではない付加的な
化学的原子団を含有する分子を記載している。このような原子団は、基本分子の
溶解性、半減時間、吸収などを改善することができる。この原子団はこの基本分
子の不所望な副作用を減少させ、基本分子の毒性を低下させることもできる。こ
のような原子団の例は、種々のテキスト、例えばRemington's Pharmaceutical S
ciences に記載されている。
【０１７７】 本発明で使用するために好適な薬剤学的組成物には、その中に活性成分が所定
の目的を達成するのに充分な量で含有されている組成物が包含される。有効量の
決定は、当業者により周知の範囲内にある。この治療に有効な用量は、先ず、例
えば悪性細胞のまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌまたはブタ中で
の細胞培養検定で判断することができる。動物モデルは、所望の濃度範囲または
適用の経路を得るためにも使用される。従って、このような情報は、ヒトにおけ
る有用な用量または適用経路の決定のために使用することができる。治療上有効
な用量は、タンパク質またはその抗体、拮抗剤または症候群または症状を改善す
る阻害剤の量に関連する。正確な用量は個々の内科医により治療すべき患者を見
て選択される。
【０１７８】 ここに記載の方法に従って同定された化合物は、シグナル伝達キナーゼの至適
変調および潜在毒性を最小にしてその活性を得るための慣用の試験により決定さ
れた適当な用量で単独で使用することができる。加えて、他の薬剤の共同適用ま
たは連続的適用も望ましいことがある。
【０１７９】 薬剤組成物は、種々の経路で、例えば経皮、局所、経口的におよび筋肉内で個
々の患者に供給することができる。薬剤組成物の適用は、経口的または非経腸的
に行われる。非経腸的適用法には、局所、動脈内（直接組織に）、筋肉内、皮下
、骨髄内、くも膜内、心室内、静脈内、腹腔内または鼻腔内適用が包含される。
本発明は、本発明の新規治療法で使用するための好適な局所、経口、全身性およ
び非経腸的薬剤処方を提供する課題をも有する。シグナル伝達キナーゼの変調で
使用するための活性成分として本発明により同定された化合物を含有する組成物
は、慣用のベヒクル中の広範囲な治療用量形で適用することができる。例えば、
化合物は、錠剤、カプセル（経時放出および遅延放出処方も包含）、ピル、粉末
、顆粒、エレキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップおよびエマルジヨン
等の経口適用形で、または注射により適用することができる。同様に、これらは
、静脈内で（ボラスおよび注入）で、皮下、腹腔内、吸蔵を伴うまたは伴わない
局所的または筋肉内形で適用することもでき、全ての用法は薬剤分野の当業者に
は周知である。シグナル伝達キナーゼ変調剤として、所望の化合物の有効である
が無害の量が使用できる。
【０１８０】 製品の１日用量は、０.０１〜１０００ｍｇ／成人／日の広い範囲内で変動で
きる。経口適用のためには、組成物を、化合物を処置すべき患者への症状に用量
を合わせるために、有効成分０.０１、０.０５、０.１、０.５、１.０、２.５、
５.０、１０.０、１５.０、２５.０および５０.０ｍｇを含有するスコア付きま
たはスコア無し錠剤の形で提供するのが有利である。この薬剤の有効量は、通常
は、約０.０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量レベルで提供される。
特に約０.００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日が有利である。この範囲
は約０.０５〜約１ｍｇ／ｋｇで変動することもより有利である。勿論、この用
量レベルは、特定の化合物の能力に依存して変動する。特定の化合物は、他のも
のよりより高い効力を有する。加えて、用量レベルは、化合物の生体利用性に依
存して変動する。化合物がより高い生体利用性および効力を有するほど、限定的
ではないが、経口的用を包含する任意の適用経路で、より少ない化合物が必要に
なる。所望の作用効果を達成するために合併される場合に、ヒトシグナル伝達キ
ナーゼモジュレーターの用量は調節される。他方、これら種々の薬剤の用量は独
立して至適化することができ、共同作用結果を達成するために合併することがで
き、この際、病状は、薬剤が単独で使用される場合よりもより減少される。当業
者は、タンパク質またはその阻害剤に対するとは異なるヌクレオチドに対する処
方を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの適用も
特定の細胞および症状に対して特異的であろう。
【０１８１】 例１ 配列構成 新規シグナル伝達キナーゼを、独占データベースからのＥＳＴ配列およびパブ
リックメルク（Merck）ワシントン（Washington）大学ＥＳＴ配列データベース
のアセンブリにより同定した。これらのＥＳＴの初期同定は、キナーゼサブドメ
インＶＩＢ配列ＨＲＤＬＫＰＥＮＩＬＬＤを用いるデータベースの基本的ローカ
ルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）により実施した。二つのＭｅｒｃ
ｋ Ｗａｓｈ．Ｕ．ＥＳＴｓ（ｚｂ０５ｅ１１、ｚｐ８３ｂ０４）のシーケンシ
ングは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されているように５’ＵＴＲ、オープンリ
ーデイングフレームおよび３’ＵＴＲよりなるオーバーラッピングシーケンシン
グを提供した。オリゴヌクレオチドプライマー、センス５’−ＧＣＣＴＣＣＡＴ
ＧＧＣＣＣＡＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびア
ンチセンス５’−ＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＧＣ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）は、Ｍｅｒｃｋ Ｗａｓｈ Ｕ．ＥＳＴｓから得た
配列に基づきデザインされた。これらのプライマーは、ＴＡＡ終止コドン（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：８）の９６ｂｐ下流に対するＡＴＧ開始コドンの６ｂｐ上流を
包囲する１３５３ｂｐフラグメントを増幅するようにデザインされた。記載のフ
ラグメントを、ヒト肺、脳および腎臓組織（Clontech,Palo Alto,CA)およびＵ９
３７、ＫＵ８１２およびＪｕｒｋａｔ細胞系からアドバンテージポリメラーゼ（
Clontech)を用いて単離されたｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡを用いて増幅さ
せた。使用されたＰＣＲ条件は、９４℃で１分間、引き続く９４℃で５０秒間の
２０サイクル、６５℃で５０秒間、７２℃で２分間であった。ＰＣＲアンプリコ
ンは、ＱｉａｘＩＩアガロースゲル精製キット（Qiagen）を用いて精製され、キ
ットプロトコルによる”ＴＡ”クローニング研究手引きによるｐＣＲ２．１Ｔｏ
ｐｏ”ＴＡ”ベクター（Invitrogen) 中にサブクローニングされたゲルであった
。ＤＨ５αＥ．コリー コンピテント細胞を形質転換するために、トポイソメラ
ーゼを用いた（Life Technologies)。単独の単離され形質転換されたＥ．コリー
コロニーを、選択培地（LB ブイヨン、カルベニシリン）中で、３７℃で一晩
成長させ、引き続きプラスミドＤＮＡを製造するために使用した（Qiagen Plasm
id DNA Prepararion Kit）。肺、脳および腎臓ｃＤＮＡから誘導されたクローン
をシーケンシングした（ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle sequencing on A
BI PRISMTR 377 automated sequencer) 。これは、このｃＤＮＡの存在を確認し
た新規キナーゼの単一ｃＤＮＡ種を生じた。肺ｃＤＮＡから誘導されたクローン
は、Ｍｅｒｃｋ Ｗａｓｈ．Ｕ．ＥＳＴクローンから決定されたものと同じ配列
を有することが判明した。１３５３ｂｐ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は、開
始ＡＴＧコドンの所にＫｏｚａｋコンセンサス配列を有する１２４８ｂｐ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）オープンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）を含有すること
が判明した。
【０１８２】 ＯＲＦの翻訳は、４１６アミノ酸タンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
を生じ、これは真核生物セリン／スレオニンプロテインキナーゼ中に認められる
全ての１２保存ドメインを含有する。このタンパク質は、４６５２７.８３ダル
トンの予想分子量、５.０９７の等電点およびpH７.０で−１３の正味電荷を有す
る。
【０１８３】 例２ ヒトキナーゼ活性に関する検定 一般 組み換え体、精製ＧＳＴ／キナーゼ（１０μｌ）を、ＨＥＰＥＳ（pH７.５）
６０ｍＭ、酢酸マグネシウム３０ｍＭ、ＡＴＰ ０.１５ｍＭ、ＤＴＴ３ｍＭ、
オルトバナジン酸ナトリウム０.００３ｍＭを含有する３Ｘキナーゼ反応緩衝液
（ＫＲＢ）１０μｌ中のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）２０μｇに添加す
る。反応を［γ−32ｐ］ＡＴＰ５μＣｉ（１０μｌ）の添加により開始させる。
試料を３０℃で５分間インキュベートし、４×Ｌａｅｍｍｌiサンプル緩衝液の
添加により反応を停止させる。タンパク質を１２％トリス／グリシンＳＤＳゲル
上で分離し、クマシーブルーで着色し、乾燥させ、オートラジオグラフ膜に露呈
させた。
【０１８４】 特異的検定 ３ｘキナーゼ反応緩衝液（ＫＲＢ） ＨＥＰＥＳ（pH ７.５） ６０ｍＭ 酢酸マグネシウム ３０ｍＭ ＡＴＰ １５０μＭ ＤＴＴ ３ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4 ０.３ｍＭ ミエリン塩基性タンパク質 ０.５μｇ／ｍｌ 検定 １. ３ｘＫＲＢ １０μｌおよび組み換えキナーゼ１０μｌ（１μｇ）を各
試験管に添加する。
【０１８５】 ２. ［γ−32ｐ］ＡＴＰ（０.５ｍＣｉ／ｍｌ）１０μｌの添加により反応を
開始させる。
【０１８６】 ３. ３０℃で３０分間インキュベートする。
【０１８７】 ４. ５Ｘ試料緩衝液７.５μｌの添加で反応を停止させる。
【０１８８】 ５. 試料を５分間煮沸し、次いで氷上に１分間置く。
【０１８９】 ６. 試料の２５μｌ（６６％）を１０〜２０％トリス／グリシンＰＡＧＥゲ
ル上に負荷させ、トリス／グリシン／ＳＤＳＰＡＧＥランニング緩衝液中で４７
分間、３５ｍＡ／ゲルで通電する。
【０１９０】 ７. このゲルをクマシーブルーで３０〜４５分間着色させ、次いで１０％メ
タノール／７％酢酸中で一晩脱色させる。
【０１９１】 ８. このゲルをＭｅＯＨ／氷酢酸／Ｈ2Ｏ３：１：６中で１時間固定させてバ
ックグラウンド放射能を減少させる。
【０１９２】 ９. タンパク質バンドを可視化するためにこのゲルの写真撮影をする。
【０１９３】 １０. ゲルを乾燥させ、膜に露呈させる。
【０１９４】 例３ 抗−キナーゼポリクローナル抗体の製造 ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆにより開発された周知の演算法を用いて、新規
ヒトキナーゼのＮ−末端、ｃ−末端および中心領域内で、抗原ペプチドフラグメ
ントを同定した。The Antigenic Index: A Novel Algorithm for Predicting An
tigenic Determinants,CABIOS, 4:181(1988) 。この演算法は次の体系を有する
主要６サブルーチンを実施する： １）親水性の測定、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ（１９８１） ２）表面プロバビリテイの計算、Ｅｍｉｎｉ（１９８５） ３）バックボーンまたはチェーンフレキシビリテイの予測、Ｋａｒｐｌｕｓ−
Ｓｃｈｕｔｚ（１９８５） ４）二次構造の予測、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ（１９７８） ５）二次構造の予測，Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ（１９７８） ６）抗原性指数を測定するためにフレキシビリテイパラメータおよびヒドロパ
シー／溶剤アクセシビリテイファクターを一緒にする。
【０１９５】 分子全体に対してこの抗原性指数をプロットした。
【０１９６】 合成のために、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３アミノ酸残基位置３６４−３７７に相
当するペプチド配列ＬＫＱＱＤＥＮＮＡＳＲＮＱＡを選択し、抗原性および配列
のユニーク性に基づく抗体形成を他の同定されたキナーゼファミリーメンバーと
比較した。Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．がこの
ペプチドを合成し、ポリクローナル抗血清を製造することを請け負った。
【０１９７】
【外１】
【０１９８】 例４免疫沈降法 ここに記載のヒトキナーゼ分子の免疫沈降法は、実質的に、Suchard,S.J.,et
al., J.Immunol.,158:4961(1997) に記載の方法に従って実施される。細胞溶解
産物を、ここに記載の組み換えキナーゼに関する抗エンテロキナーゼプロテアー
ゼ分断部位／ＸｐｒｅｓｓTM抗体（Invitrogen Corp.）またはここに記載の本来
キナーゼに対するペプチド−特異性ポリクローナル抗体１μｇと一緒にする。対
照としてウサギＩｇＧを用いる。試料を４℃で回転しながら≧２時間インキュベ
ートする。免疫複合体をプロテインＡセファロース（Pharmacia）と一緒に４℃
で回転しながら２時間インキュベートする。ビーズを、トリス（pH８.０）５０
ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、Ｎａ3ＶＯ4 １ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
１％および CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail を含有する緩衝液中で
洗浄する。吸着されたタンパク質を試料緩衝液中に溶解させ、１２％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥミニゲル上で分離させる。
【０１９９】 例５ ノーザンブロット分析 プライマー：センス５’−ＧＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣ−３
’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびアンチセンス５’−ＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡ
ＧＣＴＣＡＴＧＧＧＴＴＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１０）を用いて、
新規ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 、塩基位置１２４０〜１５２８）のオ
ープンリーデイングフレームの３’末端および３’ＵＴＲ領域から誘導された２
８９ｂｐＰＣＲアンプリコンを得た。このＤＮＡフラグメント（プローブ）を、
Ready -to GoTMDNA ラベリングキット（Pharmacia Biotech)を用いてα−32Ｐ−
ｄＣＴＰ ５０μＣｉでラベリングした。このラベルされたプローブを、固体サ
ポート上に固定されたヒト組織ｍＲＮＡ’ｓに対するハイブリダイジングのため
に使用した（Clontech Human Cancer Cell Line Multiple Tissue Northern Blo
t および a Endothelial and Epithlial Primary Cells and Cell Lines Nother
n Blott）。ハイブリダイゼーシヨンは、実質的にＣｌｏｎｔｅｃｈ（Protocol#
PT-1200-1)に記載のように、ExpressHybTM溶液を用いて実施した。このノーザン
ブロット分析は、約３.５ｋｂ長さの新規シグナル伝達キナーゼに属する一次転
写産物を同定した。一次的に免疫組織（リンパ節、末梢血液白血球、脾臓、胎児
肝臓、骨髄、胸腺および胎盤）中に顕著な転写産物が現れる。図１０。
【０２００】 例６ 活性を変調する化合物の高速スクリーニング モジュレーター化合物の高速スクリーニングを、ＭＢＰコーテッド９６−ウエ
ルフラッシュプレート(R)（ＮＥＮTMLife Science Products) を用いて実施する
。各ウエルに、キナーゼ反応緩衝液（３ｘキナーゼ反応緩衝液（ＫＲＢ）は、Ｈ
ＥＰＥＳ（pH ７.５）６０ｍＭ、酢酸マグネシウム３０ｍＭ、ＡＴＰ ０.１５
ｍＭ、ＤＴＴ ３ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウム０．０３ｍＭを含有）、［
γ−33ｐ］−ＡＴＰ０.２５μＣｉを１μ／ｍｌより大きくない濃度で（個々の
酵素調製物の滴定により、ヒトキナーゼの１時間にわたるキネテイック測定を許
容する濃度を測定した）を加え、試験化合物１０μＭの存在または不存在下に３
０℃で１時間インキュベートした。全反応量は１００μｌである。インキュベー
シヨンに引き続き、反応混合物を吸引し、ウエルをＰＢＳ３００μｌで２回洗浄
する。放射能ラベルされたホスフェートの導入をシンチレーシヨン計測により測
定する（Packard Instument Co.TopCount,12-detector,96-well microplate sci
ntillation counter and luminescence counter , model B991200）。キナーゼ
活性を１０μＭで≧５０％阻害する化合物は、シンチレーシヨン計測で＞５０％
減少で示される。特異性および選択性は、ＩＣ50（または他の比較にために文献
に公知の標準定性）を測定する阻害化合物の滴定により、かつこの検定における
他のキナーゼの置換により測定される。例えば、同様に発現され、かつ単離され
、同様な条件下に検定された組み換えＳＯＫ−１及び／又はｍｓｔ−３と比較し
たキナーゼの相対的阻害活性の測定は、選択性データを提供する。
【０２０１】 例７ 高速スクリーニングプロトコル 試験化合物 ストック溶液２.５ｍｇ／ｍｌからＤＭＳＯ中で１：１０、およ
び次いで蒸留水中で再び１：１０での希釈により、試験化合物を予め製造する。
１：１００希釈溶液（１％ＤＭＳＯ中の２５μｇ／ｍｌ）の１０μｌを９６ウエ
ルマイクロライト１プレート（Dynatech）中で製造し、プレートを−２０℃で検
定の開始の前夜まで貯蔵する。
【０２０２】 対照プレート 対照溶液を含有するプレートがＱＡ目的のスクリーニングの各
ラン中に含有される。このようなプレートを、ＨＴＳキャンペーンの開始時に製
造し、必要とされるまで−２０℃で貯蔵する。ゼロ阻害（最大シグナル）ウエル
（カラム３、６、８および１０）は、ＭｉｌｌｉＱ水中の１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳ
Ｏ溶液１０μｌを含有する。１００％阻害（最小シグナル）ウエル（カラム１、
４、９および１１）は、ＭｉｌｌｉＱ水中の１％ＤＭＳＯ溶液中に２２０ｎＭＺ
Ｍ３３３１４１／ｌ １０μｌを含有する。５０％阻害（ＲＥＦ、シグナル）ウ
エル（カラム２、５、７および１２）は、参照化合物をＭｉｌｌｉＱ水中の１％
ＤＭＳＯ溶液中に約５０％阻害を提供するための既知の濃度で含有する。
【０２０３】 検定成分 （１）組み換えキナーゼ（Ｅ．Ｃｏｌｉ中またはここに記載のような真核細胞中
で発現）または組み換え酵素を発現する原核細胞または真核細胞の溶解産物また
はヒト細胞系からの部分的に精製された天然酵素 （２）［γ−33−Ｐ］−アデノシン三リン酸 （３）抗体プロテイン−Ａまたは他の適当な方法でＰＶＴＳＰＡビーズ（Amersh
rm International から購入）の表面に結合されたミエリン塩基性タンパク質。
【０２０４】 室温に達するまでベンチ上に一晩放置された試験化合物１０μｌを含有するマ
イクロライトＩプレートに、ＧＳＴ−Ｒｂ／ＡＴＰ／ＡＴＰ33２５ｍｌを添加し
、引き続き、直ちに２つのマルチドロップを用いて酵素２０μｌを添加する。こ
れらのプレートを１３枚積み重ね（各積み重ね体の最上段の上に、最上段プレー
トの蒸発を最小にするための空のプレートを有する）、室温で１０５分間放置す
る。ビーズ抗体およびＥＤＴＡを含有する「停止溶液」１５０μｌをマルチドロ
ップを用いて添加する。このプレートをトップシール−Ｓプレートシーラーでシ
ーリングし、Ｓｃｏｔｌａｂ ペルスペックスクリーンで包囲されたベンチ上に
一晩放置する。次いで、このプレートを２５０００ｒｐｍ、１１２４×ｇで５分
間(trunnion当たり２プレート）遠心し（Heraeus Megafuge 3.0R)、トップカウ
ント（Ｉ４.３４）；（ｉｓｏｔｏｐｅ：Ｐ33；計測時間：２０秒／ウェル）上
で計測した。
【０２０５】 周知のソフトウエアを用いてデータを分析することができる。阻害に関する限
界は、例えばシンチレーシヨンシグナルの６０％阻害にセットされている。阻害
限界に達している化合物は活性であると評価される。
【０２０６】 例８ 造血起点の種々のヒトｃＤＮＡからのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＰＣＲ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１メッセージは、造血起点の種々の細胞系から単離さ
れたｃＤＮＡ’ｓでのＰＣＲによる他の細胞中の造血起点の存在を測定する。
【０２０７】 生産者指示に従うアドバンテージTMＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ（Clontech
# 8417-1、ロット 7020348) を用いる２０μｌ反応での逆転写ｍＲＮＡの２〜２
.５ｎｇから、ターゲット生成物を増幅させた。プライマーセット配列は、セン
ス５’−ＧＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：９）およびアンチセンス５’−ＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧ
ＴＴＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）である。新規キナーゼの発現
の２８３ｂｐＰＣＲアンプリコン表示は、新規ｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１塩基位置１２４０−１５２８） のオープンリーデイングフレームの３’−末
端および３’ＵＴＲ領域から発生誘導されている。使用されるＰＣＲ条件は、９
４℃で１分、引き続く９４℃で５０秒の２０サイクル、６５℃で５０秒、７２℃
で２分である。各反応の１０μｌを、Sambrook et al., Molecular Cloning La
b Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Press (1989) に記載のようなＴ
ＡＥ緩衝液中の臭化エチジウム最終濃度０.５μｇ／ｍｌを含有する１％アガロ
ースゲル上で、マーカーとしての１ｋｂＤＮＡラダー６００ｎｇを用いて分析す
る（Life Technologies, cat# 15615-016)。
【０２０８】 例９ ＧＳＴ／ヒトシグナル伝達キナーゼ融合タンパク質の発現および精製 単独の単離されたＢＬ２１形質転換されたクローンを、レノックスＬブイヨン
（カルベニシリン５０ｍｇ／ｍｌを含有するＬＢブイヨン）１０ｍｌ中で一晩成
長させ、次いでＬＢブイヨン／カルベニシリン１リットル中に接種し、３７℃で
振動（２２５ｒｐｍ）しながら０.５〜０.８のＡ600まで成長させた。イソプロ
ピルチオ−β−ガラクトシドを１００ｍＭまで添加し、連続的に２時間インキュ
ベートすることにより、ＧＳＴ／キナーゼ融合タンパク質の発現を誘導させた。
インキュベーシヨンに引き続き、細胞を４℃で１５００×ｇで１０分間遠心し、
コンプリートTMプロテアーゼインヒビターカクテイル含有リン酸塩緩衝食塩水（
ＰＢＳ）（Boehringer Mannheim GmbH) ５０ｍｌ中に再懸濁させ、次いで、氷中
での超音波処理により溶解させた。この超音波処理物にトリトンＸ−１００を最
終濃度１％まで添加して、融合タンパク質を可溶化させた。遠心分離（１２００
０×ｇ、４℃）により細胞片を除去し、上澄みを精製ＧＳＴ／キナーゼを得るた
めの源として使用した。
【０２０９】 ＧＳＴ／キナーゼ融合タンパク質の精製 １ｍｌ重力供給オープンカラムを用いるグルタチオンセファロース４Ｂビーズ
（Pharmacia) アフィニテイカラムクロマトグラフィによりＧＳＴ／キナーゼを
精製した。懸濁液をカラムに通し、次いで、このカラムをプロテアーゼ阻害剤含
有ＰＢＳで３回洗浄した。最後に、このＧＳＴ−キナーゼ融合タンパク質を、溶
離緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の１０ｍＭ還元グルタチオン、pH８.０、
プロテアーゼ阻害剤含有）１ｍｌの添加によりカラムから溶離させた。ＧＳＴ／
キナーゼを、使用まで−２０℃でアリコートとして貯蔵した。
【０２１０】 例１０ 電気穿孔 注：パルスの適用を除き、この方法の全ての工程を、無菌組織培養条件下に実
施する。
【０２１１】 １. ８０％コンフルエンシイの密度までの細胞の生長。リン酸塩緩衝食塩水（
ＰＢＳ）中に５分間細胞を浸漬することによる収穫。細胞上へのＰＢＳのピペッ
トによるフラスコからの分離。血球計数器を用いる細胞数の測定。ベンチトップ
遠心分離器中１５００ｒｐｍでの遠心分離により細胞をペレット化する。細胞を
ＰＢＳで１回洗浄し、遠心分離によりペレット化する。
【０２１２】 ２. 細胞４×１０6／牛胎児血清（ＦＢＳ）不含の媒体５００μｌの密度で細胞
を再懸濁させる。
【０２１３】 ３. 組織培養層流フード下に、個々のシールされたパッケージから０.４ｃｍキ
ュベットの要求数を取り去る。キャップを除き、再懸濁された細胞５００μｌを
このキュベットに添加する。
【０２１４】 ４. 各電気穿孔のために、ＤＮＡの１０〜２０μｇを無菌水またはＴＥ（１０
ｍＭトリスpH７.５、１ｍＭＥＤＴＡ）中に１〜２μｇ／μｌの濃度で再懸濁さ
せる。
【０２１５】 ５. ＤＮＡをキュベットに添加し、数回軽くたたいて混合させる。キュベット
上のキャップを元に戻し、氷上で１０分間インキュベートする。
【０２１６】 ６. １０分間のインキュベートに引き続き、電気穿孔を開始する。キュベット
を数回軽く振動させて、沈殿した細胞を再懸濁させ、次いでパルスを与える。パ
ルスに引き続き、キュベットを室温でなお１０分間インキュベートする。
【０２１７】 ７. 第２の１０分間インキュベーシヨン時間に引き続き、細胞をプレート化さ
せる。組織培養層流フード下にキュベットからキャップを除き、完全培地１ｍｌ
を添加する。このキュベットから無菌パスツールピペットを用いて細胞をゆっく
り吸引し、完全培地９ｍｌを含有する１００ｍｍシャーレに添加する。ＣＯ2５
０％と共に３７℃で一晩インキュベートする。
【０２１８】 ８. １６〜２４時間後に培地を交換する。
【０２１９】 ９. 電気穿孔の後４８〜７２時間に細胞を収穫し、かつ／又はその抵抗が細胞
中へトランスフェクトされた表現ベクターにより与えられている適当な抗生物質
（例えばネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、ゼオシンTM（Invitrog
en)）の添加により安定な形質転換体の選択を開始する。
【０２２０】 １０. ３〜５日内に非トランスフェクト細胞の細胞死に至るように限定された
濃度での抗生物質の存在下に、安定な細胞系を１４〜２１日の期間にわたり選択
する。この選択プロセスの間に培地を３〜４日毎に交換して培地中の抗生物質の
濃度を維持する。選択の後に、クローン安定細胞系を単離し、分離組織培養容器
中に入れることにより拡張させる。
【０２２１】 例１１ リピド介在トランスフェクシヨン（Life Technologies, Gaithersburg, Md, Lipofectin キット） １. 血清が補充された適当な生長培地４ｍｌ中に、細胞１〜２×１０5／６０−
ｍｍ組織培養プレートを接種する。
【０２２２】 ２. 細胞をＣＯ2インキュベーター中、３７℃で１８〜２４時間インキュベート
する。細胞は３０〜５０％コンフルエントであるべきである。
【０２２３】 ３. １２×７５ｍｍ無菌試験管中で次の溶液を製造する： 溶液Ａ：各トランスフェクシヨンのためにＤＮＡ２ｍｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ
Ｉ培地１００ｍｌ中に希釈する。
【０２２４】 溶液Ｂ：各トランスフェクシヨンのためにＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ試薬５〜２０
ｍｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ培地１００ｍｌ中に希釈し、室温で３０〜４５分間
放置する。
【０２２５】 ４. この２溶液を一緒にし、ゆっくり撹拌し、室温で１０〜１５分間インキュ
ベートする。
【０２２６】 ５. 細胞を抗菌剤なしで血清不含生長培地２ｍｌで１回洗浄する。
【０２２７】 ６. ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ試薬−ＤＮＡコンプレックスを含有する各試験管に
血清不含生長培地１.８ｍｌを添加する。ゆっくり撹拌して細胞上に重ねる（注
：細胞は血清の存在下にトランスフェクトされうる、下記の「血清の存在下での
トランスフェクシヨン」参照）。
【０２２８】 ７. 細胞をＣＯ2インキュベーター中、３７℃で５〜２４時間インキュベートす
る。
【０２２９】 ８. ＤＮＡ含有培地を、通常含有率の血清で補充された成長培地４ｍｌで交換
し、細胞をＣＯ2インキュベーター中、３７℃で更に４８時間インキュベートす
る。
【０２３０】 ９. 少なくとも１：５での所望割合で、細胞を選択培地中で継代培養する。
【０２３１】 血清の存在下でのトランスフェクシヨン 血清不含の培地中でリピド−ＤＮＡ−コンプレックスが形成されることを前提
として、血清の存在下でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ試薬を用いる好結果のトランスフ
ェクシヨンが達成できる（注：前記の１〜４工程参照）。抗菌剤は、培地中の細
胞にＤＮＡ−リピドコンプレックスと一緒に添加すべきではない。ダルベッコ
メデイファイド イーグル 培地(Life Technologies ,Cat. No. 11960) 、ＯＰ
ＴＩ−ＭＥＭ Ｉ還元血清培地または他の牛胎児血清５〜１０％で補充された他
の血清不含成長培地が推奨される。
【０２３２】 例１２ ドミナントネガテイブ／不活性キナーゼ突然変異体 ドミナントネガテイブ／不活性キナーゼ突然変異体は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３ の５３位のリシンをアルギニンに変えることにより、ここに例示さ
れている１態様を形成するために供給されているツールを用いて容易に製造する
ことができる。この突然変異は、多くの他のセリン／スレオニンキナーゼに関す
る不活性及び／又はドミナントネガテイブキナーゼを生産することが明らかにさ
れている。例えばHanks,S.K., et al., Science, 241:32( 1988) 参照。この新
規キナーゼのドミナントネガチブまたは不活性キナーゼ突然変異体は。５３位の
リシンをアルギニンに変えることにより製造された。この突然変異は、クイック
チェンジ サイト デイレクテッド ムタゲネシス キット（Stratagene)
およびオリゴヌクレオチド５’−ＣＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＴＧＣＴＡＴＣＣＧＧ
ＡＴＣＡＴＡＧＡＣＣＴＴＧＡＧ−３’（センス）（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１３）
および５’−ＣＴＣＡＡＧＧＴＣＴＡＴＧＡＴＣＣＧＧＡＴＡＧＣＡＡＣＧＡＣ
ＴＴＧＣＴＧ−３’（アンチセンス）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）を用いる新
規キナーゼ／ｐＣＲ２.１構成中に導入された。これは、構成Ｋ５３Ｒ／ｐＣＲ
２.１を生産した。エピトープタグ付きドミナントネガテイブベクターコンスト
ラクシヨン：新規キナーゼＫ５３ＲドミナントネガテイブキナーゼＣＤＳを含有
する構成的発現構造は、ｐｃＤＮＡ３.１Ｈｉｓ（Invitrogen Corporation) を
用いて製造された。この発現構成は、次のタンパク質配列を有するＮ−末端エピ
トープタグ付き融合タンパク質を発現するようにデザインされている：メチオニ
ン−（ヒスチジン）6−エンテロキナーゼプロテアーゼ分断部位／ＸｐｒｅｓｓT M 抗体エピトープ−新規キナーゼＫ５３Ｒドミナントネガテイブキナーゼプロテ
イン。ＥｃｏＲＩ（５’）およびＥｃｏＩＣＲＩ（３’）を用いて新規キナーゼ
Ｋ５３ｃＤＮＡをＫ５３Ｒ／ｐＣＲ２．１構造から摘出し、それぞれ５’および
３’末端のＥｃｏＲＩ（５’）およびＥｃｏＲＶ（３’）制限エンドヌクレアー
ゼ部位を用いて、ｐｃＤＮＡ３.１Ｈｉｓベクター中に挿入した。
【０２３３】 例１３ ヒトSｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のマウス同族体の同
定 ヒトＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３コード領域の５’および３’末端に対して特異的
なプライマー（図７；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７）を用いて、ＭＥＬ（マウス赤白血病 細胞系）のＲＴ−ＰＣＲ分析を行
った。条件は例１中に記載されている。生じる１３５０ｂｐＰＣＲアンプリコン
をゲル精製し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ中にリゲートさせ、例１に記載のようにシ
ーケンシングした。この配列を、ＢＬＡＳＴ分析によりＭｅｒｃｋ Ｗａｓｈ
Ｕ データベース中のマウスＥＳＴクローンを同定するために用いた。このマウ
スＥＳＴクローン、ｖ×２１ｄ０４（ａｃｃｅｓｉｏｎ ＃ ＡＡ８８１６６７
）は、ＳＯＫ−１およびＭＳＴ３に対するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対する配列
類似性に基づきヒトＴＥＮ−１キナーゼのマウスオーソログとして同定された。
クローンが得られ、その全体がシーケンシングされた。
【０２３４】 ネズミシグナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３変体） 分子量 ４６６１２.９４ダルトン ４１６アミノ酸； ５１強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）；６６強酸性（−
）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）；１３６疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）；１
０３極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）；等電点５.０５４；pH７.０での
電荷−１４．０１２ 。
【０２３５】 例１４ ＴＥＮ−１キナーゼによる転写因子の活性化 下記に、シグナル伝達キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）が特定のトランス
ファクターを活性化するか否かを測定するために使用される転写活性化レポータ
ー検定の一般的処方を示す。この検定の実施のために、ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔTM システム（レポーター構成および正対照構成を包含）を用いた。Strategene,La
Jolla,CA 。全ての検定を三重に実施し、別の時間に数回繰り返した。
【０２３６】 １. 細胞を１.５×１０5／ｍｌに希釈し、２ｍｌ（３×１０5細胞）を６−ウエ
ルシャーレの各ウエル中に置く、 ２. 細胞を、３７℃、５％ＣＯ2、９０％相対湿度（これらの条件は、この検定
の全体で使用された）で一晩培養させた、 ３. 細胞をStrategene's Lipotaxi 試薬を用い、この試薬に付されたプロトコ
ルに従ってトランスフェクトさせた。このプロトコルは、後に記載の通りである
（３トランスフェクシヨンに関して記載） ４. ＤＭＥＭ８４０μｌ＋Ｌｉｐｏｔａｘｉ 試薬６０μｌをポリウレタンチ
ューブ中で一緒にする、 ５. ＤＭＥＭ／Ｌｉｐｏｔａｘi 溶液にＤＮＡ’ｓ（表参照）を添加する、 ６. 室温で１５〜３０分インキュベートする、 ７. ＤＭＥＭ、Ｌｏｐｏｔａｘｉ、ＤＮＡ溶液へＤＭＥＭ２.１ｍｌを添加する
、 ８. 細胞から培地を除去する、 ９. 細胞の各ウエルにリピド／ＤＮＡ溶液１ｍｌを滴加し、その間シャーレを
渦動させる、 １０. リピド／ＤＮＡ：細胞培養液を５％ＣＯ2中、３７℃で５〜７時間インキ
ュベートする、 １１. ＤＭＥＭ １ｍｌ／１％ＦＢＳを添加し、一晩培養する、 １２. 培地を新製ＤＭＥＭ／０.５％ＦＢＳで置き換え、一晩培養する、 １３. Ｐａｃｋｅｒｄ’ｓＬｕｃ−Ｌｉｔｅ キット試薬および次のプロトコ
ルを用いて細胞をルシフェラーゼ活性に関して試験する、 １４. 細胞から培地を除き、Ｌｕｃ−Ｌｉｔｅ試薬（これは予め１ｍＭＣａＣ
ｌ2およびＭｇＣｌ2を含有するＰＢＳで１：１希釈された）３００μｌを添加す
る、 １５. 室温で１０分間インキュベートする、 １６. 細胞溶解産物２００μｌを白色プラスチック９６−ウエルプレート中に
分配させ、Perkin-Elmer/Tropix 96- well Flourimeter を用いて光放射を読み
とる。
【０２３７】
【表２】
【０２３８】 前記の全ての刊行物および特許明細書は、参考文献としてここに編入されてい
る。本発明の記載方法および系の種々の変更および変形は、本発明の範囲を逸脱
することなく当業者には明確であろう。本発明は、特に有利な態様との関連で記
載されているが、特許請求されているように、本発明はこのような特定の態様に
限定されるものではないことは理解されるはずである。実際に、本発明を実施す
るための記載の方法の種々の変更が、分子生物学またはそれに関連する分野に精
通している当業者には、特許請求の範囲に記載の範囲内で意図されていることが
あきらかである。 配列表 （１）書誌的事項： （１）出願人： （Ａ）名称：Ｚｅｎｅｃａ Ｌｔｄ （Ｂ）番地： １５ Ｓｔａｎｈｏｐｅ Ｇａｔｅ （Ｃ）都市：Ｌｏｎｄｏｎ （Ｄ）州： Ｇｒｅａｔｅｒ Ｌｏｎｄｏｎ （Ｅ）国： Ｅｎｇｌａｎｄ （Ｆ）郵便番号：（Ｚｉｐ） ＷＩＹ ６ＬＮ （Ｇ）電話：０７１ ３０４ ５０００ （Ｈ）テレファックス：０１７１ ３０４ ５１５１ （Ｉ）テレックス：０１７１ ８３４ ２０４２ （ｉｉ）発明の名称：プロセス （ｉｉｉ）配列の数：１２ （ｉｖ） コンピュータの記録方式： （Ａ）記録媒体：フロッピーデイスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣ 互換機 （Ｃ）システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ＃１.０， Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．３０（ＥＰＯ） （ｖ）本出願データ； 出願番号：ＵＳ ９７２６８５１.０ （ｖｉ）優先権出願データ： （Ａ）出願番号：ＧＢ ９７２６８５１.０ （Ｂ）出願日： １９−ＤＥＣ−１９９７ （２）配列番号１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３２００塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
【外２】
【外３】
【外４】 （２）配列番号２： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２５１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
【外５】 （２）配列番号３： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４１６アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：
【外６】
【外７】 （２）配列番号４： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４２６アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：
【外８】
【外９】 （２）配列番号５： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４３１アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：ペプチド （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：
【外１０】
【外１１】 （２）配列番号６： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： ＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧ ＣＣＣＡＣＴＣＧＣＣ ＧＧＴＧ ２４ ２）配列番号７： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： ＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡ ＧＣＴＣＡＴＧＧＧＴ ＴＡＡＧＣ ２５ （２）配列番号８： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１３５３塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：
【外１２】 （２）配列番号９： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： ＧＴＣＴＡＴＧＡＴＡ ＡＴＣＡＣＡＣＣＴＧ Ｃ ２１ （２）配列番号１０： ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： ＧＧＣＡＣＡＴＧＧＡ ＧＣＴＣＡＴＧＧＧＴ ＴＡＡＧＣ ２５ （２）配列番号１１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７７塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：
【外１３】 （２）配列番号１２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０２８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジイ：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｉｘ）配列 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：
【外１４】
【外１５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化する３２０１塩基ｃＤ
ＮＡ核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 。
【図２】 新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドをコード化するｃＤＮＡ核酸配列
の１２５１塩基翻訳構造領域ＡＴＧ〜ＴＡＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 。
【図３】 新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドの４１６アミノ酸残基配列ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３ 。
【図４】 ＳＯＫ−１、ヒトオキシダントストレス活性化キナーゼの４２６アミノ酸残基
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ 。
【図５】 ｍｓｔ−３、ヒトシグナル伝達キナーゼの４３１アミノ酸残基配列 ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：５ 。
【図６】 新規ヒトシグナル伝達キナーゼポリペプチドのアミノ酸残基配列（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：３）（ＴＥＮ−１と称される）とシグナル伝達キナーゼポリペプチド
のネズミ変体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）（ｖｘ２１ｄ０４と称される）およ
びＳＯＫ−１ストレス活性化キナーゼのアミノ酸残基配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：４）およびｍｓｔ−３シグナル伝達キナーゼのアミノ酸残基配列（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：５）とを比較して示している。
【図７】 新規ヒトキナーゼに関係している完全長核酸配列アンプリコンを製造するため
に使用されるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ 。
【図８】 センス、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６およびアンチセンス、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
、オリゴヌクレオチドを用いて製造された１３５３塩基ＰＣＲアンプリコンであ
るＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ 。
【図９】 新規キナーゼの発現を示している２８９ｂｐアンプリコンのＰＣＲ製造のため
のオリゴヌクレオチドプライマーのセットであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ 。
【図１０】 ノーザンブロット分析を示す図。
【図１１】 ＧＳＴ−ＴＥＮ１が自己リン酸化および基質リン酸化可能である（ミエリン塩
基性タンパク質）ことを示しているキナーゼ検定データを示す図。
【図１２】 シグナル伝達キナーゼポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のネズミ４１
６アミノ酸残基変体態様であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ 。
【図１３】 シグナル伝達キナーゼポリペプチドのネズミ４１６アミノ酸残基変体態様をコ
ード化する２０２８塩基ｃＤＮＡ核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２。
【図１４】 シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３による２９３細胞中のＮＦκＢ
、ＡＰ−１およびＳＲＦの活性化を説明している図（ＴＥＮ−１はシグナル伝達
キナーゼ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す）。
【図１５】 シグナル伝達キナーゼＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によるＨｅＬａ細胞中のＡＰ−
１およびＳＲＦの活性化を説明している図（ＴＥＮ−１はシグナル伝達キナーゼ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す）。
【図１６】 ＥＣＶ３０４細胞中の基底レベルおよびＴＮＦα−介在ＮＦκＢ活性化へのＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１アンチセンス分子発現の作用効果を説明している図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８４ 29/00 37/06 ４Ｈ０４５ 35/00 37/08 37/06 43/00 １０５ 37/08 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/40 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 5/10 1/68 Ａ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 33/50 Ｚ 1/68 33/573 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デイヴィッド シェイ シルバースタイン アメリカ合衆国 デラウェア ウィルミン トン ピー オー ボックス 15437 コ ンコード パイク 1800 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 FB08 4B024 AA01 AA11 BA10 BA61 CA04 CA07 DA02 GA27 4B050 CC03 DD11 LL01 4B063 QA01 QA05 QQ08 QR32 QR45 QX02 4B065 AA93Y AB01 BA02 CA29 CA44 4C084 AA02 AA06 AA17 NA14 ZA161 ZA451 ZA591 ZA701 ZA961 ZB071 ZB151 ZB261 ZB351 ZC351 ZC781 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA89 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような配列を有す
    るポリペプチドまたはその薬物学的に活性の及び／又は生物学的に活性の機能性
    誘導体をコード化する核酸配列を有する精製ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチド配列は、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
    に記載のような配列を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 請求項１のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
  4. 【請求項４】 請求項２に記載のポリヌクレオチドまたはその生物学的に有
    効な部分の相補体を含有するアンチセンス分子。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  6. 【請求項６】 実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のようなアミノ酸配
    列を有する精製ポリペプチド。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のポリペプチドに対して特異的な抗体。
  8. 【請求項８】 実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような生物学的ポ
    リペプチドまたはその薬物学的に活性の及び／又は生物学的に活性の機能性誘導
    体を発現する細胞を製造する方法において、この方法は、 ａ）前記ポリペプチドを発現するために好適な条件下に、請求項５に記載の宿主
    細胞を培養することよりなる、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような
    生物学的ポリペプチドまたはその薬物学的に活性の及び／又は生物学的に活性の
    機能性誘導体を発現する細胞を製造する方法。
  9. 【請求項９】 実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のようなアミノ酸配
    列を有するポリペプチドを製造する方法において、この方法は、次の工程： ａ）前記ポリペプチドを発現するために好適な条件下に請求項５に記載の宿主細
    胞を培養し、かつ ｂ）この培養宿主細胞から前記ポリペプチドを回収する よりなる、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のようなアミノ酸配列を有す
    るポリペプチドを製造する方法。
  10. 【請求項１０】 シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化合物を同定する
    方法において、この方法は、 ａ）シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合物モジュレーターを、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子のポリ
    ペプチドと一緒にし、かつ ｂ）この活性上への候補化合物モジュレーターの作用効果を測定する ことよりなることを特徴とする、シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化合物
    を同定する方法。
  11. 【請求項１１】 シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化合物を同定する
    方法において、この方法は、 （ａ）シグナル伝達キナーゼ活性の候補化合物モジュレーターを、実質的にＳＥ
    Ｑ ＩＤ ＮＯ：３に記載のような配列を有するシグナル伝達キナーゼ分子のポ
    リペプチドを発現する宿主細胞と一緒にし、かつ （ｂ）この活性上への候補化合物モジュレーターの作用効果を測定する ことよりなる、シグナル伝達キナーゼの活性を変調する化合物を同定する方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の方法で同定されたシグナル伝達キナー
    ゼの活性を変調する化合物。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の方法で同定されたシグナル伝達キナー
    ゼの活性を変調する化合物。
  14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の方法で同定されたシグナル伝達キナー
    ゼの活性を変調する化合物を含有する薬剤学的組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載のシグナル伝達キナーゼ変調化合物を適
    用することよりなる、シグナル伝達キナーゼにより介在される症状の治療が必要
    である患者の治療法。
  16. 【請求項１６】 請求項１３に記載のシグナル伝達キナーゼ変調化合物を適
    用することよりなる、シグナル伝達キナーゼにより介在される症状の治療が必要
    である患者の治療法。
  17. 【請求項１７】 請求項４に記載のアンチセンス分子の有効量を当該細胞に
    適用することよりなる、細胞中のシグナル伝達キナーゼの発現を阻害する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項７に記載の抗体を含有する、実質的にＳＥＱ ＩＤ
    ＮＯ：３に記載のようなアミノ酸配列を有するポリペプチド配列の同定のため
    の診断組成物。
  19. 【請求項１９】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から誘導されたＰＣＲプライマー
    を含有する、実質的にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のような配列を有するポリ
    ヌクレオチド配列の同定のための診断組成物。
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