DE10011530A1 - Hochwirksame Antisense-Oligodesoxynucleotide gegen Polio-like Kinasel - Google Patents

Hochwirksame Antisense-Oligodesoxynucleotide gegen Polio-like Kinasel

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Abstract

Im Stand der Technik war es bisher nicht gelungen, Antisense-ODNs aufzufinden, mit denen sich das Wachstum von mit Plk1-Überexpressionen assoziierten Tumorzellen effektiv, d. h. bis wesentlich über 50%, hemmen läßt. Es sollten daher verbesserte ODNs zur Verfügung gestellt werden, welche über eine wesentlich wirksamere Inhibitionseffizienz der Pkl1-Expression in Tumorzellen verfügen. DOLLAR A Mit Antisense-ODNs der Formeln DOLLAR A 5'-CCT GAC CAG CCC ACG CTC CG-3' (JWG 2000) DOLLAR A und DOLLAR A 5'-CCC AAA AAG CGG CCC C-3' (JWG 160) DOLLAR A stehen wirksame Inhibitoren der Expression von Poli-like Kinasel zur Verfügung, mit welcher sich der Anteil an lebensfähigen Tumorzellen bis auf 20% senken läßt. DOLLAR A Oligodesoxynucleotide zur Hemmung des Tumorwachstums mittels der Antisense-Strategie.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zwei Oligodesoxynucleotide (ODNs), mit welchen sich wirksam das Wachstum von mit Polo-like-Kinase (Plk)-Überexpression assoziierten Tumorzellen hemmen läßt. Insbesondere betrifft die Erfindung zwei hochwirksame Antisensedesoxynucleotide, mit welchen die Translation von Plk1-mRNA in Tumoren inhibiert werden kann.
Es ist bekannt, daß die Polo-like Kinasen in verschieden eukaryotischen Organismen eine wichtige Rolle in der Zellteilung und Proliferation spielen. Insbesondere ist von der hochkonservativen Serin/Threonin-Kinase Plk1 bekannt, daß ihre Expression besonders hoch in der G2/M-Anfangsphase der Mitose ist und sie auch über die Anaphase, Metaphase und Telophase hinweg eine hohe Aktivität beibehält. Wegen der wichtigen Rolle, die Plk1 im Cdc25C-Amplification-loop spielt, insbesondere für die Organisation beim Aufbau der bipolaren Spindel sowie bei der Aktivierung des Anaphase-Promotions-Komplexes, ist Plk1 besonders gut geeignet, um als diagnostischer und prognostischer Marker für die Entwicklung eines Tumors oder als Ziel einer Anti-Krebstherapie zu dienen.
Bereits seit längerem ist es bekannt, die Translation von mRNA durch komplementär zur Sequenz einer mRNA ausgerichteter antisense-ODNs zu inhibieren. Neueren Datums ist der Einsatz einzelsträngiger Nucleinsäuren für die selektive Blockade der Genexpression von Transkriptionsfaktoren. Damit derartige ODNs aber selektiver eingesetzt werden können, müssen sie zuvor modifiziert werde, um gegenüber enzymatischem Abbau stabiler zu sein. Geeignete Modifikationen stellen der Einbau von Phosphotriester-, Phosphoramid-, Methylphosphonat-, Phosphorothioat und Peptidnucleinsäurebindungen in die Struktur des Oligonucleotids dar. Wegen seiner erhöhten Stabilität und der Fähigkeit, RNase H Aktivität auszulösen, sind Phosphorothioat-modifizierte ODNs bevorzugte Kandidaten für eine spezifische Inhibition der Genexpression.
Wegen ihrer Sekundär- und Tertiärstruktur sind jedoch nicht alle mRNA-Sequenzen gleichermaßen einer effektiven Wechselwirkung mit Antisense-ODNs zugänglich. So hängt beispielsweise die Wirksamkeit einer Expressionsinhibition nicht nur von der jeweiligen Größe und einer geeigneten Komplementärsequenz der jeweiligen Antisense-ODNs ab, sondern auch davon, ob sie keine Sequenzen aufweisen, mit denen sie sich gegenseitig durch Hybridisierung, etwa durch Ausbildung zu vieler Basenpaarbindungen untereinander, in ihrer Wirksamkeit einschränken oder gar neutralisierten können.
Vor dem Hintergrund dieser Schwierigkeiten, war es im bisherigen Stand der Technik nicht gelungen, Antisense-ODNs aufzufinden, mit denen sich das Wachstum von mit Plk1- Überexpression assoziierten Tumorzellen effektiv, d. h. bis wesentlich über 50%, hemmen ließ.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, verbesserte ODNs zur Verfügung zu stellen, welche über eine wesentlich wirksamere Inhibitionseffizienz der Plk1- Expression in Tumorzellen verfügen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die in den folgenden Formeln wiedergebenen modifizierten Oligodesoxynucleotide aus 20 (JWG2000) bzw. 16 (JWG 160) Nucleotideinheiten (20-mer bzw. 16-mer) gelöst:
5'-CCT GAC CAG CCC ACG CTC CG-3' (JWG 2000)
5'-CCC AAA AAG CGG CCC C-3' (JWG 160)
Als Modifikation gegen enzymatischen Abbau kommen prinzipiell die im Stand der Technik bekannten Substituenten, entweder einzeln oder in Kombination, in Frage. Bevorzugt kommen die oben benannten Substituenten zum Einsatz. Die ganz bevorzugte Modifikation ist der Einbau von Phosphorothioat. In den folgenden Untersuchungen wurden die Antisense-ONDs in Form ihrer Phosphorthioate eingesetzt.
Oligonucleotidsynthesen
Die Herstellung der Phosphorothioat-modifizierten JWG 2000 bzw. JWG 160 erfolgte mit einem automatischen DNA-Synthesizer (Perspective 8909; BioSpring GmbH; Frankfurt) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren. Die Deprotektion der Oligonucleotide wurde mit konzentriertem Ammoniak über einen Zeitraum von 16 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Behandlung menschlicher Krebszelllinien mit Antisense-ODNs
Die in Zellkultur verwendeten menschlichen Krebszelllinien A549 und Detroit 562 sowie das A549 Xenotranplantat in nackte Mäusen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bzw. der Deutschen Sammlung von Mokroorganismen und Zellkulturen erworben. 2,5 . 105 in DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium) suspendierte, mit 10% hitzeinaktiviertem Kälberserum (FCS), Antibiotika und 2 mM L-Glutamin versetzte Zellen wurden in T25 Kulturflaschen ausgesät und bei 37°C in 5% CO2/95% Luft-Atmosphäre in einem Brutschrank unter Feuchtigkeit wachsen gelassen. Anderntags wurden die Zellen (mit einer Konfluenz von 50-60%) mit den jeweiligen, in sterilem entionisierten Wasser für Zellkulturen gelösten ODNs in Gegnwart des monokationischen Lipids N-[1-(2,3- Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat, Dotap (Roche Diagnostics) in 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4 mit NaOH) und OptiMem-Medium (Gibco BRL) behandelt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das ODN-haltige Medium durch ein eine normale Zellkultur in 10% FCS enthaltendes Medium ersetzt und für weitere 24 oder 28 Stunden inkubiert. Genügende Zeit nach der Transfektion wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch Anfärben mit Trypan Blau bestimmt und die Zellzahl mit einer Zählkammer ermittelt. Transfizierte und nur mit Dotap behandelte Zellen wiesen nach der Transfektion eine 95 bis 100% Lebensfähigkeit auf.
RNA-Isolierung, Northern Blot-Analyse und Autoradiographie
Von herausgeschnittenen Tumorxenotransplantaten wurden Portionen von 0,5 bis 1,5 g in einer Guanidiniumisothiocyanat-Lösung homogenisiert. Die RNA wurde mittels Ultrazentrifugation bei 125000 g in einem 5,7 M CsCl-Gradienten erhalten. Zur Bestimmung des mRNA-Gehalts in den transfizierten Zellen wurde die gesamte RNA aus den Zellen gewonnen, indem der RNeasy mini kit (Qiagen, Hilten) 24 und 48 Stunden nach der Transfektion oder an den angegebenen Zeiten für eine in vivo Antisense-mRNA-Analyse eingesetzt wurde. 20 µg Gesamt-RNA wurden mittels Elektrophorese in einem denaturierenden 1% Agarose/Formaldehyd-Gel abgetrennt, auf eine Nylon-Membran übertragen und mit einem radioaktiven, mittels PCR gewonnenem Plk1-Fragment als Sonde durchsucht. Mit einem 380A DNA-Synthesizervon Applied Biosynthesis wurden Primer hergestellt. Die radioaktive Markierung der Sonde zur Aufnahme von Northern Blots erfolgte nach einem Standard-PCR-Verfahren unter Verwendung von 150 µCi α-32P dCTP (6000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech). Die radioaktive Markierung der Antisense-Stränge wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: Plk1AS: 5'-GAT GTT GGC ACC CTT TCA GC-3', G3PDH: GAPAS: 5'-ATG GTT CAC ACC ATG ACG-3'.
Die Hybridisierung erfolgte in QuickHyb-Lösung (Stratagene) während 1 Stunde bei 68°C. Die Membranen wurden zwei- oder dreimal unter hoch stringenten Bedingungen in 0,1 × SSC, 1% SDS bei 65°C für 60 Minuten gewaschen und über Nacht autoradiographiert. Sodann wurden die Membranen von den Gensonden befreit und mit einer anderen radioaktiv markierten Sonde zur Kontrolle der Qualität und Einheitlichkeit der mRNA-Beladung unter identischen Bedingungen (z. B. GPDH) rehybridisiert.
Western Blot-Analyse
Für die Western Blot-Analyse wurden zelluläre Proteine unter Verwendung von 250 µl RIPA- Puffer (1 × PBS, 1% Nonidet P-0, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS) pro T25 Zellkulturflasche extrahiert. 25 µg Protein wurden elektrophoretisch in 12% SDS- Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Unter Einsatz von Anti-Plk1- (Transduction Laboratories) und Anti-Actin-Antikörpern (Sigma) wurden Plk1 und Actin nachgewiesen. Durch Einsatz von geeigneten mit Merrettich-Peroxidase konjugierten sekundären IgG (Jackson Immuno Research) und dem Chemolumineszenz- System (Amersham-Pharmacia Biotech) wurden die Immunkomplexe sichtbar gemacht.
Bestimmung der Zellproliferation und Cytotoxizität
Gegen eine Proliferation gerichtete Effekte wurden täglich durch Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit durch direktes Auszählen unter Einsatz des Trypanblau-Verfahrens ermittelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde täglich für 4 Tage nach Behandlung mit dem jeweiligen Antisense-ODN, Sense-ODN und einem beliebigen Kontroll-ODN ermittelt. Die Zellen wurden in 0,1% Trypanblau suspendiert und ausgezählt. Zu jedem Zeitpunkt wurde der Mittelwert aus drei Zählungen genommen und der Prozentsatz der lebensfähigen Zellen berechnet.
ODN-Behandlung an tieriechem Tumor-Modell
Die Tierstudien erfolgten an Gruppen mit 5 nackten, acht bis zehn Wochen alten Athymie- Mäusen (nu/nu) NMRI (Harlan Winkelmann). 2 . 106 A549- oder Detroit562-Zellen wurden subkutan injiziert und vor Beginn der Antisense-Behandlung nacheinander durch mindestens drei aufeinanderfolgende Transplantationen einer Passage unterworfen. Unter Betäubung mit Urethan wurden Tumorfragmente von ca. 20 bis 25 mg subkutan in die linke und rechte Seite des Tieres implantiert. Die Antisense-ODN-Behandlungen begannen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von 60 bis 80 mm3 erreicht hatten (7 bis 14 Tage nach der Transplantation). In Saline-Lösung gelöste ODNs wurden täglich als Bolusinjektion (200 µl) in die Schwanzvene in einer Dosis von 15 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Die Tumorgröße wurde mit einem Greifzirkel ermittelt und das Tumorvolumen mit der Formel V = π/6 . großer Durchmesser . kleiner Durchmesser2 berechnet. Zur Bestimmung von Plk1-mRNA in Tumorxenotransplantaten wurde aus herausgeschnittenen Tumoren die Gesamt-DNA isoliert und, wie oben beschrieben, mittels Northern-Blot-Analyse ermittelt.
Da das mit der Proliferation assoziierte Plk1-Gen in neoplastischen Zellen hoch exprimiert wird, wurde die Antisense-Strategie dazu verwendet, die Plk1-Expression in Zellkulturen abzusenken. Die Aufnahme der ODNs durch die Zellen wurde durch Bildaufnahmen der jeweiligen fluorescein-markierten ODNs überwacht. Die erfindungsgemäßen ODNs wiesen in Zellkulturen von A549 und Detroit 562 eine hohe Transfektionseffizienz (< 90%) auf. Die Aufnahme der ODNs durch A549 Tumorzellxenotransplantate wurde mittels Injektion der fluoresceinmarkierten erfindungsgemäßen ODNs an Athymie-Mäusen ermittelt.
Ergebnisse
Zusätzlich zu den Plk1 Antisense-Phosphorothioat-ODNs wurden die folgenden Kontrollen durchgeführt: a) eine Zufallssequenz aus dem Herpes simplex Virus und b) eine Sense- JWG2000-Sequenz.
Das dosisabhängige Verhalten für die Wirkung von JWG2000 bzw. JWG106 zeigte, daß sich schon nach einmaliger Anwendung der ODNs die mRNA von Pkl1 in A549-Zellen auf unter 10% der Kontrolle absenken ließ. Die entsprechende Wirkung für JWG2000 ist in Fig. 1A gezeigt. Der IC50-Wert für JWG2000 zur Unterdrückung der Plk1-Expression betrug 1 µM. Fig. 1B zeigt die entsprechende Wirkung von Sense-JWG2000. Eine ähnliche Wirkung auf JWG2000 wurde für Detroit 562-Zellen gefunden (nicht gezeigt).
Wie in Fig. 2 wiedergegeben, ergab sich bei Behandlung von A 549-Zellen mit 2 µM JWG2000 eine signifikante Verminderung von Plk1 auf Proteinniveau, während Pikl bei nur einer Lipofektion unterzogenen Zellen oder nach Transfektion mit 2 µM Sense-JWG2000 unverändert blieb. Der gleiche Blot wurde auch mit Anti-Actin-Antikörpern als Kontrolle für den Proteingehalt in jeder Bande erhalten.
Zur Ermittlung der antiproliferierenden Wirkungen von JWG2000 und/oder JWG160 wurden A549- und Detroit 562-Zellen entweder mit JWG2000 bzw. JWG160, den entsprechenden Sense-JWG2000 bzw. -JWG160 oder einer zufälligen Kontrolle oder nur mit Dotap behandelt. Behandlung mit Dotap allein oder den entprechenden Sense-ODNs oder dem Kontroll-ODN zeigten gegenüber den Zellen keine Wirkung. Im Vergleich zu den nur mit Dotap behandelten Zellen verminderte eine Behandlung mit JWG2000 bzw. JWG160 die Zahl lebensfähiger Zellen bis zu einem Totzellanteil von 80%. In Fig. 3 sind die entsprechenden Werte für die JWG2000-Wirkung wiedergegeben. Eine Behandlung mit der gleichen Konzentration von Kontroll(Zufalls)sequenz-ODN (aus Herpes simplex, nicht gezeigt) oder mit den entsprechenden Sense-JWG2000 bew. -JWG160 blieb ohne jegliche Wirkung. Somit ging die Unterdrückung der Plk1-Expression durch JWG2000 bew. JWG160 Hand in Hand mit der Abnahme von Proliferation und Lebensdauer der Krebszellen.
Demgegenüber wurde das Wachstum von primären menschlichen Mesangiumzellen und von menschlichen Amnion-Fibroblasten durch eine JWG2000- bzw. JWG160-Behandlung nicht signifikant beeinträchtigt (Daten nicht gezeigt), was zeigt, daß die wachstumshemmende Wirkung von JWG2000 bew. JWG160 selektiv für Krebszellen mit einer Überexpression von Plk1 ist.
Zur Untersuchung einer möglichen Antitumoraktivität von JWG2000 bew. JWG160 unter in vivo Bedingungen wurden A549-Zellen subkutan in Nacktmäuse injiziert, d. h. sie dienten als Mausmodell für ein menschliche Tumorxenotransplantat. Die Behandlung mit ODN begann nach mindestens drei Passagen entwickelter Tumore mit einem Minimaltumorvolumen von 60 bis 80 mm3. Die Tiere erhielten über 28 Tage eine tägliche ODN-Dosis von 15 mg/kg Körpergewicht. Das Volumen der Tumore wurde wöchentlich gemessen und das Tumorgewicht nach dem Töten der Tiere. In zwei unabhängigen in vivo-Experimenten war das Tumorgewicht während der ersten zwei Wochen nicht signifikant beeinflußt worden. Nach Fortsetzung der ODN-Gaben jedoch war eine signifikante Hemmung sowohl der Größe als auch des Gewichts im Vergleich mit den Kontrolltieren zu beobachten. Die entsprechenden Daten sind für JWG2000 in Fig. 4 wiedergegeben.

Claims (6)

1. Antisense-Oligodesoxynucleotid zur Hemmung der Expression der Polo-like Kinasel in Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß es
die Sequenz 5'-CCT GAC CAG CCC ACG CTC CG-3'
oder die Sequenz 5'-CCC AAA AAG CGG CCC C-3'
gegebenenfalls gegen Enzymabbau modifiziert, aufweist.
2. Antisense-Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Einbau von Phosphotriester- und/oder Phosphoramid und/oder Methylphosphonat- und/ oder Phosphorothioat und/oder Peptidnucleinsäuregruppen modifiziert ist.
3. Antisense-Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ausschließlich mit Phosphorothioatgruppen modifiziert ist.
4. Antisense-Oligodesoxynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Zellkulturen der menschlichen Krebszelllinien A549 und Detroit 562 eine Transfektionseffizient von über 90% aufweist.
5. Antisense-Oligodesoxynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich nach seiner einmaligen Anwendung an A549-Zellen die mRNA- Konzentration auf unter 10% einer Kontrolle senken läßt.
6. Antisense-Oligodesoxynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach Behandlung von A549- und Detroit 562-Zellen sich die Zahl lebensfähiger Zellen bis auf 20% senken läßt.
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