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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft ein Vakzin
und Immunogene, die wirksam zur Inhibierung des Wachstums von Brusttumoren
sind und das lokale oder metastatische Wiederauftreten des Brusttumors
inhibieren. Konkreter zeigt die Erfindung, dass die periphere Verabreichung
von Brusttumorimmunogenen, die aus Brusttumorzellen abgeleitet sind,
die mit einem Antisense-Oligonucleotid behandelt wurden, welches
komplementär
zum Gen oder der mRNA des IGF-1-Rezeptors sind, wirksam das Wachstum
von Brusttumorzellen inhibiert und die Metastase von Tumorzellen,
z. B. in das Gehirn verhindert.
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Hintergrund
der Erfindung
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Brustkrebs ist die häufigste
Malignität
bei Frauen in Nordamerika, welche bei einer von 9 Frauen klinisch
in Erscheinung tritt. Die Prevalenz von Brustkrebs ist verglichen
zu deren jährlicher
Häufigkeit
in anderen Staaten hoch (geschätzt
viermal höher
als die im Vereinigten Königreich).
Daher würde
eine Therapie dieser Krankheit einen signifikanten Vorteil für eine große Anzahl
einzelner Patienten als auch eine Entlastung der Mittel der Gesundheitsfürsorge liefern.
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Die gegenwärtige Behandlung von Brustkrebs
ist auf die nichtspezifische Eliminierungsresektion, Verabreichung
von Mitteln, die gegenüber
wachsenden Zellen toxisch sind oder Inhibierung von Rezeptorliganden,
die für
das Zellwachstum benötigt
werden, gerichtet. Beispiele schließen Bestrahlung, cytotoxische
Chemotherapie (z. B. Doxorubizin, Cyclophosphamid, Methotrexat,
5-Fluoruracil, Mitomycin C und Mitoxantron) oder hormonelle Manipulation
zur Tilgung (z. B. Ovarialablation) oder zur Antagonisierung (z.
B. Tamoxifen, Aromatase-Inhibitoren) der Östrogen/Progesteron-Stimulierung
des Tumorwachstums ein. Aufgrund von deren Mangel an Tumorspezifität werden
diese Therapien schlecht toleriert und werden unwirksam, wenn die
Erkrankung stark metastatisch ist.
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Diese Therapien besitzen zusätzliche
Beschränkungen.
Hohe Dosen cytotoxischer Agenzien, die für die therapeutische Wirksamkeit
benötigt
werden, zerstören
auch sich normal teilende immunologische Zellen und Gastrointestinal-Zellen.
Daher ist die Verabreichung von cytotoxischen Mitteln bei Neutropenie,
Thrombozytopenie und Fehlernährung
beschränkt.
Bestrahlung und operative Therapien sind auf eine relativ lokalisierbare
Erkrankung beschränkt.
Alle Strategien sind durch den Grad der Deformität und/oder den Nachteil, dass Patienten
für nur
eine mäßige Steigerung
des Überlebens
tolerierungswillig sind, beschränkt.
Daher besteht Bedarf an einer Therapie, die spezifisch auf die Malignität eines
Patienten zielt und die nicht die Qualität des dem Patienten verbleibenden
Lebens reduziert.
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Brustkrebse sind schwierige Ziele,
da sie hinsichtlich einer Vielzahl von Merkmalen heterogen sind, einschließlich z.
B. des Vorkommens und der Abwesenheit von Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren
und Vorkommen und Abwesenheit von amplifizierten Wachstumsfaktorrezeptoren.
Zusätzlich
können
die Tumorzellen eine Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen bei
somatischen Proto-Onkogenen besitzen, wie c-erb2, c-myc, int2, hst1,
bcl1 und PRAD1 oder Tumorsuppressorgenen, einschließlich RB
und TP53. Desweiteren kann ein Patient mehr als einen malignen Zellltyp
im gleichen Tumor besitzen.
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Eine Population verschiedenartiger
Ziele jedoch ist genau das, wofür
das Immunsystem eines Wirts bestimmt ist, um zu screenen und selektiv
zu eliminieren. Vakzin basierte Immunotherapie ist erwiesenermaßen wirksam
bei der Behandlung von Tiermodellen anderer Krebstypen. Die Diversität der Ziele
bei Brustkrebs plus der Wirksamkeit bei anderen Krebstypen legt
nahe, dass die Entwicklung einer Vakzin basierten Immunotherapie
wirksam zur Behandlung von Brustkrebs sein kann.
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Antisense-Oligonucleotide
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Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen,
die komplementär
zu spezifizierten Segmenten eines Zielgens oder einer mRNA sind.
Die Bindung eines Antisense-Oligonucleotids an DNA oder RNA innerhalb
einer Zelle kann die Translation oder Transkription in der Zelle
inhibieren, was die Genexpression unterbrechen kann. Typischerweise
sind Antisense-Oligonucleotide etwa 14 bis etwa 25 Nucleotide lang,
da angenommen wird, dass wenigstens etwa 14 Basen benötigt werden
um eine einzigartige Säugergensequenz
spezifisch zu treffen. Die Sequenz eines Antisense-Oligonucleotids
wird gewählt,
um Spezifität
gegenüber
einem bestimmten Säugergen
oder einer mRNA-Sequenz zu liefern.
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Antisense-Oligonucleotide können sowohl
mit natürlichen
als auch synthetischen Basen und mit natürlichem Phosphat oder modifiziertem
Phosphat oder Zuckerrückgrat
synthetisiert werden. Zum Beispiel können Phosphothioat, Phosphonat
und andere Rückgratmodifikationen
signifikant die biologische Halbwertszeit und Bioverfügbarkeit
der Antisense-Oligonucleotide verändern.
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Fortschritte der Molekularbiologie
und synthetischen Chemie über
die vergangenen zwei Jahrzehnte haben das Interesse an der Entwicklung
von Antisense-Oligonucleotiden
als therapeutische Mittel angeregt. Es wäre vorteilhaft eine Antisense-Oligonucleotid
basierte Therapie des Brustkrebs zu entwickeln, um eine gezielte
Immunotherapie bereit zu stellen.
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Insulinähnlicher
Wachstumsfaktor und dessen Rezeptor
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Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren
sind Beispiele für
molekulare Schalter, deren Aktivierung ein Signal an den Zellkern überträgt, das
Wachstum, Transformation und Schutz vor dem Zelltod ermöglicht. Der
insulinähnliche
Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und dessen Rezeptor (IGF-1R) scheinen
für die
Mitose in vielen Zelltypen benötigt
zu werden. In vitro hängen
die meisten Zellen in Kultur hinsichtlich des Wachstums von IGF-1
ab und viele Tumorlinien sekretieren IGF-1 und exprimieren IGF-1R.
IGF-1R wird für
den Eintritt von stimulierten Lymphocyten und HL-60-Zellen in die
S-Phase benötigt.
Bei der Abwesenheit der Proliferation, wie bei alternden menschlichen
Fibroblasten, ist IGF-1-mRNA nicht durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
nachweisbar. Sobald diese alternden Zellen mit einem temperatursensitiven
SV40T-Antigen-Gen transfiziert sind, erlangen sie die Fähigkeit
der Expression von IGF-1-mRNA bei zulässigen Temperaturen wieder.
IGF-1R ist auch mit dem in vivo-Wachstum verknüpft. Mäuse mit homozygoten Nullmutationen des
igf-lr-Gens sterben kurz nach deren Geburt mit einem Körpergewicht
von 30% des Wildtyps.
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Die Exprimierung von IGF-1R könnte für die Transformierung
in vitro und für
den Tumorerhalt in vivo notwendig sein. Wenn das IGF-1R kodierende
Gen in Mausembryofibroblasten unterbrochen ist, wird die Transformation
durch entweder Ha-ras, SV40-Tumorantigen oder beide verhindert.
Der transformierte Phänotyp
wird wieder hergestellt, sobald Zellen mit einem Plasmid transfiziert
werden, welches die IGF-1R-RNA exprimiert. Überexprimierung von IGF-1R
führt zu
einer erhöhten
Transformierbarkeit von NIH-3T3-Zellen. Nicht nur die Onkogenese
ist mit der Induktion von IGF-Genen verbunden, vielmehr legen vorläufige Daten
nahe, dass das Genprodukt des Retinoplastoma-Tumor-Suppressorgens
die Exprimierung des IGF-1-Gens inhibiert.
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Der IGF-1-Rezeptor (IGF-1R) ist ein
Membranglykoprotein bestehend aus zwei Alpha- (Mr 130.000) und zwei
Beta- (Mr 89.000) Untereinheiten, die durch Disulfidbindungen miteinander
verbunden sind. Die Alpha-Untereinheit bindet IGF-1 und IGF-2 mit
gleicher Affinität.
Die β-Untereinheit besitzt eine intrazelluläre Domäne mit Tyrosinkinase-Aktivität, die nach
Aktivierung durch entweder IGF-1 oder IGF-2 deren eigene ß-Untereinheit
und zwei Hauptsubstrate, Insulinrezeptorsubstrat 1 und Shc autophosphoriliert.
Einmal aktiviert überträgt IGF-1R
ein Signal, welches durch ras und raf an den Nucleus übermittelt
wird. IGF-1 stimuliert bekanntermaßen die Exprimierung von ungefähr 30 Genen,
die in 3T3-Zellen exprimiert werden, die sowohl für cytoplasmatische
als auch Kern-Proteine kodieren. Innerhalb einer Minute der IGF-1R-Ligandenbindung
werden auch eine Serie anderer zellulärer Proteine wie auch Kern-Proteine
einschließlich
dem 43-kD-Produkt des c jun-Protoonkogens in vitro phosphoryliert.
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Der IGF-1R wird für die Wirkung verschiedener
Wachstumsfaktoren benötigt.
Antisense gegenüber IGF-1R
blockiert die EGF-stimulierte Proliferation von 3T3-Zellen, die EGFR überexprimieren.
Weder PDGFR- nach EGFR-Antisense inhibieren IGF-1-stimuliertes Wachstum
in Zellen, die IGF-1R überexprimieren.
Es gibt Beweise, dass andere Protoonkogene wie c-myb die Exprimierung
von IGF-1 und IGF-1R exprimieren. Wenn c-myb in Fibroplasten überexprimiert
wird, geht die Notwendigkeit von IGF-1 für das Wachstum verloren, da sowohl
IGF-1 als auch IGF-1
R-mRNA induziert wird. Wenn c-myb-Exprimierung inhibiert wird, folgt
eine Abnahme bezüglich
der IGF-1R-mRNA. Die Inhibierung der IGF-1R-Exprimierung besitzt
jedoch keine Wirkung auf die c-myb-mRNA-Niveaus.
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IGF-1R-Antisense kann das Wachstum
von Zellen, deren Wachstum von der Exprimierung von IGF-1R abhängt, inhibieren.
Zellen, die IGF-1R-Antisense ausgesetzt sind, und Zellen, die mit
einem viralen Vektor transfiziert sind, der IGF-1 R-Antisense exprimiert, zeigen verringerte
Niveaus des IGF-1R-Proteins. Dies führt zu einer Wachstumsinhibierung
bei IGF-1R-abhängigen
Zellen wie Ratten-C6-Glioblastomazellen, einer
IGF-1R-abhängigen
Tumorzelllinie. Verringerte tumorerzeugende Wirkung rührt von
der Transfektion von C6-Glioblastomazellen mit einem viralen Vektor,
der IGF-1R-Antisense exprimiert, her. Zum Beispiel entwickelten
sich keine Tumoren in Ratten, denen C6-Glioblastomazellen, die einen
viralen Vektor, der IGF-1R-Antisense exprimiert, tragen, injiziert
wurden. Die Injektion mit diesen Antisense-transfizierten Zellen
kann Ratten auch vor der Glioblastomatumorbildung aufgrund nachfolgender
Injektion mit C6-Glioblastomazellen
des Wildtyps schützen.
Innerhalb von 4 Wochen nach der Injektion der Zellen des Wildtyps
traten keine Tumorzellen auf. Die Injektion der Antisense-transfizierten
C6-Glioblastomazellen verursachte ebenfalls eine Regression von zuvor
gebildeten C6-Glioblastomatumoren des Wildtyps. In jedem dieser
Experimente wurden die Zellen, die verringerte tumorerzeugende Wirkung
zeigten oder das Tumorwachstum beeinflussten, mit einem viralen
Vektor transfiziert um IGF-1R-Antisense zu exprimieren.
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Die Arbeit bis heute, die das Untersuchen
von IGF-1 R-Antisense in Krebszellen betrifft, wurde durch Transfizieren
von Zellen mit Antisense-DNA, die in einen vitalen Vektor integriert
ist, durchgeführt.
Die Konsequenzen der insertion viraler DNA in menschliche Gliomas
sind unbekannt. Geschätzte
23 Menschenjahre des retroviralmediierten Gentransfers sind an Menschen
ohne bekannte Nebenwirkungen durchgeführt worden, obgleich einige
der vitalen Vektoren, die zur Gentherapie verwendet werden, das
Langzeitpotenzial zur Krebsverursachung tragen. Nebenwirkungen wurden
am NIH bei 3 Affen beschrieben, die maligne T-Zell-Lymphoma nach einer
Knochenmarkstransplantation und Gentransfer mit einem Helfervirus
kontaminierten Retrovirus entwickelten. Abgesehen von den potenziellen
Nebenwirkungen und Risiken vitaler Kontamination ist die Verwendung
viraler Vektoren zur Transfektion jeder Tumorlinie mit Antisense
sehr arbeitsintensiv.
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Der praktische Nutzen der Antisense-Gentherapie
wäre durch
Inkorporierung von Antisense-Oligonucleotiden in die Brust- oder
andere Tumorzellen ohne die Verwendung eines retroviralen Vektors
stark gesteigert. Im Lichte der vorliegenden Unzulänglichkeiten
der Brustkrebstherapie wäre
es vorteilhaft, eine Therapie zu besitzen, die spezifisch das Wachstum
und die Metastase von Brustkrebszellen ohne die Nebenwirkungen der
jetzigen Therapien inhibiert. Antisense-Oligonucleotide stellen einen Weg für eine solche
Therapie dar, jedoch verlangen gegenwärtige Behandlungsverfahren
mit Antisense-Oligonucleotiden vitale Vektoren und haben nicht die
Wirksamkeit bei der Wachstumsinhibierung und Metastase von Brustkrebszellen
bewiesen. Folglich besteht ein Bedarf an einer Antisense-Oligonucleotid basierten
Therapie des Brustkrebs, die die Verwendung viraler Vektoren ausklammert.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung schließt eine
therapeutische Zusammensetzung ein, die nützlich zur Inhibierung des
Wachstums von Brustkrebszellen ist. Die Zusammensetzung schließt ein Tumorzellimmunogen ein,
welches eine solche inhibierende Aktivität besitzt, welches ableitbar
ist von Brustkrebszellen nach der Behandlung besagter Zellen mit
einem IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid. Vorzugsweise sind
die behandelten Brustkrebszellen inaktiviert, z. B. nicht lebend.
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Das bevorzugte Immunogen ist eine
inaktivierte Krebszelle, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid (AON) behandelt
wurde. Das Immunogen kann ganze Zellen, Zellmembranen, Lysate oder
Extrakte von Krebszellen, die mit IGF-1 R-Antisense-Oligonucleotid behandelt wurden,
einschließen.
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Das Antisense-Oligonucleotid, welches
zur Herstellung des Immunogens verwendet wurde, ist komplementär zu dem
Gen oder der mRNA des insulinähnlichen
Wachstumsfaktor-Typ-1-Rezeptors (IGF-1R). Vorzugsweise ist das IGF-1R-Antisense-Oligonucleotid
ungefähr
14 bis ungefähr
25 Nucleotide lang. Noch bevorzugter besitzt das IGF-1R-Antisense-Oligonucleotid
eine Sequenz, die komplementär
zu der Nucleotidsequenz der menschlichen IGF-1R-Vorläufersignalsequenz,
komplementär
zur Nucleotidsequenz an oder nahe der Ausgangsstelle oder komplementär zur Sequenz
des Nucleotids an oder nahe der Stelle des Ribosomenkomplex-Zusammenbaus
ist.
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Noch bevorzugter enthält die Sequenz
des IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotids
die folgende Sequenz:
5' TCC
TCC GGA GCC AGA CTT 3' (AON1)
[SEQ ID NO: 1], oder
5' ACT
CGT CGG CCA GAG CGA GAG 3' (AON2)
[SEQ ID NO: 2].
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Vorteilhaft ist das IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
modifiziert, z. B. durch Einschluß synthetischer Basen oder
Modifizierung des Rückgrats,
wie durch Substituieren von Phosphotioaten oder Phosphonaten.
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Die Erfindung schließt auch
ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung durch
Behandeln von Brustkrebszellen mit einem IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid ein.
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Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform
ist ein Tumorzell-Immunogen, das von Brustkrebszellen abgeleitet
ist, die mit einem IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid behandelt wurden.
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Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
ist ein IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid mit
der Sequenz:
5' ACT
CGT CGG CCA GAG CGA GAG 3' (AON2)
[SEQ ID NO: 2].
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Die Erfindung stellt ein Tumorzell-Immunogen
bereit zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines
Brustkrebspatienten; in einem Verfahren zur Inhibierung des Wachstums
von Brustkrebszellen; in einem Verfahren zur Inhibierung der Metastase
von Brustkrebszellen, einschließlich
der Inhibierung von Brustkrebszellmetastase hinter der Blut-Hirnschranke;
und in einem Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs. Jedes dieser
Verfahren schließt
das Verabreichen eines Tumorimmunogens, hergestellt durch Behandeln
von Brustkrebszellen mit einem IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
an einen Patienten ein und dadurch Induzierung einer Antitumor-Antwort.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkungen einer Behandlung
mit bestrahlten Zellen, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
AON1 vorbehandelt wurden, auf Tumorvolumen in Ratten mit MAT3B-Brusttumoren
zeigt.
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2 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Behandlung mit
bestrahlten Zellen, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
AON1 vorbehandelt wurden, auf das Überleben von Ratten mit MAT3B-Brusttumoren
zeigt.
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3 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Behandlung mit
bestrahlten Zellen, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
AON2 vorbehandelt wurden, auf das Tumorvolumen in Ratten mit MAT3B-Brusttumoren
zeigt.
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4 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Behandlung mit
bestrahlten Zellen, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
AON2 vorbehandelt wurden, auf das Überleben von Ratten mit MAT3B-Brusttumoren
zeigt.
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5 ist
eine graphische Darstellung, die die Wirkung der Behandlung mit
bestrahlten Zellen, die mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotiden
AON-1 oder AON-2 vorbehandelt wurden, auf das Überleben von Ratten mit intracerebralen
Tumoren von MAT3B-Brusttumorzellen zeigt.
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6 zeigt
die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons des IGF-1-Rezeptors [SEQ ID
NO:4] und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, wie sie von Ullrich
et al., EMBO J 5: 2503–2512
(1986) berichtet wurde. Die α-Untereinheit schließt die Aminosäuren, die
mit 31–740
nummeriert sind ein, die mutmaßliche
Vorläufer-Processing-Sequenz
liegt bei den Aminosäuren
737–740,
und die Aminosäuren
der ß-Untereinheit bei 741–1367. Aminosäuren 1–30 stellen
eine Signalsequenz mit 30 Resten dar. Von den Aminosäuren 936–959 wird
angenommen, dass sie eine transmembranale Domain bilden.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Antisense-Oligonucleotide
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Antisense-Oligonucleotide sind Nucleotidsequenzen,
die komplementär
zu vorgegebenen Segmenten eines Zielgens oder einer mRNA sind. In
der vorliegenden Erfindung ist ein IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
komplementär
zu einem Segment des IGF-1-Rezeptor-Gens oder zu IGF-1-Rezeptor-mRNA.
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Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide
sind vorzugsweise ungefähr
14– 25
Nucleotide lang. Am bevorzugtesten sind die Oligonucleotide etwa
15–20
Nucleotide lang. Es wurde abgeschatz , dass ein Antisense-Oligonucleotid,
das wenigstens 14 Basen enthält,
benötigt
wird, um spezifisch auf eine einzige Säugergensequenz zu zielen, obgleich
längere
Oligonucleotide größere Spezifität beim Zielen
auf eine spezifische Sequenz besitzen. Kleine Oligonucleotide sind
jedoch vorteilhaft, weil sie gewöhnlich
schneller durch Zellen aufgenommen werden und verbesserte Absorption
und ähnliche
Eigenschaften zeigen. Daher wird die bevorzugteste Größe, 15–20 Nucleotide,
gewählt
um einen Ausgleich zwischen Zielspezifität und verbesserter Aufnahme
durch Zellen zu erreichen. Die bevorzugte Oligonucleotidsequenz
kann Basenpaare des Watson-Crick-Typs entlang der gesamten Zielsequenz
bilden, es kann jedoch weniger Basenpaarung toleriert werden, wenn
vorteilhafte Zellaufnahme, Pharmakokinetik oder Metabolismus und
adäquate
Zielerkennung aus der geänderten
Sequenz resultieren.
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Die besondere Sequenz des Nucleotids
stattet das Molekül
mit der Spezifität
zur zielgerichteten Ansteuerung genetischen Materials, wie DNA oder
mRNA aus. Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide
besitzen Sequenzen, die komplementär zum IGF-1-Rezeptorgen oder
mRNA sind. Bevorzugte Oligonucleotide sind solche, die zu einer
Sequenz, die IGF-1-Rezeptor-Vorläufersignalpeptid
kodiert, zu Sequenzen an oder nahe dem Ausgangspunkt (AUG-Kodon)
oder solchen Sequenzen an oder nahe der Stelle des Ribosomenkomplex-Zusammenbaus,
einer Stelle, an welcher ein Ribosom an ein Polynucleotid bindet,
komplementär
sind. Eine Sequenz ist nahe an einer Stelle an einem Oligo- oder
Polynucleotid, wenn eine komplementäre Sequenz mit der Funktion
der Stelle überlappen
oder interferieren würde.
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Die bevorzugtesten erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide
sind Oligonucleotide AON1 [SEQ ID NO:1] und AON2 [SEQ ID NO:2],
die die oben gezeigten Nucleotidsequenzen besitzen. Die Antisense-Oligonucleotide
können
mittels bekannter Standardmethoden einschließlich chemischer Synthese hergestellt werden.
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Die erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotide
können
chemisch modifiziert werden, wie durch Einschließen synthetischer Basen oder
durch Modifikationen des Phosphat- oder Zücker-Rückgrats. Solch eine chemische
Modifikation kann die Stabilität
und biologische Halbwertszeit dieser Verbindungen durch Reduktion
der Sensitivität
gegenüber
Abbau durch Exonucleasen, wie 3'-Exonucleasen
und Endonucleasen steigern. Bevorzugt sind Modifikationen, die das
Phosphat-Rückgrat
betreffen, so wie Phosphorothioat-, Phosphorodithioat-, Methylphosphonat-
und Phosphoramidit-modifizierte Oligomere, da diese stabil und gewöhnlich resistent
gegenüber
Abbau durch Nucleasen sind. Die biologische Halbwertszeit einer
Phosphorothioat-Antisense-Sequenz wurde zum Beispiel auf ungefähr 48 Stunden
bestimmt. Der Ribose-Teil des Zucker-Rückgrats kann ebenfalls modifiziert
werden. Zum Beispiel können
2'-Methyl-Ribonucleotide
und ?-Anomer-Nucleotide in die Antisense-Oligonucleotide aufgenommen
werden. Herstellung und Eigenschaften modifizierter Oligonucleotide
sind in „Oligonucleotides-Antisense
Inhibitors of Gene Expression",
J. S. Cohen Hrsg., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1989) beschrieben.
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Die bei der Behandlung von Brusttumorzellen
benötigte
Menge an Antisense-Oligonucleotid
ist eine Menge, die wirksam ist, die Aktivität der Brusttumorzellen als
Tumor-Immunogen zu steigern. Vorzugsweise ist das Antisense-Oligonucleotid
wirksam ein Immunogen zu produzieren, dass eine solche Wirksamkeit
besitzt, dass ein Patient mit einem Äquivalent von ungefähr 2,5 × 109 behandelte Zellen pro 75 kg Körpergewicht
inokuliert werden kann. Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Immunogens
werden ungefähr
30 × 106 Zellen in einer Lösung von ungefähr 5 μM bis ungefähr 80 μM Antisense-Oligonucleotid
inkubiert, bevorzugter ungefähr
10 μM bis
ungefähr
40 μM Antisense-Oligonucleotid.
Das Antisense-Oligonucleotid kann Zellen in Suspension oder Kultur,
in Zellkulturmedium oder einem anderen Träger zugegeben werden.
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Mechanismus der Antisense-Wirkung
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In der vorliegenden Erfindung verändert die
Behandlung von Brusttumorzellen mit einem IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
die Tumorzellen so, dass diese ein Brusttumorimmunogen produzieren.
Solch eine modifizierte Brusttumorzelle ist ein bevorzugtes Tumorimmunogen
zur Verwendung bei der Hemmung des Wachstums von Brustkrebszellen.
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Wenngleich es nicht für die vorliegende
Erfindung beschränkend
ist, gibt es verschiedene Mechanismen, die für die Produktion eines solchen
Immunogens verantwortlich sein können.
Zum Beispiel kann die Behandlung mit dem Antisense-Oligonucleotid in
einer Änderung
des Phänotyps
der behandelten Zellen, sodass die Zellen ein Tumorimmunogen werden,
resultieren. Alternativ kann die Genexpression verändert werden
mit dem Resultat gesteigerter Expression oder dem Zeigen eines Antigens
oder Immunogens gegenüber
Brusttumor auf den behandelten Zellen. Es wird angenommen, dass
die Bindung eines Antisense-Oligonucleotids an DNA oder RNA innerhalb
einer Zelle die Translation und Transkription inhibieren kann, was
die Genexprimierung unterbrechen kann.
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Verschiedene Theorien sind herangezogen
worden, um die allgemeine Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden
in einer Vielzahl von Systemen zu erklären. Vorgeschlagene Mechanismen
der Wirkung der Antisense-Oligonucleotide können als passive, reaktive
und aktivierende klassifiziert werden. Passive Blockierung der Funktion
tritt durch sterische Hinderung ein, wobei ein mRNA-Molekül nicht
wirksam mit Ribosomen Wechselwirken kann oder nicht in der Lage
ist vom Kern zum Cytoplasma zu gelangen. Reaktive Prozesse treten auf,
wo Antisense-Oligonucleotide
direkt an eine Zielsequenz binden und entweder deren Wirkung blockieren oder
deren Spaltung verursachen.
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Zum Beispiel kann die Bindung von
Antisense-Oligonucleotiden an Ziel-DNA die Gentranskription unterbrechen
oder wenn Antisense-Oligonucleotide an mRNA binden, wird die Translation
unterbrochen. Folglich kann die Synthese eines bestimmten Proteinprodukts
inhibiert werden. In zellfreien Translationssystemen werden als
beste mRNA-Zielstellen das 5'-Ende
(an oder nahe dem Iniziations-AUG Kodon) und an oder nahe dem Ort
des Ribosomenkomplex-Zusammenbaus in Betracht gezogen. Die Spaltung
ist vorteilhaft, da sie die Ziel-DNA oder -RNA zerstört. Darüber hinaus
wird, wenn eine Ziel-DNA oder -RNA gespalten wird, das Antisense-Oligonucleotid
intakt freigegeben, um wiederververtet zu werden und um an andere
Zielsequenzen zu binden. Die Aktivierungsmechanismen von RNase-H
führen
zur Verdauung der Ziel-mRNA unabhängig vom Ort der Antisense-Anlagerung.
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Die Modifizierung des Antisense-Oligonucleotids
kann vorteilhafte Wirkungen auf den Mechanismus oder die Wirkung
des Antisense-Oligonucleotids besitzen. Zum Beispiel hybridisieren
Phosphordiester-Antisense-Oligonucleotide sehr effizient mit komplementären RNA-Sequenzen
und blockieren dadurch die Translation, sie können jedoch auch das Enzym
RNase-H heranziehen, welches die RNA-Komponente des RNA/DNA-Duplex spaltet.
Methylphosphonat-Antisense-Oligonucleotide
werden schnell durch Zellen aufgenommen, besitzen geringe Toxizität und hohe
Stabilität,
sie hybridisieren jedoch schlecht und induzieren vielleicht nicht
die Aktivität
von RNase. Phosphorothioat-Antisense-Oligonucleotide hybridisieren
im Gegensatz dazu effizient und induzieren RNase in einer konzentrationsabhängigen Art
und Weise. Basierend auf diesen Wirkungstheorien können Phosphorothioat-Antisense-Oligonucleotide
mit Resistenz gegenüber
Endonucleaseaktivität
vorteilhaft bei den Immunogenen und den erfindungsgemäßen Verfahren
sein.
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Behandelte Tumorzellen
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Erfindungsgemäßes Tumorimmunogen sind vorzugsweise
ganze Tumor- oder Krebs-Zellen, die mit einen Antisense-Oligonucleotid,
das komplementär
zu dem IGF-1-Rezeptor-Gen oder zu mRNA ist, behandelt wurden. Immunogen,
wie es hierin verwendet wird, bezeichnet eine Substanz, die eine
Immunantwort induzieren kann, einschließlich entweder einer humoralen
und/oder einer zellulären
Immunantwort. Das Tumorimmunogen kann auch von behandelten Tumorzellen abgeleitet
sein in dem diese Prozessen, wie veränderndem Wachstumsmedium, Waschen,
Reinigen, Isolieren, Einfrieren, Inaktivierung, Lyse, Extraktion
und dergleichen unterzogen werden.
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Die Behandlung kann eine Einzeldosis
oder mehrfache Dosen von Antisense-Oligonucleotid einschließen. Vorzugsweise werden Tumorzellen mit zwei Dosen
Antisense-Oligonucleotid behandelt. Typischerweise wird, wenn die
Behandlung zwei Dosen Oligonucleotid einschließt, eine Dosis des Antisense
bei Beginn der Inkubation zugegeben und eine zweite wird ungefähr nach
der Hälfte
der Inkubation zugegeben. Vorzugsweise werden die Zellen zur Behandlung
mit Antisense-Oligonucleotid
etwa 23 Stunden inkubiert, und dann bis 1 oder 2 Stunden vor deren
Verwendung als Vakzin oder Immunogen oder vor der weiteren Behandlung
in Kultur gehalten. Die Behandlung der Zellen wird vorzugsweise
unter den Kulturbedingungen, die für den Tumorzelltyp günstig sind,
im Allgemeinen bei einer Temperatur von 37°C und in einem Nährstoffmedium,
wie RPMI-Zellkulturmedium, durchgeführt.
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Nach der Behandlung mit Antisense-Oligonucleotid
werden die Zellen inaktiviert, vorzugsweise durch Bestrahlung. Behandelte
inaktivierte Zellen werden mittels Verfahren, wie schnellem Einfrieren
bei –80°C bewahrt,
die die Immunogenität
der gelagerten Zellen erhalten. Dieses Verfahren führt zu Tumorimmunogen,
das aus behandelten Brustkrebszellen abgeleitet ist. Die Bedingungen
der Kultur und Inkubation mit dem Antisense-Oligonucleotid können gewählt werden,
um die effektive Produktion von Tumorimmunogen zu liefern.
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Das Tumorimmunogen wird vorzugsweise
aus dem Tumor eines spezifischen Patienten hergestellt, zum Beispiel
aus Biopsiegewebe oder aus Explantaten eines entfernten Tumors oder
aus der Zellkultur der Tumorzellen des Patienten. Die Tumorzellen
eines Patienten können
mittels Standard-Biopsieverfahren erhalten werden. Zellen von herausgeschnittenem
Tumorgewebe können
direkt vervendet werden oder alternativ können Zellen von herausgeschnittenem
Tumor unter Standard-Kulturbedingungen kultiviert und expandiert werden
um eine gesteigerte Anzahl an Zellen zu produzieren. Tumorzellen
eines Patienten können
auch verwendet werden um eine permanente Tumorzelllinie zu etablieren,
die dann behandelt werden kann, um das erfindurgsgemäße immunogen,
das erfindungsgemäße Immunogen
oder Vakzin zu bilden oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet zu
werden.
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Tumorzellen sind vorzugsweise inaktiviert,
zum Beispiel durch auf diesem Gebiet bekannte Verfahren, wobei das
bekannteste Verfahren, wie in den unten stehenden Beispielen beschrieben,
die Bestrahlung ist. Andere bekannte Inaktivierungsverfahren schließen Sauerstoffentzug,
die Verwendung von Pflanzenund Tiertoxinen und chemotherapeutische
Mittel ein. In einer alternativen Ausführungsform können lysierte
Tumorzellen als Tumorimmunogen verwendet werden, wie auch Zellmembranen
und spezifische Tumorzellprotein-Immunogene; inaktivierte ganze
Tumorzellen sind jedoch bevorzugt.
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Zur Verabreichung wird das Tumorimmunogen
in einem wässrigen
Medium, wie Phosphat gepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Die Menge
des verabreichten Tumorimmunogens ist so ausreichend, dass eine Immunantwort
induziert wird. In Studien an Ratten war die Verabreichung von 5 × 106 bestrahlten Tumorzellen in 300 μl Phosphat
gepufferter Kochsalzlösung
wirksam Tumorwachstum zu verhindern. Daher beträgt die erwartete brauchbare
Dosis beim Menschen an bestrahlten Tumorzellen für eine subkutane Injektion
ungefähr 2,5 × 109 Zellen pro 75 kg Person. Die Verabreichung
von anderen Typen von Tumorimmunogenen, zum Beispiel Zellmembran-
oder gereinigten Tumorzell-Immunogenen, wird verabreicht um eine
gleiche Menge Immunogen zuzuführen.
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Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung
schließt
Tumorzellimmunogen in einer Form, die zur Verabreichung an einen
Patienten geeignet ist, ein. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung Zusätze, Co-Faktoren
und pharmazeutisch akzeptable Träger,
Trägersubstanzen
oder Puffer und dergleichen zur Formulierung der Zusammensetzung
zur Verabreichung an einen Patienten einschließen. Die therapeutische Zusammensetzung
kann eine oder mehrere Formen des Tumorzellimmunogens in Mengen
einschließen, die
wirksam zur Stimulierung einer Immunantwort im Patienten sind. Die
erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung
kann als Vakzin formuliert und verabreicht werden. Vakzin, wie es
hierin verwendet wird, bezeichnet eine therapeutische Zusammensetzung,
die zur Verabreichung formuliert ist um eine Krankheit wie Krebs
zu verhindern, zu verbessern oder zu behandeln.
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Verfahren der
Verabreichung
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Für
das Vakzin, Immunogen und die erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Verabreichung
des Brusttumorimmunogens zur Inhibierung des Wachstums von Brustkrebszellen
und der Behandlung von Brusttumoren an eine periphere Stelle, vorzugsweise
durch subkutane Injektion. Bevorzugte periphere Stellen zur Verabreichung
schließen
den Oberarm, den Schenkel und Rumpfbereiche des Körpers ein.
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Die Wahl des Behandlungszeitpunkts
der Tumorimmunogenverabreichung erfolgt so wie es notwendig ist
um eine Immunreaktivität
herzustellen und kann durch Beurteilung der Änderung der Tumorgröße (zum
Beispiel durch MRI), Immunantwort (zum Beispiel durch Hypersensitivitäts-Hauttest
des verzögerten
Typs) und durch Messung der Interferon-gamma Sekretion der TH-1-Zellen
des Patienten als Antwort auf das Tumorimmunogen überwacht
werden. Die Behandlung wird vorzugsweise fortgesetzt bis eine Immunantwort
detektiert und/oder Tumorablation erreicht ist.
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Patienten-Populationen
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Patienten, die gefährdet sind
oder an allen Typen von Brusttumoren leiden, werden mit einem erfindungsgemäßen Immunogen
behandelt. Eine erfolgreiche periphere Verabreichung des Tumorimmunogens zur
Behandlung von Brusttumoren ist überraschend
in Anbetracht des entfernten Orts der Tumore. Behandlung mit Brustkrebstumorimmunogen
ist besonders nützlich
bei der Verhinderung des Wiederauftretens des Tumors, zum Beispiel
nach Tumorreduktionstechniken, wie dem operativen Entfernen der
Hauptmasse des Tumors (surgical debulking removal), der Bestrahlung
und/oder der Chemotherapie.
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Die Behandlung von Brustkrebstumoren
kann auch zur Inhibierung des Wachstums von Brusttumorzellen, der
Tumorregression, der Verzögerung
des oder Verlangsamung des Tumorwachstums, der Reduktion der Tumormasse
und anderen günstigen
Wirkungen auf die Tumorprogression führen. Inhibierung des Wachstums
von Brusttumorzellen schließt
das Verlangsamen der Teilung oder Töten der Zellen ein. Inhibiertes
Zellwachstum führt
zu langsamerem Tumorwachstum, welches vom Wachstum individueller
Zellen abhängt.
Behandlung oder Verhinderung von Metastasenbildung schließt das Stoppen,
Verlangsamen oder Verzögern
der Ausbreitung der Brustkrebstumorzellen auf andere Gewebe oder
Organe im Patienten ein. Verhindern von Brustkrebs in einem Patienten
bezieht sich auf die Behandlung brustkrebsgefährdeter Patienten um den Ausbruch
von Brustkrebs zu verzögern
oder zu verhindern. Die Verhinderung kann als eine Reduktion des
Auftretens von Brustkrebs in einer brustkrebsgefährdeten Population bestimmt
werden. Alternativ schließt
die Verhinderung von Krebs in Brustkrebsüberlebenden die Hemmung des
Wiederauftretens oder erneuten Wachstums von Brustkrebs ein. Die
Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen
Zusammensetzung hemmt wirksam das erneute Wachstum des Tumors, z.
B. aus Resttumorzellen.
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Beispiele
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Die Erfindung wird durch Bezugnahme
auf die folgenden detaillierten Beispiele, welche in ihrer Natur beispielhaft
sind und nicht bestimmt sind, den Umfang der Erfindung zu beschränken, weiter
beschrieben.
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Beispiel 1
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Vakzination mit Brusttumorzellen,
die mit IGF-1-Rezeptor(AON1)-Antisense-Oligonucleotid behandelt
wurden
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Zwei IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotide
wurden verwendet um Tumorzellimmunogene zur Inhibierung des Brustkrebswachstums
zu produzieren.
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Die erste verwendete Sequenz war
eine bekannte Antisense-Sequenz, AON1 [SEQ ID NO:1], die komplementär zur Nucleotidsequenz
der Kodons –29
bis –24
(Nucleotide –87
bis –70)
der menschlichen IGF-1 R-Vorläufersignalsequenz
ist. Die Sequenz von AON1 ist:
5' TCC TCC GGA GCC AGA CTT 3' Das zweite getestete
Antisense-Oligonucleotid ist AON2, [SEQ ID NO:2], welches unten
in Beispiel 2 vollständiger
beschrieben ist und welches die folgende Sequenz besitzt:
5' ACT CGT CGG CCA
GAG CGA GAG 3'
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Vakzin-Produktion
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Um Tumorimmunogene zur Immunstimulation
bereitzustellen wurden MAT3B-Zellen bei 37°C wachsen gelassen, bis sie
80 – 90%
Konfluenz in 175 mm3 Flaschen mit DMEM-Medium,
welches mit Glycin, Penizillin, Streptomycin und 10% fötalem Kalbsserum
ergänzt
wurde, erreichten. Diese Zellen wurden dann gesammelt, bei 1000
g 5 Minuten zentrifugiert, zweimal mit eiskalter PBS gewaschen,
zentrifugiert und in je einer von 175 mm3 Flaschen
in 10 ml serumfreiem DMEM-Medium, welches mit 12,5 μM IGF-1 (Upstate
Biotechnology), 0,10% BSA und 10 μM
FeSO4 ergänzt wurde, resuspendiert.
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Diese drei Flaschen wurden verwendet
um Zellen für
eine Antisense-Oligonucleotid-Behandlung,
eine Behandlung mit Nonsense-Oligonucleotid und eine Trägersubstanz-Kontrollbehandlung
zu erzeugen. Antisense-behandelte Zellen wurden in der ersten Flasche
mit 12 μM
IGF-1R AON (NBI, Plymouth, MN) inkubiert.
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Nonsense-behandelte Zellen wurden
in der zweiten Flasche mit 12 μM
IGF-1 R NON inkubiert. Für
die Trägersubstanz-Kontrollbehandlung
wurde zu einer dritten Flasche ein Volumen des Oligonucleotid-Puffer-(PBS)-Äquivalents
entsprechend dem verwendeten Volumen in den anderen Flaschen zugegeben.
Behandelte Zellen wurden 24 Stunden inkubiert und mit 6 μM IGF-1R-AON,
6 μM IGF-1R-NON,
oder Oligonucleotid-Puffer (PBS) während der letzten Stunde der
Inkubation vor der Ernte erneut dosiert.
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Die MAT3B Zellen wurden dann geerntet,
mit einem Hämatocytometer
gezählt,
in PBS auf eine Konzentration von 106 pro
300 μl PBS
resuspendiert und mit 6000 rads 137Cs bestrahlt.
Die bestrahlten Zellen wurden dann schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren
und bei –70 °C bis zur
Verwendung gelagert (Lagerungszeit variierte zwischen 0 und 48 Stunden).
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Tier-Vakzination
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Weibliche Fischer-344-Ratten, 150–160 g und
syngenetisch gegenüber
MAT3B-Zellen, wurden
von Harlan (Indianapolis, IN) erhalten und gemäß den Richtlinien der University
of Minnesota behandelt. Die Tiere waren entweder unvakzinierte Kontrollen
oder vakziniert mit MAT3B-Zellen, die mit IGF-1 R-AON, IGF-1 R-NON
oder Oligonucleotid-Puffer (PBS) behandelt wurden, wie unter der
Vakzinproduktion beschrieben. Es wurden ein oder zwei Vakzinations-Protokolle
verwendet. Betreffend die A0N1-behandelten Brusttumorzellen wurden
die Tiere mittels subkutaner Injektionen mit behandelten Zellen
zwei Monate und einen Monat vor dem Tumorimmunitätstest in die hinteren Extremitäten vakziniert.
Betreffend AON2-oder
Nonsense-Oligonucleotid-behandelte Brusttumorzellen wurden die Tiere
durch subkutane Injektion mit behandelten Zellen in die hinteren
Extremitäten
vakziniert oder 6 Wochen, 4 Wochen und 2 Wochen vor dem Tumorimmunitätstest.
Die Tiere wurden mit 5 × 106 Zellen in 300 μl PBS vakziniert.
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Periphere Tumorinokulation
und Bewertung
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Um ein Modell zu etablieren, in welchem
das Tumorwachstum oder die Regression leicht auf einer tägliche Basis
quantifiziert werden kann, wurden dann periphere Brustkrebse in
die gegenüberliegende
hintere Flanke des vakzinierten oder unvakzinierten syngenetischen
oben beschriebenen Nagers eingeführt.
Periphere Tumore wurden durch Injizieren von 106 unmodifizierten
log-Phase-MAT3B-Zellen, die geerntet, gewaschen und in 300 μl PBS resuspendiert
wurden, eingeführt.
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Die Längen und Breiten der Tumore
wurden dann täglich
durch einen Beobachter, der über
die Vakzinationsgruppe nicht informiert war, bestimmt. Tumorvolumina
wurden unter Verwendung der Formel [(Breite)2× Länge]/2 angenähert und
Durchschnitte ± SEM
wurden täglich
für jede
Gruppe berechnet. Täglich
wurden durchschnittliche Tumorvolumina einer jeden Gruppe über den
Verlauf des Experiments hinweg unter Verwendung von ANOVA und post-hoc-TUKEY
mit dem SAS-Programm für
statistische Analyse verglichen. Gruppendurchschnitte wurden nicht
verglichen, nachdem ein oder mehrere Tiere in der Gruppe verstorben
waren oder alle Tiere in der Vakzinationsgruppe von deren Tumoren
genesen waren.
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Die Ratten, welche resistent waren
oder von peripherem Brustkrebs genesen waren, wurden dann ohne weitere
Behandlung 2 Monate (AON2 oder NON-Vakzination) bis 7 Monate (AON1-Vakzination)
beobachtet. Die tumorfreien Ratten wurden dann wie oben der Inokulation
mit peripherem Brustkrebs erneut ausgesetzt.
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Ergebnisse
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1 zeigt
den Effekt der Vakzination mit AON1-behandelten Tumorzellen auf
das Brusttumorvolumen. Sowohl unvakzinierte naive Tiere als auch
Tiere, die mit Zellen getestet wurden, die mit Phosphat gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) behandelt wurden, zeigten schnelles Tumorwachstum. Im Gegensatz
dazu zeigten Tiere, die mit AON1-behandelten Tumorzellen immunisiert
wurden, eine signifikante Verzögerung
des Tumorwachstums. In dieser letztgenannten Gruppe zeigten zwei
Tiere eine Regression des Tumorvolumens und ein drittes Tier entwickelte
nie einen tastbaren Tumor.
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Das Überleben von Tieren, die mit
bestrahlten AON1-behandelten MAT3B-Tumorzellen vakziniert wurden ist in 2 gezeigt. Naive Kontrolltiere
verstarben alle innerhalb von 25 Tagen nach Brusttumorimplantation.
Tiere, die mit Zellen vakziniert wurden, die mit NaCl-behandelt
waren, verstarben alle innerhalb von 38 Tagen. Im Gegensatz dazu überlebten
40% der Tiere mit IGF-1-Rezeptor-Antisense (AON1)-Vakzinierungen über 250
Tage nach der Tumorimplantation und überlebten weiter.
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Diese Untersuchungen zeigen, dass,
wenn IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid
(AON1) mit Brusttumorzellen inkubiert wurde, ein Vakzin produziert,
das Brusttumorzellwachstum in vakzinierten Tieren verhindert.
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Beispiel 2
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Vakzination mit Brusttumorzellen,
die mit IGF-1-Rezeptor-(AON2)-Antisense-Oligonucleotid behandelt
wurden
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Eine zweite Antisense-Sequenz IGF-1
R-AON2, entworfen unter Verwendung einer ausgewählten Region der IGF-1 R-Gensequenz,
besitzt folgende Sequenz:
5' ACT
CGT CGG CCA GAG CGA GAG 3' [SEQ
ID NO:2]
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Eine Nonsense-Sequenz, die als Kontrolle
verwendet wurde, besitzt folgende Sequenz:
5' TGG CAC CGT ACC
AGG AGG CAG 3' [SEQ
ID NO:3]
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Die IGF-1 R-AON2-Sequenz ist komplementär zu einer
Region des IGF-1 R-Gens, welches homolog zwischen Menschen, Mäusen und
Ratten ist:
-
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Brusttumorzellvakzine wurden wie
in Beispiel 1 beschrieben durch Inkubieren von MAT3B-Zellen mit dem
IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid AON2 hergestellt. Kontroll-Vakzine
wurden durch Inkubieren von MAT3B-Zellen mit dem Nonsense-Oligonucleotid (NON)
und mit PBS-behandelten Zellen wurden bestrahlt, wie in Beispiel
1 beschrieben. Syngenetische Tiere wurden mit den behandelten bestrahlten
Zellen 6, 4 und 2 Wochen vor der Brusttumorzellimplantation immunisiert
wie in Beispiel 1 beschrieben. Periphere Tumore wurden etabliert
und beurteilt wie in Beispiel 1 beschrieben.
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Ergebnisse
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Die Wirkungen dieses Vakzins, AON2-behandelte
Tumorzellen, auf das Brustkrebswachstum ist in 3 gezeigt. Unvakzinierte Kontrolltiere
zeigten schnelles Brusttumorwachstum, wie dies auch bei Tieren der Fall
war, die mit PBSinkubierten Zellen vakziniert wurden. Tiere, die
mit Tumorzellen vakziniert wurden, die mit dem Nonsense-Oligonucleotid
IGF-1 R NON behandelt wurden, zeigten eine geringfügig langsamere
Wachstumsgeschwindigkeit des Tumors. Die langsamste Wachstumsrate
des Tumors wurde von Tieren gezeigt, die mit Tumorzellen vakziniert
wurden, die mit dem neuen Antisense-Oligonucleotid, AON2 behandelt
wurden. Ein Tier in dieser letzten Gruppe besaß keinen spürbaren Tumor und ein anderes
Tier zeigte eine Regression von dessen Tumor.
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Das Überleben von Tieren, die mit
AON2-behandelten Zellen vakziniert wurden, wird in 4 gezeigt. Unbehandelte Kontrolltiere
verstarben innerhalb von 19 Tagen nach der Brusttumorimplantation.
Tiere, die mit PBS-behandelten Zellen vakziniert wurden oder mit
Zellen die mit Nonsense-Oligonucleotid behandelt wurden, erlagen
alle an deren Krebs bis zum 28. Tag. Im Gegensatz dazu überlebten
33 % der Tiere, die mit A0N2-behandelten Zellen vakziniert wurden über 125
Tage und überlebten
weiter.
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Diese Untersuchungen zeigen, dass
mit Brusttumorzellen inkubiertes IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid (AON2)
ein Vakzin produziert, das Brusttumorzellwachstum in immunisierten
Tieren hemmt.
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Beispiel 3 Die Wirkung
des A0N1-Vakzins bei Brusttumormetastasierung zum Hirn
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Die therapeutischen Wirkungen der
Tier-Vakzination mit IGF-1-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotid behandelten Zellen wurden
auch an einen Modell der Brusttumormetastasierung zum Hirn untersucht.,
Fischer-344-Ratten wurden entweder mit IGF-1R AON1- oder AON2-behandelten
bestrahlten MAT3B-Zellen vakziniert, die wie oben in Beispiel 1
beschrieben hergestellt und vakziniert wurden.
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Zentrale Tumorinokulation
und Beurteilung
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Im Modell der Brustkrebsmetastasierung
wurden 106 unmodifizierte, log-Phase-MAT3B-Zellen in 10 μl PBS suspensiert
und in das Striatum vakzinierter oder unvakzinierter syngenetischer
Ratten injiziert. Um die Länge
des durch das Vakzin gebotenen Schutzes zu bestimmen wurden diese
Tiere 3 Monate (Gruppe 2) bis 8 Monate (Gruppe 1) vor dem intracerebralen
Immunitätstest
vakziniert.
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Injektionen wurden mit einer Geschwindigkeit
von 1 μl
pro Minute mit einer 5-minütigen Pause
vor der Entnahme der Hamilton-Spritze vorgenommen. Die Tiere wurden
auf deren Überleben
beobachtet. In den Langzeitüberlebenden
wurde das Vorkommen oder die Abwesenheit von Tumoren mittels MRI
von mit Ketamin/Xylozin betäubten
Tieren beurteilt.
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Ergebnisse
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Alle Kontrolltiere (n = 10) verstarben
bis zum B. Tag nach den intracerebralen Injektionen aufgrund von Tumorwachstum
im Gehirn (siehe Tabelle 1 und 5).
Im Gegensatz dazu überlebten
75% der vorher mit entweder IGF-1R AON1 oder A0N2-behandelten Tumorzellen
immunisierte Ratten 90 Tage über
die intrazellebrale Injektion hinaus und überlebten weiter (5). Es bestand kein signifikanter
Unterschied zwischen den Tieren, die mit AON-1 oder AON-2 behandelt
wurden, und die Daten für
diese beiden Behandlungen wurden in den in Tabelle 1 und 5 dargestellten Ergebnissen
vereinigt.
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Tabelle
1. Überleben
von Ratten mit intracerebralen Tumoren aus Brustkarzinomazellen
-
MRI bei immunisierten und nichtimmunisierten
Ratten zeigte die Prävention
von metastatischem MAT3B-Brusttumorwachstum im Hirn und die Regression
der Tumore in vakzinierten Tieren.
-
Die Erfindung wurde bezugnehmend
auf verschiedene spezifische und bevorzugte Ausführungsformen und Techniken
beschrieben. Es sollte jedoch verstanden werden, dass viele Veränderungen
und Modifikationen gemacht werden können, während im Rahmen der Erfindung
verblieben wird.
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Sequenzprotokoll
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- (1) Allgemeine Angaben
- (i) Anmelder: Regents of the University of Minnesota
- (ii) Titel der Erfindung: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-
- 1-Rezeptor (IGF-1R)-Antisense-Oligonucleotid Zellen-
- Zusammensetzung
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 4
- (iv) Korrespondenzadresse:
- (A) Adressat: Merchant, Gould, Smith, Edell, Welter & Schmidt
- (B) Strasse: 3100 Norwest Center, 90 S. 7th Street
- (C) Ort: Minneapolis
- (D) Bundesstaat: MN
- (E) Land: USA
- (F) ZIP: 55402
- (v) Computerlesbare Fassung:
- (A) Datenträger:
Diskette
- (B) Computer: IBM Compatible
- (C) Betriebssystem: DOS
- (D) Software: FastSEQ Version 1.5
- (vi) Daten der vorliegenden Anmeldung
- (A) Anmeldenummer: unbekannt
- (B) Anmeldetag: 14. November 1997
- (C) Klassifizierung:
- (vii) Daten der Voranmeldung:
- (A) Anmeldenummer: 08/755,558
- (B) Anmeldetag: 22. November 1996
- (viii) Angaben zum Anwalt/Agenten:
- (A) Name: Kettleberger, Denise M
- (B) Registrierungsnummer: 33,924
- (C) Referenz/Docket-Nummer: 600.337W001
- (ix) Daten zur Telekommunikation:
- (A) Telefon: 612/332-5300
- (B) Fax: 612/332-9081
- (C) Telex:
- (2) Angaben zu SEQ ID NO: 1:
- (i) Sequenzkennzeichen:
- (A) Länge:
18 Basenpaare
- (B) Art: Nucleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (ii) Art des Moleküls:
genomische DNA
- (iii) Hypothetisch: Nein
- (iv) Antisense: Nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Ursprüngliche
Quelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
TCCTCCGGAG CCAGACTT
- (2) Angaben zu SEQ ID NO: 2:
- (i) Sequenzkennzeichen:
- (A)Länge:
21 Basenpaare
- (B)Art: Nucleinsäure
- (C)Strangform: Einzelstrang
- (D)Topologie: linear
- (ii) Art des Moleküls:
genomische DNA
- (iii) Hypothetisch: Nein
- (iv) Antisense: Nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Ursprüngliche
Quelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:
ACTCGTCGGC CAGAGCGAGA
G
- (2) Angaben zu SEQ ID NO: 3:
- (i) Sequenzkennzeichen
- (A) Länge:
21 Basenpaare
- (B) Art: Nucleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (ii) Art des Moleküls:
genomische DNA
- (iii) Hypothetisch: Nein
- (iv) Antisense: Nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Ursprüngliche
Quelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:
TGGCACCGTA CCAGGAGGCA
G
- (2) Angaben zu SEQ ID NO: 4:
- (i) Sequenzkennzeichen
- (A) Länge:
4989 Basenpaare
- (B) Art: Nucleinsäure
- (C) Strangform: Einzelstrang
- (D) Topologie: linear
- (i) Art des Moleküls:
genomische DNA
- (ii) Hypothetisch: Nein
- (iii) Antisense: Nein
- (iv) Fragmenttyp:
- (v) Ürsprüngliche
Quelle:
- (ix) Merkmal:
- (A) Name/Schlüssel:
Kodierende Sequenz
- (B) Lage: 46 ... 4149
- (D) Sonstige Angaben:
-
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID
NO: 4:
