ES2452115T3 - Un anticuerpo anti-PDGFRalfa para su uso en el tratamiento de cáncer de huesos metastásico - Google Patents

Abstract

Un antagonista de PDGFRa, en el que dicho antagonista de PDGFRa es un anticuerpo o fragmento del mismo quees específico para PDGFRa humano y que comprende SSSYY (SEC ID Nº: 2) en CDRH1; SFFYTGSTYYNPSLRS(SEC ID Nº: 4) en CDRH2; QSTYYYGSGNYYGWFDR (SEC ID Nº: 6) en CDRH3; RASQSVSSYLA (SEC ID Nº: 10) enCDRL1; DASNRAT (SEC ID Nº: 12) en CDRL2; y QQRSNWPPA (SEC ID Nº: 14) en CDRL3, para su uso en eltratamiento de cáncer de huesos metastásico en un sujeto.

Description

Un anticuerpo anti-PDGFRalfa para su uso en el tratamiento de cáncer de huesos metastásico

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/691.920.

Campo de la invención

La divulgación proporciona procedimientos para tratar cáncer de huesos, particularmente cáncer de huesos metastásico, administrando un antagonista de IGF-IR y/o un antagonista de PDGFRα. La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen a PDGFRα humano y neutralizan la activación del receptor. La presente divulgación proporciona además procedimientos para neutralizar la activación de PDGFRα, y procedimientos para tratar un mamífero con una enfermedad neoplásica usando los anticuerpos solos o en combinación con otros agentes.

Antecedentes de la invención

El cáncer de próstata es el cáncer más común entre los hombres, con aproximadamente 220.000 casos y 29.000 muertes anualmente en los Estados Unidos. Una proporción significativa de hombres diagnosticados con cáncer de próstata tienen enfermedad metastásica. Además, las metástasis se desarrollan eventualmente en muchos otros pacientes con cáncer de próstata a pesar de tratamiento con cirugía o radioterapia. El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de próstata, y también es un sitio al que frecuentemente metastatizan cánceres de mama y cánceres de pulmón. La mayoría de las metástasis del cáncer de próstata son dependientes de andrógenos, de manera que hay una rápida respuesta a castración quirúrgica o médica, pero en prácticamente todos los pacientes, el tumor se vuelve eventualmente independiente de andrógenos, conduciendo a morbilidad y mortalidad significativas. Una vez se producen las metástasis al hueso, las terapias actualmente disponibles tienen efecto limitado. La terapia aprobada más eficaz que se ha descrito para cáncer de próstata metastásico (administración de docetaxel) prolonga la mediana de la supervivencia aproximadamente tres meses. (Petrilak y col., 2004, N. Engl. J. Med. 351:1513; Tannock y col., 2004, N. Engl. J. Med. 351:1502) Por consiguiente, se necesitan urgentemente nuevas terapias para cánceres de huesos metastásicos.

El factor de crecimiento similar al receptor de la insulina (IGF-IR) es un receptor de tirosina cinasas transmembrana ubicuo que es esencial para el crecimiento y desarrollo normal fetal y post-natal. El IGF-IR se localiza sobre la superficie celular de la mayoría de los tipos de células y sirve de molécula de señalización para los factores de crecimiento IGF-I y IGF-II (conjuntamente llamados en adelante IGF). El IGF-IR puede estimular la proliferación celular, diferenciación celular, cambios en el tamaño de células y proteger células de la apoptosis. También se ha considerado que es casi obligatorio para la transformación celular (revisado en Adams y col., Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-93 (2000); Baserga, Oncogene 19:5574-81 (2000)). Se ha informado de altos niveles de expresión de IGF-IR en muestras de tejido de metástasis al hueso de cáncer de próstata. El hueso contiene el mayor almacén de IGF en el cuerpo.

El IGF-IR es un heterotetrámero preformado que contiene dos cadenas alfa y dos beta covalentemente ligadas por enlaces disulfuro. Las subunidades de receptor se sintetizan como parte de una única cadena de polipéptidos de 180 kd, que luego se procesa proteolíticamente en subunidades alfa (130 kd) y beta (95 kd). La cadena alfa entera es extracelular y contiene el sitio para la unión a ligando. La cadena beta posee el dominio transmembrana, el dominio de tirosina cinasa y una extensión del extremo C que es necesaria para la diferenciación y transformación celular, pero es dispensable para la señalización y protección de mitógeno de la apoptosis.

El IGF-IR es altamente similar al receptor de insulina (IR), particularmente dentro de la secuencia de la cadena beta (70 % de homología). Debido a esta homología, estudios recientes han demostrado que estos receptores pueden formar híbridos que contienen un dímero de IR y un dímero de IGF-IR (Pandini y col., Clin. Canc. Res. 5:1935-19 (1999)). La formación de híbridos se produce en tanto células normales como transformadas y el contenido de híbrido depende de la concentración de los dos receptores de homodímero (IR y IGF-IR) dentro de la célula. Aunque los receptores de híbrido están compuestos por pares de IR y IGF-IR, los híbridos se unen selectivamente a IGF, con afinidad similar a la de IGF-IR, y solo se unen débilmente a insulina (Siddle y Soos, The IGF System. Humana Press. pág. 199-225. 1999). Por tanto, estos híbridos pueden unirse a IGF y transducir señales en tanto células normales como transformadas.

Un segundo receptor de IGF, IGF-IIR, o receptor de manosa-6-fosfato (M6P), también se une a ligando de IGF-II con alta afinidad, pero carece de actividad de tirosina cinasas (Oates y col., Breast Cancer Res. Treat. 47:269-81 (1998)). Debido a que produce la degradación de IGF-II, se considera un sumidero para IGF-II, antagonizando los efectos promotores del crecimiento de este ligando. La pérdida de IGF-IIR en células tumorales puede potenciar el potencial de crecimiento mediante la liberación de su efecto antagonista sobre la unión de IGF-II con IGF-IR (Byrd y col., J. Biol. Chem. 274:24408-16 (1999)).

Los receptores alfa y beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα y PDGFRβ) son tirosina cinasas de receptor tipo III. PDGFRα es crítico para el desarrollo y satisface importantes funciones en la edad adulta. Por ejemplo, ratones homocigóticos para una mutación nula mueren durante la embriogénesis. En etapas tardías del

desarrollo, PDGFRα se expresa en muchas estructuras mesenquimatosas, mientras que células epiteliales adyacentes producen factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF). Las muestras de tejido de glándulas prostáticas normales o hiperplásicas dan negativo para PDGFRα, mientras que tumores de próstata primarios y masas esqueléticas de sujetos similares expresan PDGFRα. Además de líneas celulares de próstata obtenidas de diferentes sitios metastásicos, PDGFRα se encuentra en células PC3 derivadas de metástasis al hueso, pero no en líneas celulares obtenidas de metástasis al ganglio linfático (LNCaP) y cerebro (DU-145).

La familia de factores de crecimiento derivados de plaquetas de factores de crecimiento consiste en cinco dímeros ligados por disulfuro diferentes, PDGF-AA, -BB, -AB, -CC y -DD, que actúan mediante PDGFRα y PDGFRβ. Estos factores de crecimiento son moléculas dímeras compuestas por cadenas de polipéptidos ligadas por disulfuro que se unen a dos proteínas de receptor simultáneamente e inducen la dimerización de receptores, autofosforilación y señalización intracelular. PDGFRα y PDGFRβ son estructuralmente similares y pueden formar heterodímeros, además de homodímeros. Debido a que PDGFRβ no se une a la cadena de PDGF-A con alta afinidad, PDGF-AA activa solo dímeros de receptores αα, mientras que PDGF-AB y PDGF-CC activan heterodímeros de receptores αα y αβ.

Breve resumen de la invención

La presente divulgación se refiere al tratamiento de tumores óseos primarios y metastásicos, que incluyen tumores que se originan en la próstata, mama o pulmón y expresan factor de crecimiento similar al receptor de la insulina-I (IGF-IR) y/o el receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas alfa (PDGFRα).

Los tumores a tratar pueden ser dependientes de hormona/andrógenos o independientes de hormona/andrógenos, y pueden haberse originado, por ejemplo, en la próstata, mama o pulmón.

La presente divulgación proporciona procedimientos para tratar un sujeto que tiene un tumor óseo, y procedimientos para inhibir el crecimiento de un tumor óseo. Los procedimientos comprenden administrar una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-IR o una cantidad eficaz de un antagonista de PDGFRα. Los antagonistas de receptores incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, además de inhibidores de molécula pequeña intracelulares.

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-IGF-IR o anti-PDGFRα que se unen a su receptor diana e inhiben la unión a ligando. La divulgación también proporciona anticuerpos y otros antagonistas que neutralizan la activación de IGF-IR o PDGFRα. Adicionalmente, ciertos anticuerpos promueven la regulación por disminución de su receptor diana, por ejemplo, por internalización y/o degradación. Por consiguiente, los anticuerpos y antagonistas de molécula pequeña sirven para inhibir la activación de moléculas de señalización aguas abajo tales como Akt, p42/p44 y MAPK.

Los procedimientos incluyen el uso de antagonistas de IGF-IR o PDGFRα solos, en combinación entre sí o en combinación con otros agentes terapéuticos para el cáncer tales como agentes quimioterapéuticos y radiación.

La presente divulgación también proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen a PDGFRα, además de nucleótidos y célula huésped para la producción de los anticuerpos. Los anticuerpos bloquean la unión a ligando y neutralizan la activación del receptor. La divulgación también proporciona uso de los anticuerpos solos, en combinación con otros antagonistas de receptores o agentes antineoplásicos, o como conjugados para el tratamiento de enfermedad neoplásica. Los anticuerpos anti-PDGFRα se usan para tratar, por ejemplo, tumores de ovario, tumores de mama, tumores de pulmón, tumores hepatocelulares, tumores del estroma gastrointestinal, melanomas, carcinomas de células renales, tumores de próstata y sarcomas de tejido blando.

Según la presente invención, se proporciona un antagonista de PDGFRα para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de huesos metastásico, en el que dicho antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que es específico para PDGFRα humano y que comprende SSSYY (SEC ID Nº: 2) en CDRH1; SFFYTGSTYYNPSLRS (SEC ID Nº: 4) en CDRH2; QSTYYYGSGNYYGWFDR (SEC ID Nº: 6) en CDRH3; RASQSVSSYLA (SEC ID Nº: 10) en CDRL1; DASNRAT (SEC ID Nº: 12) en CDRL2; y QQRSNWPPA (SEC ID Nº: 14) en CDRL3.

Preferentemente, el antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEC ID Nº: 8) o un dominio variable de la cadena ligera que tiene EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEC ID Nº: 16).

Más preferentemente, el antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene

Preferentemente, el antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una cadena pesada que tiene

MGWSCIILFLVATATGVHSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWG WLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADT AVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID Nº: 31) y una cadena ligera que tiene

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un antagonista de PDGFRα para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer de huesos metastásico, en el que dicho antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que es específico para PDGFRα humano, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo compite para unirse a PDGFRα con un anticuerpo de la presente invención.

Preferentemente, el tumor se metastatiza de un cáncer de próstata, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

El antagonista de PDGFRα de la presente invención es preferentemente uno que inhibe la unión de PDGFRα o neutraliza PDGFRα.

Descripción de las figuras

La Figura 1 representa crecimiento de tumores de xenoinjerto subcutáneos de LuCaP 35V en ratones SCID castrados durante un periodo de tratamiento iniciado cuando los tumores habían alcanzado 150-200 mm3. Panel A: controles sin tratar; Panel B: los animales se trataron durante cuatro semanas con docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20 mg/kg) solo, o en combinación con anticuerpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12); Panel C: niveles de PSA en suero en ratones SCID tratados y sin tratar que portan tumores de xenoinjerto de LuCaP 35V subcutáneos. Los ratones tratados recibieron docetaxel (20 mg/kg) solo o docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20 mg/kg) en combinación con anticuerpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12). El tratamiento se inició cuando los tumores habían alcanzado 150-200 mm3 y terminaron después de cuatro semanas.

La Figura 2 muestra suspensiones de células individuales de tumores de xenoinjerto de LuCaP 35V tratados con docetaxel (10 mg/kg) solo (Panel A) o en combinación con anticuerpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12) (Panel B). El campo marcado R1 se corresponde con células apoptósicas con ADN fragmentado (marcado de FITC elevado).

La Figura 3 muestra síntesis de ADN (captación de BrDu) en xenoinjertos de tumor tras la terminación de tratamiento con docetaxel (10 mg/kg o 20 mg/kg) solo, y en combinación con anticuerpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12).

La Figura 4 representa la expresión diferencial de genes asociados a agresividad del tumor de próstata (TUBB), resistencia a terapia antiandrogénica (BIRC 5) e inducción de apoptosis (IGFBP3) en células tumorales de próstata en respuesta a tratamiento con docetaxel y A12 y docetaxel solo.

La Figura 5 muestra niveles en suero de A12 tras el cese del tratamiento.

La Figura 6 muestra el peso corporal (una medida de citotoxicidad global) de animales no enfermos tratados continuamente con docetaxel (tanto 10 mg/kg como 20 mg/kg) solo, o en combinación con anticuerpos anti-IGF-IR (40 mg/kg de IMC-A12).

La Figura 7 muestra el efecto del tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR (IMC-A12) en PSA producido por xenoinjerto en ratones SCID injertados con células LuCaP 23.1.

La Figura 8 muestra una serie de fotografías de rayos X de ratones SCID injertados con células LuCaP 23.1. Ratones A12 recibieron 40 mg/ml de IMC-A12 i.p. tres veces a la semana durante seis semanas. Las fotografías de rayos X se hicieron en el momento del sacrificio.

La Figura 9 muestra niveles de PSA (a) y radiografías representativas (b) de ratones SCID con xenoinjertos intratibiales de células de próstata humana LuCaP 23.1.

La Figura 10 representa el efecto de aspirado de médula ósea sobre la actividad de Akt en células de cáncer de próstata. Lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE. Para el análisis de transferencia Western, las membranas se transfirieron con anticuerpos que eligen fosfo-Akt como diana (Ser-473, Cell Signaling Technology), PDGFRα (R&D Systems) y actina (Sigma). La unión del anticuerpo primario se detectó usando proteína A conjugada con HRP o proteína G (Sigma).

La Figura 11 representa la inducción e inhibición de la fosforilación de AKT en células PC3-ML. El panel A muestra la inhibición dependiente de dosis de AG-1296 de la fosforilación de Akt en células expuestas a 30 ng/ml de PDFG-BB. El panel B muestra la fosforilación de Akt de aspirado de hueso e inhibición por AG-1296 20 μM. El panel C muestra la potencia de aspirado de médula ósea para inducir fosforilación de Akt con respecto a la potencia de una combinación de 100 pg/ml de PDGF-AA y 100 pg/ml de PDGF-BB. El panel D compara las magnitudes de fosforilación de Akt inducida por aspirado de médula ósea, fosforilación de Akt inducida por inhibición de médula ósea por AG-1296 y fosforilación de Akt inducida por PDFG-AA + PDFG-BB.

La Figura 12 representa la inhibición de la fosforilación de Akt en células PC3-ML por antagonistas de PDGFRα. El panel A muestra el efecto dependiente de la dosis del anticuerpo monoclonal IMC-3G3 sobre la fosforilación de Akt inducida por 30 ng/ml de PDGF-BB. Los paneles B y C proporcionan una comparación de los efectos de IMC-3G3 y AG1296 sobre la fosforilación de Akt inducida por médula ósea. El panel D muestra que la inhibición de la fosforilación de Akt depende del tiempo de preincubación de IMC-3G3.

Las Figuras 13 muestran la unión de anticuerpo a PDGFRα. A: unión directa de anticuerpo anti-PDGFRα al dominio extracelular inmovilizado de PDGFRα B: inhibición de la unión de [125I]PDGF-AA a PDGFRα inmovilizado.

La Figura 14 muestra la inhibición específica de fosforilación de PDGFRα y moléculas efectoras aguas abajo.

La Figura 15 muestra la inhibición de la incorporación de [3H]timidina estimulada por PDGF-AA en células PAE Rα por mAb.

La Figura 16 muestra la inhibición de la activación de moléculas efectoras aguas abajo inducida por PDGF-AA en células SKLMS-1 (A) y U118 (B).

La Figura 17 muestra la inhibición de la incorporación de [3H]timidina estimulada por PDGF-AA en células U118

(A) y SKLMS-1 (B) por mAb. La inhibición de la incorporación de [3H]timidina estimulada por PDGF-BB también se muestra para células SKLMS-1 (C) y U118 (D).

La Figura 18 muestra los efectos dependientes de la dosis para el tratamiento de xenoinjertos de tumor U118 (glioblastoma; panel A) y SKLMS-1 (leiomiosarcoma; panel B) establecidos en ratones sin pelo.

La Figura 19 muestra la reducción de la fosforilación de PDGFRα in vivo en tumores U118 tratados con anticuerpo anti-PDGFRα, con respecto al tratamiento con IgG humana no específica.

La Figura 20 representa los vectores de expresión GS usados para clonar genes de las regiones variables VH y VK humanas derivadas de hibridoma y la expresión de proteínas de las cadenas pesada (IgG1) y ligera completas humanas. Los dos vectores se recombinaron como se explica en los ejemplos y el vector combinado se transfectó en células NS0.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere al tratamiento de tumores óseos con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que

se unen al factor de crecimiento similar al receptor de la insulina-I (IGF-IR). La expresión endocrina de IGF-I está regulada principalmente por la hormona de crecimiento y se produce en el hígado, pero otros tipos de tejido también pueden expresar IGF-I, que incluye hueso que contiene un gran almacén de factores de crecimiento. Dependiendo del tipo de célula tumoral, IGF-I participa en la regulación endocrina, paracrina y/o autocrina (Yu, H. y Rohan, J., J. Natl. Cancer Inst. 92:1472-89 (2000)).

Se ha descubierto que los anticuerpos que se unen a IGF-IR son útiles en terapias para el tratamiento de tumores óseos que expresan IGF-IR. Los anticuerpos pueden usarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el cáncer, particularmente quimioterapéuticos. La terapia anti-IGF-IR, sola o en combinación con terapia con uno o más agentes antineoplásicos (tales como, por ejemplo, quimioterapia o radioterapia), tiene significativa eficacia terapéutica. La supresión del crecimiento tumoral va frecuentemente acompañada de un aumento en la apoptosis y persiste después de suspenderse el tratamiento y los tumores han empezado de nuevo a crecer en animales tratados con quimioterapia solo.

También se ha descubierto que PDGFRα desempeña una función importante en el crecimiento de tumores óseos. Por ejemplo, ciertas líneas celulares tumorales que expresan PDGFRα metastatizan preferencialmente al hueso. Tales líneas celulares muestran elevada activación de PDGFRα y fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo en respuesta a factores solubles presentes en la médula ósea. La activación de PDGFRα por la médula ósea se reduce o inhibe completamente por antagonistas de PDGFRα, y se reduce enormemente la fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo que son comúnmente activadas por la señalización mediante PDGFRα y otros sistemas de tirosina cinasas de receptor. Ciertos datos sugieren que la ruta de supervivencia de PI3K/Akt se activa por señalización de PDGFRα no solo por ligandos que activan PDGFRα directamente, sino también por factores presentes en la médula ósea que producen la transactivación del receptor.

Los tumores óseos primarios que van a tratarse según la invención incluyen, pero no se limitan a, osteosarcomas, condrosarcomas, fibrosarcomas y hemangiosarcomas. En particular, los tumores secundarios malignos (metastásicos) son mucho más comunes que los tumores óseos primarios. Los tumores óseos metastásicos que van a tratarse según la invención pueden producirse de una variedad de fuentes, las más comunes de las cuales son cánceres de la próstata, mama o pulmón. La fuente de un cáncer de huesos metastásico será normalmente evidente de la historia de un paciente. Los tumores pueden ser osteoblásticos u osteolíticos. Los tumores pueden ser dependientes de la estimulación de IGF-IR cuando aparecen, o pueden tener una transición a dependencia de IGF-IR. Por ejemplo, los cánceres de próstata o metástasis de cánceres de próstata que son inicialmente dependientes de hormona/andrógenos y controlables por tratamientos físicos o químicos que suprimen la producción de andrógenos o de hormonas pueden convertirse en independientes de hormona/andrógenos mediante la elevada sensibilidad a estimulación mediante IGF-IR. Además, además de proporcionar tratamiento de tumores independientes de hormonas/andrógenos, la invención puede ser útil para tratar tumores óseos dependientes de hormonas/andrógenos sin dependencia en la supresión de la producción de andrógenos u hormonas, por ejemplo, coadministrando anticuerpos para IGF-IR con agentes antineoplásicos. Tales tumores incluirían tumores óseos metastásicos que se estimulan mediante IFG-IR en el entorno rico en IGF del hueso, que puede ser sensible a estimulación hormonal pero no sensible a crecer sin participación de IGF. La ablación hormonal podría no ser necesaria para tales tumores.

También pueden tratarse tumores óseos que son dependientes de PDGF, además de tumores que son dependientes de la “médula ósea”. Los tumores dependientes de la médula ósea muestran activación de PDGFRα en respuesta a factores solubles presentes en la médula ósea. Por ejemplo, como se ejemplifica en el presente documento, una línea de células cancerosas que expresa PDGFRα metastásico humano experimenta activación de PDGFRα y fosforilación de Akt+ tras la exposición a aspirado de médula ósea. Un anticuerpo anti-PDGFRα y un antagonista de PDGFRα de molécula pequeña inhiben cada uno la activación de PDGFRα y fosforilación de Akt+ en la línea celular. Los factores de la médula ósea solubles que activan PDGFRα incluyen, pero no se limitan a, PDGF-AA y -BB.

Aunque tal dependencia de la médula ósea implica señalización mediante PDGFRα, puede no implicar solo la unión de PDGFRα de un ligando de PDGFRα. Por ejemplo, como se ejemplifica en el presente documento, se observa que la activación de PDGFRα por ligandos definidos (PDGF-AA o -BB) es más débil que la activación por aspirado de médula ósea. Además, se observa que en presencia de aspirado de médula ósea, la fosforilación de Akt+ disminuye al aumentar el tiempo de incubación. Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que además de responder a la unión de PDGF, PDGFRα puede transactivarse (fosforilarse) por otros elementos de transducción de señales (por ejemplo, otras tirosina cinasas de receptor) sensibles a otros componentes de la médula ósea. En cualquier caso, en una línea celular apta para crecimiento metastásico en hueso (es decir, una línea celular que metastatiza preferencialmente al hueso), se observa activación de PDGFRα dependiente de médula ósea, que se inhibe por antagonistas de PDGFRα. Además, el tratamiento con un antagonista de PDGFRα inhibe la estimulación inducida por médula ósea de la ruta antiapoptósica PI3K/Akt y proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK).

Los tumores óseos que van a tratarse con un antagonista de PDGFRα pueden producirse como metástasis de células de cáncer de próstata, y, como antes, pueden ser dependientes de hormonas/andrógenos, o haber tenido una

transición a independencia de hormonas/andrógenos. Tales tumores también pueden producirse como metástasis de cánceres de no próstata. Un experto en la materia podría diagnosticar fácilmente tales afecciones y trastornos usando pruebas convencionales conocidas.

Tratamiento significa cualquier tratamiento de una enfermedad en un animal e incluye: (1) prevenir que se produzca la enfermedad en un mamífero que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que todavía no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad; por ejemplo, prevención del estallido de los síntomas clínicos; (2) inhibir la enfermedad, por ejemplo, detener su desarrollo; o (3) aliviar la enfermedad, por ejemplo, causar la regresión de los síntomas de la enfermedad. Inhibir el crecimiento tumoral incluye ralentizar o detener el crecimiento, además de causar la regresión del tumor. Una cantidad eficaz para el tratamiento de una enfermedad significa la cantidad que, cuando se administra a un mamífero en necesidad del mismo, es suficiente para efectuar el tratamiento, como se ha definido anteriormente, para esa enfermedad. Antagonistas de IGF-IR y el antagonista de PDGFRα pueden administrarse solos, en combinación con otros, o en combinación con uno o más agentes antineoplásicos tales como, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o radiológico.

Puede desearse determinar el nivel de expresión de IGF-IR y/o PDGFRα en un tumor que va a tratarse. En tales casos, pueden recogerse biopsias de tumor y analizarse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. Un antagonista de IGF-IR o antagonista de PDGFRα se administra basándose en que el receptor correspondiente se expresa comúnmente o activa en un tipo de tumor particular o se expresa invariablemente o activa a medida que progresa la enfermedad.

Un antagonista de IGF-IR puede ser un antagonista extracelular o un antagonista intracelular y puede emplearse más de un antagonista. Antagonistas extracelulares incluyen, pero no se limitan a, proteínas u otras moléculas biológicas que se unen a IGF-IR o uno o más de sus ligandos (por ejemplo, IGF-I y IGF-II son ligandos naturales de IGF-IR). Un antagonista extracelular inhibe la unión de IGF-IR a sus ligandos. El antagonista es un anticuerpo anti-IGF-IR tal como, por ejemplo, IMC-A12. El antagonista es un fragmento de unión a ligando soluble de IGF-IR. Los antagonistas de IGF-IR intracelulares pueden ser moléculas biológicas, pero son normalmente moléculas pequeñas. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, inhibidor de tirosina cinasas AG1024 (Calbiochem), inhibidor de cinasas del receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I NVP-AEW541 (Novartis) e inhibidor del receptor de factor de crecimiento similar a la insulina-I/insulina BMS-554417 (Bristol Myers Squibb). Se apreciará que la molécula pequeña útil que va a usarse en la invención son inhibidores de IGF-IR, pero no necesitan ser completamente específicos para IGF-IR.

Los anticuerpos anti-IGF-IR que van a usarse según la presente divulgación presentan una o más de las siguientes propiedades:

1) Los anticuerpos se unen al dominio eterno de IGF-IR e inhiben la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR. La inhibición puede determinarse, por ejemplo, por un ensayo de unión directo usando receptor purificado o unido a membrana. En esta realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen preferentemente a IGF-IR al menos tan fuertemente como los ligandos naturales de IGF-IR (IGF-I y IGF-II).

2) Los anticuerpos neutralizan IGF-IR. La unión de un ligando, por ejemplo, IGF-I o IGF-II, a un dominio extracelular externo de IGF-IR estimula la autofosforilación de la subunidad beta y moléculas de señalización aguas abajo, que incluyen MAPK, Akt y IRS-1.

La neutralización de IGF-IR incluye inhibición, diminución, inactivación y/o alteración de una o más de estas actividades normalmente asociadas a la transducción de señales. La neutralización puede determinarse in vivo, ex vivo o in vitro usando, por ejemplo, tejidos, célula cultivada o componentes celulares purificados. La neutralización incluye inhibición de heterodímeros de IGF-IR / IR, además de homodímeros de IGF-IR. Así, el neutralizar IGF-IR tiene diversos efectos, que incluyen inhibición, diminución, inactivación y/o alteración del crecimiento (proliferación y diferenciación), angiogénesis (reclutamiento de vasos sanguíneos, invasión y metástasis) y motilidad y metástasis celular (adhesión e invasividad celular).

Una medida de la neutralización de IGF-IR es la inhibición de la actividad de tirosina cinasas del receptor. La inhibición de tirosina cinasas puede determinarse usando procedimientos muy conocidos; por ejemplo, midiendo el nivel de autofosforilación del receptor de cinasas recombinante, y/o fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. Así, los ensayos de fosforilación son útiles en determinar anticuerpos neutralizantes en el contexto de la presente invención. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para fosfotirosina en un ensayo de ELISA

o en una transferencia Western. Algunos ensayos para actividad de tirosina cinasas se describen en Panek y col., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) y Batley y col., Life Sci. 62:143-50 (1998). Los anticuerpos de la invención producen una disminución en la fosforilación de tirosina de IGF-IR de al menos aproximadamente el 75 %, preferentemente al menos aproximadamente el 85 %, y más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % en células que responden a ligando.

Otra medida de neutralización de IGF-IR es la inhibición de la fosforilación de sustratos aguas abajo de IGF-IR. Por

consiguiente, el nivel de fosforilación de MAPK, Akt o IRS-1 puede medirse. La disminución en la fosforilación es de al menos aproximadamente el 40 %, y puede ser de al menos aproximadamente el 60 %, o de al menos aproximadamente el 80 %.

Además, pueden utilizarse procedimientos para la detección de la expresión de proteínas para determinar la neutralización de IGF-IR, en los que las proteínas que se miden están reguladas por la actividad de tirosina cinasas de IGF-IR. Estos procedimientos incluyen inmunohistoquímica (IHC) para la detección de la expresión de proteínas, hibridación por fluorescencia in situ (FISH) para la detección de la amplificación génica, ensayos de unión a radioligando competitivos, técnicas de transferencia en matriz sólida tales como transferencias Northern y Southern, reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa (RT-PCR) y ELISA. Véanse, por ejemplo, Grandis y col., Cancer, 78:1284-92 (1996); Shimizu y col., Japan J. Cancer Res., 85:567-71 (1994); Sauter y col., Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, Glia 15:289-96 (1995); Radinsky y col., Clin. Cancer Res. 1:19-31 (1995); Petrides y col., Cancer Res. 50:3934-39 (1990); Hoffmann y col., Anticancer Res. 17:4419-26 (1997); Wikstrand y col., Cancer Res. 55:3140-48 (1995).

También pueden utilizarse ensayos ex vivo para determinar la neutralización de IGF-IR. Por ejemplo, puede observarse la inhibición de tirosina cinasas del receptor por ensayos mitogénicos usando líneas celulares estimuladas con ligando de receptor en presencia y ausencia de inhibidor. La línea de cáncer de mama MCF7 (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD) es una línea celular tal que expresa IGF-IR y se estimula por IGF-I o IGF-II. Otro procedimiento implica probar la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan IGF-IR o células transfectadas para expresar IGF-IR. La inhibición también puede observarse usando modelos de tumor, por ejemplo, células tumorales humanas inyectadas en un ratón.

Los anticuerpos no están limitados por ningún mecanismo particular de neutralización de IGF-IR. Los anticuerpos antiIGF-IR pueden unirse externamente al receptor de la superficie celular de IGF-IR, bloquear la unión de ligando (por ejemplo, IGF-I o IGF-II) y posterior transducción de señales mediada por tirosina cinasa asociada al receptor, y prevenir la fosforilación del IGF-IR y otras proteínas aguas abajo en la cascada de transducción de señales.

3) Los anticuerpos modulan por disminución IGF-IR. La cantidad de IGF-IR presente sobre la superficie de una célula depende de la producción, internalización y degradación de proteína del receptor. La cantidad de IGF-IR presente sobre la superficie de una célula puede medirse indirectamente, detectando la internalización del receptor o una molécula unida al receptor. Por ejemplo, la internalización del receptor puede medirse poniendo en contacto células que expresan IGF-IR con un anticuerpo marcado. Entonces, el anticuerpo unido a membrana se desprende, se recoge y se cuenta. El anticuerpo internalizado se determina lisando las células y detectando marca en los lisados.

Otro forma es medir directamente la cantidad del receptor presente sobre la célula tras el tratamiento con un anticuerpo anti-IGF-IR u otra sustancia, por ejemplo, por análisis de citometría de flujo activada por fluorescencia de células teñidas para la expresión superficial de IGF-IR. Las células teñidas se incuban a 37 ºC y la intensidad de fluorescencia se mide con el tiempo. Como control, parte de la población teñida puede incubarse a 4 ºC (condiciones bajo las que se detiene la internalización del receptor).

El IGF-IR de la superficie celular puede detectarse y medirse usando un anticuerpo diferente que es específico para IGF-IR y que no bloquea o compite con la unión del anticuerpo que se prueba (Burtrum, y col. Cancer Res. 63:8912-21 (2003)). El tratamiento de una célula que expresa IGF-IR con un anticuerpo produce reducción de IGF-IR de la superficie celular. En una realización preferida, la reducción es de al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente de al menos aproximadamente el 80 %, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente el 90 % en respuesta a tratamiento con un anticuerpo. Puede observarse una disminución significativa en tan solo cuatro horas.

Otra medida de modulación por disminución es la reducción de la proteína de receptor total presente en una célula, y refleja la degradación de receptores internos. Por consiguiente, el tratamiento de células (particularmente células cancerosas) con anticuerpos produce una reducción en IGF-IR celular total. En un aspecto preferido, la reducción es de al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente de al menos aproximadamente el 80 %, e incluso más preferentemente de al menos aproximadamente el 90 %.

Para el tratamiento de sujetos humanos, los anticuerpos son preferentemente humanos. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser de primates no humanos u otros mamíferos, o ser anticuerpos humanizados o quiméricos. Un anticuerpo anti-IGF-IR comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47 y SEC ID Nº: 49 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L, respectivamente). El anticuerpo anti-IGF-IR comprende una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57 y SEC ID Nº: 59 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L, respectivamente). Preferentemente, los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) tienen CDR de la cadena pesada de SEC ID Nº: 35,

SEC ID Nº: 37 y SEC ID Nº: 39. Alternativamente y también preferentemente, los presentes anticuerpos que incluyen fragmentos de los mismos tienen CDR de la cadena ligera de SEC ID Nº: 45, SEC ID Nº: 47 y SEC ID Nº: 49 o SEC ID Nº: 55, SEC ID Nº: 57 y SEC ID Nº: 59. Un anticuerpo anti-IGF-IR tal es el anticuerpo para IgG1 humano IMC-A12 (documento WO2005016970), que tiene un dominio variable de la cadena pesada representado por SEC ID Nº: 41 y un dominio variable de la cadena ligera representado por SEC ID Nº: 51. Otro anticuerpo humano preferido es IMC-2F8 (documento WO2005016970), que tiene un dominio variable de la cadena pesada idéntico a IMC-A12 y un dominio variable de la cadena ligera representado por SEC ID Nº: 61. Anticuerpos útiles incluyen adicionalmente anticuerpos anti-IGF-IR que compiten con IMC-A12 o IMC-2F8 para unirse a IGF-IR, además de anticuerpos que se unen a otros epítopes (es decir, anticuerpos que se unen a otros epítopes y presentan propiedades como se han descrito previamente tales como bloqueo de ligandos, internalización de receptor, etc., pero no compiten con IMC-A12 o IMC2F8).

También pueden usarse antagonistas de PDGFRα para el tratamiento. Un antagonista de PDGFRα puede ser un antagonista extracelular o un antagonista intracelular y puede emplearse más de un antagonista. Antagonistas extracelulares incluyen, pero no se limitan a, proteínas u otras moléculas biológicas que se unen a PDGFRα o uno o más de sus ligandos (por ejemplo, PDGF-AA, -AB, -BB, -CC). Un antagonista extracelular inhibe la unión de PDGFRα a sus ligandos. En un aspecto, el antagonista es un anticuerpo anti-PDGFRα tal como, por ejemplo, IMC-3G3. En otro aspecto, la proteína de unión es un fragmento de unión a ligando soluble de PDGFRα. Los antagonistas de IGF-IR intracelulares pueden ser moléculas biológicas, pero normalmente son moléculas pequeñas. En un aspecto, el antagonista de PDGFRα intracelular es AG1296. AG1296 (Calbiochem) es un inhibidor de PDGFα, PDGFβ y c-KIT, y también reacciona con Flt3. Otras moléculas pequeñas que eligen PDGFR como diana incluyen STI-571 (mesilato de imatinib, Gleevec®, Novartis) y SU11248 (maleato de sunitinib, SUTENT®, Pfizer).

Un anticuerpo anti-PDGFRα comprende una, dos, tres, cuatro, cinco y/o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 14 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L, respectivamente). Preferentemente, los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) tienen CDR de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 6. Alternativamente y también preferentemente, los presentes anticuerpos, o fragmentos de los mismos, tienen CDR de SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 14. Las secuencias de aminoácidos de las CDR se exponen a continuación en la Tabla 1.

Tabla 1 - CDR de IMC-3G3

Cadena pesada

CDR1

SSSYY SEC ID Nº: 2

CDR2

SFFYTGSTYYNPSLRS SEC ID Nº: 4

CDR3

QSTYYYGSGNYYGWFDR SEC ID Nº: 6

Cadena ligera

CDR1

RASQSVSSYLA SEC ID Nº: 10

CDR2

DASNRAT SEC ID Nº: 12

CDR3

QQRSNWPPA SEC ID Nº: 14

En otro aspecto, el anticuerpo anti-PDGFRα, o fragmento del mismo, tiene una región variable de la cadena pesada humana de SEC ID Nº: 8 y/o una región variable de la cadena ligera humana de SEC ID Nº: 16. IMC-3G3 es un anticuerpo tal y se ejemplifica en la presente divulgación.

Preferentemente, los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, neutralizan PDGFRα. La unión de un ligando, por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB o PDGF-CC, a un dominio extracelular de PDGFRα estimula la dimerización de receptores, autofosforilación, activación del dominio de tirosina cinasa citoplásmico interno del receptor e iniciación de múltiples rutas de transducción de señales y transactivación que participan en la regulación de la síntesis de ADN (activación de genes) y progresión o división del ciclo celular. Los anticuerpos anti-PDGFRα normalmente bloquean la unión a ligando y/o dimerización de receptores, e inhiben una o más de la autofosforilación, activación de actividad de tirosina cinasas y transducción de señales. Los anticuerpos anti-PDGFRα pueden ser específicos para la región de unión a ligando extracelular de PDGFRα y previenen la unión de un ligando de PDGFRα. Preferentemente, tales anticuerpos anti-PDGFRα, o fragmentos de los mismos, se unen a PDGFRα al menos tan fuertemente como los ligandos naturales de PDGFRα. Alternativamente o adicionalmente, los anticuerpos pueden ser específicos para una

región del monómero de receptor que de otro modo formaría una superficie de separación del dímero de receptores. Tales anticuerpos bloquean la formación de dímeros, aunque la unión de ligando a un monómero de receptor podría o no podría bloquearse.

Como se ha descrito anteriormente para anticuerpos anti-IGF-IR, la neutralización de receptores puede determinarse mediante una variedad de procedimientos in vivo, in vitro y ex vivo. Los anticuerpos anti-PDGFRα reducen la fosforilación de PDGFRα al menos aproximadamente el 75 %. En otros aspectos, la fosforilación se reduce por al menos aproximadamente el 85 % o al menos aproximadamente el 90 %. Como resultado de la inhibición de la transducción de señales de PDGFRα, la fosforilación de un componente de la ruta de transducción de señales aguas abajo (por ejemplo, Akt, p42/p44, etc.) se reduce al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 60 % o al menos aproximadamente el 80 %. La neutralización de receptores puede determinarse usando ligandos definidos (por ejemplo, PDGF-AA,-AB, -BB, -CC), mezclas de tales ligandos o preparaciones tales como aspirados de médula ósea que comprenden PDGF, además de otros factores de crecimiento estimulantes.

La neutralización de PDGFRα incluye inhibición, diminución, inactivación y/o alteración de una o más de estas actividades normalmente asociadas a la transducción de señales. Así, el neutralizar PDGFRα tiene diversos efectos, que incluyen inhibición, diminución, inactivación y/o alteración del crecimiento (proliferación y diferenciación), angiogénesis (reclutamiento de vasos sanguíneos, invasión y metástasis) y motilidad y metástasis celular (adhesión e invasividad celular).

También pueden utilizarse ensayos ex vivo, como se ha descrito anteriormente, para determinar la neutralización de PDGFRα. Por ejemplo, pueden usarse células de leiomiosarcoma SKLMS-1 humanas (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, MD; ATCC HTB-88™) o células de glioblastoma U118 (ATCC HTB-15™) estimuladas con PDGF-AA para ensayar la inhibición de PDGFRα. La inhibición del crecimiento puede determinarse usando células tumorales humanas que expresan PDGFRα inyectadas en un ratón SCID.

La presente divulgación no está limitada por ningún mecanismo particular de neutralización de PDGFRα. Los anticuerpos anti-PDGFRα se unen externamente al receptor de la superficie celular de PDGFRα, bloquean la unión de ligando (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC), inhiben la fosforilación de PDGFRα, inhiben la transducción de señales mediada por la tirosina cinasa asociada a receptor y modulan la actividad de componentes de la transducción de señales aguas abajo. El complejo receptor-anticuerpo también puede internalizarse y degradarse, produciendo la regulación por disminución de receptores de la superficie celular. Las metaloproteinasas de matriz, que funcionan en la invasión y metástasis de células tumorales, también pueden regularse por disminución por los anticuerpos. Además, los anticuerpos pueden presentar inhibición de la producción y angiogénesis de factores de crecimiento.

Como se ha descrito anteriormente, los antagonistas de PDGFRα son útiles para tratar tumores óseos, que incluyen tumores óseos metastásicos. Otros tipos de tumores que expresan PDGFRα y pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a, tumores de ovario, tumores de mama, tumores de pulmón, tumores hepatocelulares, tumores del estroma gastrointestinal, melanoma, carcinoma de células renales, tumores de próstata y sarcomas de tejido blando. Los sarcomas de tejido blando se originan en tejidos tales como grasa, músculos, nervios, tendones y vasos sanguíneos y linfáticos. Normalmente, las células tumorales expresan en exceso PDGFRα. La expresión de PDGFRα puede determinarse, por ejemplo, por histoquímica o análisis de ARN. Por ejemplo, un análisis de Scatchard de unión de IMC3G3 radiomarcado a células U118 y células tumorales SKLMS-1 indica que el número de moléculas de PDGFRα sobre las células es aproximadamente 500 y 2500, respectivamente.

Los antagonistas de PDGFRα funcionan inhibiendo la transducción de señales por PDGFRα expresada sobre las propias células tumorales, o inhibiendo PDGFRα expresado sobre células del estroma circundantes que de otro modo experimentan estimulación paracrina por PDGF expresados de células tumorales. Así, anticuerpos tales como IMC3G3 y otros antagonistas de PDGFRα son útiles para tratar tumores caracterizados por estimulación autocrina y/o paracrina de PDGFRα

Pueden producirse fragmentos de anticuerpos escindiendo un anticuerpo completo, o expresando ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos pueden prepararse mediante procedimientos descritos por Lamoyi y col., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) y por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Tales fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentos Fab o el fragmento F(ab')2. Tales fragmentos también pueden contener anticuerpos de la región variable de fragmentos monocatenarios, es decir, scFv, dicuerpos u otros fragmentos de anticuerpos. Procedimientos de producción de tales equivalentes funcionales se desvelan en la solicitud PCT WO 93/21319, solicitud de patente europea nº EP 239400; solicitud PCT WO 89/09622; solicitud de patente europea EP 338745; y solicitud de patente europea EP 332424.

Células huésped preferidas para la transformación de vectores y expresión de los anticuerpos de la presente invención son células de mamífero, por ejemplo, células COS-7, células de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares de origen linfoide tales como células de linfoma, mieloma (por ejemplo, NS0) o hibridoma. Alternativamente pueden usarse

otros huéspedes eucariotas tales como levaduras.

Si se desea expresar una construcción de gen en levadura, un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7. Stinchcomb y col. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC nº 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de daño de trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

Las células huésped transformadas se cultivan mediante procedimientos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono (hidratos de carbono tales como glucosa o lactosa), nitrógeno (aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares) y sales inorgánicas (sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio). El medio contiene además, por ejemplo, sustancias promotoras del crecimiento tales como oligoelementos, por ejemplo, hierro, cinc, manganeso y similares.

Anticuerpos anti-PDGFRα y anti-IGF-IR de alta afinidad según la presente invención pueden aislarse de una biblioteca de expresión en fago construida a partir de genes de la región variable de la cadena pesada y cadena ligera humana. Por ejemplo, un dominio variable de la invención puede obtenerse a partir de un linfocito de sangre periférica que contiene un gen de la región variable reorganizado. Alternativamente, pueden obtenerse porciones de dominio variable, tales como regiones CDR y FW, a partir de diferentes fuentes y recombinarse. Además, porciones de los dominios variables (por ejemplo, regiones FW) pueden ser secuencias consenso sintéticas.

Pueden obtenerse anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, a partir de anticuerpos que se producen naturalmente, o bibliotecas de Fab o scFv de expresión en fago. Se entiende que, para preparar un anticuerpo de un único dominio a partir de un anticuerpo que comprende un dominio VH y VL, pueden desearse ciertas sustituciones de aminoácidos fuera de las CDR para potenciar la unión, expresión o solubilidad. Por ejemplo, puede desearse modificar residuos de aminoácidos que de otro modo estarían enterrados en la superficie de separación de VH-VL.

Además, pueden obtenerse anticuerpos y fragmentos de anticuerpos por tecnología de hibridomas convencional (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998),) usando ratones transgénicos (por ejemplo, ratones KM de Medarex, San Jose, Calif.) que producen cadenas pesadas gamma y ligeras kappa humanas de inmunoglobulina. En un aspecto preferido, una porción sustancial del genoma productor de anticuerpo humano se inserta en el genoma del ratón y se convierte en deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Tales ratones puede inmunizarse subcutáneamente (s.c.) con PDGFRα (normalmente en adyuvante completo de Freund) con refuerzos según se necesite. Los procedimientos de inmunización son muy conocidos en la técnica.

La proteína usada para identificar anticuerpos de unión para IGF-IR es preferentemente IGF-IR y, más preferentemente, es el dominio extracelular de IGF-IR. La proteína usada para identificar anticuerpos de unión para PDGFRα es preferentemente PDGFRα y, más preferentemente, es el dominio extracelular de PDGFRα. Tales dominios extracelulares pueden estar libres o conjugarse con otras moléculas.

La presente divulgación también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, descritos previamente. Detalles del anticuerpo anti-IGF-IR IMC-A12 se desvelan en el documento WO2005016970. La Tabla 2 expone las secuencias de ácidos nucleicos para IMC-3G3.

Tabla 2 - Secuencias de nucleótidos que codifican CDR de IMC-3G3 5

Cadena pesada CDR1 agtagtagtt actac SEC ID Nº: 1 CDR2 agtttctttt atactgggag cacctactac aacccgtccc tcaggagt SEC ID Nº: 3 CDR3 cagtccacgt attactatgg ttcggggaat tattatggct ggttcgaccg c SEC ID Nº: 5 Cadena ligera CDR1 agggccagtc agagtgttag cagctactta gcc SEC ID Nº: 9 CDR2 gatgcatcca acagggccac t SEC ID Nº: 11 CDR3 cagcagcgta gcaactggcc tccggcg SEC ID Nº: 13

Los anticuerpos humanos que codifican ADN pueden prepararse recombinando regiones constantes y regiones variables humanas que codifican ADN, distintas de las CDR, derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones de anticuerpo humano correspondientes y CDR que codifican ADN derivadas de un ser humano (SEC ID Nº: 1, 3 y 5 para las CDR del dominio variable de la cadena pesada y SEC ID Nº: 9, 11 y 13 para las CDR del dominio variable de la cadena ligera).

Fuentes adecuadas de ADN que codifican fragmentos de anticuerpos incluyen cualquier célula, tal como hibridomas y células del bazo, que expresan el anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos pueden usarse por sí mismos como equivalentes de anticuerpo, o pueden recombinarse en equivalentes, como se ha descrito anteriormente. Las deleciones y recombinaciones de ADN descritas en esta sección pueden llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos, tales como aquellos descritos en las publicaciones enumeradas anteriormente con respecto a equivalentes de anticuerpos y/u otras técnicas de ADN recombinante convencionales, tales como aquellas descritas más adelante. Otra fuente de ADN son anticuerpos monocatenarios producidos a partir de una biblioteca de expresión en fago, como se conoce en la técnica.

Adicionalmente, la presente divulgación proporciona vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos previamente descritas operativamente ligadas a una secuencia de expresión, un promotor y una secuencia potenciadora. Se ha desarrollado una variedad de vectores de expresión para la eficaz síntesis de polipéptido de anticuerpo en procariotas, tales como bacterias y sistemas eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a, sistemas de cultivo celular en levadura y en mamífero. Los vectores de la presente divulgación pueden comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético.

Puede usarse cualquier vector de expresión adecuado. Por ejemplo, vectores de clonación procariotas incluyen plásmidos de E. coli tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM y RP4. Vectores procariotas también incluyen derivados de ADN de fago tales como M13 y otros fagos de ADN monocatenario filamentosos. Un ejemplo de un vector útil en levadura es el plásmido 2μ. Vectores adecuados para la expresión en células de mamífero incluyen derivados muy conocidos de SV40, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores lanzadera derivados de combinación de vectores de mamífero funcionales, tales como aquellos descritos anteriormente, y plásmidos funcionales y ADN de fago.

Vectores de expresión eucariotas adicionales se conocen en la técnica (por ejemplo, P.J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341 (1982); Subramani y col., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann y Sharp, “Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene”, J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann y Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill y col., “Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene in Chinese Hamster Ovary Cells”, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Los vectores de expresión útiles en la presente divulgación contienen al menos una secuencia de control de la expresión que está operativamente ligada a la secuencia de ADN o fragmento que va a expresarse. La secuencia de control se inserta en el vector con el fin de controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Ejemplos de secuencias de control de la expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, operador principal y regiones promotoras del fago lambda, la región de control de la proteína de la envuelta fd, los promotores de levadura glicolíticos, por ejemplo, un promotor para 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de fosfatasa ácida de levadura, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de levadura y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus y virus simio, por ejemplo, los promotores temprano y tardío o SV40, y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas y sus virus o combinaciones de los mismos.

La presente divulgación también proporciona células huésped recombinantes que contienen los vectores de expresión previamente descritos. Los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares distintas de en hibridomas. Pueden usarse ácidos nucleicos, que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido, para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada.

Líneas celulares de particular preferencia se seleccionan basándose en el alto nivel de expresión, expresión constitutiva de proteína de interés y contaminación mínima de proteínas huésped. Líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión son muy conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas, tales como, pero no se limitan a, células NS0, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón hámster bebé (BHK) y muchas otras. Células eucariotas adicionales adecuadas incluyen levadura y otros hongos. Huéspedes procariotas útiles incluyen, por ejemplo, E. coli tales como SG-936 de E. coli, HB 101 de E. coli, W3110 de

E. coli, X1776 de E. coli, X2282 de E. coli, DHI de E. coli y MRC1 de E. coli, Pseudomonas, Bacillus tales como Bacillus subtilis y Streptomyces.

Estas células huésped recombinantes presentes pueden usarse para producir un anticuerpo, o fragmento del mismo, cultivando las células en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo y purificando el

anticuerpo o fragmento del mismo de la célula huésped o medio de alrededor de la célula huésped. La elección como diana del anticuerpo expresado o fragmento para la secreción en las células huésped recombinantes puede facilitarse insertando un secuencia codificante de péptido señal o conductor secretor (véase, Shokri y col., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64 (2003), Nielsen y col., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) y von Heinje y col., Nucl. Acids Res. 14:46834690 (1986)) en el extremo 5' del gen de interés que codifica el anticuerpo. Estos elementos de péptido conductor secretor pueden derivarse de tanto secuencias procariotas como eucariotas. Por consiguiente, adecuadamente, se usan péptidos conductores secretores, que son aminoácidos unidos al extremo N de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido fuera del citosol de la célula huésped y secreción en el medio.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden fusionarse con residuos de aminoácidos adicionales. Tales residuos de aminoácidos pueden ser una marca de péptido, quizás para facilitar el aislamiento. También se contemplan otros residuos de aminoácidos para recircular anticuerpos a órganos o tejidos específicos.

En otro aspecto, un anticuerpo de la presente divulgación se prepara expresando un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un animal transgénico, de forma que el anticuerpo se exprese y pueda recuperarse. Por ejemplo, el anticuerpo puede expresarse de una manera específica de tejido que facilita la recuperación y purificación. En un aspecto tal, un anticuerpo se expresa en la glándula mamaria para la secreción durante la lactancia. Animales transgénicos incluyen, pero no se limitan a, ratones, cabra y conejo.

Anticuerpos que pueden usarse incluyen inmunoglobulinas completas, fragmentos de unión a antígeno de inmunoglobulinas, además de proteínas de unión a antígeno que comprenden dominios de unión a antígeno de inmunoglobulinas. Fragmentos de unión a antígeno de inmunoglobulinas incluyen, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2. Se han desarrollado otros formatos de anticuerpo que retienen especificidad de unión, pero tienen otras características que pueden ser deseables, que incluyen, por ejemplo, biespecificidad, multivalencia (superior a dos sitios de unión), tamaño compacto (por ejemplo, dominios de unión solo).

Los anticuerpos monocatenarios carecen de algunos o todos los dominios constantes de los anticuerpos completos de los que se derivan. Por tanto, pueden vencer algunos de los problemas asociados al uso de anticuerpos completos. Por ejemplo, los anticuerpos monocatenarios tienden a estar libres de ciertas interacciones no deseadas entre regiones constantes de la cadena pesada y otras moléculas biológicas. Adicionalmente, los anticuerpos monocatenarios son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y pueden tener mayor permeabilidad que los anticuerpos completos, permitiendo que anticuerpos monocatenarios se localicen y unan a sitios de unión a antígeno diana más eficazmente. Además, el tamaño relativamente pequeño de anticuerpos monocatenarios hace que sea menos probable que provoquen una respuesta inmunitaria no deseada en un receptor que los anticuerpos completos.

Anticuerpos monocatenarios múltiples, teniendo cada cadena individual un dominio VH y uno VL covalentemente ligados por un primer péptido ligador, pueden ligarse covalentemente por al menos uno o más péptidos ligadores para formar un anticuerpo monocatenario multivalente, que puede ser monoespecífico o multiespecífico. Cada cadena de un anticuerpo monocatenario multivalente incluye un fragmento de la cadena ligera variable y un fragmento de la cadena pesada variable, y está ligado por un péptido ligador a al menos otra cadena. El péptido ligador está compuesto por al menos quince residuos de aminoácidos. El máximo número de residuos de aminoácidos es aproximadamente cien.

Dos anticuerpos monocatenarios pueden combinarse para formar un diacuerpo, también conocido como un dímero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de unión, y pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio VH conectado a un dominio VL. Los dominios están conectados con ligadores que son suficientemente cortos para prevenir el apareamiento entre dominios en la misma cadena, accionándose así el apareamiento entre dominios complementarios en diferentes cadenas para volver a crear los dos sitios de unión a antígeno.

Tres anticuerpos monocatenarios pueden combinarse para formar triacuerpos, también conocidos como trímeros trivalentes. Los triacuerpos se construyen con el extremo de aminoácido de un dominio VL o VH directamente fusionado con el extremo carboxilo de un dominio VL o VH, es decir, sin ninguna secuencia de ligador. El triacuerpo tiene tres cabezas de Fv con los polipéptidos dispuestos en un modo de cabeza a cola cíclico. Una conformación posible del triacuerpo es plana con los tres sitios de unión localizados en un plano a un ángulo de 120 grados entre sí. Los triacuerpos pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o triespecíficos.

Así, anticuerpos de la presente divulgación y fragmentos de los mismos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos que se producen naturalmente, fragmentos bivalentes tales como (Fab')2, fragmentos monovalentes tales como Fab, anticuerpos monocatenarios, Fv monocatenario (scFv), anticuerpos de un único dominio, anticuerpos monocatenarios multivalentes, diacuerpos, triacuerpos, y similares que se unen específicamente con antígenos.

Los anticuerpos anti-IGF-IR y anti-PDGFRα o fragmentos de anticuerpos, que pueden internalizarse tras la unión a células que llevan IGF-IR (documento WO2005016970) o PDGFRα, pueden ligarse químicamente o biosintéticamente a agentes antitumorales. Los agentes antitumorales ligados a un anticuerpo tal incluyen cualquier agente que destruya

o dañe un tumor al que el anticuerpo se ha unido o en el entorno de la célula al que el anticuerpo se ha unido. Por ejemplo, un agente antitumoral es un agente tóxico tal como un agente quimioterapéutico o un radioisótopo. Agentes quimioterapéuticos adecuados son conocidos para los expertos en la materia e incluyen antraciclinas (por ejemplo, daunomicina y doxorubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina, cis-platino, clorambucilo, citosina arabinósido, 5-fluorouridina, melfalan, ricina y caliqueamicina. Los agentes quimioterapéuticos se conjugan con el anticuerpo usando procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Hermentin y Seiler, Behring Inst. Mitt. 82:197-215(1988)).

Radioisótopos adecuados para su uso como agentes antitumorales también son conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, se usa 131I o 211At. Estos isótopos se unen al anticuerpo usando técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Pedley y col., Br. J Cancer 68, 69-73(1993)).

Alternativamente, el agente antitumoral que está unido al anticuerpo es una enzima que activa un profármaco. De esta forma, se administra un profármaco que permanece en su forma inactiva hasta que alcance el sitio diana en el que se convierte en su forma de citotoxina. En la práctica, el conjugado anticuerpo-enzima se administra al paciente y se deja que se localice en la región del tejido que va a tratarse. Entonces, el profármaco se administra al paciente de manera que la conversión en el fármaco citotóxico se produzca en la región del tejido que va a tratarse.

Otros agentes antitumorales incluyen citocinas tales como interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El anticuerpo elige como diana la citocina para el tumor de manera que la citocina medie en el daño a o la destrucción del tumor sin afectar otros tejidos. La citocina puede conjugarse con el anticuerpo al nivel de ADN usando técnicas de ADN recombinante convencionales.

En ciertos aspectos, anticuerpos anti-IGF-IR o anti-PDGFRα se administran en combinación con uno o más agentes antineoplásicos. Para ejemplos de terapias de combinación véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.217.866 (Schlessinger y col.) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con agentes antineoplásicos); documento WO 99/60023 (Waksal y col.) (Anticuerpos anti-EGFR en combinación con radiación). Puede usarse cualquier agente antineoplásico adecuado, tal como un agente quimioterapéutico, radiación o combinaciones de los mismos. El agente antineoplásico puede ser un agente alquilante o un antimetabolito. Ejemplos de agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, ciclofosfamida, melfalan y dacarbazina. Ejemplos de antimetabolitos incluyen, pero no se limitan a, doxorubicina, daunorubicina y paclitaxel, gemcitabina.

Agentes antineoplásicos útiles también incluyen inhibidores mitóticos tales como los taxanos docetaxel y paclitaxel. Los inhibidores de la topoisomerasa son otra clase de agentes antineoplásicos que pueden usarse en combinación con anticuerpos de la invención. Éstos incluyen inhibidores de la topoisomerasa I o la topoisomerasa II. Los inhibidores de la topoisomerasa I incluyen irinotecan (CPT-11), aminocamptotecina, camptotecina, DX-8951f, topotecan. Los inhibidores de la topoisomerasa II incluyen etopósido (VP-16) y tenipósido (VM-26). Otras sustancias están siendo actualmente evaluadas con respecto a la actividad inhibidora de la topoisomerasa y eficacia como agentes antineoplásicos. En un aspecto preferido, el inhibidor de la topoisomerasa es irinotecan (CPT-11).

En un aspecto particular, un anticuerpo anti-IGF-IR se administra en combinación con docetaxel. Un anticuerpo anti-PDGFRα se administra en combinación con doxorubicina.

Cuando el agente antineoplásico es radiación, la fuente de la radiación puede ser tanto externa (radioterapia de haz externo - EBRT) como interna (braquiterapia - BT) al paciente que está tratándose. La dosis de agente antineoplásico administrada depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de agente, el tipo y gravedad del tumor que está tratándose y la vía de administración del agente. Debe enfatizarse, sin embargo, que la presente invención no se limita a ninguna dosis particular.

Los tratamientos con anticuerpo (anti-IGF-IR o anti-PDGFRα) y anticuerpo más agente antineoplásico también pueden usarse para pacientes que reciben terapia hormonal adyuvante (por ejemplo, para cáncer de mama) o terapia de deprivación de andrógenos (por ejemplo, para cáncer de próstata).

Los antagonistas anti-IGF-IR y anti-PDGFRα pueden coadministrarse o administrarse con antagonistas de receptores que neutralizan otros receptores que participan en el crecimiento o angiogénesis tumoral. Por ejemplo, se coadministran un anticuerpo anti-IGF-IR y un anticuerpo anti-PDGFRα. En un aspecto en el que una célula tumoral diana expresa tanto IGF-IR como PDGFRα, elementos de transducción de señales comunes se activan por transducción de señales mediante cada receptor. Aunque la inhibición de un receptor producirá generalmente la disminución de la activación de los componentes aguas abajo comunes, la inhibición de ambos receptores disminuirá adicionalmente la activación. En otro aspecto, ciertas células en un tumor o tejido circundante expresan cantidades significativas de un receptor, y otras células expresan cantidades significativas del segundo receptor. La coadministración de los antagonistas reduce el crecimiento de la célula tumoral y la estimulación paracrina de células circundantes.

Un anticuerpo biespecífico puede proporcionarse como una alternativa a la coadministración. Existe una variedad de

anticuerpos biespecíficos que se diseñan para incorporar diversas características deseables. Por ejemplo, los diacuerpos biespecíficos tienen tamaño mínimo. Anticuerpos biespecíficos con cuatro sitios de unión a antígeno (dos para cada especificidad de unión) tienen avideces de unión que son similares a aquellas de anticuerpos naturales correspondientes. Ciertos anticuerpos biespecíficos incorporan regiones Fc, reciclando así funciones efectoras (por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)) de anticuerpos naturales. El documento WO 01/90192 describe anticuerpos tetravalentes similares a IgG. El documento WO2006/02025 describe un anticuerpo tetravalente que incorpora dos diacuerpos y retiene funciones efectoras.

En otro aspecto, un anticuerpo anti-IGF-IR o un anticuerpo anti-PDGFRα u otro antagonista se usa en combinación con un antagonista de receptor que se une específicamente a un receptor de factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, EGFR, Her2/erbB2, erbB3, erbB4). Particularmente se prefieren proteínas de unión a antígeno que se unen al dominio extracelular de EGFR y bloquean la unión de uno o más de sus ligandos y/o neutralizan la activación inducida por ligando de EGFR. Los antagonistas de EGFR también incluyen anticuerpos que se unen a un ligando de EGFR e inhiben la unión de EGFR a su ligando. Ligandos para EGFR incluyen, por ejemplo, EGF, TGF-α, anfiregulina, EGF de unión a heparina (HB-EGF) y betacelulina. Se cree que EGF y TGF-α son los principales ligandos endógenos que producen estimulación mediada por EGFR, aunque se ha mostrado que TGF-α es más potente en promover la angiogénesis. Antagonistas de EGFR también incluyen sustancias que inhiben la dimerización de EGFR con otras subunidades de receptor EGFR (es decir, homodímeros de EGFR) o heterodimerización con otros receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, HER2). Antagonistas de EGFR adicionales incluyen moléculas biológicas y moléculas pequeñas, tales como inhibidores de cinasas sintéticos que actúan directamente sobre el dominio citoplásmico de EGFR para inhibir la transducción de señales mediada por EGFR. Erbitux® (cetuximab) es un ejemplo de un antagonista de EGFR que se une a EGFR y bloquea la unión a ligando. Un ejemplo de un antagonista de EGFR de molécula pequeña es IRESSA ™(ZD1939), que es un derivado de quinozalina que funciona como mimético de ATP para inhibir EGFR. Véase la patente de EE.UU. nº 5.616.582 (Zeneca Limited); documento WO 96/33980 (Zeneca Limited) en la pág. 4; véase, por tanto, Rowinsky y col., Resumen 5 presentado en la 37ª Reunión anual de ASCO, San Francisco, CA, 12-15 de mayo de 2001; Anido y col., Resumen 1712 presentado en la 37ª Reunión anual de ASCO, San Francisco, CA, 12-15 de mayo de 2001. Otro ejemplo de un antagonista de EGFR de molécula pequeña es Tarceva® (OSI-774), que es un derivado de inhibidor de EGFR de 4-(fenilamino sustituido)quinozalina [clorhidrato de 6,7-bis(2-metoxi-etoxi)-quinazolin-4-il]-(3-etinil-fenil)amina]. Véase el documento WO 96/30347 (Pfizer Inc.) en, por ejemplo, página 2, línea 12 a página 4, línea 34 y página 19, líneas14-17. Véase también Moyer y col., Cancer Res.,

57: 4838-48 (1997); Pollack y col., J. Pharmacol., 291: 739-48 (1999). Tarceva® puede funcionar inhibiendo la fosforilación de EGFR y sus rutas de transducción de señales de las cinasas PI3/Akt y MAP (proteína activada por mitógeno) aguas abajo produciendo la detención del ciclo celular mediada por p27. Véase Hidalgo y col., Resumen 281 presentado en la 37ª Reunión anual de ASCO, San Francisco, CA, 12-15 de mayo de 2001.

También se informa que otras moléculas pequeñas inhiben EGFR, muchas de las cuales se cree que son específicas para el dominio de tirosina cinasa de un EGFR. Algunos ejemplos de tales antagonistas de EGFR de molécula pequeña se describen en los documentos WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited), WO 97/30034 (Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company) y WO 00/31048 (Warner Lambert Company). Ejemplos de antagonistas de EGFR de molécula pequeña específicos incluyen CI-1033 (Pfizer), que es un inhibidor de tirosina cinasas de quinozalina (N-[4-(3-cloro-4-fluoro-fenilamino)-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quinazolin-6-il]acrilamida), particularmente EGFR y se describe en el documento WO 00/31048 en la página 8, líneas 22-6; PKI166 (Novartis), que es un inhibidor de EGFR de pirrolopirimidina y se describe en el documento WO 97/27199 en las páginas 10-12; GW2016 (GlaxoSmithKline), que es un inhibidor de EGFR y HER2; EKB569 (Wyeth), que se informa que inhibe el crecimiento de células tumorales que expresan en exceso EGFR o HER2 in vitro e in vivo; AG-1478 (Tyrphostin), que es una molécula pequeña de quinazolina que inhibe la señalización de tanto EGFR como erbB-2; AG1478 (Sugen), que es un inhibidor de bisustrato que también inhibe la proteína cinasa CK2; PD 153035 (Parke-Davis) que se informa que inhibe la actividad de cinasas de EGFR y crecimiento tumoral, induce apoptosis en células en cultivo y potencia la citotoxicidad de agentes citotóxicos quimioterapéuticos; SPM-924 (Schwarz Pharma), que es un inhibidor de tirosina cinasas dirigido para el tratamiento de cáncer de próstata; CP-546.989 (OSI Pharmaceuticals), que es supuestamente un inhibidor de la angiogénesis para el tratamiento de tumores sólidos; ADL-681, que es un inhibidor de cinasas de EGFR dirigido para el tratamiento de cáncer; PD 158780, que es una piridopirimidina que se informa que inhibe la tasa de crecimiento tumoral de xenoinjertos A4431 en ratones; CP-358.774, que es una quinzolina que se informa que inhibe la autofosforilación en xenoinjertos HN5 en ratones; ZD1839, que es una quinzolina que se informa que tiene actividad antitumoral en modelos de xenoinjerto de ratón que incluyen cánceres de vulva, NSCLC, próstata, ovario y colorrectal; CGP 59326A, que es una pirrolopirimidina que se informa que inhibe el crecimiento de xenoinjertos positivos para EGFR en ratones; PD 165557 (Pfizer); CGP54211 y CGP53353 (Novartis), que son dianilnoftalimidas. Los inhibidores de tirosina cinasas de EGFR naturalmente derivados incluyen genisteína, herbimicina A, quercetina y erbstatina.

Otras moléculas pequeñas que se informó que inhibían EGFR son compuestos tricíclicos tales como los compuestos

descritos en la patente de EE.UU. nº 5.679.683; derivados de quinazolina tales como los derivados descritos en la patente de EE.UU. nº 5.616.582; y compuestos de indol tales como los compuestos descritos en la patente de EE.UU. nº 5.196.446.

Otro receptor que puede elegirse como diana junto con IGF-IR o PDGFRα es un receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR). Un anticuerpo anti-IGF-IR o anticuerpo anti-PDGFRα se usa en combinación con un antagonista de VEGFR. En una realización se usa un antagonista que se une específicamente al receptor VEGFR1/Flt-1. En otro aspecto, el antagonista de VEGFR se une específicamente al receptor VEGFR-2/KDR. Particularmente se prefieren proteínas de unión a antígeno que se unen al dominio extracelular de VEGFR-1 o VEGFR-2 y bloquean la unión por sus ligandos (VEGFR-2 se estimula muy fuertemente por VEGF; VEGFR-1 se estimula muy fuertemente por PIGF, pero también por VEGF) y/o neutralizan la activación inducida por ligando. Por ejemplo, IMC-1121 es un anticuerpo humano que se une a y neutraliza VEGFR-2 (documento WO 03/075840; Zhu). Otro ejemplo es el mAb 6.12 que se une a VEGFR-1 soluble y expresado en la superficie celular. ScFv 6.12 comprende los dominios VL y VH del anticuerpo monoclonal de ratón MAb 6.12. Una línea celular de hibridoma que produce MAb 6.12 se ha depositado como el número de ATCC PTA-3344 bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del procedimiento de patente y las reglamentaciones en virtud del mismo (Tratado de Budapest). En otro aspecto, el antagonista de VEGFR se une a un ligando de VEGFR y bloquea la activación de un VEGFR por el ligando. Por ejemplo, Avastin® (bevacizumab) es un anticuerpo que se une a VEGF.

Otros ejemplos de receptores de factores de crecimiento que participan en la tumorigénesis son el factor de crecimiento nervioso (NGFR) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR).

En un aspecto alternativo adicional, los anticuerpos anti-IGF-IR y anti-PDGFRα o pueden administrarse en combinación con uno o más adyuvantes adecuados tales como, por ejemplo, citocinas (IL-10 y IL-13, por ejemplo) u otros inmunoestimulantes tales como, pero no se limitan a, quimiocina, antígenos asociados a tumor y péptidos. Véase, por ejemplo, Larrivée y col., arriba. Debe apreciarse, sin embargo, que la administración de solo un anticuerpo anti-IGF-IR

o anti-PDGFRα es suficiente para prevenir, inhibir o reducir la progresión del tumor de una manera terapéuticamente eficaz.

En una terapia de combinación, el anticuerpo anti-IGF-IR o anti-PDGFRα se administra antes, durante o después de comenzar terapia con otro agente, además de cualquier combinación de los mismos, es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de comenzar la terapia con agente antineoplásico. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse entre 1 y 30 días, preferentemente 3 y 20 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar radioterapia. En un aspecto preferido, la quimioterapia se administra simultáneamente con o, más preferentemente, posterior a la terapia con anticuerpo.

Puede usarse cualquier procedimiento adecuado o vía para administrar anticuerpos de la invención, y opcionalmente, para co-administrar agentes antineoplásicos y/o antagonistas de otros receptores. Las pautas de agentes antineoplásicos utilizadas según la invención incluyen cualquier pauta que se cree que es óptimamente adecuada para el tratamiento de la afección neoplásica del paciente. Diferentes tumores malignos pueden requerir el uso de anticuerpos antitumorales específicos y agentes antineoplásicos específicos, que se determinarán en una base paciente por paciente. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. La dosis de antagonista administrada depende de numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, el tipo de antagonistas, el tipo y gravedad del tumor que está tratándose y la vía de administración de los antagonistas. Debe enfatizarse, sin embargo, que la presente divulgación no se limita a ningún procedimiento o vía de administración particular.

Un experto en la materia entenderá que las dosificaciones y frecuencia de tratamiento dependen de la tolerancia del paciente individual y de las propiedades farmacológicas y farmacocinéticas del agente de bloqueo o inhibidor usado. Idealmente, se desea lograr farmacocinética saturable para el agente usado. Una dosis de carga para tanto los anticuerpos anti-IGF-IR como anti-PDGFRα puede oscilar, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 1400 mg/m2, preferentemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mg/m2. Ésta puede ir seguida de varias dosificaciones diarias o semanales adicionales que oscilan, por ejemplo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mg/m2. El paciente se monitoriza para efectos secundarios y el tratamiento se detiene cuando tales efectos secundarios son graves.

Un experto en la materia también sabrá cómo monitorizar el progreso del tratamiento con el fin de determinar una dosis eficaz. Para metástasis óseas de cáncer de próstata, una forma tal es monitorizar niveles de PSA. Otras formas para monitorizar metástasis óseas incluyen gammagrafías óseas y RMN.

Para pacientes para los que la pérdida ósea inducida por tratamiento para el cáncer (CTIBL) es un riesgo o problemática (por ejemplo, pacientes que reciben terapia hormonal adyuvante para cáncer de mama o terapia de deprivación de andrógenos para cáncer de próstata), cualquier tratamiento anteriormente mencionado puede

complementarse por la administración de agentes para la prevención de CTIBL, tales como bisfosfonatos. Los bisfosfonatos incluyen, por ejemplo, clodronato, risedronato y ácido zoledrónico.

Descripciones detalladas de procedimientos convencionales, tales como aquellos empleados en la construcción de vectores y plásmidos, y expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse de numerosas publicaciones, que incluyen Sambrook, J y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Coligan, J. y col. (1994) Current Protocols in Immunology, Wiley & Sons, Incorporated; Enna,

S.J. y col. (1991) Current Protocols in Pharmacology, Wiley & Sons, Bonifacino, J.S. y col. (1999) Current Protocols in Cell Biology, Wiley & Sons.

Ejemplos

Ejemplo 1 (PARA REFERENCIA SOLAMENTE)

Efectos de IMC-A12 y docetaxel sobre el crecimiento tumoral. Fragmentos de tumor (20 a 30 mm3) de LuCaP 35V independiente de andrógenos (IA) se implantaron subcutáneamente (s.c.) en 32 ratones SCID castrados de seis semanas de edad, respectivamente, como se describe previamente (4). Cuando se observó que el tumor implantado alcanzaba un volumen de 150-200 mm3, los animales se aleatorizaron en cuatro grupos para los estudios de tratamiento. Los animales del grupo 1 recibieron tratamiento con docetaxel a una dosis de 20 mg/kg. Los animales del grupo 2 recibieron tratamiento con docetaxel a una dosis de 10 mg/kg. Los animales del grupo 3 recibieron tratamiento combinado de 10 mg/kg de docetaxel y 40 mg/kg de A12. Los animales del grupo 4 recibieron tratamiento combinado de 20 mg/kg de docetaxel y 40 mg/kg de A12. Todos los tratamientos se administraron intraperitonealmente (ip). El docetaxel se administró una vez a la semana. A12 se administró tres veces a la semana. Todos los animales se trataron durante cuatro semanas y se monitorizaron durante cuatro semanas adicionales antes de la eutanasia. Los tumores se midieron dos veces a la semana y el volumen del tumor se estimó por la fórmula: volumen = L X W2/2. Siguiendo el protocolo para animales aprobado por el IACUC de la Universidad de Washington, algunos animales se sacrificaron antes cuando el tumor alcanzó un volumen de 1000 mm3 o cuando la pérdida de peso del animal superó el 20 % del peso corporal inicial. Los animales se pesaron dos veces a la semana. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital semanalmente. Se separó el suero y el nivel de PSA se determinó usando el ensayo de PSA total IMx (Abott Laboratories, Abott Park, IL). BrdU se inyectó en los tumores 1 h antes de sacrificar los animales para la evaluación de la tasa de proliferación de células tumorales in vivo.

Después de la eutanasia, los tumores se recogieron y se dividieron en dos. Una porción de los tumores se fijó en 10 % de tampón formalina neutra (NFB) y se incorporó en parafina. Se prepararon secciones de cinco micrómetros para tinción inmunohistoquímica (IHC). La porción restante de los tumores se separó mecánicamente en células individuales troceando y filtrando a través de tamices de nailon de 70 μm.

Como se muestra en la Fig. 1, el xenoinjerto de LuCaP 35V creció agresivamente en ratones a una tasa de crecimiento promedio de 362,0 ± 72,0 mm3/semana sin ningún tratamiento. Todos los animales en el grupo no tratado tuvieron que sacrificarse en el plazo de tres semanas después del inicio del tratamiento en grupos experimentales debido a que el volumen del tumor superaba 1000 mm3. Cuando los animales se trataron con 40 μg/kg de A12 solo, la tasa de crecimiento tumoral se redujo a 192,7 ± 35,6 mm3/semana durante el tratamiento. Cuando se administró docetaxel a los animales a una dosis de 10 mg/kg, la tasa de crecimiento tumoral de LuCaP 35V se redujo a un promedio de 29,6 ± 6,1 mm3/semana. Cuando docetaxel se administró en combinación con tratamiento de A12, la tasa de crecimiento tumoral de LuCaP 35V se redujo adicionalmente a un promedio de 7,9 ± 1,0 mm3/semana (Fig. 1b). El efecto de la inhibición de docetaxel combinado con A12 persistió durante más de cuatro semanas después de la terminación de los tratamientos. Cuando se administró una mayor dosis de docetaxel (20 mg/kg) a los animales, independientemente con

o sin tratamiento de A12 combinado, el volumen del tumor no aumentó durante el periodo de tratamiento de cuatro semanas; a diferencia, se observó una tendencia de volúmenes de tumor reducidos. Sin embargo, en las cuatro semanas tras la terminación del tratamiento, la reducción de los volúmenes de tumor continuó en el grupo de animales tratados con docetaxel combinado con A12. A diferencia, los volúmenes de tumor estuvieron aumentando a una tasa promedio de 27,0 ± 16,1 mm3/semana en el grupo de animales tratados con docetaxel solo. Estos resultados han sugerido que, en una dosis dada de docetaxel, el tratamiento combinado con A12 puede potenciar el efecto inhibidor de docetaxel sobre el crecimiento tumoral durante el tratamiento o después de seguimientos del tratamiento.

PSA es un parámetro clínico comúnmente usado para evaluar el crecimiento de tumor de próstata. Se midieron niveles de PSA en suero en animales durante y después de los tratamientos. Como se muestra en la Fig. 1c, en animales tratados con A12 y docetaxel o 20 mg/kg de docetaxel solo, no se observó cambio significativo en niveles de PSA en suero durante el tratamiento de cuatro semanas, de acuerdo con el crecimiento tumoral suprimido. Después de la terminación del tratamiento, el nivel de PSA en suero se mostró elevado en animales tratados con docetaxel solo y, a diferencia, era coherente o incluso disminuyó en animales tratados con docetaxel en combinación con A12. Estos datos están de acuerdo con la inhibición después del tratamiento continuada del crecimiento tumoral en animales tratados con docetaxel y A12.

Inducción de apoptosis por docetaxel combinado con anticuerpo anti-IGF-IR. El efecto in vivo combinado de docetaxel y tratamiento con A12 sobre el ciclo celular y la supervivencia celular en el criterio de valoración experimental se midió por ensayo de marcado de extremos cortados mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) y tinción con propidio (PI) usando el kit Apop-Direct (BD BioScience) como se describe previamente. Brevemente, 1x106 células de la suspensión de una única célula se fijaron con 10 % de tampón formalina neutra (NBF) seguido de 70 % de alcohol etanólico a -20 ºC durante 30 min. Después de varios lavados, las células se permeabilizaron con 0,1 % de Triton X-100 y se incubaron con dUTP conjugado con FITC y enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) a 37 ºC durante 1 h, seguido de una incubación con tampón PI/RNasa (100 μg/ml de PI, 50 μg/ml de RNasa) a temperatura ambiente durante 60 min. Las muestras se analizaron por citometría de flujo usando un BD FACscan. Los datos se analizaron con el software CellQuestPRO.

Cuatro semanas después de la terminación del tratamiento, la apoptosis se detectó en un porcentaje significativo de tumores de animales que se habían tratado con docetaxel (66,7 % en el grupo tratado con 10 mg/kg de docetaxel y 77,8 % en el grupo tratado con 20 mg/kg de docetaxel) en combinación con A12 (Fig. 2b y Tabla 1), independientemente de la dosificación de docetaxel que se usó. Los eventos apoptósicos promedio en estos tumores se produjeron a una tasa del 15,0 ± 4,3 %. No se detectó apoptosis en tumores en animales que se trataron con docetaxel solo. En su lugar, la mayoría (88 % en el grupo tratado con 10 mg/kg de docetaxel y 100 % en el grupo tratado con 20 mg/kg de docetaxel) de los tumores avanzaron al ciclo celular normal (Fig. 2a y Tabla 3).

Tabla 3 - Ciclo de células tumorales y actividades de supervivencia en el momento del sacrificio

Tratamiento

Apoptosis (%) Detención de G1 (%) Detención de G2 (%) Ciclo normal (%)

Ninguno

0 0 0 100

Doc (20)

0 0 0 100

Doc (20) ± A12

66,7 33,3 0 0

Doc (10)

0 0 12 88

Doc (10) + A12

77,8 0 0 12,2

Para evaluar adicionalmente la capacidad de proliferación de células tumorales después de diferente terminación del tratamiento, la sección en parafina se tiñó con anticuerpo anti-BrDu. Las muestras tumorales se fijaron en 10 % de NBF, se incorporaron en parafina y se seccionaron a 5 μm sobre portaobjetos. Después de la desparafinización y rehidratación, los antígenos se recuperaron con ácido cítrico 0,01 M (pH 6,0) a 95 ºC durante 2 X 5 min. Los portaobjetos se dejaron enfriar durante 30 min, seguido de aclarado secuencial con PBS. La actividad de peroxidasa endógena se inactivó por una incubación con 0,3 % de H2O2 en metanol durante 15 min. Después de bloquear con 1,5 % de suero de cabra normal en PBS que contenía 0,05 % de Tween 20 (PBST) durante 1 h, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo de ratón anti-BrDu (1 μg/ml) durante 1 h, seguido de incubación secuencial con anticuerpo de cabra biotinilado dirigido contra IgG de ratón durante 30 min, avidina marcada con peroxidasa durante 30 min (Santa Cruz Biotechnology) y sustrato cromógeno de diaminobencidina (DAB) / peróxido de hidrógeno (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 5-10 min. Todas las etapas de incubación se realizaron a temperatura ambiente. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina (Sigma) y se montaron en Permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, New Jersey). Para control negativo se usó IgG de ratón (Vector Laboratories) en lugar del anticuerpo anti-BrDu primario. Los portaobjetos se examinaron bajo un Microscopio Zeiss y se obtuvieron imágenes digitales. Los números de núcleos marcados con BrdU y núcleos totales se recogieron de 10 vistas al azar de cada sección. El índice de proliferación se calculó por el número de núcleos positivos para BrdU dividido entre el número total de núcleos. Se contaron diez campos por portaobjetos. Se realizaron tinciones con H&E usando hematoxilina y eosina (Richard Allen, Kalamazoo, MI).

En animales que se trataron con docetaxel y A12, la captación de BrDu fue significativamente inferior a aquellos tratados con la misma dosis de docetaxel solo (Fig. 3). Estos datos de incorporación de BrDu están de acuerdo con las observaciones anteriores de ciclo celular y apoptosis, sugiriendo que A12 potenció significativamente la citotoxicidad de docetaxel.

Regulación diferencial de la expresión génica en tumores tratados con docetaxel combinado con anticuerpo anti-IGF-IR frente a docetaxel solo. Para determinar posibles mecanismos para el efecto marcadamente potenciado de docetaxel por A12, la expresión de IGF-IR se examinó en todos los tumores recogidos por inmunohistoquímica y análisis de citometría de flujo. No hubo diferencia en la expresión de IGF-IR superficial entre todos los grupos de tratamiento o en comparación con el grupo de control (datos no mostrados). La expresión génica después del tratamiento se examinó usando análisis de micromatrices de ADNc en tumores de animales que habían recibido 20 mg/kg de docetaxel y 20 mg/kg de docetaxel combinado con A12. Basándose en el análisis de SAM, 49 genes se identificaron como diferencialmente expresados en tumores que recibieron tratamiento combinado de docetaxel y A12 en comparación con aquellos que recibieron docetaxel solo, con más de 2 veces de cambio y menos del 10 % de tasa de descubrimiento falso (FDR) (datos no mostrados). Se identificaron trece genes que participan posiblemente en la regulación de la apoptosis o ciclo celular (Tabla 4). Los 13 genes fueron al menos 2 veces diferentes entre los dos tratamientos y tuvieron una FDR inferior al 0,02 %. Nueve genes se regularon por disminución y cuatro genes se regularon por incremento en tumores tratados con docetaxel y A12, con respecto a tumores tratados con docetaxel solo.

Tabla 4 - Expresión génica diferencial después del tratamiento en tumores tratados con docetaxel + A12 en comparación con tumores tratados con docetaxel solo.

HUGO Nombre Función de GO Veces de cambio FDR

Genes regulados por disminución

CDC2 Ciclo 2 de la división celular citocinesis; mitosis; 3,0 �0,02 % CDC6 mg homólogo a ciclo 6 de la división celular CDC6 regulación negativa de la proliferación celular 2,2 �0,02 % CCNA2 Ciclina A2 regulación de actividad de CDK 2,1 �0,02 % MYBL2 2 similar a homólogo (aviar) del oncogén viral de la mieloblastosis V-myb antiapoptosis; desarrollo; regulación del ciclo celular; 3,2 �0,02 % TUBB Polipéptido de tubulina-beta resistencia de taxanos al movimiento basado en microtúbulos 2,3 �0,02 % K-ALPHA-1 Tubulina-alfa ubicua resistencia de taxanos al movimiento basado en microtúbulos 2,5 �0,02 % BIRC5 5 que contiene repetición de IAP baculoviral (survivina) antiapoptosis 2,5 �0,02 % CDC25B Ciclo 25B de la división celular regulación positiva de la proliferación celular 2,0 �0,02 % MYC Homólogo (aviar) del oncogén viral de la mielocitomatosis Vmyc detención del ciclo celular; 2,5 �0,02 %

Genes regulados por incremento

TOB1 Transductor de ERBB21 regulación negativa de la proliferación celular 2,2 �0,02 % CCNG2 Ciclina G2 punto de regulación del ciclo celular 2,1 �0,02 % IGFBP3 Proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina regulación del crecimiento celular, pro-apoptósico 2,0 �0,02 % BIRC3 3 que contiene repetición de IAP baculoviral antiapoptosis; receptor de la transducción de señales ligadas a la superficie celular 2,2 �0,02 %

Para genes seleccionados, los resultados se confirmaron por RT-PCR en tiempo real. Se purificó un fragmento de PCR patrón de ADNc diana. Se usó una serie de diluciones de los patrones de 10 ng/μl a 10-3 pg/μl para RT-PCR en tiempo real para generar curvas patrón. Un μg de ARN total de cada grupo de tumor reunido se usó para la síntesis de ADNc de la primera hebra usando el sistema de síntesis de la primera hebra Superscript (Invitrogen). La RT-PCR en tiempo 15 real se realizó en 20 μl de mezcla de reacción que contenía 1 μl de la primera hebra de ADNc, conjuntos de cebadores

específicos y Lightcycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green usando un Lightcycler de Roche siguiendo el protocolo del fabricante (Roche, Nutley, NJ). Los productos de RT-PCR se sometieron a análisis de la curva de fusión usando el software Lightcycler v3.5. Los tamaños de amplicón se confirmaron por electroforesis en gel de agarosa. Cada muestra se ensayó por duplicado. Los resultados se muestran en la Fig. 4.

De los genes regulados por disminución, se ha mostrado que TUBB produce resistencia a docetaxel (Tanaka y col., 2004, Int. J. Cancer 111, 617-26) y se ha mostrado que la elevada expresión de BIRC 5 (survivina) se asocia a cáncer de próstata agresivo y resistencia a terapia antiandrogénica (de Angelis y col., 2004, Int. J. Oncol. 24, 1279-88; Zhang y col., 2005, Oncogene 24, 2474-82). Adicionalmente, TUBB es un gen regulado por IGF-IR que participa con la transformación mediada por IGF-IR (Loughran y col., 2005, Oncogene 24, 6185-93). De los cuatro genes regulados por incremento se ha mostrado que IGFBP3 inhibe la señalización del ligando de IGF, además de inducir apoptosis en células tumorales de próstata en un modo dependiente de ligando (Grimberg y col., 2000, J. Cell. Physiol. 183, 1-9).

Niveles de A12 en suero después del tratamiento. Los niveles de A12 en suero se midieron en animales que habían recibido docetaxel combinado con A12. Los niveles de A12 en suero disminuyeron 100 veces dos semanas después del cese del tratamiento y se detectó a un nivel muy bajo cuatro semanas después del cese del tratamiento (Fig. 5).

Citotoxicidad global. Se examinó la citotoxicidad de la coadministración de docetaxel y IMC-A12. Aunque A12 tiene más del 95 % de reactividad cruzada con IGF-IR murino, no se observaron actividad diaria anormal o cambios de comportamiento en animales tratados con reactivos combinados o docetaxel solo en comparación con animales que portan tumor de control. No se observó efecto significativo sobre células renales en ningún grupo de tratamiento por tanto ensayos del ciclo celular como de apoptosis (datos no mostrados). No se observó cambio significativo en el peso corporal entre los grupos de tratamiento (Fig. 6).

Terapia de anticuerpo anti-IGF-IR para metástasis óseas. La eficacia de tratamiento con anticuerpos anti-IGF-IR sobre el crecimiento metastásico de células de cáncer de próstata en hueso se evaluó usando células de cáncer de próstata inyectadas directamente en la tibia de ratones SCID. Por este procedimiento, los tumores metastásicos se establecen directamente sin dependencia de la invasión dependiente de quimiotaxia de la circulación. Están disponibles una variedad de líneas tumorales para establecer metástasis óseas. Éstas incluyen células PC-3, LuCaP35 y LnCaP que producen lesiones osteolíticas y células LuCaP 23.1 que producen lesiones osteoblásticas.

Las células LuCaP 23.1, que expresan IGF-1R, tienen una tasa de crecimiento de ~80 % en el entorno del hueso y producen reacciones osteoblásticas. En experimentos preliminares, muestras de LuCaP 23.1 presentaron un aumento significativo en el volumen del hueso frente al volumen de tejido (% de VH/VT) en tumor frente a tibias de control (254503 % de control, p=0,024). Todos los tumores de LuCaP 23.1 en tibias presentaron nuevas trabéculas óseas, que no estaban presentes en las muestras normales, y un alto número de focos de tumor, que habían sustituido la médula ósea normal. En algunos especímenes, el crecimiento de tumor y hueso se extendió fuera del hueso original. También se observó elevado % de VH/VT de muestras de LuCaP 23.1 después de la castración; el % de VH/VT de tibias con tumor fue del 212-354 % del de tibias sin tumor (p=0,024). Los resultados observados para los xenoinjertos intratibiales de LuCaP 23.1 son indicativos de formación ósea de novo estimulada por células tumorales. Además, los tumores muestran muchas similitudes con muestras humanas de metástasis óseas osteoblásticas, que incluyen grandes números de focos de tumor y elevadas cantidades de hueso mineralizado.

Para evaluar la eficacia del tratamiento con IMC-A12, tumores de xenoinjerto de LuCaP 23.1 se injertaron en ratones SCID, y los niveles de PSA en suero se midieron cada dos semanas para evaluar el crecimiento tumoral. Todos los animales se castraron dos semanas antes del injerto de células tumorales tibiales. La administración de IMC-A12 para probar ratones empezó cuando los niveles de PSA en suero alcanzaron 5-10 ng/ml (que indica tumores establecidos). Se inyectaron 40 mg/kg de IMC-A12 i.p. tres veces a la semana durante seis semanas.

La densidad mineral ósea (DMO) de las tibias con tumor y las tibias contralaterales sin tumor se midió por absorciometría de rayos X dual (densitómetro PIXImus Lunar) realizada en un área de 2,5 mm x 2,5 mm en el sitio de inyección de células tumorales, o el sitio correspondiente de la tibia contralateral en el momento del injerto. La evaluación cada dos semanas de lesiones se hizo por medidas de PSA en suero. Todos los animales se sacrificaron cuando las lesiones óseas en el grupo de control habían vuelto a ocurrir después de la castración basándose en niveles de PSA en suero (LuCaP 35 >60 ng/ml, ng/ml, LuCaP 23.1 >500 ng/ml), aspecto radiográfico de las lesiones óseas o cuando los animales se comprometieron. Una hora antes de sacrificar los animales se inyectaron con BrdU para monitorizar la proliferación de células tumorales. Las radiografías se tomaron antes del sacrificio (FaxitronX-ray MX-20), y se midieron la DMO de ambas tibias en el momento del sacrificio.

Tabla 5 - Densidad mineral ósea (DMO)

Tratamiento

A12 Control

Pata con tumor

Pata sin tumor Pata con tumor Pata sin tumor

Media

0,060 0,045 0,098 0,053

Valor de p en comparación con tumor de control

0,0057

Valor de p en comparación con pata sin tumor

0,0004 0,0049

Los niveles de PSA en suero fueron significativamente menores en ratones tratados con IMC-A12 (Fig. 7), y el aumento en la DMO asociada al crecimiento de tumores metastásicos osteoblásticos también se redujo significativamente (Tabla 5). Las mediciones de DMO de las patas sin tumor indicaron que el tratamiento con IMC-A12 no produjo una pérdida de densidad ósea (osteoporosis). Las radiografías de ratones tratados con IMC-A12 y sin tratar muestran que la progresión tumoral se redujo significativamente o se previno en ratones tratados (Fig. 8).

Combinación de anticuerpo anti-IGF-IR y docetaxel para metástasis óseas. Ratones SCID se castran 2 semanas antes de las inyecciones de tumor tibial. Las metástasis óseas se generan por inyección directa de células LuCaP 23.1 de cáncer de próstata en la tibia de los ratones, dando lugar a lesiones osteoblásticas. Los xenoinjertos expresan IGF-IR. Se miden niveles de PSA en suero cada dos semanas para evaluar el crecimiento tumoral. Cuando los niveles de PSA en suero alcanzan 5-10 ng/ml que indica tumor establecido, los animales se aleatorizan en cuatro grupos.

En dos grupos se inyectan i.p. 40 mg/kg de IMC-A12 tres veces a la semana durante seis semanas, recibiendo un grupo IMC-A12 + docetaxel 20 mg/kg i.p una vez a la semana durante 6 semanas y un segundo grupo IMC-A12 + docetaxel 10 mg i.p. tres veces a la semana durante 6 semanas. Los grupos de control reciben 10 ó 20 mg de docetaxel i.p. sin IMC-A12.

Los animales se monitorizan con medidas de PSA semanales. Después de la terminación del tratamiento, los animales continúan monitorizándose con medidas de PSA semanales hasta que los tumores en los grupos de solo docetaxel muestran recrecimiento tumoral. Como los valores de PSA suben en los grupos de solo docetaxel (no obstante a una menor tasa que en los animales no tratados), los niveles de PSA en los ratones tratados con IMC-A12 + docetaxel se estabilizan, y en algunos animales, empiezan a disminuir. Se observa que las reducciones en niveles de PSA continúan, incluso después de la terminación del tratamiento a las seis semanas.

Como se indica anteriormente, las mediciones de DMO se hacen en el momento del injerto y en el sacrificio, y las radiografías se toman justo antes del sacrificio. Los grupos tratados con IMC-A12 + docetaxel muestran poco o ningún aumento en la DMO, y las radiografías muestran poco o ningún signo de actividad osteoblástica.

Combinación de anticuerpo anti-IGF-IR y docetaxel para metástasis óseas. Trozos de tumor de próstata humano de LuCaP 23.1 (20 a 30 mm3) se digirieron mecánicamente. 2-5 x 105 células LuCaP 23.1 viables se inyectaron en las tibias de ratones SCID de 6 - 8 semanas de edad. Para el estudio se usaron 21 ratones aleatorizados en tres grupos. Después de la inyección tumoral, el PSA en suero se monitorizó semanalmente. El tratamiento empezó cuando el nivel de PSA en suero alcanzó 5-10 ng/ml, una indicación de crecimiento tumoral. El grupo 1 recibió tampón de solución salina de vehículo de control. El grupo 2 recibió 20 mg/kg de docetaxel i.p una vez a la semana durante 4 semanas. El grupo 3 recibió 20 mg/kg de docetaxel una vez a la semana y 40 mg/kg de A12 i.p. tres veces a la semana durante 4 semanas. Para determinar si la respuesta al tratamiento fue osteoblástica u osteolítica, la DMO se midió por barrido Dexa y rayos X de los animales en el punto final de todos los tratamientos.

Docetaxel solo o docetaxel combinado con A12 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de LuCaP 23.1 como se refleja por la supresión de niveles de PSA en suero (Fig. 9a), sin diferencia significativa entre los dos tratamientos. Sin embargo, después del cese del tratamiento, el PSA en suero empezó a aumentar en animales que habían sido tratados con docetaxel solo, que indica un recrecimiento del tumor; mientras que la supresión continuada de niveles de PSA en suero se observó en animales que recibieron tratamiento combinado, que indica un periodo prolongado de quiescencia del tumor después del tratamiento. Se mostró que los niveles de PSA en suero se correlacionaron con la densidad ósea (DMO) y tamaños de hueso con tumor radiografiados (Fig. 9b). En la semana cinco, la densidad ósea promedio en los animales de control, tratados con docetaxel 20 y docetaxel 20 combinado con A12, fue 0,112 ± 0,01, 0,09 ± 0,02 y 0,05 ± 0,009 (media ± EEM), respectivamente. Hubo una evidente tendencia hacia una disminución en la densidad ósea con el tratamiento.

Ejemplo 2

Fosforilación de Akt inducida por aspirado de médula ósea. Muestras de médula ósea de donantes masculinos normales (edades 18-45) se suministraron por Cambrex (programa de donantes Poietics™). Las muestras se centrifugaron a 1.500 rpm con el fin de separar las fases solubles y celulares. El sobrenadante se filtró usando filtros de 0,8 μm y 0,22 μm en sucesión. Se administraron 50 μl de aspirado de médula ósea a células en 1 ml de medio (dilución final 1:20).

Para experimentos realizados en presencia de suero, las células se cultivaron en DMEM complementado con 10 % de SBF y 50 μg/ml de gentamicina durante 24 horas antes de la exposición a médula ósea. Para experimentos en ausencia de suero (células privadas), las células se lavaron dos veces con PBS, el medio de crecimiento se sustituyó con DMEM libre de suero y las células se incubaron durante 4 horas antes de la exposición a preparaciones de médula ósea. Cuando se usó, AG-1296, un inhibidor específico de receptores de PDGF (Rice y col., 1999, Amer. J. Path. 155, 213-21), se añadió a cultivos 30 min antes de la exposición a aspirado de médula ósea. Se administraron anticuerpos IMC-3G3 como se describe en los momentos antes del tratamiento como se establece más adelante.

La activación por médula ósea de Akt se detectó en células PC3-ML, que expresan PDGFRα, pero no en células DU145, que carecen del receptor. En un experimento, para minimizar el efecto de los componentes del suero sobre la activación de Akt, las células se preincubaron durante 4 horas en medio libre de suero. La adición de extractos de médula ósea produjo la robusta fosforilación de Akt en células PC3-ML, pero no en células DU-145 (Fig. 10A). Para evaluar la significancia de la respuesta se realizó un segundo experimento con suero. La robusta estimulación de la fosforilación de Akt en células PC3-ML por aspirado de médula ósea también se observó en presencia de suero (Fig. 10B). Solo se produjo una pequeña respuesta en células DU-145.

Fosforilación de Akt mediada por PDGFR . Se cree que los osteoblastos y osteoclastos, que secretan tanto PDGF-AA como PDGF-BB, proporcionan estos factores de crecimiento en el medio soluble de médula ósea. Para determinar si la sensibilidad de células PC3-ML a extractos de médula ósea estuvo o no relacionada con la transducción de señales mediante PDGFRα, células PC3-ML se expusieron a aspirado de médula ósea en ausencia o presencia de AG-1296 20 μM. Esta concentración de AG-1296 inhibe completamente la activación de Akt inducida por PDGF-BB (Fig. 11A). AG-1296 inhibió la activación de Akt inducida por aspirado de médula ósea más del 40 % (Fig. 11B y D). Esto indica que la señalización de PDGFRα es responsable de una proporción significativa de activación de Akt inducida por médula ósea.

También se evaluó la contribución directa de PDGF-AA y -BB a la señalización de PDGFRα con respecto a otros componentes de aspirados de médula ósea. Se determinó que las concentraciones de PDGF-AA y -BB en aspirados de médula ósea de tres donantes diferentes osciló de 400 pg/ml a 2 ng/ml. Dada la dilución de 20 veces de los aspirados de médula ósea, las células de prueba estuvieron en realidad expuestas a concentraciones de PDGF-AA y -BB entre 20 y 100 pg/ml. Por consiguiente, células PC3-ML se trataron con 100 pg/ml de cada uno de PDGF-AA y - BB. La fosforilación de Akt fue inferior al 10 % de la obtenida con los aspirados de médula ósea (Fig. 3C y D). Por consiguiente, parece que la activación de la ruta de Akt por señalización de PDGFRα puede implicar ligandos de PDGFRα distintos de PDGF-AA y -BB y/o mecanismos distintos de la activación de PDGFRα por unión directa de un ligando.

Inhibición de la fosforilación de Akt por un anticuerpo anti-PDGFR . El anticuerpo neutralizante IMC-3G3, que es específico para PDGFRα humano, también se probó para su capacidad para inhibir la fosforilación de Akt en células PC3-ML. Un tiempo de pre-incubación de 30 minutos y una concentración de 20 μg/ml neutralizaron el efecto estimulante de 30 ng/ml de PDGF-BB (Fig. 12A). El tratamiento con el anticuerpo también produjo aproximadamente el 40 % de inhibición de la fosforilación de Akt inducida por la médula ósea (Fig. 12B y C). También se observó que el efecto inhibidor de IMC-3G3 sobre la fosforilación de Akt dependía de la duración de la preincubación, siendo un tiempo de incubación de 120 minutos significativamente más eficaz (Fig. 12D) que el tiempo de incubación de 30 minutos (Fig. 12B y C). Una posible explicación es que IMC-3G3 induce la internalización de PDGFRα, y que su efecto inhibidor está relacionado no solo con bloquear la unión a ligando, sino también con la eliminación del receptor de la membrana plasmática.

Ejemplo 3

Aislamiento de anticuerpos anti-PDGFR humanos. Se generaron anticuerpos monoclonales anti-PDGFRα humanos por una tecnología de hibridomas convencional (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), que se incorpora por referencia en el presente documento) usando ratones transgénicos (Medarex Inc., Sunnyvale, CA) que expresan cadenas de inmunoglobulina pesadas gamma y ligeras kappa humanas. Se compró dominio extracelular (DEC) de PDGFRa humano de R&D Systems (Minneapolis, MN). Ratones KM se inmunizaron subcutáneamente (s.c.) con 3x107 células endoteliales aórticas porcinas que expresan establemente PDGFRa (PAE Ra). Después de 4 semanas, los ratones se reforzaron s.c. con 50 μg de DEC de PDGFRa en adyuvante completo de Freund más 3 x 107 células PAE Ra administradas i.p. Los ratones se reforzaron

dos veces más, 3 semanas separadas, con 25 μg de DEC de PDGFRa en adyuvante incompleto de Freund.

Se aislaron esplenocitos de ratones con altos títulos de unión a suero y bloqueo y se fusionaron con células de mieloma. Se subclonaron los cultivos de hibridomas que muestran actividad de bloqueo y los anticuerpos de estos hibridomas se purificaron por cromatografía en proteína G.

Las IgG se evaluaron para unirse a PDGFRα en un ensayo de unión directo. El DEC de PDGFRa en PBS se inmovilizó sobre una placa de 96 pocillos (100 ng/pocillo). Entonces, las placas se lavaron con PBST (PBS + 0,05 % de Tween 20) y se bloquearon con PBSM (3 % en leche en PBS, 200 μl/pocillo) durante 2 horas a 25 ºC. Las IgG diluidas en PBSM se incubaron con el DEC de PDGFRa inmovilizado durante 1 h a 25 ºC, y las placas se lavaron con PBST. Un anticuerpo secundario (conjugado de F(ab')2 de cabra dirigido contra IgG humana-peroxidasa de rábano picante; BioSource International, Camarillo, CA) diluido 1:5.000 en PBSM se añadió durante 1 hora a 25 ºC. Después las placas se lavaron con PBST, se añadió un sustrato de TMB-peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD) y la reacción se detuvo con 100 μl de 1 mol/l de H2SO4. Las placas se leyeron a A450 nm usando un lector de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

El bloqueo de PDGF se evaluó usando un ensayo de bloqueo de PDGF en fase sólida (véase Duan y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:413-8, que se incorpora por referencia). DEC de PDGFRα se diluyó en PBS y se recubrió sobre placas de microtitulación de 96 pocillos (tiras 1 x 12 Removawell de fondo plano de Immulon 2HB de poliestireno de unión a proteína irradiada; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Cada pocillo se recubrió con 60 ng de PDGFRα durante 3 horas a 25 ºC en un volumen total de 100 μl. Entonces, las placas se lavaron dos veces y se bloquearon durante la noche a 4 ºC con 25 mmol/l de HEPES (pH 7,45), 0,5 % de gelatina, 100 mmol/l de NaCl y 0,1 % de Tween 20. Entonces, las placas se calentaron a 25 ºC durante 20 minutos y se lavaron una vez con tampón de unión (25 mmol/l de HEPES (pH 7,45), 0,3 % de gelatina, 100 mmol/l de NaCl, 0,01 % de Tween 20). Se añadieron cincuenta microlitros de IgG a cada pocillo y se incubaron a 25 ºC durante 30 minutos. Se diluyó PDGF yodado en tampón de unión y se añadió (50 μl de una disolución 1 nmol/l) a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 2 horas a 25 ºC y luego se lavaron cinco veces con tampón de unión. Cada pocillo se contó en un contador gamma. Se hizo un ensayo de bloqueo basado en células como se describe en Heldin y col., 1988, EMBO J. 7, 1387-93.

La cinética de la unión de anticuerpos a PDGFRα se midió usando un instrumento BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). DEC de PDGFRα se inmovilizó sobre un chip sensor y el anticuerpo se inyectó a diversas concentraciones. Se obtuvieron sensogramas a cada concentración y se evaluaron usando el programa BIA Evaluation

2.0 para determinar las constantes de velocidad. La constante de afinidad, Kd, se calculó a partir de la relación de las constantes de velocidad Kdis/Kas.

La Fig. 13 muestra la unión dependiente de la dosis del anticuerpo monoclonal humano IMC-3G3 a DEC de PDGFRα inmovilizado en el ELISA. La concentración de anticuerpo requerida para la máxima unión del 50 % a DEC de PDGFRα fue 0,06 nmol/l (Tabla 6). La DE50 está de acuerdo con la Kd para el anticuerpo como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales en un instrumento BIAcore (Tabla 1). El anticuerpo monoclonal también bloqueo la unión de [125I]PDGF-BB a receptor inmovilizado, con una CI50 de 0,43 nmol/l. Los sitios de unión para PDGF-AA y PDGF-BB sobre PDGFRα no son estructuralmente coincidentes. Los datos sugieren que el epítope para 3G3 solapa espacialmente ambos sitios de unión del factor de crecimiento.

Tabla 6 - Características de unión de anticuerpo anti-PDGFRα

Unión de PDGFRα

Bloqueo de PDGF Cinética de unión

(ED50, nmol/l)

Fase sólida (CI50, nmol/l) Basado en células (CI50, nmol/l) Kas (105 mol/l-1 s -1) Kdis (10-4 s -1) Kd (10-9 mol/l)

0,06

0,24 0,58 11,50 0,47 0,04

Inhibición de la fosforilación de receptor y activación de moléculas efectoras aguas abajo. Los efectos sobre la señalización intracelular inducida por PDGF por IMC-3G3 se determinaron usando células PAE Rα. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido Falcon de seis pocillos (250.000 células por pocillo) y se dejaron crecer durante la noche. Entonces, los pocillos se aclararon y se incubaron en medio sin suero. Después de una incubación durante la noche para convertir las células en quiescentes, las células se trataron con anticuerpos durante 30 minutos a 37 ºC, seguido de la adición de PDGF-AA o PDGF-BB e incubación durante 10 minutos adicionales a 37 ºC. Entonces, las células se desprendieron y se lisaron en 200 μl de tampón de lisis (50 mmol/l de Tris-HCl (pH 8,0), 1 % de Triton X100, 150 mmol/l de NaCl, 1 mmol/l de EDTA, 0,1 % de SDS, 1 mmol/l de ortovanadato de sodio e inhibidores de proteasa (Complete Mini, Roche, Mannheim, Alemania)). Los lisados celulares se analizaron por SDS-PAGE y transferencia Western usando reactivos de quimioluminiscencia potenciados e Hyperfilm (Amersham Biosciences).

Se probó para la capacidad del anticuerpo para inhibir la fosforilación de tirosina de receptor inducida por ligando. PDGF-AA y PDGF-BB aumentan la fosforilación de tirosina de PDGFRa aproximadamente 5 veces a concentraciones de 1 y 3 nmol/l, respectivamente. Mayores concentraciones de ligando (10 nmol/l) produjeron receptor menos fosforilado posiblemente debido a la degradación inducida por ligando. El anticuerpo inhibió el receptor inducido por PDGF-BB a niveles próximos al ruido de fondo (Fig. 14A, fila superior). Se obtuvieron datos similares usando PDGF-AA para inducir la fosforilación de receptores.

Los PDGF transducen señales mitogénicas y ejercen efectos antiapoptósicos sobre células que expresan receptor mediante proteína efectora aguas abajo. Por consiguiente, el anticuerpo monoclonal se probó para su capacidad para inhibir la activación de MAPK p44/p42 y Akt (implicado en el crecimiento celular y rutas antiapoptósicas, respectivamente). El anticuerpo anti-PDGFRα inhibió la fosforilación de tanto MAPK como Akt en respuesta a PDGF-BB (Fig. 2A) y PDGF-AA (no mostrado). La inhibición de la fosforilación de PDGFRα fue dependiente de la dosis, con 50 % de inhibición alcanzada a 0,25 nmol/l (Fig. 14B).

Actividad antimitogénica. El anticuerpo monoclonal anti-PDGFRα se probó para su capacidad para bloquear mitogénesis inducida por PDGFAA de células PAE Rα. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocillos (1 x 104 células por pocillo) y se cultivaron durante la noche en 100 μl de medio por pocillo. Entonces, los pocillos se aclararon con medio sin suero y las células se privaron de suero durante la noche con 75 μl de medio sin suero añadido a cada pocillo. Se añadió IgG (25 μl/pocillo) y las placas se incubaron durante 30 minutos a 37 ºC. Entonces se añadió PDGF-AA o PDGF-BB (25 μl/pocillo) y las placas se incubaron durante 18 a 20 horas a 37 ºC. Las placas se incubaron durante 4 horas adicionales después de que cada pocillo recibiera 0,25 μCi de [3H]timidina (25 μl/pocillo). El anticuerpo, PDGF y [3H]timidina se diluyeron todos en medio sin suero. Entonces, las células se lavaron con PBS más 1 % de albúmina de suero bovino y se desprendieron mediante tratamiento con tripsina (100 μl/pocillo). Las células se recogieron sobre un filtro y se lavaron tres veces con agua doblemente destilada usando un recolector de células MACH III (Tomtec, Inc., Hamden, CT). Después de procesar el filtro, la radiactividad incorporada en el ADN se determinó en un contador de centelleo (Paredac Microbeta, modelo 1450).

Cuando IMC-3G3 se añadió a células PAE Rα privadas de suero, la incorporación de timidina inducida por PDGF-AA se inhibió específicamente (Fig. 15) con una CE50 de 8,3 nmol/l. El anticuerpo también inhibió la mitogénesis inducida por 3 nmol/l de PDGF-BB de células PAE Rα con una CE50 de 1,25 nmol/l (datos no mostrados).

Inhibición del crecimiento de líneas celulares tumorales humanas que expresa PDGFR . Se probaron líneas celulares tumorales humanas que expresan PDGFRα para determinar los efectos del anticuerpo anti-PDGFRα humano sobre el crecimiento maligno en sistemas in vitro e in vivo. Dos de tales líneas celulares tumorales que expresan PDGFRα como se ha determinado por citometría de flujo son SKLMS-1 (leiomiosarcoma) y U118 (glioblastoma). Estas líneas celulares también responden a ligando en ensayos mitogénicos y forman tumores en ratones. SKLMS-1 tiene las posibilidades de no solo estimulación paracrina, sino también autocrina. Se mostró que SKLMS-1 expresaba proteína PDGF-AA cuando se cultivó en cultivo usando una técnica de inmunoensayo enzimático de sándwich cuantitativa (R&D Systems).

Como puede apreciarse en la Fig. 16A, IMC-3G3 inhibió la fosforilación de tanto Akt como MAPK en respuesta a estimulación de PDGF-AA de células SKLMS-1. La inhibición de la fosforilación de Akt fue del 100 % y la de MAPK fue de aproximadamente el 80 %. El anticuerpo también es un inhibidor eficaz de la fosforilación en células U118 (Fig. 16B). También se bloqueó la mitogénesis inducida por ligando de células tumorales. Cuando el anticuerpo anti-PDGFRα se añadió a células U118 privadas de suero, la incorporación de timidina inducida por PDGF-AA se inhibió específicamente (Fig. 17A) con una CE50 de 3,4 nmol/l. El anticuerpo también inhibió la respuesta mitogénica inducida por PDGF-AA de células SKLMS-1 con una CE50 de 5 nmol/l (Fig. 17B), además de la respuesta mitogénica estimulada por PDGF-BB (Fig. 17C). Solo se observó inhibición parcial (40 % a 66 nmol/l; Fig. 17D) de la respuesta mitogénica estimulada por PDGF-BB para células U118. Esto se atribuye a la expresión de tanto PDGFRα como PDGFRβ en aquellas células (datos no mostrados).

Inhibición del crecimiento de xenoinjerto de tumor. IMC-3G3 se probó in vivo en modelos de xenoinjerto de glioblastoma (U118) y leiomiosarcoma (SKLMS-1) subcutáneo (s.c.) en ratones sin pelo atímicos. Los xenoinjertos de tumor s.c. se establecieron inyectando 10 x 106 células SKLMS-1 o U118 mezcladas en Matrigel (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA) en ratones sin pelo atímicos femeninos (Crl:NU/NU-nuBR, Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Se dejó que los tumores alcanzaran un volumen del tumor medio (n / 6 x longitud más larga x anchura perpendicular2) de aproximadamente 400 mm3. Los ratones se aleatorizaron en cinco grupos (n = 12) y se trataron por inyección i.p. dos veces a la semana durante la duración del estudio. Los ratones del grupo 1 se trataron con control de vehículo (0,9 % de NaCl, USP para irrigación, B/Braun). Los ratones de los grupos 2 a 4 se trataron con 6, 20 y 60 mg/kg del presente anticuerpo anti-PDGFRα. Los ratones del grupo 5 se trataron con 60 mg/kg de IgG humana (Sigma). Los grupos tratados con 6, 20 ó 60 mg/kg de anticuerpo anti-PDGFRα o IgG humana se administraron con 21,4, 71,4 y 214 mg/kg de dosis de carga, respectivamente. Las dosis de carga se calcularon para lograr una concentración en plasma en estado estacionario de la primera dosis (semivida de eliminación, 7 días)

usando una pauta de dosificación de dos veces a la semana. Los volúmenes de tumor se evaluaron dos veces a la semana y el crecimiento tumoral en los grupos de tratamiento se comparó con un ANOVA de medidas repetidas.

Como se muestra en la Fig. 18A, la IgG humana no tuvo efecto sobre el crecimiento de glioblastoma en comparación con ratones tratados con solución salina (P = 0,74), mientras que el anticuerpo anti-PDGFRα inhibió significativamente el crecimiento tumoral a dosis de 6 (P = 0,06), 20 (P = 0,03) y 60 (P =0,0004) mg/kg. Al final del estudio de U118, los valores de % de T/C [(volumen del tumor promedio para el grupo tratado con 3G3 al finalizar el estudio / volumen del tumor promedio al inicio del tratamiento) / (volumen del tumor promedio para grupo tratado con control al finalizar el estudio / volumen del tumor promedio al inicio del tratamiento) x 100] fueron 67 %, 63 % y 35 % durante 6, 20 y 60 mg/kg de grupos de dosis tratados con 3G3, respectivamente. Además, se observó regresión tumoral en 4 de 12, 5 de 11 y 10 de 12 animales en los grupos de tratamiento de 6, 20 y 60 mg/kg. No hubo regresiones en ningún grupo de control.

La Fig. 18B muestra que el crecimiento de leiomiosarcoma también se inhibió significativamente mediante tratamiento a 6 (P = 0,02), 20 (P = 0,003) y 60 (P < 0,0001) mg/kg. Los valores de % de T/C finales fueron 66 %, 57 % y 31 % para los grupos de tratamiento de 6, 20 y 60 mg/kg, respectivamente, sin regresiones tumorales.

El examen histológico de xenoinjertos al final del tratamiento mostró marcadas diferencias en tumores de animales tratados en comparación con tumores de animales que recibieron terapia de control. Los tumores reseccionados se fijaron en fijador QDL a 4 ºC durante 24 horas. Después de incorporarlos en parafina y seccionar a 4 μm, las secciones fijadas en formalina se tiñeron con Mayer's H&E (Richard Allen, Kalamazoo, MI).

En el grupo de U118 tratado con la mayor dosis (60 mg/kg) se encontraron menos células tumorales viables y hubo sustancialmente más regiones escasas de células en comparación con el grupo de control de solución salina (Fig. 18C). Los xenoinjertos de SKLMS-1 tratados en el día 25 también mostraron una reducción en la cantidad de células tumorales viables y empaquetamiento celular en comparación con el grupo de control de solución salina (Fig. 18D).

Inhibición in vitro de la estimulación mediada por PDGFR de una línea de glioblastoma. El nivel de fosfotirosina de receptor en tumores U118 se evaluó una semana después del tratamiento con anticuerpo anti-PDGFRα o IgGt humana. Ratones con tumores U118 establecidos (500 mm3) se trataron con una dosis de carga de 214 mg/kg seguido 72 horas después por una dosis de mantenimiento de 60 mg/kg de anticuerpo. Los tumores se recogieron de ratones una semana (168 horas) después de la primera inyección de anticuerpo (en un momento antes que se observara la regresión tumoral en promedio; véase la Fig. 18A) y se homogeneizaron en tampón de lisis de ensayo de fosforilación (véase anteriormente). Los lisados se centrifugaron dos veces a 14.000 rpm y se determinó la concentración de proteína para el sobrenadante recogido (ensayo de proteínas Bio-Rad, Bio-Rad, Hercules, CA). El lisado (4 mg) de cada muestra se inmunoprecipitó usando anticuerpo anti-PDGFRα. Entonces, PDGFRα humano inmunoprecipitado se inmunotransfirió con tanto un anticuerpo anti-PDGFR como anti-fosfotirosina. La Fig. 19 muestra que la administración de anticuerpo anti-PDGFRα produjo reducción en el nivel de fosfotirosina de PDGFRα con respecto a un control de IgG humana en estos tumores.

Ingeniería de la línea celular. Primero, los genes que codifican los dominios variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-PDGFRα humano se clonaron y se secuenciaron. Se obtuvo una primera serie de MEDAREX que se hibridó con las secuencias flanqueantes de 5' y 3' de las secuencias de inmunoglobulina humana de la región variable dentro de hibridomas derivados de MEDAREX. La región variable de la cadena pesada se amplificó con el par de cebadores AB88 (directo) y AB90 (inverso) (Tabla 7). Los productos de la cadena ligera se amplificaron con pares de cebadores que contienen el cebador directo AB182 y el cebador inverso AB16 (Tabla 7). Los productos de 0,4 kb de estas reacciones se clonaron en el vector ZeroBlunt (Invitrogen) para producir AB88-1 (VH) y AB 182-3 (Vk), y los insertos se secuenciaron con cebadores T7 y M13R universales.

Tabla 7 - Cebadores para hibridomas MEDAREX

Oligo

Tamaño Secuencia de ADN (5'-3') SEC ID Nº

AB88

21 ATGAAACACCTGTGGTTCTTC 20

AB90

21 TGCCAGGGGGAAGACCGATGG 21

AB182

24 ATGGAA(G/A)CCCCAGCGCAGCTTCTC 22

AB16

20 CGGGAAGATGAAGACAGATG 23

Con el fin de generar vectores de plásmido para expresar el anticuerpo IgG1 completo, las regiones variables clonadas se amplificaron por PCR y se ligaron en dos etapas en vectores de expresión que contenían genes de la región

25 5

constante. La amplificación de la cadena pesada por PCR primaria utilizó 25 ng de plásmido AB88-1 como molde para cebadores IPHF5 (directo) e IPHR5 (inverso). La amplificación de la cadena pesada por PCR secundaria utilizó 5 μl de reacción primaria como molde y los cebadores OPSIF y IPHR5. La combinación de los dos cebadores directos añade una secuencia de 57 pares de bases al extremo 5' de los genes de inmunoglobulina que codifican una secuencia señal del gen de la cadena pesada de ratón de 19 aminoácidos (MGWSCIILFLVATATGVHS; SEC ID Nº: 24) para el eficaz procesamiento y secreción de inmunoglobulina. Además, el cebador directo OPSIF añade una secuencia de “Kozak” consenso (J. Mol. Biol. 196:947) para la eficaz iniciación de la traducción de estos genes en células de mamífero y un sitio de endonucleasa de restricción 5' HindIII para clonar el producto amplificado en el vector de expresión adecuado. El cebador inverso de la cadena pesada contiene un sitio NheI en marco para clonar en el vector de la región constante.

La PCR se realizó en dos etapas utilizando el kit de PCR Expand (Boehringer Mannheim Inc.) según especificaciones del fabricante usando el sistema de tampón Expand nº 3 en reacciones de 50 μl con las siguientes condiciones de

ciclado:

1 ciclo

94º, 2 minutos

5 ciclos

94º, 20 segundos

48º, 60 segundos

68º, 2 minutos

20 ciclos

94º, 20 segundos

65º, 60 segundos

68º, 2 minutos

1 ciclo

68º, 5 minutos

Después de dos rondas de PCR, el producto se purificó siguiendo electroforesis en gel de agarosa y se clonó como un fragmento digerido con HindIII-NheI en vector pDFc (Fig. 8), que contenía la región constante gamma 1 humana.

La amplificación de la cadena ligera por PCR primaria utilizó 25 ng de plásmido pAB182-3 como cebadores de molde IPLF4 (directo) e IPLR2 (inverso). La amplificación de la cadena ligera por PCR secundaria utilizó 5 μl de reacción primaria como molde y los cebadores OPSIF e IPLR2. Al igual que para la cadena pesada, los dos cebadores directos proporcionan una secuencia señal de la secreción. El cebador inverso de la cadena ligera contiene un sitio BsiWI en marco para clonación en el vector de la región constante kappa pLck (Fig. 8). Las reacciones de PCR se realizaron como para la cadena pesada anteriormente. Después de dos rondas de PCR, el producto se purificó siguiendo electroforesis en gel de agarosa y se clonó en pLck, que contiene la región constante kappa humana de la cadena ligera.

Tabla 8 - Cebadores para vectores de expresión de VH y VK

Oligo

Tamaño secuencia de ADN (5'-3') SEC ID Nº

OPSIF

53 25

IPHF5

58 26

IPHR5

37 CGCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGG 27

IPLF4

58 28

IPLR2

37 GCGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCG 29

Con el fin de generar un único vector de plásmido para transfección estable, el casete de expresión de la cadena pesada, que contiene un promotor del CMV, región codificante de la cadena pesada y elemento poliA se clonaron en el vector de la cadena ligera como un fragmento NotI-SalI (Fig. 20).

Este construcción se utilizó entonces para generar una línea de producción estable en células NS0 de la línea de células de mieloma. Las células NS0 se transfectaron con el plásmido de expresión mediante electroporación usando

BioRad Gene Pulser II. Antes de la transfección, el ADN de plásmido se linealizó con PvuI, se precipitó en etanol y se resuspendió a una concentración de 0,4 mg/ml (40 ug en 100 ul de dH2O). Las células se electroporaron con 40 ug de ADN en un volumen final de 800 ul por un único pulso de 250 voltios, 400 μFd. Las células electroporadas se dispersaron en alícuotas de 50 ul en medio DMEM (JRH Biosciences Inc.) que contenía 10 % de suero bovino fetal dializado (dFCS) (Hyclone, nº de lote: AHA7675) y glutamina 2 mM (Invitrogen/Life Technologies) en pocillos de aproximadamente dieciocho placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 -10.000 células por pocillo. La selección de transfectantes positivos para glutamina sintetasa (GS) se inició 24 horas después de la adición de DMEM sin glutamina que contenía 10 % de dFCS y complementado con 1x suplemento GS (JRH Biosciences Inc.). Las células se cultivaron durante 2-4 semanas a 37 ºC, 5 % de CO2 para permitir el crecimiento y expansión de colonias. Más de 300 colonias se cribaron usando un ELISA anti-Fc humano (gamma) (detección de peroxidasa de rábano picante a A450 nm). Los clones que expresan anticuerpo (58 %) se expandieron y se volvieron a probar para productividad durante 3-5 días de cultivo. Para adaptar las células en medio sin suero, las líneas celulares positivas se expandieron mediante la adición de un volumen igual de medio de cultivo GS-0S sin suero en cada pase. Positivos fuertes, que producen 25 ug/ml o más en cultivos en 24 pocillos subconfluentes de 3 días, se expandieron para el posterior análisis para completar la adaptación a medio sin suero.

Otras realizaciones incluyen:

(a) Tratamientos con antagonistas de IGF-IR

Un procedimiento para tratar un sujeto que tiene un tumor óseo, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-IR.

Un procedimiento para inhibir crecimiento de un tumor óseo, que comprende administrar una cantidad eficaz de un antagonista de IGF-IR.

El tumor óseo según estos procedimientos pueden ser un tumor primario o secundario.

El crecimiento de células tumorales puede ser dependiente de andrógenos o independiente de andrógenos.

El tumor puede metastatizarse de un cáncer de próstata, un cáncer de mama o un cáncer de pulmón.

Los antagonistas pueden coadministrarse con un segundo antagonista de tirosina cinasa de receptor.

Los antagonistas pueden coadministrarse con una cantidad eficaz de un agente antineoplásico. El agente antineoplásico puede ser docetaxel, doxorubicina o radiación.

El antagonista de IGF-IR puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Tal anticuerpo o fragmentos de anticuerpos pueden competir para unirse a IGF-IR con un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene SEC ID Nº: 41 y un dominio variable de la cadena ligera que tiene SEC ID Nº: 51. Alternativamente, el antagonista de IGF-IR puede ser un inhibidor intracelular de IGF-IR y puede seleccionarse del grupo que consiste en AG1024, NVP-AEW541 y BMS-554417.

El antagonista de IGF-IR puede inhibir la unión de IGF-I o IGF-II a IGF-IR, neutralizar la activación de IGF-IR por IGF-I o IGF-II, reducir la concentración de receptor de la superficie de IGF-IR o inhibir la fosforilación de una molécula de señalización en la dirección 3' de IFG-IR.

El antagonista de IGF-IR puede ser un anticuerpo que se une a IGF-IR con una Kd de aproximadamente 3 x 10-10 M-1 o menos.

El antagonista de IGF-IR puede ser un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico puede ser específico para IGF-IR y PDGFRα; o IGF-IR y EGFR.

(b) Anticuerpos para PDGFRα

Un anticuerpo humano aislado o fragmento de anticuerpo específico para PDGFRα que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 2 en CDRH1; SEC ID Nº: 4 en CDRH2; SEC ID Nº: 6 en CDRH3; SEC ID Nº: 10 en CDRL1; SEC ID Nº: 12 en CDRL2; y SEC ID Nº: 14 en CDRL3.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende preferentemente:

(a)

SEC ID Nº: 2 en CDRH1; SEC ID Nº: 4 en CDRH2; y SEC ID Nº: 6 en CDRH3; o

(b)

SEC ID Nº: 10 en CDRL1; SEC ID Nº: 12 en CDRL2; y SEC ID Nº: 14 en CDRL3.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende más preferentemente SEC ID Nº: 2 en CDRH1; SEC ID Nº: 4 en CDRH2; SEC ID Nº: 6 en CDRH3; SEC ID Nº: 10 en CDRL1; SEC ID Nº: 12 en CDRL2; y SEC ID Nº: 14 en CDRL3.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender SEC ID Nº: 8 o SEC ID Nº: 16 y más preferentemente comprende SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 16.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede:

(a)

unirse selectivamente a PDGFRα;

(b)

inhibir la unión de PDGFRα a un ligando de PDGFRα; o

(c)

neutralizar PDGFRα.

El fragmento de anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo monocatenario, un Fab, un Fv monocatenario, un diacuerpo y un triacuerpo.

Otra realización de la invención se refiere a un conjugado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo tratado anteriormente. El conjugado puede comprender un agente antineoplásico, un resto diana o un resto indicador.

Otra realización de la invención se refiere a polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1 en CDRH1; SEC ID Nº: 3 en CDRH2; SEC ID Nº: 5 en CDRH3; SEC ID Nº: 9 en CDRL1; SEC ID Nº: 11 en CDRL2; y SEC ID Nº: 13 en CDRL3.

El polinucleótido aislado puede comprender SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 15.

Otra realización de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende el polinucleótido.

Otra realización de la invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el vector de expresión. La célula huésped recombinante puede producir:

(a)

un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 8 y un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 16; o

(b)

un polipéptido que comprende SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 16.

Otra realización de la invención se refiere a una cantidad eficaz del anticuerpo descrito anteriormente para su uso como un medicamento para neutralizar la activación de PDGFRα en un mamífero.

Otra realización adicional de la invención se refiere a una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo descrito anteriormente para su uso como medicamento para inhibir el crecimiento tumoral en un mamífero. Preferentemente, el anticuerpo se usa para inhibir el crecimiento de un tumor que expresa o expresa en exceso PDGFRα. El tumor es preferentemente un tumor primario, un tumor metastásico, un tumor resistente al tratamiento o un tumor vascularizado. Además, el tumor puede seleccionarse del grupo que consiste en un tumor de ovario, un tumor de mama, un tumor de pulmón, un tumor hepatocelular, un tumor del estroma gastrointestinal, un melanoma, un carcinoma de células renales, un tumor de próstata y un sarcoma de tejido blando.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse en combinación con un agente antineoplásico. El agente antineoplásico es preferentemente un agente quimioterapéutico. El agente antineoplásico puede también ser preferentemente doxorubicina o radiación.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse con un segundo antagonista de PDGFRα. El antagonista de PDGFRα es preferentemente un antagonista de PDGFRα intracelular.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede administrarse con una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR) o una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de factor de crecimiento receptor similar a insulina (IGF-IR).

Listado de secuencias

<110> Imclone Systems Incorporated y col.

<120> Antagonistas de receptores para el tratamiento de cáncer de huesos metastásico

<130> 11245/54076

5

<140> Por asignar <141> 19/06/2006 <150> 60/691.920 <151> 17/06/2005

10

<160> 63 <170> PatentIn versión 3.3

15

<210> 1 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens

20

<220> <221> CDS <222> (1)..(15)

<400> 1

25

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30

<400> 2

<210> 3

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(48)

<400> 3

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(51)

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 381

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(381) 20

<400> 7

<210> 8

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(33) <400> 9

5 <210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 10

<210> 11 15 <211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 11

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 27

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<400> 13

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 15

<210> 16 5 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16 10

<210> 17 15 <211> 15

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> péptido sintético

<400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> péptido sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> péptido sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> artificial

5 <220>

<223> cebador sintético

<400> 20 atgaaacacc tgtggttctt c 21 10

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> artificial 15

<220>

<223> cebador sintético

<400> 21 20 tgccaggggg aagaccgatg g 21

<210> 22

<211> 24

<212> ADN 25 <213> artificial

<220>

<223> cebador sintético

30 <400> 22 atggaarccc cagcgcagct tctc 24

<210> 23

<211> 20 35 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 23 cgggaagatg aagacagatg 20

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

<210> 25

<211> 53

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 25 gagaagcttg ccgccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt agc 53

<210> 26

<211> 58

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> cebador sintético

5 10

<400> 26 tcctttttct agtagcaact gcaactggag tacattcaca gctgcagctg caggagtc <210> 27 <211> 37 <212> ADN <213> artificial <220> <223> sintético 58

15

<400> 27 cgcgctagct gaggagacgg tgaccagggt tccctgg 37

20

<210> 28 <211> 58 <212> ADN <213> artificial

<220> <223> cebador sintético

25

<400> 28 tcctttttct agtagcaact gcaactggag tacattcaga aattgtgttg acacagtc 58

30

<210> 29 <211> 37 <212> ADN <213> artificial

35

<220> <223> cebador sintético

<400> 29 gcgcgtacgt ttgatttcca ccttggtccc ttggccg

37

5

<210> 30 <211> 1431 <212> ADN <213> Homo sapiens

10

<220> <221> CDS <222> (1)..(1431)

<400> 30

<210> 31

<211> 476

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 702

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(702)

10 <400> 32

<210> 33

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 15 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(15)

<400> 34

15

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20

<400> 35

25 <210> 36

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5 <220> .

<221> CDS

<222> (1)..(51)

<400> 36 10

<210> 37 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37 20

<210> 38

<211> 63 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 30 <222> (1)..(63)

<400> 38

<210> 39 5 <211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39 10

<210> 40

<211> 390 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 20 <222> (1)..(390)

<400> 40

<210> 41

<211> 130

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 1440

<212> ADN

<213> Homo sapiens 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1440)

10 <400> 42

<210> 43

<211> 479

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 33 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(33)

<400> 44

5 <210> 45

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

10 <400> 45

<210> 46 15 <211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 20 <221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 46

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(33)

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(327)

<400> 50

<210> 51 5 <211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51 10

<210> 52

<211> 702

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(702)

<400> 52

<210> 53

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

10 <210> 54

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(33)

<400> 54

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(21)

<400> 56

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(33)

<400> 58

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(327)

<400> 60

10 <210> 61

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 61

<210> 62

<211> 702 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(702)

<400> 62

<210> 63

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un antagonista de PDGFRα, en el que dicho antagonista de PDGFRα es un anticuerpo o fragmento del mismo que es específico para PDGFRα humano y que comprende SSSYY (SEC ID Nº: 2) en CDRH1; SFFYTGSTYYNPSLRS (SEC ID Nº: 4) en CDRH2; QSTYYYGSGNYYGWFDR (SEC ID Nº: 6) en CDRH3; RASQSVSSYLA (SEC ID Nº: 10) en CDRL1; DASNRAT (SEC ID Nº: 12) en CDRL2; y QQRSNWPPA (SEC ID Nº: 14) en CDRL3, para su uso en el tratamiento de cáncer de huesos metastásico en un sujeto.

2. 2.

   El antagonista de PDGFRα para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene

   QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS ( SEC ID Nº: 8) o un dominio variable de la cadena ligera que tiene EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEC ID Nº: 16).

3. 3.

   El antagonista de PDGFRα para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio variable de la cadena pesada que tiene

   QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWGWLRQSPGKGLEWIGSFFY TGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADTAVYYCARQSTYYYGSGNY YGWFDRWDQGTLVTVSS (SEC ID Nº: 8) y un dominio variable de la cadena ligera que tiene EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPAFGQGTKVEIK (SEC ID Nº: 16).

4. 4.

   El antagonista de PDGFRα para su uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena pesada que tiene

   MGWSCIILFLVATATGVHSQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINSSSYYWG WLRQSPGKGLEWIGSFFYTGSTYYNPSLRSRLTISVDTSKNQFSLMLSSVTAADT AVYYCARQSTYYYGSGNYYGWFDRWDQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID Nº: 31) y una cadena ligera que tiene

   MGWSCIILFLVATATGVHSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQ QKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSN WPPAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEC ID Nº: 33).

5. 5.

   El antagonista de PDGFRα para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el tumor ha metastatizado de un cáncer de próstata, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

6. 6.

   El antagonista de PDGFRα para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la unión de PDGFRα o neutraliza PDGFRα.