PT1735348E - Anticorpo anti-receptor do factor de crescimento humano - Google Patents

Description

ΡΕ1735348 1

DESCRIÇÃO "ANTICORPO ΑΝΤΙ—RECEPTOR DO FACTOR DE CRESCIMENTO HUMANO" A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais que são específicos para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Estes anticorpos podem ser utilizados no tratamento de doenças neoplásicas e doenças hiperproliferativas, entre outras.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Embora as células normais proliferem através da activação altamente controlada de quinases de tirosina do receptor do factor de crescimento (RTKs) através dos seus respectivos ligandos, as células do cancro também proliferam através da activação de receptores do factor de crescimento, mas perdem o controlo cuidadoso da proliferação normal. A perda de controlo pode ser provocada por numerosos factores, tais como a sobre-expressão de factores de crescimento e/ou receptores, e a activação autónoma das vias bioquímicas reguladas por factores de crescimento. Alguns exemplos de RTKs envolvidos na tumorigénese são os receptores para o factor de crescimento epidérmico (EGFR), o factor do crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), factor de crescimento de tipo insulina (IGFR), factor de crescimento nervoso (NGFR), e factor de crescimento de 2 ΡΕ1735348 fibroblasto (FGF). A ligação destes factores de crescimento aos seus receptores de superfície celular induz a activação do receptor, que inicia e modifica as vias de transdução de sinal e conduz à proliferação e diferenciação celular.

Os membros da família do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGF) são quinases da tirosina do receptor do factor de crescimento particularmente importantes associadas à tumorigénese de células epidérmicas. 0 primeiro membro da família do receptor de EGF a ser descoberto foi o EGFR, que é expresso em muitos tipos de células tumorais. Verificou-se que o EGFR está envolvido na regulação da divisão e do crescimento de células tumorais, reparação e sobrevivência, angiogénese, invasão e metástase tumoral. EGFR é uma glicoproteína de 170 kD que se estende pela membrana com um domínio de ligação ao ligando extracelular, uma região de transmembrana e um domínio de quinase da tirosina da proteína citoplásmica. Exemplos de ligandos que estimulam o EGFR incluem o factor de crescimento epidérmico (EGF), transformando o factor α do crescimento (TGF-α), factor de crescimento de ligação à heparina (HBGF), β-celulina, e Cripto-1. A ligação de ligandos específicos resulta na autofosforilação do EGFR, activação do domínio da quinase da tirosina citoplásmica do receptor e iniciação de múltiplas vias de transdução de sinal que regulam o crescimento e sobrevivência do tumor. A via do EGFR também influencia a produção de vários outros 3 ΡΕ1735348 factores angiogénicos, tais como NEGF e factor de crescimento fibroblástico básico (bFGF), em tumores.

Também se pensa que os factores de crescimento que activam o EGFR desempenham um papel na angiogénese tumoral. A angiogénese, que se refere à formação de capilares a partir de vasos pré-existentes no embrião e no organismo adulto, é conhecida como sendo um elemento chave no crescimento tumoral, sobrevivência e metástase. Foi relatado que a estimulação mediada por EGFR de células tumorais conduz à expressão aumentada do factor de crescimento endotelial vascular de factores angiogénicos (NEGF), interleuquina-8 (IL-8), e factor de crescimento do fibroblasto básico (bFGF), que pode conduzir à activação de células endoteliais vasculares associadas ao tumor. A estimulação das células endoteliais vasculares associadas ao tumor também pode ocorrer através da activação dos seus próprios receptores de EGF, através de factores de crescimento produzidos pelo tumor, tais como TGF-α e EGF.

Foi relatado que muitos tumores humanos expressam, ou sobre-expressam EGFR. A expressão do EGFR está correlacionada com um prognóstico fraco, diminuição de sobrevivência, e/ou aumento da metástase. 0 EGFR, devido ao seu envolvimento na tumorigénese, foi especificamente considerado um alvo para terapias anti-cancro. Estes terapias incluíram predominantemente um anticorpo mono-clonal que bloqueia a ligação do ligando ao domínio extra-celular do receptor ou um inibidor da quinase da tirosina 4 ΡΕ1735348 sintético que actua directamente sobre a região intracelular para prevenir a transdução de sinal.

Por exemplo, Cetuximab MAb (ERBITUX®) é um anticorpo monoclonal recombinante, quimérico humano/de murganho, que se liga especificamente ao domínio extracelular do EGFR humano. Cetuximab é um antagonista de EGFR, que bloqueia a ligação do ligando ao EGFR, previne a activação do receptor, e inibe o crescimento das células tumorais que expressam EGFR. 0 Cetuximab foi aprovado para utilização em combinação com ou sem irinotecan no tratamento de doentes com cancro colorrectal metastático que expressa o receptor do factor de crescimento epidérmico que são refractários ou não podem tolerar quimioterapia à base de irinotecan. Também foi demonstrado que Cetuximab é eficaz para o tratamento da psoríase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente descrição proporciona anticorpos monoclonais ou fragmentos destes específicos para EGFR, preferencialmente a região extracelular de EGFR, compreendendo qualquer uma desde uma até seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) seleccionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO; 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14. Preferencialmente, os anticorpos são humanos. Mais preferencialmente, os anticorpos da presente invenção, ou fragmentos destes, compreendem SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 5 ΡΕ1735348 e SEQ ID NO: 6. Alternativamente, mas também preferencialmente, os anticorpos da presente invenção, ou fragmentos destes, compreendem SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14. Mais preferencialmente os anticorpos do presente invenção, ou fragmentos destes, compreendem uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 8 e/ou uma região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 16. Esses anticorpos ou fragmentos destes da presente invenção possuem várias propriedades, incluindo a capacidade para neutralizar o EGFR e prevenir a ligação de um ligando do EGFR ao seu receptor.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona polinucleótidos isolados que codificam os presentes anticorpos ou fragmentos destes assim como vectores de expressão compreendendo estas sequências polinucleotídicas ligadas operacionalmente a uma sequência de expressão. São também proporcionadas células hospedeiras recombinantes compreendendo o vector de expressão, ou uma descendência destas, em que a célula expressa os presentes anticorpos ou fragmentos destes. Também são fornecidos métodos para produzir anticorpos ou fragmentos destes compreendendo cultivar estas células em condições que permitem a expressão dos anticorpos ou fragmentos destes. Os anticorpos ou fragmentos destes podem ser então purificados a partir da célula ou meio da célula.

Também são descritos métodos de tratamento do crescimento do tumor num mamífero, compreendendo adminis- 6 ΡΕ1735348 tração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um presente anticorpo. Os presentes anticorpos podem ser co-adminis-trados com anticorpos que se liqam a outros RTKs. Os métodos também podem compreender administrar ao mamífero um agente antineoplásico ou tratamento, incluindo, por exemplo, um aqente quimioterapêutico e/ou radiação. Em certas formas de realização, o crescimento do tumor é inibido, em formas de realização preferidas, o tratamento resulta em regressão tumoral.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo ou um seu conjugado para utilização como um medicamento para inibir o crescimento tumoral num mamífero.

Em particular, o medicamento pode ser utilizado para inibir o crescimento tumoral num mamífero, em que o tumor expressa EGFR, sobre-expressa EGFR, é um tumor primário, é um tumor metastático, é um tumor refractário, é um tumor vascularizado, ou em que o tumor é seleccionado a partir de um tumor colorrectal, um tumor de cabeça e pescoço, um tumor pancreático, um tumor pulmonar, um tumor da mama, um carcinoma celular renal e um glioblastoma. São descritos métodos de tratamento de uma doença hiperproliferativa não cancerosa, e.g., psoríase, num mamífero compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do presente anticorpo. 7 ΡΕ1735348

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras IA e 1B apresentam os vectores de clonagem para a expressão de genes de imunoglobulina, pDFC e pEE12.1L. A Figura IC apresenta o vector plasmidico resultante gue contém o anticorpo anti-EGFR humano total único, pGS-llF8. A Figura 2 apresenta o perfil de digestão de restrição de pGS-llF8. Os marcadores de tamanho de DNA estão indicados na escada de DNA em guilopares de bases. A Figura 3 apresenta a ligação in vitro de IMC-C1 1F8 e IMC-C225 a EGFR como medido por ELISA. A Figura 4 apresenta os resultados da competição in vitro de MC-1 1F8 e IMC-C225 com EGF marcado com 125I para ligação a EGFR. A Figura 5 apresenta os efeitos de IMC-11F8 e IMC-C225 na fosforilação de EGFR em células BxPC3. 0 anticorpo de controlo utilizado é IMC-1C11. A Figura 6 apresenta a inibição da fosforilação de EGFR por IMC-11 F8 e IMC-C225 em células A431. A Figura 7 apresenta a análise de Transferência de Western da fosforilação de EGFR na presença de células ΡΕ1735348 de controlo não estimuladas (pista 1), EGF (pista 2), IMC-C225 (pista 3), IMC-11F8 (pista 4) e anticorpo de controlo (pista 5) . A Figura 5A apresenta EGFR fosforilado utilizando um anticorpo anti-fosfotirosina e a Figura 5B apresenta o EGFR total nas células não estimuladas. A Figura 8 apresenta a inibição da fosforilação de EGFR estimulada por EGF por várias concentrações de IMC-11F8. A Figura 8A apresenta a análise de transferência de Western com anticorpo anti-fosfotirosina de EGFR em células de controlo não estimuladas (pista 1), células estimuladas tratadas sem anticorpo IMC-11F8 (pista 2), 15 pg/mL (pista 3), 3 pg/mL (pista 4), e 0,6 pg/mL (pista 3) de IMC-11F8. A Figura 8B apresenta EGFR total. A Figura 9 apresenta a inibição da proliferação de células DiFi por IMC-11F8, IMC-C225 e anticorpo controlo, IMC-1C11 como avaliado através de um ensaio de MTT. A Figura 10 apresenta a lise especifica de células DiFi marcadas com 51Cr tratadas com IMC-11F8 ou IMC-C225 (ERBITUX™). A Figura 11 apresenta o gráfico de células tumorais A431 em murganhos tratados com IMC-11F8 ou com IMC-C225 (Cetuximab). Os animais não tratados serviram como controlos para o crescimento tumoral. A Figura 12 apresenta o crescimento de células 9 ΡΕ1735348 tumorais BxPC3 em murganhos tratados com IMC-11F8 ou com IMC-C225 (Cetuximab). Os animais não tratados serviram como controlos para o crescimento tumoral. A Figura 13 apresenta a coloração imuno-histo-química de tumores humanos xenoenxertados de murganhos sem pêlo tratados com soro fisiológico ou IMC-11F8. Painel A e B, A431 xenoenxertos de murganhos sem pêlo tratados com soro fisiológico (A) ou IMC-11F8 (B). Painel C e D, xenoenxertos BxPC3 de murganhos sem pêlo tratados com soro fisiológico (C) ou IMC-11F8 (D). Painel E e F, coloração de Ki-67 dos xenoenxertos A413 de murganhos sem pêlo tratados com soro fisiológico (E) ou IMC-11F8 (F). A Figura 14 apresenta a inibição de carcinomas colorrectais humanos xenoenxertados em murganhos sem pêlo por IMC-11F8 em combinação com CPT-11. Murganhos sem pêlo contendo xenoenxertos de tumor colorrectal humano GEO (painel A), DLD-1 (painel B), ou HT-29 (painel C), tratados por injecção intraperitoneal com soro fisiológico ou IMC-11F8 duas vezes por semana a 0,3 mg ou 1,0 mg/injecção, isoladamente ou em combinação com CPT-11 na dose de 100 mg/kg uma vez por semana. Os tamanhos do tumor foram medidos duas vezes por semana. Os resultados representam a média ± EP das medições do tumor de 10 animais em cada grupo. (D) A regressão do tumor após tratamento com IMC-11F8 isoladamente ou em combinação com CPT-11. Cada grupo de tratamento consiste em 10 animais contendo tumor. 10 ΡΕ1735348

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona anticorpos mono-clonais e fragmentos destes, como definidos nas reivindicações, que são especificas para EGFR, assim como sequências polinucleotidicas isoladas ou purificadas que codificam os anticorpos. Os anticorpos da presente invenção são preferencialmente humanos e podem ser utilizados para tratar doenças neoplásicas, incluindo tumores sólidos e não sólidos e para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos.

Os anticorpos que ocorrem naturalmente possuem tipicamente duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, com cada cadeia leve ligada covalentemente a uma cadeia pesada através de uma ligação persulfureto intercadeia e ligações persulfureto múltiplas que ligam posteriormente as duas cadeias pesadas uma à outra. As cadeias individuais podem dobrar-se nos dominios que possuem tamanhos semelhantes (110-125 aminoácidos) e estruturas, mas diferentes funções. A cadeia leve pode compreender um dominio variável (VL) e/ou um dominio constante (CL) . A cadeia pesada pode também compreender um dominio variável (VH) e/ou, dependendo da classe ou isotipo do anticorpo, três ou quatro dominios constantes (CHI, Ch 2, Ch3 e Cr4) . Em humanos, os isotipos são IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, com IgA e IgG subdivididos ainda em subclasses ou subtipos (IgAi-2 e IgGi-4) .

De um modo geral, os dominios variáveis apresen- 11 ΡΕ1735348 tam uma variabilidade de sequência de aminoácidos considerável de um anticorpo para o seguinte, particularmente na localização do sitio de ligação ao antigénio. Encontram-se três regiões, denominadas regiões hipervariáveis ou de complementaridade-determinação (CDRs), em cada uma de VL e VH, que são suportadas por regiões menos variáveis denominadas de grelha variáveis. A porção de um anticorpo que consiste nos dominios vL e VH é designada Fv (fragmento variável) e constitui o sitio de ligação ao antigénio. 0 Fv de cadeia simples (scFv) é um fragmento de anticorpo que contém um dominio V e um dominio VH numa cadeia polipeptidica, em que o terminal N de um dominio e o terminal C do outro dominio são unidos por um ligante flexivel (ver, e.g., Pat. U.S. N°. 4 946 778 (Ladner et al.); WO 88/09344, (Huston et al.) . WO 92/01047 (McCafferty et al.) descreve a apresentação de fragmentos scFv na superfície de sistemas de empacotamento de apresentação genética recombinante solúveis, tais como bacteriófago.

Os ligantes peptidicos utilizados para produzir os anticorpos de cadeia simples podem ser péptidos flexíveis seleccionados para assegurar que ocorre a dobragem tridimensional apropriada dos dominios VL e NH. O ligante tem geralmente 10 até 50 residuos de aminoácidos. Preferencialmente, o ligante tem 10 até 30 residuos de aminoácidos. Mais preferencialmente, o ligante tem 12 até 30 residuos de aminoácidos. Muito preferencialmente, é um 12 ΡΕ1735348 ligante de 15 até 25 resíduos de aminoácidos. Um exemplo desses péptidos ligantes inclui (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 (SEQ ID NO: 19).

Os anticorpos de cadeia simples não têm alguns ou todos os dominios constantes dos anticorpos totais a partir do qual derivaram. Por isso, eles podem ultrapassar alguns dos problemas associados com a utilização de anticorpos totais. Por exemplo, os anticorpos de cadeia simples tendem a estar isentos de certas interacções indesejadas entre regiões constantes de cadeia pesada e outras moléculas biológicas. Adicionalmente, os anticorpos de cadeia simples são consideravelmente mais pequenos do que os anticorpos totais e podem possuir maior permeabilidade do que os anticorpos totais, permitindo que os anticorpos de cadeia simples para localizar e ligam-se aos sitios de ligação ao antigénio alvo mais eficientemente. Para além disso, o tamanho relativamente mais pequeno dos anticorpos de cadeia simples tornam-nos menos prováveis de provocar uma resposta imunitária indesejada num recipiente do que os anticorpos totais.

Os anticorpos de cadeia simples múltiplos, possuindo cada cadeia simples um dominio VH e um domínio VL ligados covalentemente por um primeiro ligante peptídico, podem ser ligados covalentemente através de, pelos menos um ou mais, ligantes peptídicos para formar anticorpos de cadeia simples multivalente, que podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos. Cada cadeia de um anticorpo de cadeia 13 ΡΕ1735348 simples multivalente inclui um fragmento de cadeia simples variável e um fragmento de cadeia pesada variável, e está ligado através de um ligante peptídico a pelo menos uma outra cadeia. 0 ligante peptídico é composto por pelo menos quinze resíduos de aminoácidos. 0 número máximo de resíduos de aminoácidos é de cerca de cem.

Podem ser combinados dois anticorpos de cadeia simples para formar um diacorpo, também conhecido como um dímero bivalente. Os diacorpos possuem duas cadeias e dois sítios de ligação, e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. Cada cadeia do diacorpo inclui um domínio VH ligado a um domínio VL. Os domínios estão ligados com ligantes que são suficientemente curtos para prevenir o emparelhamento entre domínios no mesmo domínio, conduzindo desse modo o emparelhamento entre domínios complementar nas diferentes cadeias para recrear os dois sítios de ligação ao antigénio.

Podem ser combinados três anticorpos de cadeia simples para formar triacorpos, também conhecidos como trímeros trivalentes. Os triacorpos são construídos com o terminal de aminoácidos de um domínio VL ou VH fundido directamente ao terminal carboxilo de um domínio VL ou VH, i.e., sem qualquer sequência ligante. 0 triacorpo possui três cabeças Fv com os polipéptidos dispostos de uma forma cíclica, cabeça-para-cauda. Uma conformação possível para o triacorpo é planar com os três sítios de ligação ao anticorpo localizados num plano num ângulo de 120 graus um 14 ΡΕ1735348 do outro. Os triacorpos podem ser monoespecificos, biespecíficos ou triespecífico.

Fab (Fragmento, ligação ao antigénio) refere-se aos fragmentos do anticorpo que consistem nos domínios VL CL VH e CHI. Aqueles criados após digestão com papaína simplesmente são referidos como Fab e não retêm a região da dobra da cadeia pesada. Após a digestão com pepsina, são criados vários Fabs que retêm a dobra da cadeia pesada. Os fragmentos divalentes com as ligações persulfureto intactas são referidos como F(ab') , embora resulte um Fab' monovalente quando as ligações persulfureto não são retidas. Os fragmentos F(ab') possuem uma avidez superior para o antigénio do que os fragmentos Fab monovalentes.

Fc (cristalização fragmentos) é a designação para a porção ou fragmento de um anticorpo que compreende domínios constantes de cadeia pesada emparelhadas. Num anticorpo IgG, por exemplo, o Fc compreende os domínios CH2 e CH3. 0 Fc de um IgA ou um anticorpo IgM compreende ainda um domínio CH4. 0 Fc está associado à ligação do receptor

Fc, activação da citotoxicidade mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC). Para anticorpos tais como IgA e IgM, que são complexos de proteínas de tipo IgG múltiplas, a formação do complexo requer domínios Fc constantes.

Finalmente, a região da dobra separa as porções Fab e Fc do anticorpo, proporcionando a mobilidade de Fabs 15 ΡΕ1735348 um em relação ao outro e relativamente a Fc, assim como incluindo ligações persulfureto múltiplas para ligação covalente a duas cadeias pesadas.

Assim, os anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos que ocorrem naturalmente, fragmentos bivalentes tais como (Fab')2, fragmentos monovalentes tais como Fab, anticorpos de cadeia simples, Fv de cadeia simples (scFv), anticorpos de dominio simples, anticorpos de cadeia simples multivalentes, diacorpos e triacorpos, que se ligam especificamente com antigénios.

Os anticorpos, ou seus fragmentos, da presente invenção são específicos para o EGFR. A especificidade do anticorpo refere-se ao reconhecimento selectivo do anticorpo para um epitopo particular de um antigénio. Anticorpos, ou fragmentos destes, por exemplo, podem ser monoes-pecificos ou biespecificos. Os anticorpos biespecificos (BsAbs) são anticorpos que possuem duas especificidades ou sitios de ligação ao antigénio diferentes. Quando um anticorpo possui mais do que uma especificidade, os epitopos reconhecidos podem ser associados a um único antigénio ou com mais do que um antigénio. Assim, são descritos anticorpos biespecificos, ou fragmentos destes, que se ligam a dois antigénios diferentes, com pelo menos uma especificidade para EGFR. A especificidade dos presentes anticorpos, ou fragmentos destes, para o EGFR podem ser determinados com 16 ΡΕ1735348 base na afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pela constante de equilíbrio para a dissociação de um antigénio com um anticorpo (KJ), mede a força de ligação entre um determinante antigénico e um sítio de ligação ao anticorpo. Avidez é a medição da força de ligação entre um anticorpo com o seu antigénio. A avidez está relacionada com a afinidade entre um epitopo com o seu sítio de ligação ao antigénio no anticorpo, e a valência do anticorpo, que se refere ao número de sítios de ligação ao antigénio de um epitopo particular. Os anticorpos ligam-se tipicamente com uma constante de dissociação (Kd) de 10‘5 até 1CT11 litros/mol. Qualquer Kd inferior a 10~4 litros/mol é geralmente considerada como indicadora de ligação não específica. Quanto menor for o valor de Kd, mais forte será a força de ligação entre um determinante antigénico e o sítio de ligação ao anticorpo.

Como aqui utilizado, "anticorpos" e "fragmentos de anticorpo" inclui as modificações que retêm especificidade para o receptor de EGF. Essas modificações incluem, mas não estão limitadas a, conjugação a uma molécula efectora, tal como um agente quimioterapêutico (e.g., cisplatina, taxol, doxorrubicina) ou citotoxina (e.g., uma proteína, ou um agente quimioterapêutico orgânico não proteico) . Os anticorpos podem ser modificados por conjugação com unidades repórter detectáveis. Também são incluídos anticorpos com alterações que afectam características de não ligação tais como a semivida (e.g., peguilação). 17 ΡΕ1735348

Podem ser conjugadas proteínas e agentes não proteicos com os anticorpos através de métodos que são conhecidos na arte. Métodos de conjugação incluem ligação directa, ligação através de ligantes ligados covalente-mente, e membros de pares de ligação específica (e.g., avidina-biotina). Esses métodos incluem, por exemplo, os descritos por Greenfield et al., Câncer Research 50, 6600-6607 (1990) para a conjugação de doxorrubicina e aqueles descritos por Arnon et al., Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991) e por Kiseleva et al., Mol. Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991) para a conjugação de compostos de platina.

Equivalentes de anticorpos, ou fragmentos destes, da presente invenção também incluem polipéptidos com sequências de aminoácidos substancialmente iguais às da sequência de aminoácidos das regiões variáveis ou hipervariáveis dos anticorpos anti-EGFR de comprimento total aqui revelados. Substancialmente, a mesma sequência de aminoácidos é aqui definida como uma sequência com pelo menos cerca de 70%, preferencialmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% de homologia, como determinado pelo método de pesquisa FASTA de acordo com Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 2444-8 (1988)), incluindo sequências que são pelo menos cerca de 70%, preferencialmente pelo menos cerca de 80%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% idênticas.

Esses anticorpos terão uma ligação, bloqueamento de ligando e actividades de neutralização do receptor 18 ΡΕ1735348 iguais ou semelhantes aos anticorpos da invenção que compreendem as SEQ ID NOS: 8 e 16, particularmente quando existem substituições de aminoácidos conservadoras. Uma substituição de aminoácidos conservadora é definida como uma alteração na composição de aminoácidos através da alteração de um ou mais aminoácidos de um péptido, poli-péptido ou proteina, ou fragmento desta. A substituição é de aminoácidos com propriedades geralmente semelhantes (e.g., ácido, básico, aromático, tamanho, carregado positivamente ou negativamente, polaridade, não polaridade) de modo a que as substituições não alterem substancialmente as caracteristicas relevantes do péptido, polipéptido ou proteina (e.g., carga, ponto isoeléctrico, afinidade, avidez, conformação, solubilidade) ou actividade. São seleccionadas substituições conservadoras tipicas nos grupos de aminoácidos, cujos grupos incluem, mas não estão limitados a: (1) hidrofóbicos: metionina (M) , alanina (A), valina (V) , leucina (L), isoleucina (I); (2) hidrofilicos: cisteina (C) , serina (S) , treonina (T) , asparagina (N), glutamina (Q); (3) acidicos: ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); (4) básicos: histidina (H), lisina (K), arginina (R); (5) aromáticos: fenilalanina (F), tirosina (Y) e triptofano (W) ; (6) residuos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro.

Os anticorpos da presente descrição incluem ainda 19 ΡΕ1735348 aqueles para os quais as características de liqação foram melhoradas através de mutação directa, métodos de maturação de afinidade, apresentação em fagos, ou mistura de cadeias. A afinidade e especificidade podem ser modificadas ou melhoradas por mutação de CDRs e rastreio para sitios de ligação ao antigénio possuindo as caracteristicas desejadas (ver, e.g., Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). As CDRs são mutadas numa variedade de formas. Uma forma é randomizar os residuos individuais ou combinações de residuos de modo que numa população de, sitios de ligação ao antigénio idênticos de outra forma, todos os vinte aminoácidos são encontrados em posições particulares. Alternativamente, as mutações são induzidas num intervalo de resíduos de CDR por métodos de PCR propensos a erro (ver, e.g., Hawkins et al., J. Mol. Biol, 226: 889-896 (1992) ) . Por exemplo, os vectores de apresentação em fagos contendo genes da região variável da cadeia pesada e leve podem ser propagados em estirpes mutadoras de E. coli (ver, e.g., Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Estes métodos de mutagénese são ilustrativos de muitos métodos conhecidos do especialista da técnica.

Cada dominio do anticorpo desta invenção pode ser um dominio de imunoglobulina completo (e.g., dominio variável ou constante de cadeia pesada ou leve), ou pode ser um equivalente funcional ou um mutante ou derivado de um dominio que ocorre naturalmente, ou um dominio sintético construido, por exemplo, in vitro utilizando uma técnica, tal como uma descrita em WO 93/11236 (Griffiths et al.). 20 ΡΕ1735348

Por exemplo, é possível unir em conjunto domínios que correspondem a domínios variáveis de anticorpo, que não têm pelo menos um aminoácido. A propriedade caracterizante importante dos anticorpos é a presença de um sítio de ligação ao antigénio. Os termos fragmento de cadeia variável pesada e leve não deve ser interpretado como excluindo variantes que não possuem um efeito material na especificidade.

Os anticorpos da presente descrição, ou fragmentos destes, são anticorpos humanos que possuem uma, duas, três, quatro, cinco, e/ou seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) seleccionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, e SEQ ID NO:14. Os anticorpos (ou fragmentos destes) da presente invenção possuem CDRs de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:6 e CDRs de SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14. As sequências de aminoácidos das CDRs são apresentadas abaixo na Tabela 1. TABELA 1

Cadeia pesada CDR1 SGDYYWS SEQ ID NO: 2 CDR2 YIYYSGSTDYNPSLKS SEQ ID NO: 4 CDR3 VSIFGVGTFDY SEQ ID NO: 6 Cadeia leve CDR1 RASQSVSSYLA SEQ ID NO: 10 CDR2 DASNRAT SEQ ID NO: 12 CDR3 HQYGSTPLT SEQ ID NO: 14 21 ΡΕ1735348

Os presentes anticorpos, ou fragmentos destes, possuem uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 8 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:16. 0 IMC-11F8 é um anticorpo particularmente preferido da presente invenção. Este anticorpo possui regiões de grelha VH e VL humanas (FWs) assim como CDRs. 0 domínio variável de VH de IMC-11F8 (SEQ ID N0:8) possui três CDRs (SEQ ID N0S:2, 4, e 6) e quatro FWs e o domínio VL (SEQ ID N0:16) possui três CDRs (SEQ ID NOS:10, 12, e 14) e quatro FWs.

Preferencialmente, os anticorpos, ou fragmentos destes, da presente invenção neutralizam o EGFR. A ligação de um ligando, e.g., EGF ou TGF-α, a um domínio extra-celular externo do EGFR estimula a dimerização do re-ceptor, a autofosforilação do EGFR, a activação do interior do receptor, domínio da quinase da tirosina citoplásmica, e iniciação de vias múltiplas de transdução de sinal e transactivação envolvidas na regulação da síntese do DNA (activação do gene) e progressão ou divisão do ciclo celular. Também preferencialmente, os anticorpos anti-EGFR (ou fragmentos destes) da presente invenção são específicos para a região extracelular do EGFR. Os presentes anticorpos, ou fragmentos destes, previnem ainda, preferencialmente, a ligação de um ligando do EGFR ao seu receptor. Nesta forma de realização, os anticorpos da presente invenção, ou fragmentos destes, ligam o EGFR pelo menos tão fortemente como os ligandos do EGFR naturais (EGF e TGF-α). 22 ΡΕ1735348 A neutralização do EGFR inclui a inibição, diminuição, inactivação e/ou ruptura de uma ou mais dessas actividades normalmente associadas com a transdução de sinal. Assim, a neutralização do EGFR tem vários efeitos, incluindo inibição, diminuição, inactivação e/ou ruptura de crescimento (proliferação e diferenciação), angiogénese (recrutamento de vasos sanguíneos, invasão, e metástase), e motilidade celular e metástase (adesão celular e capacidade invasiva).

Uma medida da neutralização do EGFR é a inibição da actividade da quinase da tirosina do receptor. A inibição da quinase da tirosina pode ser determinada utilizando métodos bem conhecidos; por exemplo, através da medição do nível de autofosforilação do receptor da quinase recombinante, e/ou da fosforilação de substratos naturais ou sintéticos. Assim, os ensaios de fosforilação são úteis na determinação de anticorpos neutralizantes no contexto da presente invenção. A fosforilação pode ser detectada, por exemplo, utilizando um anticorpo específico para a fosfotirosina num ensaio de ELISA ou numa transferência de western. Alguns ensaios para a actividade da quinase da tirosina são descritos em Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-44 (1997) e Batley et al., Life Sei. 62: 143-50 (1998) .

Adicionalmente, podem ser utilizados métodos para a detecção da expressão de proteínas para determinar a neutralização do EGFR, em que as actividades das proteínas 23 ΡΕ1735348 ou da proteína ou os estados de activação a serem medidos são regulados pela actividade da quinase da tirosina do EGFR. Estes métodos incluem imuno-histoquímica (IHC) para a detecção da expressão da proteína, hibridação de fluorescência in situ (FISH) para detecção da amplificação do gene, ensaios de ligação competitiva do radioligando, técnicas de transferência de matriz sólida, tais como transferências de Northern e de Southern, reacção em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR) e ELISA. Ver, e.g., Grandis et al, Câncer, 78:1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Câncer Res., 85:567-71(1994); Sauter et al, Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, Glia, 15:289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Câncer Res., 1:19-31 (1995); Petrides et al., Câncer Res., 50:3934-39 (1990); Hoffmann et al., Anticancer Res., 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., Câncer Res., 55:3140-48 (1995).

Também podem ser utilizados ensaios in vivo para determinar a neutralização do EGFR. Por exemplo, pode ser observada inibição da quinase da tirosina do receptor através de ensaios mitogénicos utilizando linhas celulares estimuladas com o ligando receptor na presença e na ausência do inibidor. Por exemplo, células A431 (American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD) estimuladas com EGF podem ser utilizadas para ensaiar a inibição do EGFR. Outro método envolve testar a inibição de crescimento de células tumorais que expressam EGFR, utilizando por exemplo, células tumorais humanas injectadas num murganho. Ver, e.g., Patente U.S. N°. 6 365 157 (Rockwell et al). - 24 - ΡΕ1735348 A presente invenção não está limitada por um qualquer mecanismo de neutralização de EGFR particular. Os anticorpos anti-EGFR da presente invenção podem ligar-se externamente ao receptor de superfície da célula EGF, bloquear a ligação do ligando (e.g., EGF ou TGF-oí) e a subsequente transdução de sinal mediada pela quinase da tirosina associada ao receptor, e prevenir a fosforilação do EGFR e outras proteínas a jusante na cascata de transdução de sinal. 0 complexo receptor-anticorpo também pode ser internalizado e degradado, resultando na regulação negativa da superfície celular do receptor. As metalopro-teinases da matriz, que funcionam na inversão de células tumorais e metástase, também podem ser reguladas negativamente pelos anticorpos da presente invenção. Para além disso, os anticorpos da presente invenção podem exibir inibição da produção do factor de crescimento e angio-génese.

Os fragmentos do anticorpo podem ser produzidos através da clivagem de um anticorpo total, ou expressando o DNA que codifica o fragmento. Os fragmentos dos anticorpos podem ser preparados através dos métodos descritos por Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) e por Parham, J. Immunol. 131: 2895-2902 (1983). Esses fragmentos podem conter um ou ambos os fragmentos Fab ou o fragmento F(ab')2· Esses fragmentos também podem conter anticorpos da região variável do fragmento de cadeia simples, í.e. scFv, dicorpos, ou outros fragmentos de anti- 25 ΡΕ1735348 corpo. São revelados métodos de produção desses equivalentes funcionais no Pedido de PCT WO 93/21319, Pedido de Patente Europeia No. EP 239400; Pedido de PCT WO 89/09622; Pedido de Patente Europeia EP 338745; e Pedido de Patente Europeia EP 332424. Células hospedeiras preferidas para a transformação de vectores e a expressão dos antagonistas do re-ceptor da presente invenção são células de mamiferos, e.g., células COS-7, células do ovário de hamster chinês (CHO), e linhas celulares de origem linfóide tais como linfoma, mieloma (e.g. NSO), ou células de hibridoma. Outros hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras, podem ser utilizados alternativamente.

Quando se deseja expressar uma construção genética em leveduras, um gene de selecção adequado para utilização em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo de leveduras YRp7. Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979). O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de leveduras sem a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). A presença da lesão de trpl no genoma da célula hospedeira da levedura proporciona então um meio eficaz para detectar a transformação através do crescimento na ausência de triptofano. De um modo semelhante, as estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20,622 ou 38,626) são complementadas pelos plasmideos conhecidos que comportam o gene Leu2. 26 ΡΕ1735348

As células hospedeiras transformadas são cultivadas através de métodos conhecidos na arte num meio líquido contendo fontes assimiláveis de carbono (hidratos de carbono, tais como glucose ou lactose), azoto (amino-ácidos, péptidos, proteínas ou seus produtos de degradação, tais como peptonas, sais de amónio ou semelhantes) , e sais inorgânicos (sulfatos, fosfatos e/ou carbonatos de sódio, potássio, magnésio e cálcio). 0 meio contém ainda, por exemplo, substâncias de promoção de crescimento, tais como elementos vestigiais, por exemplo ferro, zinco, manganês e semelhantes.

Como descrito nos exemplos abaixo, os anticorpos anti-EGFR de elevada afinidade de acordo com a presente invenção podem ser isolados a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos construída a partir de genes da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve humana. Por exemplo, um domínio variável da invenção pode ser obtido a partir de um linfócito de sangue periférico que contém um gene da região variável rearranjado. Alternativamente, as porções de domínio variável, tais como as regiões CDR e FW, podem ser obtidas a partir de diferentes sequências humanas. Mais de 90% dos clones recuperados após três rondas de selecção são específicas para EGFR. As afinidades de ligação para EGFR dos Fabs rastreados estão na gama de nM, que são tão elevadas como vários anticorpos monoclonais anti-EGFR bivalentes produzidos utilizando a tecnologia do hibridoma. 27 ΡΕ1735348

Podem ser obtidos anticorpos e fragmentos de anticorpo da presente invenção, por exemplo, a partir de anticorpos que ocorrem naturalmente, ou bibliotecas de apresentação em fago de Fab ou scFv. Deve entender-se que, para produzir um anticorpo de dominio simples a partir de um anticorpo compreendendo um dominio VH e um dominio V, podem ser desejadas certas substituições de aminoácidos fora das CDRs para aumentar a ligação, a expressão ou a solubilidade. Por exemplo, pode ser desejável modificar residuos de aminoácidos que iriam de outra forma ficar enterrados na interface VH-VL.

Além disso, os anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção podem ser obtidos através da tecnologia de hibridoma convencional (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), utilizando murganhos transgénicos (e.g., murganhos KM de Medarex, San Jose, Calif.) que produzem cadeias pesada gama e leve capa de imunoglobulina humana, Numa forma de realização preferida, é inserida uma porção substancial do genoma que produz o anticorpo humano no genoma do murganho, e é tornado deficiente na produção de anticorpos de murino endógenos. Esses murganhos podem ser imunizados subcuta-neamente (s.c.) com KDR (NEGFR-2) em adjuvante completo de Freund.

A proteína utilizada para identificar anticorpos que se ligam ao EGFR da invenção é preferencialmente EGFR 28 ΡΕ1735348 e, mais preferencialmente, é o domínio extracelular do EGFR. 0 domínio extracelular de EGFR pode estar livre ou conjugado com outra molécula. A presente invenção também proporciona nucleóti-dos isolados que codificam os anticorpos, ou fragmentos destes, descritos anteriormente. A invenção inclui ácidos nucleicos que possuem uma sequência que codifica todas as seis CDRs. A Tabela 2 apresenta as sequências de ácido nucleico. TABELA 2

Cadeia l pesada CDR1 agtggtgatt actactggag t SEQ ID NO:1 CDR2 tacatctatt acagtgggag caccgactac aacccgtccc tcaaagt SEQ ID NO:3 CDR3 gtgtcgattt ttggagtggg ggacatttga ctac SEQ ID NO:5 Cadeia Leve CDR1 agggccagtc agagtgttag cagctactta gcc SEQ ID NO:9 CDR2 gatgcatcca acagggccac t SEQ ID NO:11 CDR3 caccagtatg gtagcacacc tctcact SEQ ID NO:13 0 DNA que codifica anticorpos humanos pode ser preparado através da recombinação de DNA que codifica regiões constantes e regiões variáveis humanas, diferentes das CDRs, derivadas substancialmente ou exclusivamente das regiões de anticorpo humano correspondente e do DNA que codifica as CDRs derivadas de um humano (SEQ ID NOS: 1, 3, e 5 para as CDRs do domínio variável da cadeia pesada e SEQ ID NOS: 9, 11, e 13 para as CDRs do domínio variável da cadeia leve). 29 ΡΕ1735348

Fontes adequadas de DNAs que codificam fragmentos de anticorpos incluem qualquer célula, tal como hibridomas e células do baço, que expressam o anticorpo de comprimento total. Os fragmentos podem ser utilizados por si próprios como equivalentes de anticorpo, ou podem ser recombinados em equivalentes, como descrito acima. As deleções e recombinações de DNA descritas nesta secção podem ser realizados através de métodos conhecidos, tais como aqueles descritos nas publicações listados acima em relação a equivalentes de anticorpos e/ou outras técnicas de DNA recombinante convencionais, tais como aquelas descritas abaixo. Outra fonte de DNAs são anticorpos de cadeia simples produzidos a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos, como é conhecido na arte.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona vectores de expressão contendo as sequências polinucleo-tídicas previamente descritas ligadas operacionalmente a uma sequência de expressão, um promotor e uma sequência de intensificador. Foram desenvolvidos vários vectores de expressão para a sintese eficiente de polipéptido de anticorpo em procariotas, tais como bactérias e sistemas eucarióticos, incluindo mas não limitados a sistemas de células de leveduras e de mamiferos. Os vectores da presente invenção podem compreender segmentos de sequências de DNA cromossómico, não cromossómico e sintético.

Pode ser utilizado qualquer vector de expressão 30 ΡΕ1735348 adequado. Por exemplo, vectores de clonagem procarióticos incluem plasmideos de E. coli, tais como colEl, pCRl, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, e RP4. Os vectores procarióticos também incluem derivados de DNA fágico, tais como Ml3 e outros fagos de DNA de cadeia simples filamentosos. Um exemplo de um vector útil em leveduras é o plasmideo 2μ. Vectores adequados para a expressão em células de mamíferos incluem derivados bem conhecidos de SN40, adenovírus, sequências de DNA derivadas de retrovírus e vectores vaivém derivados da combinação de vectores de mamíferos funcionais, tais como aqueles descritos acima, e plasmideos funcionais e DNA de fagos. São conhecidos na arte vectores de expressão eucarióticos adicionais (e.g., P.J. Southern e P. Berg, J.

Mol. Appl. Genet., 1, 327-341 (1982); Subramani et al. Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann e Sharp "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann e Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill et al., "Expression e Characterization Of The Product Of A Human Immune friterferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 80, 4654-4659 (1983);

Uriaub e Chasin, Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 77, 4216-4220, (1980).

Os vectores de expressão úteis na presente invenção contêm pelo menos uma sequência de controlo de 31 ΡΕ1735348 expressão que está ligada operacionalmente à sequência de DNA ou fragmento a ser expresso. A sequência de controlo é inserida no vector de modo a controlar e regular a expressão da sequência de DNA clonado. Exemplos de sequências de controlo de expressão úteis são o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, regiões de operador e promotor principais de fago lambda, a região de controlo da proteína de revestimento fd, os promotores glicolíticos de leveduras, e.g., o promotor para a quinase de 3-fosfoglicerato, os promotores da fosfatase ácida de leveduras, e.g., Pho5, os promotores dos factores de cruzamento alfa de levedura, e promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus, e vírus símio, e.g., os promotores precoces e tardios ou SN40, e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas e seus vírus ou combinações destes. A presente invenção também proporciona células hospedeiras recombinantes contendo os vectores de expressão previamente descritos. Os anticorpos da presente invenção podem ser expressos em linhas celulares diferentes dos hibridomas. Podem ser utilizados ácidos nucleicos, que compreendem uma sequência que codifica um polipéptido de acordo com a invenção, para a transformação de uma célula hospedeira de mamífero adequada.

Linhas celulares de preferência particular são seleccionadas com base no elevado nível de expressão, 32 ΡΕ1735348 expressão constitutiva da proteína de interesse e contaminação minima das proteínas hospedeiras. Linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidos na arte e incluem muitas linhas celulares imortalizadas, tais como mas não limitadas a, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) , células de Rim de Hamster Bebé (BHK) e muitas outras. Células eucarióticas adicionais adequadas incluem leveduras e outros fungos. Hospedeiros procarióticos úteis incluem, por exemplo, E. coli, tais como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, e E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tais como Bacillus subtilis, e Streptomyces.

Estas células hospedeiras recombinantes aqui apresentadas podem ser utilizadas para produzir um anticorpo, ou fragmento deste, cultivando as células em condições que permitem a expressão do anticorpo ou seu fragmento e purificar o anticorpo ou seu fragmento a partir da célula hospedeira ou do meio que rodeia a célula hospedeira. A marcação do anticorpo ou fragmento expresso para secreção nas células hospedeiras recombinantes pode ser facilitada através da inserção de uma sequência que codifica um péptido líder secretor ou de sinal (ver, Shokri et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6): 654-64 (2003),

Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) e von Heinje et al., Nucl. Ãcids Res. 14:4683-4690 (1986)) na extremidade 5' do gene de interesse que codifica o anticorpo. Estes elementos péptido líder secretores podem ser derivados de 33 ΡΕ1735348 sequências procarióticas ou eucarióticas. De uma forma consequentemente adequada, os péptidos líder secretores são utilizados, sendo aminoácidos unidos à extremidade N-terminal de um polipéptido para direccionar o movimento do polipéptido para fora do citosol da célula hospedeira e ser secretado para o meio.

Os anticorpos desta invenção podem ser fundidos com resíduos de aminoácidos adicionais. Esses resíduos de aminoácidos podem ser um marcador peptídico, talvez para facilitar o isolamento. Estão também contemplados outros resíduos de aminoácidos para hospedar os anticorpos em órgãos ou tecidos específicos.

Um anticorpo do presente invenção é construído para expressar um ácido nucleico que codifica o anticorpo num animal transgénico, de modo a que o anticorpo seja expresso e possa ser recuperado. Por exemplo, o anticorpo pode ser expresso de um modo específico para o tecido que facilita a recuperação e purificação. Um anticorpo da invenção é expresso na glândula mamária para secreção durante a lactação. Os animais transgénicos, incluem, mas não estão limitados a murganhos, cabras, e coelhos.

Um método de tratamento do crescimento do tumor num mamífero através da administração no mamífero de uma quantidade eficaz de um anticorpo como descrito previamente é também proporcionado. Tumores adequados a serem tratados de acordo com a presente invenção expressam preferencial- 34 ΡΕ1735348 mente EGFR. Embora não seja pretendido estar limitado por qualquer mecanismo particular, as doenças e condições que podem ser tratadas ou prevenidas pelos presentes métodos incluem, por exemplo, aquelas em que o crescimento do tumor ou angiogénese patogénica é estimulada através de uma ansa parácrina e/ou autócrina de EGFR. Isto é, os tumores que expressam EGFR são caracteristicamente sensíveis ao EGF presente no seu ambiente, e podem ainda produzir e ser estimulados por EGF e/ou TGF-α numa anda estimuladora autócrina. 0 tratamento desses tumores de acordo com a invenção inclui a inibição parcial ou completa de crescimento tumoral. Notoriamente, em certas formas de realização, a inibição inclui ainda a regressão tumoral.

A expressão de EGFR foi observada numa variedade de tumores humanos, tanto in vitro como in vivo, e os níveis da expressão de EGFR variam em grande medida com o tipo de tumor. 0 EGFR é expresso em níveis variáveis na superfície celular numa percentagem significativa de tumores humanos, tais como carcinoma colorrectal, da cabeça e pescoço (célula escamosa), pancreático, do pulmão, da mama, e da célula renal, assim como glioblastoma. Em certos tipos de tumor, a expressão de EGFR é muito comum (e.g., 35% até 70% de cancros ováricos e aproximadamente 25% até 77% dos cancros colorrectais). Níveis elevados da expressão de EGFR podem ocorrer na correlação com produção de ligandos do receptor (i.e., EGF e TGF-α). A expressão do EGFR também foi correlacionada com o aumento da resistência a certos agentes quimioterapêuticos e radioterapia. A 35 ΡΕ1735348 expressão de EGFR também pode servir como um factor prognóstico em certos tipos de tumores, na medida em que foi associado a sobrevivência reduzida, prognóstico fraco, e/ou risco aumentado de metástase. Para além disso, o aumento da expressão de EGFR existe em múltiplos tipos de tumor.

Os tumores a serem tratados incluem tumores primários e tumores metastáticos, assim como tumores refrac-tários. Tumores refractários incluem tumores que não respondem ou são resistentes ao tratamento apenas com agentes quimioterapêuticos, anticorpos isoladamente, apenas radiação ou combinações destes. Os tumores refractários também contemplam tumores que parecem ser inibidos pelo tratamento com esses agentes, mas recorrem até cinco anos, por vezes até dez anos ou mais após o tratamento ser descontinuado.

Os tumores que podem ser tratados com anticorpos da presente invenção incluem os tumores que não são vascularizados, ou ainda não são substancialmente vascula-rizados, assim como tumores vascularizados. Exemplos de tumores sólidos, que podem ser tratados adequadamente, incluem carcinoma da mama, carcinoma do pulmão, carcinoma colorrectal, carcinoma pancreático, glioma e linfoma. Alguns exemplos desses tumores incluem tumores epider-móides, tumores escamoso, tais como tumores da cabeça e do pescoço, tumores colorrectais, tumores da próstata, tumores da mama, tumores do pulmão, incluindo tumores do pulmão de 36 ΡΕ1735348 célula pequena e de célula não pequena, tumores pancre-áticos, tumores da tiróide, tumores do ovário, e tumores do fígado. Outros exemplos incluem o sarcoma de Kaposi, neoplasmas do SNC, neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas e metástases cerebrais, melanoma, carcinomas gastrointestinal e renal e sarcomas, rabdomios-sarcoma, glioblastoma, preferencialmente glioblastoma multiforme, e leiomiossarcoma.

Noutro aspecto da invenção, os anticorpos anti-EGFR inibem a angiogénese associada ao tumor. A estimulação do endotélio vascular pelo EGFR está associada com a vascularização dos tumores. Tipicamente, o endotélio vascular é estimulado de um modo parácrino através de, e.g., EGF e/ou TGF-α de outras fontes (e.g., células tumorais).

Consequentemente, os anticorpos anti-EGFR humanos são eficazes para o tratamento de indivíduos com tumores vascularizados ou neoplasmas ou doenças angiogénicas. Esses tumores e neoplasmas incluem, por exemplo, tumores e neoplasmas malignos, tais como blastomas, carcinomas ou sarcomas, e tumores e neoplasmas altamente vasculares. Os cancros que podem ser tratados através dos métodos da presente descrição incluem, por exemplo, os cancros do cérebro, do tracto genitourinário, do sistema linfático, do estômago, renal, do cólon, laringe e pulmão e osso. Exemplos não limitantes incluem ainda tumores epidermóides, tumores escamosos, tais como tumores da cabeça e do 37 ΡΕ1735348 pescoço, tumores colorrectais, tumores da próstata, tumores da mama, tumores do pulmão, incluindo o adenocarcinoma do pulmão e tumores do pulmão de célula pequena e de célula não pequena, tumores pancreáticos, tumores da tiróide, tumores do ovário, e tumores do figado. 0 método é também utilizado para o tratamento de cancros da pele vascularizados, incluindo carcinoma da célula escamosa, carcinoma da célula basal, e cancros da pele que podem ser tratados através da supressão do crescimento de queratinócitos malignos, tais como queratinócitos malignos humanos. Outros cancros que podem ser tratados incluem o sarcoma de Kaposi, neoplasmas do SNC (neuroblastomas, hemangioblastomas capilares, meningiomas e metástases cerebrais), melanoma, carcinomas gastrointestinal e renal e sarcomas, rabdomiossarcoma, glioblastoma, incluindo glioblastoma multiforme, e leiomiossarcoma. A presente descrição também proporciona um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa não cancerosa num mamífero compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz do anticorpo da presente invenção. Como aqui revelado, "doença hiperproliferativa" é definida como um estado provocado pelo crescimento excessivo de células não de cancro que expressam um membro do da família de receptores de EGFR. As células em excesso criadas por uma doença hiperproliferativa expressam EGFR em níveis normais ou podem sobre-expressar EGFR.

Os tipos de doenças hiperproliferativas que podem 38 ΡΕ1735348 ser tratadas de acordo com a invenção são quaisquer doenças hiperproliferativas que são estimuladas por um ligando de EGFR ou mutantes desses ligandos. Exemplos de doença hiperproliferativa incluem psoriase, queratoses actinicas, e queratoses seborreicas, verrugas, cicatrizes quelóides, e eczema. Também estão incluídas doenças hiperproliferativas provocadas por infecções com vírus, tais como a infecção por vírus papiloma. Por exemplo, a psoriase apresenta muitas variações e graus de gravidade diferentes. Diferentes tipos de psoriase apresentam características tais como bolhas tipo pus (psoriase pustulosa), descamação grave da pele (psoriase eritrodérmica), marcas do tipo pingos (psoriase gutata) e lesões inflamadas suaves (psoriase invertida). 0 tratamento de todos os tipos de psoriase (e.g., psoriase vulgar, psoriase pustulosa, psoriase eritrodérmica, psoriase artropática, parapsoríase, pultulose palmoplantar) é descrito pela invenção.

Nos métodos da presente descrição, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo da invenção é administrada a um mamífero que dele necessite. 0 termo administrar, como aqui utilizado, significa distribuir os anticorpos da presente invenção a um mamífero através de qualquer método que pode atingir o resultado desejado. Eles podem ser administrados, por exemplo, intravenosamente ou intramuscularmente. Embora os anticorpos humanos da invenção sejam particularmente úteis para administração a humanos, eles podem ser igualmente administrados a outros mamíferos. 0 termo mamífero, como aqui utilizado pretende 39 ΡΕ1735348 incluir, mas não está limitado a, humanos, animais de laboratório, animais de companhia e animais de criação. Quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de anticorpo da presente invenção que, quando administrada a um mamifero, é eficaz na produção do efeito terapêutico desejado, tal como inibir a actividade da quinase ou a inibição do crescimento tumoral. A identificação dessa doença está bem dentro a capacidade e do conhecimento de um especialista na arte. Por exemplo, indivíduos humanos que sofrem de uma doença neoplásica clinicamente significativa ou de doença angiogénica ou estão em risco de desenvolver sintomas clinicamente significativos são adequados para administração dos presentes anticorpos de EGFR. Um clínico especialista na arte pode determinar rapidamente, por exemplo, através da utilização de testes clínicos, o exame físico e o historial médico/familiar, se um indivíduo é um candidato para esse tratamento.

Os presentes anticorpos anti-EGFR podem ser administrados para tratamentos terapêuticos a um doente que sofre de um estado patológico associado a um tumor ou angiogénese, numa quantidade suficiente para prevenir, inibir, ou reduzir a progressão do tumor ou estado patológico. A progressão inclui, e.g., o crescimento, capacidade invasiva, metástases e/ou recorrência do tumor ou estado patológico. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma dose terapeuticamente eficaz. As 40 ΡΕ1735348 quantidades eficazes para esta utilização irão depender da gravidade da doença e do estado geral do sistema imunitário do doente. Os horários da dosagem também irão variar com o estado da doença e com o estado do doente, e irão variar tipicamente desde uma dosagem de bolus único ou infusão continua até administrações múltiplas por dia (e.g., a cada 4-6 horas), ou como indicado pelo médico assistente e o estado do doente. Deve ser salientado, todavia, que a presente invenção não está limitada a qualquer dose particular.

Um cocktail de antagonistas de EGFR, e.g., anticorpos monoclonais, proporciona um tratamento especialmente eficiente para a inibição do crescimento de células tumorais. 0 cocktail pode incluir antagonistas de EGFR que não sejam anticorpos e pode possuir apenas 2, 3 ou 4 antagonistas do receptor, e tantos quanto 6, 8 ou 10.

Numa forma de realização da invenção, os anticorpos anti-EGFR podem ser administrados em combinação com um ou mais agentes antineoplásicos. Para exemplos de terapias de combinação, ver, e.g., Patente U.S. N°. 6 217 866 (Schlessinger et al.) (Anticorpos anti-EGFR em combinação com agentes antineoplásicos); WO 99/60023 (Waksal et al.) (Anticorpos anti-EGFR em combinação com radiação). Pode ser utilizado qualquer agente antineo-plásico adequado, tal como um agente quimioterapêutico, radiação ou combinações destes. O agente antineoplásico pode ser um agente alquilante ou um anti-metabolito. Exem- 41 ΡΕ1735348 pios de agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a, cisplatina, ciclofosfamida, melfalano, e dacar-bazina. Exemplos de anti-metabolitos incluem, mas não estão limitados a, doxorrubicina, daunorrubicina, paclitaxel, irinotecan (CPT-11), e topotecan. Quando o agente antineo-plásico é a radiação, a fonte de radiação podem ser externa (terapia de radiação de feixe externo - EBRT) ou interna (braquiterapia - BT) em relação ao doente a ser tratado. A dose de agente antineoplásico administrada depende de vários factores, incluindo, por exemplo, o tipo de agente, o tipo e a gravidade do tumor a ser tratado e a via de administração do agente. Deve ser salientado, todavia, que a presente invenção não está limitada a qualquer dose particular.

Para o tratamento de doença hiperproliferativa, a administração dos anticorpos da invenção como descrito acima podem ser combinada com a administração de qualquer agente de tratamento convencional. Por exemplo, quando a doença hiperproliferativa é a psoriase, existe uma variedade de agentes sistémicos e tópicos convencionais disponíveis. Agentes sistémicos para a psoriase incluem metotrexato, e retinóides orais, tais como acitretina, etretinato, e isotretinoina. Outros tratamentos sistémicos da psoriase incluem hidroxiureia, NSAIDS, sulfasalazina, e 6-tioguanina. Podem ser utilizados antibióticos e agentes antimicrobianos para tratar ou prevenir a infecção que pode fazer com que a psoriase se espalhe e piore. Agentes tópicos para a psoriase incluem antralina, calcipotrieno, 42 ΡΕ1735348 alcatrão, corticosteróides, retinóides, queratolíticos, e tazaroteno. Os esteróides tópicos são uma das terapias mais comuns prescritas para psoriase suave a moderada. Os esteróides tópicos são aplicados à superfície da pele, mas alguns são injectados nas lesões da psoriase.

Os tratamentos de doença hiperproliferativa incluem a administração de anticorpos anti-EGFR em combinação com fototerapia. A fototerapia inclui a administração de qualquer comprimento de onda de luz que reduz os sintomas da doença hiperproliferativa, assim como a fotoactivação de um agente quimioterapêutico (fotoquimiote-rapia). Para posterior discussão de tratamento de distúrbios hiperproliferativos, ver WO 02/11677 (Teufel et al.) (Tratamento de doenças hiperproliferativas com antagonistas do receptor do factor de crescimento epidérmico).

Os anticorpos anti-EGFR da invenção podem ser administrados com antagonistas de EGFR, e/ou antagonistas de outros RTKs tais como anticorpos que bloqueiam os ligandos de RTK ou de outra forma neutralizam os RTKs. Os ligandos de EGFR incluem, por exemplo, EGF, TGF-α anfirre-gulina, EGF de ligação a heparina (HB-EGF) e betacelulina. Pensa-se que o EGF e TGF-α sejam os principais ligandos endógenos que resultam em estimulação mediada por EGFR, embora o TGF-α tenha demonstrado ser mais potente na promoção da angiogénese. Consequentemente, os antagonistas de EGFR incluem anticorpos que se ligam a esses ligandos e desse modo bloqueiam a ligação a e a activação de EGFR. 43 ΡΕ1735348

Um exemplo de outro desses RTK é VEGFR. Numa forma de realização da presente invenção, um anticorpo anti-EGFR é utilizado em combinação com um antagonista de NEGFR. Um anticorpo anti-EGFR é utilizado em combinação com um antagonista do receptor que se liga especificamente ao receptor de NEGFR-2/KDR (PCT/US92/01300, submetido em 20 de Fevereiro de 1992; Terman et ai., Oncogene 6: 1677-1683 (1991)). É utilizado um anticorpo anti-EGFR em combinação com um antagonista do receptor que se liga especificamente ao receptor de NEGFR-l/Flt-1 (Shibuya M. et al., Oncogene 5, 519-524 (1990)). São particularmente preferidas proteínas de ligação ao antigénio que se ligam ao domínio extracelular de NEGFR-1 ou NEGFR-2 e bloqueiam a ligação através do ligando (NEGF ou P1GF), e/ou neutralizam a activação induzida por NEGF ou induzida por P1GF. Por exemplo, o Mab IMC-1121 liga-se a KDR solúvel e expresso na superfície da célula. O Mab IMC-1121 compreende os domínios VH e VL obtidos a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos de Fab humana. (Ver WO 03/075840). Noutro exemplo, o ScFv 6.12 liga-se a Fit-1 solúvel e expresso na superfície da célula. ScFv 6.12 compreende os domínios VH e VL do anticorpo monoclonal de murganho MAb 6.12. Uma linha celular de hibridoma que produz MAb 6.12 foi depositada como o número ATCC PTA-3344.

Outro exemplo desse RTK é o receptor do factor de crescimento do tipo insulina (IGFR). Em certas células tumorais, a inibição da função de EGFR pode ser compensada 44 ΡΕ1735348 por regulação positiva de outras vias de sinalização do receptor do factor de crescimento, e particularmente por estimulação de IGFR. Além disso, a inibição da sinalização de IGFR resulta num aumento da sensibilidade das células tumorais a certos agentes terapêuticos. A estimulação de EGFR ou de IGFR resulta na fosforilação de moléculas de transdução de sinal comuns a jusante, incluindo Akt e p44/42, embora em graus diferentes. Consequentemente, numa forma de realização da invenção, um antagonista de IGFR (e.g., um anticorpo que se liga a IGF ou IGFR e neutraliza o receptor) é co-administrado com um anticorpo da invenção, bloqueando desse modo uma segunda entrada na via de sinalização comum a jusante (e.g., inibindo a activação de Akt e/ou p44/42). Um exemplo de um anticorpo humano especifico para IGFR é o IMC-A1 2 (Ver WO 2005/016970).

Outros exemplos de receptores de factor de crescimento envolvidos na tumorigénese são os receptores para o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o factor do crescimento do nervo (NGF), e o factor de crescimento do fibroblasto (FGF).

Os anticorpos anti-EGFR também podem ser administrados com antagonistas intracelulares de RTK que inibem a actividade de RTKs ou dos seus elementos de sinalização associados que estão envolvidos no crescimento do tumor ou angiogénese associada ao tumor. Os antagonistas intracelulares de RTK são preferencialmente moléculas pequenas. Alguns exemplos de moléculas pequenas incluem 45 ΡΕ1735348 compostos orgânicos, compostos organometálicos, sais de compostos orgânicos e compostos organometálicos, e compostos inorgânicos. Os átomos numa molécula pequena estão ligados em conjunto por via de ligações covalentes e iónicas; o primeiro é típico para compostos orgânicos pequenos, tais como quinase de molécula pequena dos inibidores da tirosina e o último é típico de compostos inorgânicos pequenos. 0 arranjo dos átomos numa molécula orgânica pequena pode representar uma cadeia, e.g., uma cadeia carbono-carbono ou cadeia carbono-heteroátomo ou pode representar um anel contendo átomos de carbono, e.g. benzeno ou um sistema policíclico, ou uma combinação de carbono e heteroátomos, i.e., heterociclos tais como uma pirimidina ou quinazolina. Embora as moléculas pequenas possam possuir qualquer peso molecular elas incluem geralmente moléculas que iriam, de outro modo, ser consideradas moléculas biológicas, excepto que o seu peso molecular não é superior a 650 D. As moléculas incluem tanto compostos que se encontram na natureza, tais como hormonas, neuro-transmissores, nucleótidos, aminoácidos, açúcares, lípidos, e seus derivados, como compostos produzidos sinteticamente, quer através de síntese orgânica tradicional, síntese bio-mediada, ou uma combinação destas. Ver e.g. Ganesan, Drug Discov. Today 7(1): 47-55 (Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Dez. 2001).

Mais preferencialmente, a molécula pequena a ser utilizada como um antagonista intracelular de RTK de acordo com a presente invenção é um antagonista intracelular de 46 ΡΕ1735348 EGFR que compete com ATP para ligação à região de ligação intracelular de EGFR possuindo um domínio da quinase ou às proteínas envolvidas nas vias de transdução de sinal da activação de EGFR. Exemplos dessas vias de transdução de sinal incluem a via da quinase da proteína activada ras-mitogen (MAPK), a via da fosfatidilinosital-3 quinase (P13K)-Akt, a via da quinase da proteína activada pelo stress (SAPK), e os transdutores de sinal e activadores das vias de transcrição (STAT). Exemplos não limitantes das proteínas envolvidas nessas vias (e às quais um antagonista de EGFR de molécula pequena se pode ligar) incluem GRB-2, SOS, Ras, Raf, MEK, MAPK, e metaloproteinases da matriz (MMPs).

Um exemplo de um antagonista de EGFR de molécula pequena é o IRESSA™ (ZD1939) , que é um derivado da quinozalina que funciona como um mimético de ATP para inibir o EGFR. Ver Patente U.S. N°. 5 616 582 (Zeneca

Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) na pág. 4; ver também, Rowinsky et al, Resumo 5 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 Maio de 2001;

Anido et al., Resumo 1712 apresentado no 37th Annual

Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 Maio de 2001.

Outros exemplos de um antagonista de EGFR de molécula pequena é TARCEVA™ (OSI-774) , que é um derivado da 4-(fenilamino substituída) quinozalina [cloridrato de 6,7-Bis(2-metoxi-etoxi)-quinazolin-4-il]-(3-etinil-fenil)amina] inibidor de EGFR. Ver WO 96/30347 (Pfizer Inc.) em, por exemplo, página 2, linha 12 até à página 4, linha 34 e 47 ΡΕ1735348 página 19, linhas 14-17. Ver também Moyer et ai., Câncer Res., 57: 4838-48 (1997); Pollack et ai., J. Pharmacol, 291: 739-48 (1999). TARCEVA™ pode funcionar através da inibição da fosforilação de EGFR e as suas vias de transdução de sinal da quinase a jusante PI3/Akt e MAP (proteína activada pelo mitogénio) que resultam na paragem do ciclo celular mediado por p27. Ver Hidalgo et ai., Resumo 281 apresentado no 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 Maio de 2001. São também relatadas outras moléculas pequenas que inibem EGFR, muitas das quais se pensa que estejam no domínio da quinase da tirosina de um EGFR. Alguns exemplos desses antagonistas de EGFR de molécula pequena são descritos em WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited). WO 97/30034 (Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company), e WO 00/31048 (Warner Lambert Company). Exemplos de antagonistas de EGFR de molécula pequena específicos incluem Cl-1033 (Pfizer), que é uma quinozalina (N-[4-(3-cloro-4-fluoro-fenilamino)-7-(3-morfolin-4-il-propoxi)-quinazolin-6-il]-acrilamida) inibidor de quinases da tirosina, particularmente EGFR e é descrito no WO 00/31048 na página 8, linhas 22-6; PKI166 (Novartis), que é um inibidor da pirrolopirimidina de EGFR e é descrito em WO 97/27199 nas páginas 10-12; GW2016 (GlaxoSmithKline), que é um inibidor de EGFR e de HER2; EKB569 (Wyeth) , que é relatado como inibindo o crescimento das células tumorais 48 ΡΕ1735348 que sobre-expressam EGFR ou HER2 in vitro e in vivo; AG-1478 (Tryphostin), que é uma molécula pequena de quina-zolina que inibe a sinalização a partir de EGFR e erbB-2; AG-1478 (Sugen), que é um inibidor de bi-substrato que também inibe a quinase de proteina CK2; PD 153035 (Parke-Davis) que é relatado como inibindo a actividade a quinase do EGFR e o crescimento tumoral, induzir a apoptose em células em cultura, e aumentar a citotoxicidade dos agentes citotóxicos quimioterapêuticos; SPM-924 (Schwarz Pharma), que é um inibidor da quinase da tirosina direccionado para tratamento do cancro da próstata; CP-546,989 (OSI Pharma-ceuticals), que é reportadamente um inibidor de angiogénese para o tratamento de tumores sólidos; ADL-681, que é um inibidor da quinase de EGFR dirigido para o tratamento do cancro; PD 158780, que é uma piridopirimidina que é reportada como inibindo o crescimento da taxa tumoral de xenoenxertos A4431 em murganhos; CP-358,774, que é uma quinozolina que é reportada para inibir a autofosforilação em xenoenxertos de HN5 em murganhos; ZD1839, que é uma quinzolina que é reportada como possuindo actividade anti-tumoral em modelos de xenoenxerto de murganho incluindo os cancros vulvar, NSCLC, da próstata, do ovário, e color-rectal; CGP 59326A, que é uma pirrolopirimidina que é reportado como inibindo o crescimento de xenoenxertos positivos para EGFR em murganhos; PD 165557 (Pfizer); CGP54211 e CGP53353 (Novartis), que são dianilnoftalimidas. Naturalmente os inibidores derivados da quinase da tirosina de EGFR incluem genisteina, herbimicina A, quercetina, e erbstatina. 49 ΡΕ1735348

Outras moléculas pequenas reportadas para inibir EGFR são compostos triciclicos, tais como os compostos descritos na Patente U.S. N°. 5 679 683; derivados da quinazolina, tais como os derivados descritos na Patente U.S. N°. 5 616 582; e compostos indole tais como os compostos descritos na Patente U.S. N°. 5 196 446. 0 antagonista de EGFR pode ser administrado em combinação com um ou mais adjuvantes adequados, tais como, por exemplo, citoquinas (IL-10 e IL-13, por exemplo) ou outros estimuladores imunitários, tais como, mas não limitados a, quimioquina, antigénios associados a tumor, e péptidos. Ver, e.g., Larrivee et al., supra. Deve ser entendido, todavia, que a administração de apenas um anticorpo anti-EGFR é suficiente para prevenir, inibir, ou reduzir a progressão do tumor de um modo terapeuticamente eficaz.

Numa terapia de combinação, o anticorpo anti-EGFR é administrado antes, durante, ou após começar a terapia com outro agente, assim como em qualquer outra sua combinação, i.e., antes e durante, antes e após, durante e após, ou antes, durante e após começar a terapia com o agente antineoplásico. Por exemplo, o anticorpo anti-EGFR pode ser administrado entre 1 e 30 dias, preferencialmente 3 e 20 dias, mais preferencialmente entre 5 e 12 dias antes de começar a terapia da radiação. A quimioterapia é administrada concorrentemente com ou, mais preferencialmente, subsequente à terapia do anticorpo. 50 ΡΕ1735348

Qualquer método ou via adequada pode ser utilizada para administrar anticorpos anti-EGFR da invenção, e opcionalmente, para co-administrar agentes antineoplásicos e/ou antagonistas de outros receptores. Os regimes de agente antineoplásico utilizados de acordo com a invenção, incluem qualquer regime que se crê ser optimamente adequado para o tratamento do estado neoplásico do doente. Diferentes neoplasias podem necessitar da utilização de anticorpos anti-tumor específicos e agentes antineoplásicos específicos, que serão determinados numa base de doente a doente. As vias de administração incluem, por exemplo, administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular. A dose de antagonista administrada depende de vários factores, incluindo, por exemplo, o tipo de antagonistas, o tipo e gravidade do tumor a ser tratado e a via de administração dos antagonistas. Deve ser salientado, todavia, que a presente invenção não está limitada a qualquer método ou via de administração particular.

Deve ser referido que um anticorpo anti-EGFR da invenção pode ser administrado como um conjugado, que se liga especificamente ao receptor e distribui uma carga tóxica, letal após a internalização ligando toxina. O conjugado anticorpo-fármaco/molécula pequena pode ser ligado directamente um ao outro ou através de um ligante, péptido ou não péptido.

Um anticorpo anti-EGFR da invenção pode ser 51 ΡΕ1735348 ligado quimicamente ou biossinteticamente a um ou mais agentes antineoplásicos ou anti-angiogénicos. A invenção refere-se ainda a anticorpos anti-EGFR aos quais as unidades alvo ou repórter estão ligados. As unidades alvo são os primeiros membros de pares de ligação. Os agentes antineoplásicos, por exemplo, são conjugados com os segundos membros desses pares e são por isso dirigidos para o sitio onde o anticorpo anti-EGFR está ligado. Um exemplo comum desse par de ligação é avidina e biotina. A biotina pode ser conjugada a um anticorpo anti-EGFR, e desse modo proporcionar um alvo para um agente antineoplásico ou outra unidade, que é conjugada com avidina ou estreptavidina. Alternativamente, a biotina ou outra dessas unidades está ligada a um anticorpo anti-EGFR da invenção e é utilizada como um repórter, por exemplo num sistema de diagnóstico em que um agente de produção de sinal detectável é conjugado com avidina ou estreptavidina.

Deve ser entendido que os anticorpos anti-EGFR da invenção, quando utilizados num mamifero para o objectivo da profilaxia ou tratamento, serão administrados na forma de uma composição que compreende adicionalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, por exemplo, um ou mais de água, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, assim como combinações destes. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de 52 ΡΕ1735348 substâncias auxiliares, tais como agentes humidificantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, que aumentam a vida de prateleira ou a eficácia das proteínas de ligação. As composições da injecção podem, como é bem conhecido na arte, ser formuladas de modo a proporcionar uma libertação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente activo após a administração ao mamifero. A presente invenção também se refere a kits para inibir o crescimento do tumor e/ou angiogénese associada ao tumor, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-EGFR humano. Os kits podem ainda conter qualquer antagonista adequado de, por exemplo, outro receptor do factor de crescimento envolvido em tumorigénese ou angiogénese (e.g., NEGFR-l/Flt-1, NEGFR-2, PDGFR, IGFR, NGFR, FGFR, etc, como descrito acima). Alternativamente, ou adicionalmente, os kits podem compreender ainda um agente antineoplásico. Foram aqui descritos exemplos de agentes antineoplásicos adequados no contexto da presente invenção. Os kits da presente invenção podem compreender ainda um adjuvante; os exemplos também foram descritos acima.

Para além disso, é descrita a utilização dos presentes anticorpos in vivo e in vitro para métodos de investigação ou diagnóstico, que são bem conhecidos na arte. Os métodos de diagnóstico incluem kits, que contêm anticorpos da presente invenção.

Consequentemente, os presentes antagonistas do 53 ΡΕ1735348 receptor podem desse modo ser utilizados in vivo e in vitro para métodos de investigação, diagnóstico, profilácticos, ou de tratamento, que são bem conhecidos na arte. Certamente, deve ser entendido e esperado que as variações nos princípios de invenção aqui reveladas podem ser realizadas por um especialista na arte. A activação de EGFR aumentada é por vezes associada com as condições que são tratadas de acordo com a presente invenção. Niveis mais elevados de ligando, amplificação do gene da EGFR, aumento da transcrição do receptor ou mutações que provocam uma sinalização desregulada do receptor podem resultar num aumento da activação do EGFR. A amplificação do gene que codifica o EGFR também resulta num número aumentado de ligandos que se ligam a EGFR, que pode ainda estimular a proliferação das células. 0 EGFR pode ser sobre-expresso na ausência da amplificação do gene, presumivelmente através de mutações que aumentam a transcrição do EGFR, tradução de mRNA, ou estabilidade da proteína. Os EGFR mutantes foram identificados em gliomas, carcinomas do pulmão de célula não pequena, carcinomas do ovário e carcinomas da próstata que possuem uma quinase da tirosina constitutivamente activa, sugerindo um papel para a actividade de nível elevado de EGFR em vez da sobre-expressão de EGFR nestes cancros. Ver, e.g., Pedersen et al., Ann. Oncol., 12(6): 745-60 (2001). (Type III EGFR mutation - variously named EGFRvIII, de2-7 EGFR or AEGFR -lacks a portion of the extracelular ligand binding domain encoded by exons 2-7.); ver também Wikstrand et al., Câncer Res., 55:3140-3148 (1995). 54 ΡΕ1735348

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes ilustram adicionalmente a invenção, mas não devem ser encarados como limitando o âmbito da invenção, de modo algum. Descrições detalhadas de métodos convencionais, tais como aqueles empregues na construção de vectores e plasmídeos, a inserção de genes que codificam os polipéptidos nesses vectores e plasmídeos, a introdução de plasmídeos nas células hospedeiras, e a sua expressão e determinação dos genes e os produtos genéticos podem ser obtidos a partir de várias publicações, incluindo Sambrook, J. et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ncl ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Todas as referências aqui mencionadas são incorporadas na sua totalidade.

Exemplo 1 - Isolamento de Anticorpos Anti-EGFR

Humanos

Resumidamente, os anticorpos humanos foram isolados a partir de uma biblioteca de bacteriófagos de Fab naives humanos, obtidos de Dyax, Cambridge, MA, através de biosselecção contra EGFR humano solúvel isolado a partir de tumores positivos para EGFR. A biblioteca de bacteriófagos Fab naives que contêm as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo que produzem células de humanos (linfócitos B periféricos) foi construída a partir de células do baço não imunizadas naives e sem tumor humanas 55 ΡΕ1735348 de um doente com carcinoma gástrico através da amplificação em reacções de PCR primárias utilizando iniciadores no sentido directo e reverso específicos para o gene V e clonar estes genes VH e VL individuais em vectores separados (WO 00/70023).

O stock da biblioteca Fab foi cultivado até à fase log, recuperado com o fago M13K07 auxiliar e amplificado durante a noite em meio 2YTAK (2YT contendo 100 pg/mL de ampicilina e 50 pg/mL de canamicina) a 30 °C. A preparação do fago foi precipitada em 4% de PEG/0,5 M de NaCl, ressuspenso em 3% de leite magro/PBS para bloquear ligação não específica.

Foram incubados aproximadamente 1 x 1012 pfu de fagos pré-bloqueados com 106 células A431 que sobre-expressam EGFR em 1 mL de meio DMEM simples a 4 °C durante 1 h, após a qual as células foram lavadas 15 vezes com PBS. Os fagos ligados foram eluídos por incubação à Temperatura ambiente durante 30 min com 1 mL de PBS contendo IMC-C225 a 0,5 mg/mL. Os fagos eluídos foram incubados com 10 mL de células TGI a meio da fase log a 37 °C durante 30 min em repouso e 30 min com agitação. As células TGI infectadas foram sedimentadas e plaqueadas em várias placas de 2YTAG grandes e incubadas durante a noite a 30 °C. Todas as colónias cultivadas nas placas foram raspadas para 3 até 5 mL de meio 2YTA, misturadas com glicerol (10% de concentração final), divididas em fracções, e armazenadas a -70 °C. Para a ronda de selecção seguinte, foram adicio- 56 ΡΕ1735348 nados 100 pL do stock de fagos a 25 mL de meio 2YTAG e cultivados até meio da fase log. A cultura foi recuperada com o fago auxiliar M13K07, amplificada, precipitada, e utilizada para selecção seguindo o procedimento descrito acima.

Os clones individuais de TGI recuperados após cada ronda de selecção foram repicados aleatoriamente e cultivados a 37 °C em placas de 96 poços e recuperados com o fago auxiliar M13K07 como descrito acima. A preparação do fago foi bloqueada com 1/6 volume de 18% leite/PBS à Temperatura Ambiente durante lhe adicionados às placas de microtitulação Maxi-sorp de 96 poços (Nunc) revestidos com EGFR recombinante (1 pg/mL x 100 pL) . Após incubação à temperatura ambiente durante 1 h, as placas foram lavadas três vezes com PBST e incubadas com um conjugado de fago anti-M13 de murganho-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . As placas foram lavadas cinco vezes, foi adicionado substrato de peroxidase TMB (KPL, Gaithersburg, MD) , e foi realizada a leitura da absorvência a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Os clones identificados foram ainda testados para bloqueamento de ligação de EGF. Foi utilizado "DNA fingerprinting" dos clones para diferenciar clones únicos. Os clones representativos de cada padrão de digestão foram repicados e sujeitos a sequenciação de DNA. 57 ΡΕ1735348

Exemplo 2 - Expressão e purificação dos fra gmentos Fab solúveis.

Os plasmídeos que contêm os genes que codificam o 11F8 Fab foram utilizados para transformar um hospedeiro não supressor de E. coli HB2151. A expressão dos fragmentos de Fab em HB2151 foi induzida cultivando as células em meio 2YTA contendo 1 mM de isopropil-l-tio-p-D-galactopiranósido (IPTG, Sigma) a 30 °C. Foi preparado um extracto periplás-mico das células ressuspendendo o sedimento das células em Tris a 25 mM (pH 7,5) contendo 20% (p/v) de sacarose, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, e 1 mM de PMSF, seguido pela incubação a 4 °C com agitação moderada durante 1 h. Após a centrifugação, a proteína Fab solúvel foi purificada a partir do sobrenadante através de cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de Proteína G, seguindo o protocolo do fabricante (Amersham Pharmacia Biotech).

Exemplo 3 - Construção de Anticorpos IgGl Anti-EGFR Humano O Fab anti-EGFR humano foi manipulado num IgGl humano completo. Um candidato Fab seleccionado, C11F8, foi identificado a partir da biblioteca de apresentação em fagos de Fab narve humanos com elevada afinidade de ligação a, e actividade de bloqueamento de ligando de EFGR humano (ErbB). As sequências de DNA que codificam as regiões variáveis dos genes das cadeias leve e pesada do Fab 11F8 58 ΡΕ1735348 (SEQ ID NO: 15) foram obtidas (SEQ ID NO:7) por amplificação por PCR e clonados num vector de expressão contendo os domínios constantes de IgGl humano utilizando o sistema de expressão de glutamina sintase de Lonza Biologies, Inc. A amplificação por PCR foi efectuada em dois passos utilizando o Expand PCR kit (Boehringer Mannheim, Inc.) de acordo com as especificações do fabricante e os iniciadores listados na Tabela 3.

TABELA 3 - Iniciadores de Amplificação por PCR

Iniciador Sequência de Nucleótidos SEQ ID _NO: C11F8HF 5'TCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGAA-3' 20

Cl 1F8HR 5' -CGAGCTAGCGCTTGAGACGGTGACCAGGGTG-3' 21

Cl1F8LF 5'-TCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGATGACACA-3' 22 C11F8LR 5'-CGATCTAGAACTCACGTTTGATCTCCGCCTTGGTC-3' 23 OSIF 5'-GAGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGC-3' 24

Resumidamente, os produtos de PCR das cadeias leve e pesada foram amplificados utilizando 25 ng de DNA de plasmídeo do Fab de C11F8 como molde e o par dos iniciadores directos e reversos para as cadeias pesada (C11F8HF e C11F8HR) e leve (C11F8LF e C11F8LR) em reacções de 50 pL em Expand Buffer System #3 sob as seguintes condições de ciclos na Tabela 4: 59 ΡΕ1735348 TABELA 4 1 ciclo 94 °C 2 minutos 5 ciclos 0 O 20 segundos O o 00 2 minutos co o O 20 segundos 20 ciclos 0 O 20 segundos 65 °C 60 segundos Oh co 0 O 2 minutos 1 ciclo O 0 LO hO 5 minutos

Os produtos de PCR resultantes adicionam uma sequência de 57 pares de bases à extremidade 5' dos genes de imunoglobulina que codificam uma sequência sinal do gene da cadeia pesada de murganho de 19 aminoácidos (MGWSCIILFLNATATGVHS, SEQ ID NO:25), que permite o processamento eficiente da imunoglobulina e secreção. Para a eficiente iniciação de tradução de genes em células de mamifero, uma sequência de consenso "Kozak" (J. Mol. Biol. 196:947) foi adicionada por amplificação da cadeia pesada e leve numa reacção de PCR secundária utilizando o iniciador directo, OSIF em combinação com CH11F8HR ou C11F8LR respectivamente. Este produto de PCR também proporciona um sitio de endonuclease de restrição 5' Hind III para clonagem do produto amplificado no vector de expressão adequado, 60 ΡΕ1735348 O fragmento da cadeia pesada HindIII-Nhel purificado a partir do gel de agarose foi clonado num vector dirigido por um promotor CMV, pDFc (Figura 1 A) para produzir uma região codificante contígua de cDNA da sequência de DNA da região variável e constante. Um fragmento de cadeia leve HindiII-XbaI foi clonado num segundo vector dirigido pelo promotor CMV, pl2.1L (Figura IB). A construção resultante contém um intrão único que separa as regiões variáveis leve e constante kapa, que é eficientemente separado do transcrito de RNA nascente. Os plasmideos recombinantes foram transformados em E. coli competentes e isolados de plasmideo seleccionados foram pesquisados para co-expressão transiente das cadeias pesada e leve em células COS.

Exemplo 4 - Expressão dos Anticorpos IgGl Humanos Anti-EGFR

Para transfecção estável, um único vector plasmidico foi produzido por clonagem do fragmento Not I-Sal I da cassete de expressão de cadeia pesada contendo o promotor CMV no vector pl2.1L contendo a cadeia leve. O vector plasmidico resultante, pGS-llF8 foi mapeado por restrição (ver, Figura 1C) . A análise por digestão por restrição foi apresentada na Figura 2.

A linha de células recombinantes utilizada para a produção do anticorpo monoclonal 11F8 é derivada da linha de células de mieloma de murino não secretora, NSO 61 ΡΕ1735348 (referida por Barnes et al., Cytotechnology 32:109 (2000)). A linha de células NSO foi obtida de Lonza Biologies, Inc. (Slough, Berkshire, UK). A linha de células de mieloma, NSO foi transfec-tada com plasmídeo, pGS-llF8 via electroporação utilizando o BioRad Gene Pulser II, a uma voltagem de 250 V com uma capacitância de 400 pFd e uma constante de tempo observada de 9,0 msec. As células electroporadas foram ressuspensas em DMEM (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) contendo 10% de soro de vitela fetal dialisado, dFCS (HyClone, Logan, UT) e 2 mM de glutamina (InVitrogen/Life Technologies, Paisley, PA). Foram semeados 50 pL de células ressuspensas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 000-10 000 células por poço. Os transfectantes positivos para a glutamina sintetase (GS) foram seleccionados por adição de meio DMEM sem glutamina contendo 10% de dFCS, suplementado com 1 x GS (JRH Biosciences, Inc.) 24-h pós-transfecção. As células foram cultivadas durante 2-4 semanas a 37 °C, 5% de CO2 para permitir o crescimento e expansão de colónias antes do rastreio dos clones que expressam o anticorpo.

Os clones que expressavam anticorpo anti-EGFR foram pesquisados utilizando uma ELISA baseada no anti-Fc humano com peroxidase de rábano (gama) e a detecção foi efectuada a A50nm. Os clones positivos foram expandidos e retestados ao longo de 3-5 dias de período de cultivo. Os positivos fortes (produção de anticorpo de 25 pL/mg ou mais) foram expandidos para análise posterior. Com base no 62 ΡΕ1735348 resultado da produção de anticorpo em contínuo de 249 pg/mL, o Clone #34 foi seleccionado para subclonagem por diluição limitante e reavaliado. 0 clone 34-5 foi seleccionado com base em níveis de produção consistentes, comparáveis a ou melhores do que os da linha de células parental (produção em descontínuo = 310 pg/mL, alimentação em descontínuo = 0,75 - 0,8 g/L) . O clone #34-5-3 foi isolado após uma segunda ronda de subclonagem e a análise mostrou que o clone #34-5-3 produz um nível elevado de anticorpo (produção em descontínuo = 324 pg/mL, alimentação em descontínuo-= 1,0 - 1,2 g/L). outra caracterização deste clone foi realizada nos exemplos que se seguem.

Exemplo 5 - Ligação In Vitro de Anticorpos a EGFR.

Os anticorpos foram pesquisados numa ELISA de estado sólido comparando as características de ligação de IMC-11F8 e IMC-C225. Uma placa de microtitulação de noventa e seis poços foi revestida durante a noite com 1 pg/mL em tampão carbonato a 4 °C. As placas foram bloqueadas com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) suplementado com 10% de soro de vitelo recém-nascido durante uma hora a 37 °C. Várias quantidades de IMC-11F8 ou IMC-C225 foram adicionadas às placas e incubadas à temperatura ambiente por mais 60 minutos, seguidos por lavagem com PBS. Foi adicionado anticorpo anti-Fc humano de murganho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) e incubou-se durante mais 60 minutos à temperatura ambiente, seguido por extensa 63 ΡΕ1735348 lavagem com PBS. A placa foi depois incubada com substrato de HRP durante 30 sec. - 2 min. e a reacção parou com 0,1 M de H2S04. As placas foram lidas utilizando um leitor de ELISA a DO450 nm. A Figura 3 apresenta a ligação dos anticorpos IMC-11F8 e OC225 a EGFR. Ambos, IMC-11F8 e C-C225, exibem ligação comparável a EGFR.

Exemplo 6 - Cinética da Ligação de Anticorpos

Anti-EGFR

As cinéticas de ligação dos anticorpos IMC-11F8 e IgG C-C225 e seus respectivos fragmentos Fab foram medidos utilizando um sensor BIAcore (Pharmacia Biosensor). A proteina de fusão EGFR-ΑΡ foi imobilizada num chip sensor e os anticorpos IMC-11F8 e IMC-C225 solúveis foram injectados a concentrações variando de 1,5 nM a 100 nM. Os sensorgramas foram obtidos a cada concentração e foram analisados com BIA Evaluation 2.0, um programa para determinar as constantes de velocidade, kon e k0. A constante de afinidade, Kd, foi calculada a partir da proporção das constantes de velocidade, k0ff/k0n.

As cinéticas de ligação dos anticorpos anti-EGFR da presente invenção são ilustradas na Tabela 5. Esta mostra que ambos os anticorpos IgG têm cinéticas de ligação a EGFR comparáveis. ΡΕ1735348 64 TABELA 5

Anticorpo Formato kon (105 M-V'1) koff (10 4s 2) Kd (nM) IMC-11F8 Fab 22,9 ± 9, 9 36,7 ± 8,5 1,78 ± 0,5 IMC-11F8 IgG -hl 00 \—1 7,7 5,8 ± 2,2 0,32 ± 0,06 IMC-C225 Fab 23,1 ± co 11,7 ± 3,4 0,53 ± 0,17 IMC-C225 IgG 21,3 ± 7,3 5,4 ± 1,0 0,3 ± 0,2

Os resultados representam a média ± DP de pelo menos três determinações em separado.

Exemplo 7 - Especificidade dos Anticorpos para

EGFR A ligação do anticorpo a EGFR foi avaliada por um ensaio de competição com 125I-EGF. As células HT29 foram semeadas a 2 x 104 células por poço em placas COSTAR™ de 24 poços (Fisher Scientific, U.S.A.) em meio de McCoy 5a suplementado com 1,5 mM de L-glutamina, 10% de CS e antibióticos a 37 °C. A monocamada de células foi depois incubada à temperatura ambiente durante 1 hora com várias concentrações de EGF não marcado, 11F8 ou IMC-C225 que foram misturadas com várias quantidades de EGF marcado com I. As células foram lavadas com PBS frio e a radioacti-vidade associada às células foi medida num contador gama. A Figura 4 apresenta a inibição da ligação de 125I-EGF a EGFR em células HT29. Em concentrações entre 10 a 65 ΡΕ1735348 100 ηΜ, ο IMC-11F8 é tão eficiente como o IMC-C225 na inibição da ligação de 125I-EGF a EGFR em células HT29. Ambos os anticorpos são melhores a competir para a ligação do que EGF, o ligando natural de EGFR. Foram observados resultados semelhantes para a inibição da ligação de 125I-EGF a EGFR em células A431.

Exemplo 8 - Activação de EGFR

Resumidamente, foi efectuado um ensaio de activação de receptor de cinase (ensaio KIRA), ou ensaio de fosforilação, utilizando células BxPC3 ou A431. As células foram primeiro cultivadas a 90% confluência em DME suplementado com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glucose, 10% de CS, a 37 °C. Antes da experiência, as células foram mantidas sem alimento 24 h em DME suplementado com 0,5% de CS. Para avaliar os efeitos dos anticorpos, IMC-11F8, IMC-C225 e IMC-1C11 na activação de EGFR induzida por EGF, várias concentrações de anticorpos foram pré-ligadas à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguidas por estimulação com EGF a 8 ng/mL por mais 15 minutos. Após estimulação, as monocamadas de células foram lavadas com PBS arrefecido em gelo contendo 1 mM de ortovanadato de sódio. As células foram lisadas em tampão de lise [20 mM de Tric-HCl, pH 7,4, 1% de Triton X-100, 137 mM de NaCl, 10% de glicerol, 10 mM de EDTA, 2 mM de ortovanadato de sódio, 100 mM de NaF, 100 mM de pirofosfato de sódio, 5 mM de 66 ΡΕ1735348 PEFABLOC® SC (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indiana-polis, IN) , 100 pg de aprotinina e 100 pg/mL leupeptina] e centrifugadas a 14 000 x g durante 10 minutos. Os lisados de células clarificados foram adicionados a poços de placas de 96 poços revestidas com anticorpo policlonal anti-EGFR. As placas foram lavadas para remover proteínas ligadas não especificamente e o nível de fosforilação de EGFR foi avaliado pela adição de anticorpo anti-fosfotirosina. Depois de extensa lavagem, a quantidade de anticorpo anti-fosfotirosina ligada foi medida utilizando um leitor de ELISA a DO450 nm.

Os resultados mostram um decréscimo acentuado na fosforilação de EGFR pelo anticorpo IMC-11F8 em ambas as células BxPC3 (Figura 5) e A431 (Figura 6) testadas em comparação com anticorpo de controlo, IMC-1C11. A inibição de fosforilação EGFR estimulada por EGF foi depois avaliada por análise de transferência de Western do EGFR imunoprecipitado. As células A431 foram pré-ligadas com anticorpos seguidos por estimulação com EGF como se descreve a seguir. Foi utilizado um anticorpo de controlo que se liga a EGFR mas não inibe fosforilação de EGFR. A proteína (EGFR) foi imunoprecipitada a partir de lisados clarificados utilizando anticorpo policlonal anti-EGFR seguido por esferas de Proteína A Sepharose. As esferas ligadas foram depois lavadas uma vez com 0,2% de Triton X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 67 ΡΕ1735348 2 mM de EDTA (Tampão A) , duas vezes com Tampão A contendo 500 mM de NaCl e duas vezes com Tris-HCl, pH 8,0. As esferas drenadas foram misturadas com 30 pL de tampão de aplicação 2 X SDS, fervidas e o sobrenadante foi sujeito a SDS-PAGE. Após separação de proteinas por electroforese, as bandas de proteína foram transferidas para filtros de nitrocelulose para análise de Transferência de Western. Os filtros foram bloqueados durante a noite em tampão de bloqueamento, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl (TBS) contendo 5% de albumina de soro bovino e 10% de leite em pó magro. Para detectar o receptor fosforilado, as transferências foram pesquisadas com um anticorpo anti-fosfotirosina em tampão de bloqueamento durante 1 hora à temperatura ambiente. As transferências foram depois lavadas extensamente com 0,5 x TBS contendo 0,1% de Tween-20 (TBS-T) e incubadas com anti-IgG de murganho de cabra conjugado com HRP (Amersham, Little Chalfont, U.K.). As transferências foram lavadas com TBS e incubadas durante 1 minuto com um reagente de quimiluminescência (ECL, Amersham, Little Chalfont, U.K.). Anti-fosfotirosina que reagiu com proteínas fosforiladas foi detectada por exposição a um filme de detecção de luminescência de levado desempenho (Hyperfilm-ECL, Amersham, Little Chalfont, U.K.) durante 0,5 a 10 minutos. A análise de transferência de Western na Figura 7A mostra que o IMC-11F8, como o IMC-C225, inibe a fosforilação de EGFR. Nem as células tratadas com o 68 ΡΕ1735348 anticorpo para EGF nem com o anticorpo controlo inibiram completamente a fosforilação de EGFR. A Figura 7B mostra que a síntese de EGFR não é inibida com a adição de anticorpos às células. A Figura 8 mostra que a fosforilação de EGFR é inibida por IMC-11F8. Mais do que 70% de inibição foi observada para três linhas de células de tumor de diferentes origens (A431, BxPC3, HT-29) na menor concentração de anticorpo testada (0,8 nM). 0 efeito de IMC-11F8 numa das moléculas de sinalização principais a jusante de EGFR, cinases MAP p44/p42, foi também examinado. 0 IMC-11F8 bloqueou a fosforilação p44/42 das quinases MAP após estimulação por EGF em células A431, BxPC3 e HT-29 de uma forma dependente da dose (Fig. 4) .

Exemplo 9 - Inibição de Proliferação de Células 0 Ensaio de Proliferação de Células MTT é medido colorimetricamente como resultado da redução do tetrazólio amarelo, MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-feniltetrazólio) por células metabolicamente activas num produto formazan intracelular púrpura, que pode ser solubi-lizado e quantificado por meios espectrofotométricos. Resumidamente, as células DiFi foram cultivadas durante a noite em DMEM-10% de CS. Os anticorpos, IMC-11F8, IMC-C225 ou IMC-1C11 foram adicionados a poços em triplicado e incubados durante mais 72 horas a 37 °C, 5% de CO2 · Para 69 ΡΕ1735348 medir o crescimento das células, foi adicionada uma alíquo-ta de 20 pL de corante tetrazólio a cada poço e as células foram incubadas durante 3 horas a 37 °C. Quando o precipitado púrpura ficou claramente visível sob um microscópio, as células foram lisadas por adição de 100 pL de reagente detergente. A absorvência do produto formazan foi medida a DO570 nm como uma quantificação da proliferação.

Como apresentado na Figura 9, ao contrário do anticorpo de controlo IMC-1C11, o IMC-11F8 é tão potente como inibidor de proliferação de células como o IMC-C225.

Exemplo 10 - Actividade de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo-(ADCC)

Um método de avaliar a morte celular é através de um ensaio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo ou ADCC, que geralmente utiliza o radioisótopo 51Cr. As células alvo marcadas com 51Cr foram misturadas com anticorpo e o grau de morte foi avaliado pela libertação de 51Cr. Resumidamente, aproximadamente 3 x 106 células DiFi foram ressuspensas em 0,5 pL de meio de cultura e foi adicionado 0,5 mCi de Na51CrC>4. A mistura foi incubada durante 1 h a 37 °C com agitação ocasional. As células foram então lavadas três vezes com meio de cultura frio. As células marcadas foram depois ressuspensas em 100 pL de meio de cultura contendo várias concentrações de anticorpos anti-EGFR (IMC-11F8 ou IMC-C225) e incubadas durante 30 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas três vezes 70 ΡΕ1735348 com meio de cultura por centrifugação. Foi adicionado complemento de coelho e as células tratadas foram depois incubadas a 37 °C durante 1 h. Foram depois adicionados 50 pL de meio frio e centrifugados. Os sobrenadantes foram depois removidos e a radioactividade libertada pelas células no sobrenadante foi medida num contador gama. A libertação máxima de radioactividade foi obtida por adição de 1% de Triton X às células alvo. A percentagem de citotoxicidade foi calculada como cpm experimental libertada menos cpm de ruido de fundo vezes 100%, que é depois dividido pelo cpm máximo libertado menos o cpm de ruido de fundo. A Figura 10 apresenta a morte celular mediada por IMC-11F8 e TMC-C225 (ou ERBITUX™) através da activação da actividade de Citotoxicidade Celular Dependente do Anticorpo ou ADCC).

Exemplo 11 - Inibição In Vivo de Crescimento de Células de Tumor em Murganhos

Foram concebidos estudos anti-tumor in vivo para determinar se o IMC-11F8 bloqueava o crescimento de células tumorais num modelo de xenoenxerto. Murganhos atímicos (nu/nu; Charles River Lab, Wilmington, MA) foram injectados subcutaneamente com 1-2 milhões de células A431 ou BxPC-3 no flanco. Foi administrado intraperitonealmente anticorpo anti-EGFR (IMC-11F8 e IMC-C225) ou anticorpo de controlo a 1 mg/dose ou 0,3 mg/dose, três vezes por semana. O tamanho 71 ΡΕ1735348 do tumor foi medido pelo menos três vezes por semana com um paquímetro e o volume do tumor foi calculado (Ver, e.g. Baselga et al., J Natl. Câncer Inst. (1993) 85:1327-1333) A Figura 11 apresenta a actividade anti-tumor de IMC-11F8 no modelo de xenoenxerto A431. A uma dose de 1 mg (Figura 11, painel da direita, o IMC-11F8 é tão eficaz como IMC-C225 (CETUXIMAB) na supressão ou inibição do crescimento do tumor em comparação com os animais de controlo, a uma dose baixa de 0,3 mg, a progressão do crescimento do tumor é retardada. Do mesmo modo, a Figura 12 mostra 0 efeito de IMC-11F8 e de IMC-C225 num segundo modelo de tumor (xenoenxerto BxPC-3). A cinética de crescimento do tumor BxPC3 é semelhante à observada no modelo de tumor A431. Um nivel de dose de 1,0 mg/murganho/injecção de IMC-11F8 levou a 6 regressões de tumor em 8 animais portadores de A413, e 5 regressões de tumor em 8 murganhos portadores de BxPC3. A coloração por imuno-histoquimica das secções de xenoenxerto A431 e BxPC3 revelaram que o tratamento com IMC-11F8 reduziu marcadamente a densidade das células de tumor e aumentou a área de residuos necróticos acelulares nos tumores (Fig. 13) . Além, disso, o IMC-11F8 reduziu a percentagem de células positivas Ki-67 ao longo de toda a secção do tumor, indicando uma redução na proliferação de células nos tumores (Fig. 13). 72 ΡΕ1735348

Exemplo 12 - Terapia de Combinação com IMC-11F8

Os murganhos sem pêlo portadores de xenoenxertos de tumor colorrectal humano, GEO, DLD-1, ou HT-29, de aproximadamente 200-300 mm3 foram tratados por injecção interperitoneal de IMC-11F8 duas vezes por semana a 0,3 mg ou 1.0 mg/injecção, isolado ou em combinação com irinotecan (CPT-11) numa dose de 100 mg/kg uma vez por semana. Os tamanhos de tumor foram medidos duas vezes por semana. O tratamento com IMC-11F8 a 0,3 mg ou 1,0 mg/mur-ganho/injecção inibiu significativamente o crescimento de todos os três xenoenxertos colorrectais (GEO, DLD-1, ou HT-29; Fig. 14A-C). Quando administrado aos murganhos portadores de xenoenxertos GEO em combinação com CPT-11, o IMC-11F8 aumentou significativamente a inibição de crescimento do tumor observada com CPT-11 isolado (Fig. 14A; p<0,01 para ambas as doses de IMC-11F8). Além disso, enquanto o CPT-11 isolado não causou regresses de tumor neste modelo, 4 de 10 e 9 de 10 regressões de tumor foram conseguidas quando CPT-11 foi combinado com IMC-11F8 a 0,3 mg ou 1,0 mg/murganho/injecção, respectivamente (p=0,004 e p<0,0001, respectivamente). Foram observados efeitos combinatórios anti-tumor em dois outros xenoenxertos, DLD-1 (Fig. 14B) e HT-29 (Fig. 14C) com significância estatística equivalente na regressão de tumor no grupo da dose maior de anticorpo (1,0 mg) . A Fig. 14D ilustra o aumento significativo no número de regressões de tumor observadas quando CPT-11 é 73 ΡΕ1735348 combinado com IMC-11F8 nestes três modelos de xenoenxertos de carcinoma colorrectal.

Exemplo 13 - Farmacocinética de IMC-11F8 A farmacocinética de IMC- 11 F8 foi estudada em macacos cinomólogos e comparados com a farmacocinética de IMC-C225. Um estudo farmacocinético de uma dose única a 20,5 mg/kg de MC-11F8 radiomarcado com 125I e IMC-C225 foram separadamente injectados intravenosamente em macacos e sangue foi drenado no dia para determinar o nivel de anticorpo que é retido no plasma do animal. A Tabela 6 proporciona uma comparação farmacocinética de IMC-11F8 e IMC-C225 em macacos cinomólogos. TABELA 6 IMC-11F8 IMC-C225 Cmax (mg/L) 1213 1161 Tmax (hrs) 0,75 0,117 Tl/2 (hrs) 116 117 AUC (mg*hr/L) 115400 97871 Cl (mL/hr) 0,736 0, 636

Entende-se e espera-se que as variações nos princípios da invenção aqui revelada possam ser concretizados por um especialista na técnica. ΡΕ1735348 - 74 -

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Eli Lilly

<12 0> ANTICORPO HUMANO ANTI-RECEPTOR DO FACTOR DE CRESCIMENTO EPIDÉRMICO <130> X18508 <140> PCT/US2005/009583 <141> 2005-03-21 <150> US 60/554555 <151> 2004-03-19 <160> 25 <17 0> Patentln versão 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtggtgatt actactggag t <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 ser 1 Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser 5 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tacatctatt açagtgggag catcgactat <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 ryr lie Tyr ' Tyr Ser Gly ser Tfor 1 S <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens 21 48 10 15 75 ΡΕ1735348 <400> 5

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Lisboa, 17 de Junho de 2012

Claims (26)

1. ΡΕ1735348 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano isolado anti-EGFR ou fragmento de anticorpo compreendendo a região variável da cadeia pesada SEQ ID NO: 8 e região variável de cadeia leve de SEQ ID NO:16.
2. 2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo da reivindicação 1 ou reivindicação 2, que inibe a ligação do ligando EGF a EGFR.
3. 3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo da reivindicação 1 ou reivindicação 2, que neutraliza EGFR.
4. 4. Fragmento de anticorpo de qualquer das reivindicações 1 a 3, que é seleccionado a partir do grupo que consiste num anticorpo de cadeia única, um Fab, uma cadeia única Fv, um diacorpo, e a triacorpo.
5. 5. Conjugado do anticorpo ou fragmento de anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores.
6. 6. Conjugado da reivindicação 5, que compreende um agente antineoplásico, uma unidade alvo ou uma unidade repórter.
7. 7. Ácido nucleico isolado que codifica para a sequência de aminoácidos de qualquer dos anticorpos ou 2 ΡΕ1735348 fragmentos de anticorpo de qualquer das reivindicações anteriores.
8. 8. Vector de expressão compreendendo o poli-nucleótido da reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira compreendendo o vector de expressão da reivindicação 8.
10. 10. Quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo como definido por qualquer das reivindicações 1 a 4 ou um seu conjugado para utilização como medicamento para inibir o crescimento de tumor num mamifero.
11. 11. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o medicamento é para inibir o crescimento de tumor num mamífero, em que o tumor expressa EGFR.
12. 12. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o medicamento é para inibir o crescimento de tumor num mamífero, em que o tumor sobre-expressa EGFR.
13. 13. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o medicamento é para inibir o crescimento de tumor num mamífero, em que o tumor é um tumor primário. 3 ΡΕ1735348
14. 14. Anticorpo da zação como um medicamento, inibir o crescimento de turno é um tumor metastático.
15. 15. Anticorpo da zação como um medicamento, inibir o crescimento de turno é um tumor refractário. reivindicação 10 para utili-em que o medicamento é para : num mamífero, em que o tumor reivindicação 10 para utili-em que o medicamento é para : num mamífero, em que o tumor
16. 16. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o medicamento é para inibir o crescimento de tumor num mamífero, em que o tumor é um tumor vascularizado.
17. 17. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o medicamento é para inibir o crescimento de tumor num mamífero, em que o tumor é seleccionado a partir de tumor colorrectal, de um tumor da cabeça ou pescoço, um tumor pancreático, um tumor de pulmão, um tumor da mama, um carcinoma de célula renal, e um glioblastoma.
18. 18. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é administrado em combinação com um agente antineoplásico. 4 ΡΕ1735348
19. 19. Anticorpo da reivindicação 18, em que o agente antineoplásico é um agente quimioterapêutico.
20. 20. Anticorpo da reivindicação 18, em que o agente antineoplásico é irinotecan (CPT-11) .
21. 21. Anticorpo da reivindicação 18, em que o agente antineoplásico é radiação.
22. 22. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo é administrado com um antagonista de EGFR.
23. 23. Anticorpo da reivindicação 22, em que o antagonista de EGFR é um antagonista de EGFR intracelular.
24. 24. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista do receptor do factor endotelial vascular (VEGFR).
25. 25. Anticorpo da reivindicação 10 para utilização como um medicamento, que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista do receptor do factor de crescimento tipo insulina (IGFR). 5 ΡΕ1735348
26. 26. Anticorpo da reivindicação 11 para utilização como um medicamento, que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista do receptor do factor de crescimento tipo insulina (IGFR). Lisboa, 17 de Junho de 2012