JP6103832B2 - Ｅｇｆｒ結合性ペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor : EGFR）に特異的に結合するペプチド及びこれを含有する医薬に関する。
EGFRは、細胞の増殖及び成長を制御する上皮成長因子を認識し、シグナル伝達を行う受容体であり、細胞増殖、分化、移動などの細胞機能に重要な役割を担っている。EGFRのシグナルとしては細胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制し、腫瘍細胞の運動性と血管新生を増長する。EGFRは腫瘍特異的であり、非小細胞肺がん（NSCLC）や乳癌、頭頸部癌（SCCHN）、胃癌、大腸癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、脾臓、卵巣癌を含むヒトの上皮組織の腫瘍において広い範囲で、その強発現が観察されている。
これらの発見により、癌治療において薬物と遺伝子の受容体を介したデリバリーシステムにとって重要なターゲットとしてEGFRが位置づけられている。しかし、EGFRのリガンドであるEGFは強い有糸分裂と血管新生力を有しており、それゆえ、EGFのような基質を探すことは重要である。容易に拡散するようなアドバンテージや低い免疫原性を持ち、遺伝子輸送ベクターを容易に取り込む能力を持ったリガンドペプチドは、放射性核種、サイトカイン、化学薬物、腫瘍に対する治療遺伝子を選択的にデリバリーするための標的部として研究されている。最近、ファージライブラリースクリーニングを利用してペプチドリガンドを取得したという研究結果が報告されている（非特許文献１）。
これらの発見により、癌治療において薬物と遺伝子の受容体を介したデリバリーシステムにとって重要なターゲットとしてEGFRが位置づけられている。しかし、EGFRのリガンドであるEGFは強い有糸分裂と血管新生力を有しており、それゆえ、EGFのような基質を探すことは重要である。容易に拡散するようなアドバンテージや低い免疫原性を持ち、遺伝子輸送ベクターを容易に取り込む能力を持ったリガンドペプチドは、放射性核種、サイトカイン、化学薬物、腫瘍に対する治療遺伝子を選択的にデリバリーするための標的部として研究されている。最近、ファージライブラリースクリーニングを利用してペプチドリガンドを取得したという研究結果が報告されている（非特許文献１）。
一方、受容体タンパクのEGFRファミリーメンバーは癌細胞のBest-characterized targetsの1つである。HER1、ErbB1として知られるEGFR、ErbB2もしくはneuとして知られるHER2、HER3（ErbB3）、HER4（ErbB4）を含むEGFファミリーは細胞生存、分化、増殖において重要である。特に、EGFRシグナルが増大すると、発癌性形質転換とアソシエートし、結果として自立した細胞生存、腫瘍侵襲、血管新生、転移が誘導される。EGFRの発現と強発現は多様な腫瘍タイプで報告されており、３分の１の上皮癌においてEGFRの発現レベルが高いことが知られており、EGFR強発現はしばしば予後不良と関連する。また、EGFRは癌の発生と発達に関係していることが知られているので、EGFRを標的とした化学療法薬の開発がなされている。EGFRの阻害剤の１つであるセツキシマブ（IMC-C225、アービタックス）は転移性大腸癌の治療薬としてFDAで認可されているモノクローナル抗体である。セツキシマブはキメラヒト−マウス抗体であり、EGFRの細胞外ドメインを標的としている。セツキシマブはEGFRと本来のリガンドであるEGFやTGF-αよりも強い親和性で結合し、EGFRの結合を競合阻害し、活性を抑制する（非特許文献２、特許文献１）。他にヒト型抗EGFRモノクローナル抗体として、パニツムマブ（ベクティビックス）がある（特許文献２）。
The FASEB Journal, 2005;19, 1978-1985
Journal of the National Cancer Institute, 2005; 97 (22), 1663-1670
しかしながら、既に報告されたEGFRのペプチドリガンドは、EGFRに対する結合性が不十分であり、また抗EGFR抗体については分子量が大きく、投与手段が限定される、副作用の発生等の問題がある。
従って、本発明の課題は、EGFRに特異的かつ高親和性で結合する新たな物質及びそれを含む医薬を提供することにある。
そこで本発明者は、ファージディスプレイ法を用いてEGFRに特異的に結合するペプチドを提示するファージを探索したところ、特定のアミノ酸配列を有するペプチドがリコンビナントヒトEGFRタンパク質に特異的に結合すること、及びこのペプチド又はその標識体を用いてEGFRを発現する細胞や組織を特異的に検出できることを見出した。さらに、該ペプチド又はその標識体がEGFRとEGFとの結合を競合的に阻害することから、該ペプチド又はその標識体は癌治療薬としても有用であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、少なくとも下記式(1)、(2)又は(3)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数12〜50のペプチドを提供するものである。
X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His (1)
（式(1)中、X1はTrp又はPheを示し、
X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、
X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示し、
X5はTrp、Phe又はTyrを示し、
X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示し、
X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示す）
X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、
X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示し、
X5はTrp、Phe又はTyrを示し、
X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示し、
X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示す）
Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (2)
（式(2)中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示し、
X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X13はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
X15はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示す。）
X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X13はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
X15はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示す。）
Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27 (3)
（式(3)中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
X22：Glu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X23：Tyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示し、
X24：Val、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
X25：Asp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X26：Ile、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示し、
X27：His、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示す。）
X22：Glu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X23：Tyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示し、
X24：Val、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
X25：Asp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
X26：Ile、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示し、
X27：His、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示す。）
また、本発明は、上記ペプチド又はその標識体を含有する医薬及び診断薬を提供するものである。
本発明のペプチドは、EGFRに特異的かつ強い結合性を有することから、このペプチド又はその標識体は、EGFRを発現する細胞又は組織、特に種々の癌細胞又は癌組織の検出薬、すなわち癌の診断薬として有用である。また、本発明のペプチドは、EGFRとEGFとの結合を競合的に阻害することから、EGFRを発現する癌治療薬として有用である。
本発明のペプチドは、少なくとも下記式(1)、(2）又は(3)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数12〜50のペプチドである。
X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His (1)
Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (2)
Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27 (3)
Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (2)
Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27 (3)
上記式(1)中、X1はTrp又はPheを示す。X2はLeu、Met、Ile又はValを示す。X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示すが、Ser、Ala、Thr、Gly又はAsnが好ましく、Ser又はAlaがより好ましい。X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示すが、Leu、Met、Ile、Val又はAlaが好ましく、Leu又はAlaがより好ましい。X5はTrp、Phe又はTyrを示すが、Trp又はPheが好ましく、Trpがより好ましい。X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示すが、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Gln又はAlaがより好ましい。X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示すが、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asn又はAlaがより好ましい。X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示すが、Ala、Gly、Ser又はThrが好ましく、Alaがより好ましい。
式（１）のペプチドのうち、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X4がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X5がTrp又はPheであり、X6がGln、Asn又はAlaであり、X7がAsn、Gln又はAlaであり、X8がAla、Gly、Ser又はThrである、アミノ酸数12〜50のペプチドが好ましい。
また、式(1)のペプチドのうち、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer又はAlaであり、X4がLeu又はAlaであり、X5がTrpであり、X6がGln又はAlaであり、X7がAsn又はAlaであり、X8がAlaである、アミノ酸数12〜50のペプチドがより好ましい。
上記式(2)中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示すが、Leu、Met、Ile、Val又はAlaが好ましく、Leu又はAlaがより好ましい。X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Glu、Asp、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Glu又はAlaがより好ましい。X13はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示すが、Val、Ala、Leu又はIleが好ましく、Val又はAlaがより好ましい。X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示すが、Ser、Ala、Thr、Gly又はAsnが好ましく、Ser又はAlaがより好ましい。X15はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示すが、Pro、Val、Ile又はAlaが好ましく、Pro又はAlaがより好ましい。X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示すが、Pro、Val、Ile又はAlaが好ましく、Pro又はAlaがより好ましい。X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Asp、Glu、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asp又はAlaがより好ましい。
式(2)のペプチドのうち、X11がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X12がGlu、Asp、Gln、Asn又はAlaであり、X13がVal、Ala、Leu又はIleであり、X14がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X15がPro、Val、Ile又はAlaであり、X16がPro、Val、Ile又はAlaであり、X17がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaである、アミノ酸数12〜50のペプチドが好ましい。
式(2)のペプチドのうち、X11がLeu又はAlaであり、X12がGlu又はAlaであり、X13がVal又はAlaであり、X14がSer又はAlaであり、X15がPro又はAlaであり、X16がPro又はAlaであり、X17がAsp又はAlaである、アミノ酸数12〜50のペプチドがより好ましい。
上記式(3)中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示すが、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Gln又はAlaがより好ましい。X22はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Glu、Asp、Gln又はAlaが好ましく、Glu又はAlaがより好ましい。X23はTyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示すが、Tyr、Phe、Trp、His又はAlaが好ましく、Tyr又はAlaがより好ましい。X24はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示すが、Val、Ala、Leu又はIleが好ましく、Val又はAlaがより好ましい。X25はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Asp、Glu、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asp又はAlaがより好ましい。X26はIle、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示すが、Ile、Val、Leu、Met又はAlaが好ましく、Ile又はAlaがより好ましい。
X27はHis、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示すが、His、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaが好ましく、His又はAlaがより好ましい。
X27はHis、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示すが、His、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaが好ましく、His又はAlaがより好ましい。
式(3)のペプチドのうち、X21がGln、Asn又はAlaであり、X22がGlu、Asp、Gln又はAlaであり、X23がTyr、Phe、Trp、His又はAlaであり、X24がVal、Ala、Leu又はIleであり、X25がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaであり、X26がIle、Val、Leu、Met又はAlaであり、X27がHis、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaであるアミノ酸数12〜50のペプチド。
式(3)のペプチドのうち、X21がGln又はAlaであり、X22がGlu又はAlaであり、X23がTyr又はAlaであり、X24がVal又はAlaであり、X25がAsp又はAlaであり、X26がIle又はAlaであり、X27がHis又はAlaである、アミノ酸数12〜50のペプチドがより好ましい。
また、本発明ペプチドのアミノ酸数としては、12〜50であるが、当該アミノ酸数の上限は40が好ましく、30がより好ましく、20がさらに好ましく、18が特に好ましい。なお、式(1)、(2)又は(3)のN末側又はC末側のいずれに任意のアミノ酸が付加していてもよい。
本発明ペプチドのX1〜X8、X11〜X17及びX21〜X27の置換は、後記実施例記載の結合性試験結果、保存的置換及び半保存的置換であれば同様の活性を示すことに基づくものである。ここで典型的な保存的置換及び半保存的置換を表１に示す。
本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列をコードするDNAを用いる組み換え技術によって製造することもできるが、有機合成化学的ペプチド合成法によって製造することができる。有機合成化学的ペプチド合成法は、一般的な官能基の保護、カルボキシル基の活性化、ペプチド結合の形成、保護基の脱保護の手段によって行われる。これらの反応は固相法で行うのが好ましい。
本発明のペプチドのうち、配列番号2、4及び7で示されるペプチド(I-1010、I-1012及びI-1015)は、ランダムなペプチド配列を提示させたファージライブラリーからファージディスプレイ法によってEGFRと結合性を有するペプチドをスクリーニングすることにより選択することができる。ファージディスプレイ法に用いられるファージとしてはD12が好ましい。ファージライブラリーからEGFRと強く結合するものを選択するには、ファージ集団をEGFRとインキュベートし、EGFRに結合しなかったファージを洗い流した後に、結合したファージを回収する。回収したファージがどのような配列のペプチドを提示しているかは、ファージゲノムの該当部分をシークエンスすればよい。EGFRとペプチドの相互作用がそれほど強いものではない場合には、弱い結合力を持つファージがバックグラウンドとしてつきまとってしまう。そこで、結合→洗浄→回収の一連の流れの後に、再度大腸菌に感染させ、二次ライブラリーを調製し、このライブラリーを用いて再度一連の操作を繰り返すパニング操作を行う。パニングを繰り返していくことによって得られるライブラリーの中には、EGFRに高い結合能力を持ったファージの数が増えてくる。このようにして、目的とするEGFRと強い結合性を有するファージが選択できる。
本発明のペプチドは、EGFRに特異的に結合する。従って、本発明のペプチド又はその標識体は、EGFR又はEGFRを発現している細胞若しくは組織を検出するための試薬として有用である。ここで本発明のペプチドの標識体としては、EGFRに結合したペプチドを検出し得る標識体であればよく、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン等）、常磁性原子等が挙げられる。これらの標識体のうち、蛍光標識やポジトロン核種による標識は、例えば大腸癌等のEGFRが発現している癌細胞又は癌組織を検出するうえでより好ましい。
本発明のペプチドの標識体は、EGFRが発現している癌診断、例えば早期癌診断に有用である。例えば、癌組織の存在の有無の確認を目的とした診断においては、対象部位に例えば上記蛍光標識ペプチドを散布又は注射などの手段により接触させた後、洗浄処理により余剰な蛍光成分を除去した後、該当部位に励起光を照射し、蛍光染色された組織の有無を肉眼的又は顕微鏡的に確認することができる。
より好ましい形態としては、本発明の蛍光標識ペプチドを蛍光造影剤として内視鏡による癌診断に用いることである、例えば、蛍光標識ペプチドを経内視鏡的に散布などの手段により組織に接触させた後、洗浄処理を行い、内視鏡光源により励起光を該当部に照射し、蛍光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればよい。これにより早期癌の発見診断に使用可能となるばかりではなく、通常内視鏡的に病変と疑われる部位を染色し、拡大蛍光観察をすることにより蛍光の有無による病変部位と非病変部位の境界を判別することにも使用可能となる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルオレセインのための励起光を照射できる蛍光内視鏡又は、加えて拡大能を有する共焦点内視鏡が好ましい。
また、修飾する蛍光色素はフルオレセインだけではなく、たとえばシアニン系化合物など励起波長の異なる蛍光色素を用いてもよい。蛍光剤としてインドシアニングリーンなどのシアニン系化合物を用いた場合、フルオレセインと比較して励起波長がさらに長波長側にシフトするため、より深部の病変の確認に有効である。またポジトロン核種を本発明ペプチドに修飾させた場合、PETやSPECTなどにより検出可能となる。また、ガドリニウムを本発明ペプチドに修飾させた場合、MRIにより検出可能である。これにより主に消化器などといった経内視鏡的に到達可能な部位の癌のみならず、全身の癌病変において、本発明ペプチドが利用可能となる。
より好ましい形態としては、本発明の蛍光標識ペプチドを蛍光造影剤として内視鏡による癌診断に用いることである、例えば、蛍光標識ペプチドを経内視鏡的に散布などの手段により組織に接触させた後、洗浄処理を行い、内視鏡光源により励起光を該当部に照射し、蛍光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればよい。これにより早期癌の発見診断に使用可能となるばかりではなく、通常内視鏡的に病変と疑われる部位を染色し、拡大蛍光観察をすることにより蛍光の有無による病変部位と非病変部位の境界を判別することにも使用可能となる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルオレセインのための励起光を照射できる蛍光内視鏡又は、加えて拡大能を有する共焦点内視鏡が好ましい。
また、修飾する蛍光色素はフルオレセインだけではなく、たとえばシアニン系化合物など励起波長の異なる蛍光色素を用いてもよい。蛍光剤としてインドシアニングリーンなどのシアニン系化合物を用いた場合、フルオレセインと比較して励起波長がさらに長波長側にシフトするため、より深部の病変の確認に有効である。またポジトロン核種を本発明ペプチドに修飾させた場合、PETやSPECTなどにより検出可能となる。また、ガドリニウムを本発明ペプチドに修飾させた場合、MRIにより検出可能である。これにより主に消化器などといった経内視鏡的に到達可能な部位の癌のみならず、全身の癌病変において、本発明ペプチドが利用可能となる。
また、本発明ペプチド又はその標識体はEGFRとEGFとの結合を競合的に阻害することから、上記のような癌細胞検出、癌診断だけでなく、癌の治療にも用いることができる。
本発明ペプチドが検出、診断又は治療可能な細胞又は組織としては、EGFRを発現している細胞又は組織であればよく、例えば癌細胞又は癌組織、具体的には、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌（SCCHN）、大腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌等が挙げられる。
本発明のペプチド又はその標識体を癌検出薬、癌診断薬、癌治療薬として用いる場合、本発明ペプチド又はその標識体はそのまま用いることもできるが、薬学的に許容される担体とともに各種投与形態に適した組成物とすることができる。該組成物としては、注射用剤、散布用剤、経口投与用剤、経直腸用剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、各種緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等が挙げられる。
本発明のペプチド又はその標識体を癌治療薬として用いる場合の投与量は、症状、体重等によっても異なるが、通常成人1日あたり0.1mg〜1000mgが好ましい。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１（ファージディスプレイ）
［手順］
１．パニング実験-ラウンド1
96wellプレートに5μg/mLのRecombinant human IgG1 Fc(rhIgG1、R&D Systems)、Recombinant human EGFR/Fc Chimera（rhEGFR、R&D Systems）を個別に200μLずつ添加し（1μg/well）、4℃、一晩、静置インキュベートした（プレートへの固相化）。ウェル内の非固相タンパクを除去し、Blocking buffer（5mg/mL BSA（牛血清アルブミン）/TBS（50mM Tris-HCl/150mM NaCl））を300μL/well添加し、37℃、1時間、静置インキュベートし、その後、0.1％TBST(0.1%Tween20/TBS）200μL/wellで3回洗浄した。
rhIgG1個相化ウェルに0.1%TBSTを100μL添加し、D12ファージライブラリー（1×1013PFU/mL）、C7Cファージライブラリー（2×1013PFU/mL）をそれぞれ10μL添加した。ここで、rhEGFR固相化ウェルには、乾燥防止のため0.1%TBSTを200μl添加した。
＊PFU：plaque forming units（プラーク形成単位）
［手順］
１．パニング実験-ラウンド1
96wellプレートに5μg/mLのRecombinant human IgG1 Fc(rhIgG1、R&D Systems)、Recombinant human EGFR/Fc Chimera（rhEGFR、R&D Systems）を個別に200μLずつ添加し（1μg/well）、4℃、一晩、静置インキュベートした（プレートへの固相化）。ウェル内の非固相タンパクを除去し、Blocking buffer（5mg/mL BSA（牛血清アルブミン）/TBS（50mM Tris-HCl/150mM NaCl））を300μL/well添加し、37℃、1時間、静置インキュベートし、その後、0.1％TBST(0.1%Tween20/TBS）200μL/wellで3回洗浄した。
rhIgG1個相化ウェルに0.1%TBSTを100μL添加し、D12ファージライブラリー（1×1013PFU/mL）、C7Cファージライブラリー（2×1013PFU/mL）をそれぞれ10μL添加した。ここで、rhEGFR固相化ウェルには、乾燥防止のため0.1%TBSTを200μl添加した。
＊PFU：plaque forming units（プラーク形成単位）
ペプチド提示ファージライブラリー（NEW ENGLAND BioLabs Inc.）は、2種類利用し、D12ライブラリーは、12残基の直線状ランダムペプチドを提示しており、2.7×109種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。C7Cライブラリーは、7残基の環状ランダムペプチドを提示しており、1.2×109種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。
室温、1時間、シーソーを用いて振とうインキュベートし、rhEGFRのFc部位に結合すると予想されるペプチド提示ファージ（以下ファージと略す）を除去する目的で、固相化したrhIgG1に結合させた後、ファージ溶液を除去し、0.1%TBST 200μL/wellで10回洗浄した。1mg/mL BSA/0.2M Glycine-HCl(pH2.2)100μL添加し、室温、10分、振とうインキュベートしファージを溶出させた。溶出液を回収し、回収溶液に１M Tris-HCl(pH9.1)を15μL添加することで中和した。回収した溶出液の一部を用いてファージの力価を測定した。
２．回収ファージの増幅
１の操作で得られたファージ溶出液をLB20mL中で対数増殖中のER2738菌[F'laclqΔ(lacZ) M15 proA+B+zzf::Tn10 (TetR)/fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hs-dMS-mcrB) 5 (rk -mk -McrBC-)]に感染させ、振とう培養機を用いて、37℃で激しく攪拌しながら、4時間30分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を50mL遠心チューブに移し、上記サンプルを高速冷却遠心機を用いて、4℃、10分、8,900×gで遠心した。遠心後、ER2738菌を除去する目的で、上清を新しいチューブに回収した。回収ファージ溶液に3.6mL（1/5量）のPEG/NaCl（20% Polyehtylene glycol 6,000、2.5M NaCl）溶液を添加し、ミキサーでよく攪拌して、4℃、16時間、インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを回収するために、高速冷却遠心機で4℃、10分、8,900×gで遠心して、上清を除去した。上清を完全除去する目的で、もう一度遠心し、上清を除去した。沈殿ファージに、氷冷TBS 1mLを加え、懸濁し、マイクロチューブに移した。ファージ懸濁液を、高速冷却遠心機を用いて、4℃、5分、16,000×gで遠心した。上清を別のチューブに回収し、懸濁されない残渣を取り除き、回収溶液に、200μLのPEG/NaClを加えて、ミキサーで攪拌した。上記溶液を氷上、1時間、インキュベートしファージを沈殿させた。溶液を高速冷却遠心機で4℃、10分、16,000×g遠心してファージを沈殿させ上清を除去した。この遠心工程を再び行い、上清を完全に除去した。得られたファージ沈殿に、200μLの0.02%NaN3（Wako）/TBSを加え、完全に懸濁させ、高速冷却遠心機で、4℃、5分、16,000×g、遠心し、上清を回収することで懸濁されなかった残渣を除去した。回収ファージ濃縮液の力価を測定した。
１の操作で得られたファージ溶出液をLB20mL中で対数増殖中のER2738菌[F'laclqΔ(lacZ) M15 proA+B+zzf::Tn10 (TetR)/fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hs-dMS-mcrB) 5 (rk -mk -McrBC-)]に感染させ、振とう培養機を用いて、37℃で激しく攪拌しながら、4時間30分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を50mL遠心チューブに移し、上記サンプルを高速冷却遠心機を用いて、4℃、10分、8,900×gで遠心した。遠心後、ER2738菌を除去する目的で、上清を新しいチューブに回収した。回収ファージ溶液に3.6mL（1/5量）のPEG/NaCl（20% Polyehtylene glycol 6,000、2.5M NaCl）溶液を添加し、ミキサーでよく攪拌して、4℃、16時間、インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを回収するために、高速冷却遠心機で4℃、10分、8,900×gで遠心して、上清を除去した。上清を完全除去する目的で、もう一度遠心し、上清を除去した。沈殿ファージに、氷冷TBS 1mLを加え、懸濁し、マイクロチューブに移した。ファージ懸濁液を、高速冷却遠心機を用いて、4℃、5分、16,000×gで遠心した。上清を別のチューブに回収し、懸濁されない残渣を取り除き、回収溶液に、200μLのPEG/NaClを加えて、ミキサーで攪拌した。上記溶液を氷上、1時間、インキュベートしファージを沈殿させた。溶液を高速冷却遠心機で4℃、10分、16,000×g遠心してファージを沈殿させ上清を除去した。この遠心工程を再び行い、上清を完全に除去した。得られたファージ沈殿に、200μLの0.02%NaN3（Wako）/TBSを加え、完全に懸濁させ、高速冷却遠心機で、4℃、5分、16,000×g、遠心し、上清を回収することで懸濁されなかった残渣を除去した。回収ファージ濃縮液の力価を測定した。
３．パニング実験-ラウンド２、３
濃縮ファージ溶液を用いて、2、及び3回目のパニング実験を実施した。2回目のパニング実験において、1回目の操作と異なる点は添加ファージ量を2×1011PFU/well、洗浄液を0.3%TBST(0.3%Tween20/TBS)にしたことである。3回目のパニング実験では、1回目の操作と異なる点は添加ファージ量を2×1011PFU/well、洗浄液を0.5%TBST(0.5%Tween20/TBS)にしたことである。
濃縮ファージ溶液を用いて、2、及び3回目のパニング実験を実施した。2回目のパニング実験において、1回目の操作と異なる点は添加ファージ量を2×1011PFU/well、洗浄液を0.3%TBST(0.3%Tween20/TBS)にしたことである。3回目のパニング実験では、1回目の操作と異なる点は添加ファージ量を2×1011PFU/well、洗浄液を0.5%TBST(0.5%Tween20/TBS)にしたことである。
４．力価測定
LB 3mL内でER2738菌を対数増殖期（OD600； 〜0.5）となるまで培養し、ER2738培養液200μLに、必要濃度となるよう希釈したファージ液を10μL添加した。この混合溶液をミキサーでよく攪拌し、室温、5分間インキュベートした後、溶解したトップアガー溶液4mLと混合させ、LB/IPTG/Xgalプレート上に播種した。
ファージ感染大腸菌播種プレートを37℃、16時間、インキュベートした後、得られた青色プラークの数をカウントした。ファージ希釈倍率を用いて、ファージ数を算出した（カウントプラーク数×希釈倍率/10μL）。
LB 3mL内でER2738菌を対数増殖期（OD600； 〜0.5）となるまで培養し、ER2738培養液200μLに、必要濃度となるよう希釈したファージ液を10μL添加した。この混合溶液をミキサーでよく攪拌し、室温、5分間インキュベートした後、溶解したトップアガー溶液4mLと混合させ、LB/IPTG/Xgalプレート上に播種した。
ファージ感染大腸菌播種プレートを37℃、16時間、インキュベートした後、得られた青色プラークの数をカウントした。ファージ希釈倍率を用いて、ファージ数を算出した（カウントプラーク数×希釈倍率/10μL）。
［結果］
ファージライブラリーを用いた実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力値）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力値）の比の値の変化について、D12ライブラリーの結果を図1に、C7Cライブラリーの結果を図2に示す。
D12ライブラリーを利用した、rhEGFR標的パニング実験を3ラウンドまで進めた結果、アウトプット力価/インプット力価比を比較したところ、3ラウンドは2ラウンドの130倍程度の増加が観察された。したがって、rhEGFR特異結合性を示すファージがセレクションされたことが予想された。
C7Cライブラリーを利用した、rhEGFR標的パニング実験も3ランドまで進めたが、アウトプット力価/インプット力価比の増加は観察されなかった。
ファージライブラリーを用いた実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力値）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力値）の比の値の変化について、D12ライブラリーの結果を図1に、C7Cライブラリーの結果を図2に示す。
D12ライブラリーを利用した、rhEGFR標的パニング実験を3ラウンドまで進めた結果、アウトプット力価/インプット力価比を比較したところ、3ラウンドは2ラウンドの130倍程度の増加が観察された。したがって、rhEGFR特異結合性を示すファージがセレクションされたことが予想された。
C7Cライブラリーを利用した、rhEGFR標的パニング実験も3ランドまで進めたが、アウトプット力価/インプット力価比の増加は観察されなかった。
実施例２（シークエンス解析）
［手順］
D12ライブラリーを用いたパニング実験の3ラウンドで得られたファージを、常法（Phage Display A Laboratory Manual, Cole Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、提示ペプチド領域から96残基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー[-96ｇIII シーケンシングプライマー（5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'） (配列番号1)、S1259A、NEB]を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した。反応産物の泳動とデータ解析には、キャピラリーシーケンサーを用いた。
［手順］
D12ライブラリーを用いたパニング実験の3ラウンドで得られたファージを、常法（Phage Display A Laboratory Manual, Cole Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、提示ペプチド領域から96残基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー[-96ｇIII シーケンシングプライマー（5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'） (配列番号1)、S1259A、NEB]を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した。反応産物の泳動とデータ解析には、キャピラリーシーケンサーを用いた。
［結果］
決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列を図3に示す。
この中で、得られたI-1010ファージの提示するペプチド配列（配列番号2）は、3ラウンドで調べた15個のクローンの中に同じ配列を持つクローンが6個であった（40%）。また、I-1012ファージ（配列番号4）とI-1015ファージ（配列番号7）は2クローンが得られた（13.3%）。I-1011ファージ（配列番号3）、I-1013ファージ（配列番号5）、I-1014ファージ（配列番号6）、I-1016ファージ（配列番号8）、I-1017ファージ（配列番号9）は各1クローンしか得られなかった。
したがって、パニングの回数が進むにつれ、I-1010ファージ、I-1012ファージ、及びI-1015ファージがセレクションされていることが明らかとなった。特定のファージクローンがセレクションされている理由として、そのファージクローンが標的分子に対し強い結合性を示していることが挙げられる。
決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列を図3に示す。
この中で、得られたI-1010ファージの提示するペプチド配列（配列番号2）は、3ラウンドで調べた15個のクローンの中に同じ配列を持つクローンが6個であった（40%）。また、I-1012ファージ（配列番号4）とI-1015ファージ（配列番号7）は2クローンが得られた（13.3%）。I-1011ファージ（配列番号3）、I-1013ファージ（配列番号5）、I-1014ファージ（配列番号6）、I-1016ファージ（配列番号8）、I-1017ファージ（配列番号9）は各1クローンしか得られなかった。
したがって、パニングの回数が進むにつれ、I-1010ファージ、I-1012ファージ、及びI-1015ファージがセレクションされていることが明らかとなった。特定のファージクローンがセレクションされている理由として、そのファージクローンが標的分子に対し強い結合性を示していることが挙げられる。
実施例３（ファージ結合性試験（タンパク固相化条件−１））
［手順］
標的タンパクであるrhEGFRとrhEGFRに標識されたFc部位であるrhIgG1、標準タンパクとしてBSAを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、I-1015ファージ、及びM13KE（ペプチド非提示ファージ））を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクであるrhEGFRとrhEGFRに標識されたFc部位であるrhIgG1、標準タンパクとしてBSAを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、I-1015ファージ、及びM13KE（ペプチド非提示ファージ））を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
I-1010、I-1012、I-1015を用いた固相化法による結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比を図4に示す。
I-1010ファージのrhEGFRへの結合性は、Fc部であるrhIgG1より1665倍高く、標準タンパクであるBSAよりも3809倍高いことが明らかとなった。
I-1012ファージのrhEGFRへの結合性は、Fc部であるrhIgG1より3420倍高く、標準タンパクであるBSAよりも3095倍高いことが明らかとなった。
I-1015ファージのrhEGFRの結合性は、Fc部であるrhIgG1より19018倍高く、標準タンパクであるBSAよりも13964倍高いことが明らかとなった。
M13KEファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
I-1010、I-1012、I-1015を用いた固相化法による結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比を図4に示す。
I-1010ファージのrhEGFRへの結合性は、Fc部であるrhIgG1より1665倍高く、標準タンパクであるBSAよりも3809倍高いことが明らかとなった。
I-1012ファージのrhEGFRへの結合性は、Fc部であるrhIgG1より3420倍高く、標準タンパクであるBSAよりも3095倍高いことが明らかとなった。
I-1015ファージのrhEGFRの結合性は、Fc部であるrhIgG1より19018倍高く、標準タンパクであるBSAよりも13964倍高いことが明らかとなった。
M13KEファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
図4の結果からI-1010、I-1012、及びI-1015ファージは、タンパク固相化条件においてrhEGFRに特異的に結合することが明らかとなった。
また、I-1010ファージとM13KEファージのrhEGFRへの結合性を比較すると、I-1010ファージの方が52235倍高い事が明らかとなった。また、M13KEファージと比較してrhEGFRに対する結合はI-1012ファージでは16301倍、I-1015ファージでは86592倍高かった。この結果より、I-1010、I-1012、及びI-1015ファージの提示するペプチド配列がrhEGFRとの結合に関与していることが示された。
また、I-1010ファージとM13KEファージのrhEGFRへの結合性を比較すると、I-1010ファージの方が52235倍高い事が明らかとなった。また、M13KEファージと比較してrhEGFRに対する結合はI-1012ファージでは16301倍、I-1015ファージでは86592倍高かった。この結果より、I-1010、I-1012、及びI-1015ファージの提示するペプチド配列がrhEGFRとの結合に関与していることが示された。
実施例４（ファージ結合性試験（タンパク固相化条件−２））
［手順］
標的タンパクであるrhEGFR、EGFRと同じErbBファミリーに属するHER2タンパクとしてRecombinant human ErbB2（rhErbB2、PROSPEC）、細胞外タンパクの1つであるIGF-1RタンパクとしてRecombinant human IGF-1R , CF（rhIGF-1R、R&D Systems）を1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、I-1015ファージ、及びM13KE（ペプチド非提示ファージ））を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクであるrhEGFR、EGFRと同じErbBファミリーに属するHER2タンパクとしてRecombinant human ErbB2（rhErbB2、PROSPEC）、細胞外タンパクの1つであるIGF-1RタンパクとしてRecombinant human IGF-1R , CF（rhIGF-1R、R&D Systems）を1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、I-1015ファージ、及びM13KE（ペプチド非提示ファージ））を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
I-1010、I-1012、及びI-1015ファージを用いた固相化法による結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比を図5に示す。比較としてのM13KEファージの結果も図5に示す。
I-1010ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より1764倍高く、rhIGF-1Rよりも2827倍高いことが明らかとなった。
I-1012ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より1581倍高く、rhIGF-1Rよりも4345倍高いことが明らかとなった。
I-1015ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より4745倍高く、rhIGF-1Rよりも7708倍高いことが明らかとなった。
M13KEファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
I-1010、I-1012、及びI-1015ファージを用いた固相化法による結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比を図5に示す。比較としてのM13KEファージの結果も図5に示す。
I-1010ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より1764倍高く、rhIGF-1Rよりも2827倍高いことが明らかとなった。
I-1012ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より1581倍高く、rhIGF-1Rよりも4345倍高いことが明らかとなった。
I-1015ファージのrhEGFRへの結合性は、rhErbB2より4745倍高く、rhIGF-1Rよりも7708倍高いことが明らかとなった。
M13KEファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
図5の結果からI-1010、I-1012、及びI-1015ファージは、タンパク固相化条件においてrhEGFRに特異的に結合することが明らかとなった。
また、I-1010ファージとM13KEファージのrhEGFRへの結合性を比較すると、I-1010ファージの方が34439倍高い事が明らかとなった。また、M13KEファージと比較してrhEGFRに対する結合はI-1012ファージでは13934倍、I-1015ファージは30806倍高かった。この結果より、I-1010、I-1012、及びI-1015ファージの提示するペプチド配列がrhEGFRとの結合に関与していることが示された。
また、I-1010ファージとM13KEファージのrhEGFRへの結合性を比較すると、I-1010ファージの方が34439倍高い事が明らかとなった。また、M13KEファージと比較してrhEGFRに対する結合はI-1012ファージでは13934倍、I-1015ファージは30806倍高かった。この結果より、I-1010、I-1012、及びI-1015ファージの提示するペプチド配列がrhEGFRとの結合に関与していることが示された。
実施例5（競合試験）
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルにI-1010増幅ファージ液を1×1010 PFUになるように添加し、次に、I-1010ファージ提示ペプチド（配列番号2）を人工的に合成した合成ペプチドPep055（純度89%, HPLCグレード, 北海道システムサイエンス）を各濃度に、rhEGFRとの結合には無関係な合成ペプチドPep018（GAASRTYLHELI：配列番号10）（純度90%＜, HPLCグレード, AnyGen, Korea）を各濃度になるように添加し、ピペッティングで混合した。どちらも添加せず、I-1010ファージのみの反応をコントロールとした。I-1010ファージペプチド同様に、I-1012ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号4）Pep056（純度86.7%, HPLCグレード,北海道システムサイエンス）、I-1015ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号7）Pep057（純度83.7%＜, HPLCグレード, 北海道システムサイエンス）も用いた。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した。その後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルにI-1010増幅ファージ液を1×1010 PFUになるように添加し、次に、I-1010ファージ提示ペプチド（配列番号2）を人工的に合成した合成ペプチドPep055（純度89%, HPLCグレード, 北海道システムサイエンス）を各濃度に、rhEGFRとの結合には無関係な合成ペプチドPep018（GAASRTYLHELI：配列番号10）（純度90%＜, HPLCグレード, AnyGen, Korea）を各濃度になるように添加し、ピペッティングで混合した。どちらも添加せず、I-1010ファージのみの反応をコントロールとした。I-1010ファージペプチド同様に、I-1012ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号4）Pep056（純度86.7%, HPLCグレード,北海道システムサイエンス）、I-1015ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号7）Pep057（純度83.7%＜, HPLCグレード, 北海道システムサイエンス）も用いた。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した。その後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
I-1010ファージとPep055の競合試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化、及びI-1010ファージとPep018の結果を図6に示す。
図6からわかるように、I-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比がPep055を1μM添加したときを境に右肩下がりに落ちており、I-1010ファージのrhEGFRへの結合を濃度依存的に阻害していることが明らかとなった。しかし、Pep018を添加した場合のI-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比は、Pep018を100μMの濃度で添加しても高い値を保っている。
Pep018は、I-1010ファージとEGFRの結合に全く関与しないため高濃度でもI-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比の低下が見られなかったが、I-1010ファージの提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドPep055は、濃度依存的にI-1010ファージとEGFRの結合を阻害していることが明らかとなった。この結果から、I-1010ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、I-1010ファージがrhEGFRに結合するのと同じ部位に結合していると考えられる。
I-1010ファージとPep055の競合試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化、及びI-1010ファージとPep018の結果を図6に示す。
図6からわかるように、I-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比がPep055を1μM添加したときを境に右肩下がりに落ちており、I-1010ファージのrhEGFRへの結合を濃度依存的に阻害していることが明らかとなった。しかし、Pep018を添加した場合のI-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比は、Pep018を100μMの濃度で添加しても高い値を保っている。
Pep018は、I-1010ファージとEGFRの結合に全く関与しないため高濃度でもI-1010ファージのインプット力価/アウトプット力価比の低下が見られなかったが、I-1010ファージの提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドPep055は、濃度依存的にI-1010ファージとEGFRの結合を阻害していることが明らかとなった。この結果から、I-1010ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、I-1010ファージがrhEGFRに結合するのと同じ部位に結合していると考えられる。
同様に、図7、図8で示される結果より、I-1012、及びI-1015ファージが提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドPep056、及びPep057も各ファージのEGFRとの結合を阻害していることが明らかとなった。したがって、I-1012、及びI-1015ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、各ファージがEGFRに結合するのと同じ部位に結合していると考えられる。
実施例6（アラニン置換ファージ作製）
［手順］
１．部位特異的変異誘発
KOD-Plus-Mutagenesis kit（SMK-101、TOYOBO）を用いて、M13KEファージのペプチド提示部分のアミノ酸をアラニンに置換したファージの作製を行った。提示ペプチド配列のヌクレオチド配列に所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを受託合成した（日本遺伝子研究所）。合成プライマーは、HPLCにて精製した、脱塩オリゴヌクレオチドである。今回合成したプライマーは、長さ18〜34bpであり、GC含量が50-60%となるよう設計した。今回使用したKOD-Plus-Mutagenesis Kitでは、PCR産物のセルフライゲーションと同時にリン酸化を行うことができるので、プライマーのリン酸化はしていない。鋳型プラスミドDNAはI-1010、I-1012、及びI-1015ファージ感染ER2738菌より、QIAGEN Plasmid kit（QIAGEN）を用いて精製した。
鋳型プラスミドDNA、プライマー、dNTPs、KOD - plus-を用いて、[94℃、2分]→｛[98℃、10秒]→[68℃、7.5分]｝×8サイクル→[4℃、Hold]条件でPCRを実施した。PCR反応はサーマルサイクラー（PCR Thermal Cycler Dice、TAKARA）を利用した。PCR反応条件は増幅サイズを基に設定した。
DpnI処理により鋳型プラスミドの消化を行ない、T4 Polynucleotide Kinase処理によりPCR産物のセルフライゲーションを行った。
［手順］
１．部位特異的変異誘発
KOD-Plus-Mutagenesis kit（SMK-101、TOYOBO）を用いて、M13KEファージのペプチド提示部分のアミノ酸をアラニンに置換したファージの作製を行った。提示ペプチド配列のヌクレオチド配列に所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを受託合成した（日本遺伝子研究所）。合成プライマーは、HPLCにて精製した、脱塩オリゴヌクレオチドである。今回合成したプライマーは、長さ18〜34bpであり、GC含量が50-60%となるよう設計した。今回使用したKOD-Plus-Mutagenesis Kitでは、PCR産物のセルフライゲーションと同時にリン酸化を行うことができるので、プライマーのリン酸化はしていない。鋳型プラスミドDNAはI-1010、I-1012、及びI-1015ファージ感染ER2738菌より、QIAGEN Plasmid kit（QIAGEN）を用いて精製した。
鋳型プラスミドDNA、プライマー、dNTPs、KOD - plus-を用いて、[94℃、2分]→｛[98℃、10秒]→[68℃、7.5分]｝×8サイクル→[4℃、Hold]条件でPCRを実施した。PCR反応はサーマルサイクラー（PCR Thermal Cycler Dice、TAKARA）を利用した。PCR反応条件は増幅サイズを基に設定した。
DpnI処理により鋳型プラスミドの消化を行ない、T4 Polynucleotide Kinase処理によりPCR産物のセルフライゲーションを行った。
２．形質転換
XL-1Blueコンピテント細胞を氷上で溶解した。60μLのXL-1Blueコンピテント細胞に対し、Self-ligation処理済み溶液を15μL添加し、混合した。氷上、30分間、インキュベートした後、42℃、90秒間、ヒートブロック上でインキュベートし、氷上で2分間、インキュベートした。15mLコニカルチューブ内で、ER2738菌のO/Nカルチャー100μLに、上記XL-Blue菌を１μL添加し、混合した。15mLコニカルチューブ内に、XL-1Blue菌を74μL入れた。上記それぞれのサンプルに、トップアガーを4mL添加し、ボルテックスで混合した。上記大腸菌サンプルをLB/IPTG/Xgalプレート上に播種し、37℃、16時間、インキュベートした。
XL-1Blueコンピテント細胞を氷上で溶解した。60μLのXL-1Blueコンピテント細胞に対し、Self-ligation処理済み溶液を15μL添加し、混合した。氷上、30分間、インキュベートした後、42℃、90秒間、ヒートブロック上でインキュベートし、氷上で2分間、インキュベートした。15mLコニカルチューブ内で、ER2738菌のO/Nカルチャー100μLに、上記XL-Blue菌を１μL添加し、混合した。15mLコニカルチューブ内に、XL-1Blue菌を74μL入れた。上記それぞれのサンプルに、トップアガーを4mL添加し、ボルテックスで混合した。上記大腸菌サンプルをLB/IPTG/Xgalプレート上に播種し、37℃、16時間、インキュベートした。
３．変異体のシークエンス解析
得られたLB/IPTG/Xgalプレート上の青プラークを、常法に（Phage Display A Laboratory Mnual, Cole Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。
得られたLB/IPTG/Xgalプレート上の青プラークを、常法に（Phage Display A Laboratory Mnual, Cole Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。
［結果］
I-1010ファージについては、図9に示す配列番号11〜21のアラニン置換ファージを得た。
同様に、I-1012ファージについては図10に示す配列番号22〜33のアラニン置換ファージ、I-1015ファージについては図11に示す配列番号34〜45のアラニン置換ファージを得た。
I-1010ファージについては、図9に示す配列番号11〜21のアラニン置換ファージを得た。
同様に、I-1012ファージについては図10に示す配列番号22〜33のアラニン置換ファージ、I-1015ファージについては図11に示す配列番号34〜45のアラニン置換ファージを得た。
実施例7（アラニン置換ファージの結合性試験）
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、及びI-1015ファージ又は実施例6で作製したアラニン置換ファージ）を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（I-1010、I-1012、及びI-1015ファージ又は実施例6で作製したアラニン置換ファージ）を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
アラニン置換ファージの結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化をI-1010ファージについては図12に、I-1012ファージについては図13に、I-1015ファージについては図14に示す。
図12から分かるように、I-1010ファージに比べ結合性が低下したファージは7種存在し、1、7、11番目のW（Trp）、2、12番目のH（His）、3番目のL（Leu）、5番目のD（Asp）をアラニン(Ala)に置換したファージである。
特に、I-1010ファージが提示しているペプチドの1、7番目のW(Trp)、2番目のH(His)、3番目のL(Leu)をアラニン(Ala)で置換したファージの結合性が顕著に低下した。
上記結果より、I-1010ファージとEGFRとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、1、7、11番目のW、2、12番目のH、3番目のL、5番目のDであることが明らかとなった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、1、7番目のW、2番目のH、3番目のLであった。
アラニン置換ファージの結合性試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化をI-1010ファージについては図12に、I-1012ファージについては図13に、I-1015ファージについては図14に示す。
図12から分かるように、I-1010ファージに比べ結合性が低下したファージは7種存在し、1、7、11番目のW（Trp）、2、12番目のH（His）、3番目のL（Leu）、5番目のD（Asp）をアラニン(Ala)に置換したファージである。
特に、I-1010ファージが提示しているペプチドの1、7番目のW(Trp)、2番目のH(His)、3番目のL(Leu)をアラニン(Ala)で置換したファージの結合性が顕著に低下した。
上記結果より、I-1010ファージとEGFRとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、1、7、11番目のW、2、12番目のH、3番目のL、5番目のDであることが明らかとなった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、1、7番目のW、2番目のH、3番目のLであった。
次に、図13よりI-1012ファージに比べ結合性が低下したファージは5種存在し、1番目のF（Phe）、2番目のH(His)、3番目のD(Asp)、4番目のW(Trp)、6番目のP（Pro）をアラニンに置換したファージである。したがって、I-1012ファージとrhEGFRとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、1番目のF、2番目のH、3番目のD、4番目のW、6番目のPであることが明らかとなった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、1番目のF、2番目のH、4番目のWであった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、1番目のF、2番目のH、4番目のWであった。
また、図14よりI-1015ファージに比べ結合性が低下したファージは5種存在し、1番目のL(Leu)、2番目のH(His)、4番目のS（Ser）、6番目のW(Trp)、7番目のM(Met)をアラニンに置換したファージである。特に、I-1015ファージが提示しているペプチドの4番目のS、6番目のWをアラニンで置換したファージの結合性が顕著に低下した。
上記結果より、I-1015ファージとrhEGFRとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、1番目のL、2番目のH、4番目のS、6番目のW、7番目のMであることが明らかとなった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、4番目のS、6番目のWであった。
上記結果より、I-1015ファージとrhEGFRとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、1番目のL、2番目のH、4番目のS、6番目のW、7番目のMであることが明らかとなった。
その中でも、特にrhEGFRとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、4番目のS、6番目のWであった。
実施例8（アミノ酸置換ファージ作製）
［作業手順］
実施例6と同様の手順により、M13KEファージのペプチド提示部分のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したミュータントファージの作製を行った。以下、アラニンスキャンの作業手順を参照とする。
［作業手順］
実施例6と同様の手順により、M13KEファージのペプチド提示部分のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したミュータントファージの作製を行った。以下、アラニンスキャンの作業手順を参照とする。
[結果］
図15に示すペプチドを提示したI-1010アミノ酸置換ファージ（配列番号46〜53）を得た。
図15に示すペプチドを提示したI-1010アミノ酸置換ファージ（配列番号46〜53）を得た。
実施例9（アミノ酸置換ファージの結合性試験）
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking buffer（5mg/mL BSA/TBS）を300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST（0.5% Tween20/TBS）200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycin-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking buffer（5mg/mL BSA/TBS）を300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST（0.5% Tween20/TBS）200μlでウェルを3回洗浄し、最後に0.5%TBSTを100μl添加した。上記ウェルに増幅ファージ液を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で1時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycin-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
[結果]
アミノ酸1個置換ファージの結果
アミノ酸1個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図16に示す。
I-1010ファージの結合性に比べ等倍から1/10倍程度の結合性を示すファージは、1番目のWをFに、3番目のLをM（Met）、I（Ile)、V(Val)、7番目のWをF、Y（Tyr）に置換した場合（配列番号46〜51）の6種類存在した。
アミノ酸1個置換ファージの結果
アミノ酸1個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図16に示す。
I-1010ファージの結合性に比べ等倍から1/10倍程度の結合性を示すファージは、1番目のWをFに、3番目のLをM（Met）、I（Ile)、V(Val)、7番目のWをF、Y（Tyr）に置換した場合（配列番号46〜51）の6種類存在した。
アミノ酸2個置換ファージの結果
図12のアラニン置換ファージの結合性および、図16のアミノ酸1個置換ファージの結合性試験の結果から、I-1010ファージの結合性と比較して変化の低かったアミノ酸残基について、2か所同時に置換を実施した。
アミノ酸2個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図17に示す。
今回実施したアミノ酸2個置換ファージは、1番目のWをFに8番目のQをAに置換したファージ（W1F/Q8A、配列番号52）と、3番目のLをMに8番目のQをAに置換したファージ（L3M/Q8A、配列番号53）であるが、いずれもI-1010ファージの結合性と比較して等倍から1/10倍の結合性を示す結果であった。
図12のアラニン置換ファージの結合性および、図16のアミノ酸1個置換ファージの結合性試験の結果から、I-1010ファージの結合性と比較して変化の低かったアミノ酸残基について、2か所同時に置換を実施した。
アミノ酸2個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図17に示す。
今回実施したアミノ酸2個置換ファージは、1番目のWをFに8番目のQをAに置換したファージ（W1F/Q8A、配列番号52）と、3番目のLをMに8番目のQをAに置換したファージ（L3M/Q8A、配列番号53）であるが、いずれもI-1010ファージの結合性と比較して等倍から1/10倍の結合性を示す結果であった。
実施例10（ウェスタンブロット）
ヒト類表皮癌由来A-431細胞（DSファーマバイオメディカル）とヒト乳腺癌由来MCF7細胞（DSファーマバイオメディカル）を用いて、ウェスタンブロット法によりEGFR発現量を評価した。
その結果、各細胞のEGFR発現量をウェスタンブロットで評価した結果、A-431細胞で高発現していることが明らかとなった（図18）。
ヒト類表皮癌由来A-431細胞（DSファーマバイオメディカル）とヒト乳腺癌由来MCF7細胞（DSファーマバイオメディカル）を用いて、ウェスタンブロット法によりEGFR発現量を評価した。
その結果、各細胞のEGFR発現量をウェスタンブロットで評価した結果、A-431細胞で高発現していることが明らかとなった（図18）。
実施例11（結合性試験(in vitro)）
実施例10より、EGFRタンパクの発現が認められたA-431細胞株を標的として、I-1010ファージの結合性試験を実施した。
実施例10より、EGFRタンパクの発現が認められたA-431細胞株を標的として、I-1010ファージの結合性試験を実施した。
［手順］
6ウェル培養プレートにA-431細胞を40×104cells/wellで播種し、37℃、5%CO2条件で一晩培養した。プレートを4℃で30分間インキュベートした後、各ウェルの培地を除去し、1%BSA/PBS 1mLで2回洗浄処理を行った。I-1010ファージとM13KEファージを力価1×1010PFUとなるように10%FBS培地(増殖培地)1mLに希釈し、各ウェルに添加し、4℃で60分間インキュベートした。反応後、反応液を除去し、1%BSA/PBS 1mLで10回洗浄処理を行い、非結合のファージを除去した。0.05%トリプシン/0.53mM EDTA溶液を100μl添加し、37℃で10分程度インキュベートし、増殖培地を900μl添加し、回収ファージ液とした。各回収ファージ液の力価を測定した。
6ウェル培養プレートにA-431細胞を40×104cells/wellで播種し、37℃、5%CO2条件で一晩培養した。プレートを4℃で30分間インキュベートした後、各ウェルの培地を除去し、1%BSA/PBS 1mLで2回洗浄処理を行った。I-1010ファージとM13KEファージを力価1×1010PFUとなるように10%FBS培地(増殖培地)1mLに希釈し、各ウェルに添加し、4℃で60分間インキュベートした。反応後、反応液を除去し、1%BSA/PBS 1mLで10回洗浄処理を行い、非結合のファージを除去した。0.05%トリプシン/0.53mM EDTA溶液を100μl添加し、37℃で10分程度インキュベートし、増殖培地を900μl添加し、回収ファージ液とした。各回収ファージ液の力価を測定した。
［結果］
図19に回収細胞数を考慮した各ファージのインプット力価とアウトプット力価の比を示す。I-1010ファージの力価比はM13KEファージと比較して45倍高かった。
以上の結果より、I-1010ファージは遺伝子組み換えEGFRタンパクだけでなく、細胞が発現するEGFRに対しても結合性を示した。
図19に回収細胞数を考慮した各ファージのインプット力価とアウトプット力価の比を示す。I-1010ファージの力価比はM13KEファージと比較して45倍高かった。
以上の結果より、I-1010ファージは遺伝子組み換えEGFRタンパクだけでなく、細胞が発現するEGFRに対しても結合性を示した。
実施例12（In vitroイメージング）
［手順］
ガラスボトムディッシュにA-431細胞を20×104 Cells/Dish、MCF7細胞は75×104 Cells/Dish になるように播種し、37℃、CO2条件下で24時間培養した。各種細胞を明示した時間培養後にEGFを100ng/mLとなるよう添加し、6日間培養した。その後、ディッシュの培養液を除去し、37℃の増殖培地1000μLで10回洗浄した。ペプチドのN末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にFITCを標識したペプチド（Pep055-F、Pep032-F（YLPLWRLSESHM（EGFRとの結合に無関係のペプチド）：配列番号54））（純度80.6%, HPLCグレード, AnyGen, Korea）を増殖培地で100μMに調製し、1mL添加して37℃で1時間インキュベートした。染色液を除去し、37℃の増殖培地1mLで3回洗浄し、最後に培地を1mL添加した。観察は、共焦点顕微鏡（Leica SP2）を用い、励起光のレーザー波長は488nmを照射し蛍光観察を行った。
［手順］
ガラスボトムディッシュにA-431細胞を20×104 Cells/Dish、MCF7細胞は75×104 Cells/Dish になるように播種し、37℃、CO2条件下で24時間培養した。各種細胞を明示した時間培養後にEGFを100ng/mLとなるよう添加し、6日間培養した。その後、ディッシュの培養液を除去し、37℃の増殖培地1000μLで10回洗浄した。ペプチドのN末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にFITCを標識したペプチド（Pep055-F、Pep032-F（YLPLWRLSESHM（EGFRとの結合に無関係のペプチド）：配列番号54））（純度80.6%, HPLCグレード, AnyGen, Korea）を増殖培地で100μMに調製し、1mL添加して37℃で1時間インキュベートした。染色液を除去し、37℃の増殖培地1mLで3回洗浄し、最後に培地を1mL添加した。観察は、共焦点顕微鏡（Leica SP2）を用い、励起光のレーザー波長は488nmを照射し蛍光観察を行った。
［結果］
図20に共焦点顕微鏡で観察した、Pep055-FのA-431細胞の染色性を示す。A-431細胞の細胞質が染色されていることが観察された。核は染色されていない。
図21に共焦点顕微鏡で観察した、Pep032-FのA-431細胞の染色性を示す。コントロールペプチドはA-431細胞をほとんど染色していない。
図22に共焦点顕微鏡で観察した、Pep055-FのMCF7細胞の染色性、及び、図23に共焦点顕微鏡で観察した、Pep032-FのMCF7細胞の染色性を示す。
両ペプチドともに、MCF7細胞をほとんど染色しなかった。
上記結果より、A-431細胞で見られたPep055-Fによるドット状の染色は、A-431細胞が発現するEGFRによるものであると考えられ、Pep055-Fは細胞が発現するEGFRに結合していると考えられる。
図20に共焦点顕微鏡で観察した、Pep055-FのA-431細胞の染色性を示す。A-431細胞の細胞質が染色されていることが観察された。核は染色されていない。
図21に共焦点顕微鏡で観察した、Pep032-FのA-431細胞の染色性を示す。コントロールペプチドはA-431細胞をほとんど染色していない。
図22に共焦点顕微鏡で観察した、Pep055-FのMCF7細胞の染色性、及び、図23に共焦点顕微鏡で観察した、Pep032-FのMCF7細胞の染色性を示す。
両ペプチドともに、MCF7細胞をほとんど染色しなかった。
上記結果より、A-431細胞で見られたPep055-Fによるドット状の染色は、A-431細胞が発現するEGFRによるものであると考えられ、Pep055-Fは細胞が発現するEGFRに結合していると考えられる。
実施例13（Recombinant human EGFとI-1010ファージの競合試験）
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄した。0.5%TBSTで各濃度に希釈したEGFRのリガンドタンパクであるRecombinant human EGF（rhEGF、Invitrogen）を100μl添加し、室温で1時間穏やかに振とうさせた。上記ウェルにI-1010ファージ増幅液を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で15分間穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［手順］
標的タンパクrhEGFRを1μg/wellになるように96ウェルマイクロプレートに添加し、4℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Blocking bufferを300μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Blocking bufferを除去後、洗浄液0.5%TBST 200μlでウェルを3回洗浄した。0.5%TBSTで各濃度に希釈したEGFRのリガンドタンパクであるRecombinant human EGF（rhEGF、Invitrogen）を100μl添加し、室温で1時間穏やかに振とうさせた。上記ウェルにI-1010ファージ増幅液を1×1010 PFUになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で15分間穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、0.5%TBST 200μlでウェルを10回洗浄した後、0.2M Glycine-HCl(pH 2.2)をウェルに100μl添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で10分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、1M Tris-HCl(pH 9.1)を15μl添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
rhEGFとI-1010ファージの競合試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化を図24に示す。
rhEGFを添加した場合、添加濃度が増加するにつれ、I-1010ファージのrhEGFRへの結合性が減少した。
上記結果より、I-1010ファージの結合性がrhEGFの添加濃度依存的に減少している事から、rhEGFがI-1010ファージのrhEGFRへの結合を阻害している事が明らかとなった。つまり、I-1010ファージはEGFのEGFRへの結合を阻害できると考えられ、I-1010ファージの提示するペプチドはEGFの阻害剤になりうる。
rhEGFとI-1010ファージの競合試験のインプット力価/アウトプット力価比の値の変化を図24に示す。
rhEGFを添加した場合、添加濃度が増加するにつれ、I-1010ファージのrhEGFRへの結合性が減少した。
上記結果より、I-1010ファージの結合性がrhEGFの添加濃度依存的に減少している事から、rhEGFがI-1010ファージのrhEGFRへの結合を阻害している事が明らかとなった。つまり、I-1010ファージはEGFのEGFRへの結合を阻害できると考えられ、I-1010ファージの提示するペプチドはEGFの阻害剤になりうる。
Claims (6)
- 少なくとも下記式(1)、(2)又は(3)で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数12〜18のペプチド。
X1-His-X2-X3-Asp-X4-Trp-X6-X7-Ala-Trp-His (1)
（式(1)中、X1はTrp又はPheを示し、
X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、
X3はSer又はAlaを示し、
X4はLeu又はAlaを示し、
X6はGln又はAlaを示し、
X7はAsn又はAlaを示す。）
Phe-His-Asp-Trp-Leu-Pro-Glu-X13-X14-X15-X16-Asp (2)
（式(2)中、X 13はVal又はAlaを示し、X14はSer又はAlaを示し、
X15はPro又はAlaを示し、X16はPro又はAlaを示す）
Leu-His-Gln-Ser-Glu-Trp-Met-X23-X24-Asp-X26-X27 (3)
（式(3)中、X23はTyr又はAlaを示し、X24はVal又はAlaを示し、X26はIle又はAlaを示し、X27はHis又はAlaを示す） - EGFR結合性を有する請求項1記載のペプチド。
- 請求項1記載のペプチド又はその標識体を含有する医薬。
- 請求項1記載のペプチド又はその標識体を含有する癌細胞又は癌組織検出薬。
- 請求項1記載のペプチド又はその標識体を含有する癌診断薬。
- 請求項1記載のペプチド又はその標識体を含有する癌治療薬。
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