CN110511269B - 一种与muc4蛋白特异性结合的靶向多肽zp-16在制备药物中的用途 - Google Patents
一种与muc4蛋白特异性结合的靶向多肽zp-16在制备药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP‑16在制备药物中的用途。本发明以特异性高表达于胰腺癌的MUC4蛋白为靶标，利用噬菌体展示肽库技术获得MUC4的亲和靶向多肽ZP‑16，该短肽分子量小，特异性强，生物相容性好，对MUC4蛋白具有高亲和力和靶向性，对MUC4蛋白的结合能力于MUC4抗体相当，克服了现有技术以抗体分子作为靶向剂无法穿透细胞膜的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP-16在制备药物中的用途。
背景技术
胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，每年全球新增病例42万，早期无特定症状或体征，确诊时多已进展到晚期，预后极差，被称为“癌中之王”。统计数据显示：超过90％的胰腺癌为胰腺导管腺癌(PDAC)，近年来发病率和死亡率均呈上升趋势，手术切除率不到20％，化疗、放疗效果也差，整体5年生存率＜6％。早期发现和有效治疗是改变胰腺癌现状的关键，而利用肿瘤标志物进行分子影像检查已被证明是实现肿瘤早期诊断行之有效的途径。
粘蛋白MUC4(mucin4)属于跨膜型黏蛋白家族中的一员，基因位点3q29，MUC4实际分子量范围为550至930kDa，糖基化范围为4650kDa。MUC4以自催化方式在Gly-Asp-Pro-His(GDPH)位点被切割成两个亚基：分子量大且高糖基化的胞外α亚基(500-850kDa)和锚定在细胞膜并延伸胞浆的β亚基(80-90kDa)。MUC4α亚基由血管性血友病因子D型结构域(vWD)、粘附相关结构域(AMOP)、巢蛋白结构域(NIDO)以及16个氨基酸残基重复多达400次且数量可变的串联重复结构域(VNTR)组成。由于MUC4α亚基N端存在数目不等的短串连重复序列，其长度从2415到6433个氨基酸不等，再加上其他序列则共含4378-8626个氨基酸，使其拥有延展的丝状结构，这意味着其胞外区域的长度可达1.22-2.31μm，故MUC4蛋白能将细胞表面的其它分子遮盖，可能干扰整合素和钙粘蛋白介导的细胞间及细胞与基质间的粘附作用，并干扰免疫细胞等对肿瘤细胞的识别和杀伤作用，从而促进细胞转移。MUC4C端能编码MUC4β亚基，β亚基为跨膜部分，结构包含N-糖基化区域(包含2个EGF样结构域，该结构域富含半胱氨酸残基)、1个表皮生长因子(EGF)样结构域、1个疏水跨膜结构域及胞质尾结构。β亚基被认为是癌基因，可作为ErbB2(Her2)的配体引起ErbB2的磷酸化，影响ErbB2信号通路，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤生长。生理条件下，MUC4主要由呼吸、胃肠、泌尿和生殖系统的上皮细胞表达，具有保持水分、润滑、抗粘附及屏障等作用，但在胆囊、胰腺和肝脏中没有发现MUC4。在正常胰腺和胰腺炎症性疾病中无法检测到MUC4，而在胰腺癌早期的导管上皮内瘤变(PanIN)中可检测到MUC4，随着从侵袭性PDAC向转移性PDAC的进展，其表达亦逐渐增加。人类胰腺组织标本的免疫组化分析表明，MUC4表达从PanIN的17％逐渐增加到PDAC的89％。MUC4是胰腺导管腺癌(PDAC)差异表达最大的一种跨膜粘蛋白。另外MUC4解除调控的机制、糖基化的改变、多剪接变异体的存在以及TR表位的多样性也使其成为胰腺癌早期诊断和治疗的理想靶点。
与抗体相比，小分子多肽具有作为分子成像探针所必需的特性：1、因体积小而具有组织扩散能力，血浆清除速度快，能够被肿瘤细胞摄取，而在非靶点位置能快速被清除，背景信号少；2、易于化学合成和优化，制造成本低；3、可以调整结构增加对蛋白酶降解的稳定性并保持低免疫原性；4、部分肿瘤靶向肽还具有穿膜特性，携带的药物能更有效进入癌细胞内发挥治疗作用；5、用化学方法改变肽与成像材料或药物之间的联系相对容易，例如，奥曲肽(octreotide)，一种生长抑素类似物，标记放射物铟-111后，目前正在临床上用于检测神经内分泌肿瘤。噬菌体展示肽库技术已有效筛选出特异性结合肿瘤细胞或肿瘤血管生物标志物的肽，RGD肽就是一个典型例子，通过αvβ3整合素靶向肿瘤血管内皮细胞。另外，Charles筛选出的RK-10多肽，标记上Cy5荧光后，运用直接免疫荧光技术可以检测NSCLC所表达的阻断程序性死亡配体1(PD-L1)。
噬菌体随机展示肽库技术是把随机短肽片段与噬菌体的P3或P8基因的N端进行融合，通过展示技术让随机短肽得以独立表达并具有生物学功能。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具，通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物，起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合，起到生物治疗的作用。利用噬菌体肽库并经过几轮吸附、洗脱、扩增的筛选过程可以得到具有高特异性和高亲和力的多肽。近年来噬菌体肽库技术已广泛应用于肿瘤研究，如癌症的检测、抗原表位分析、肿瘤细胞信号转导、肿瘤药物的研制及肿瘤的基因治疗研究等。
目前，尚没有特异性靶向MUC4的多肽配体被发现。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP-16在制备药物中的用途，该靶向多肽ZP-16以及其荧光成像组合物ZP-16-Cy5，作为高表达MUC4蛋白相关疾病的早期诊断、靶向成像以及治疗系统具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP-16在制备药物中的用途，靶向多肽ZP-16的氨基酸序列为Val-His-Trp-Asp-Phe-Arg-Gln-Trp-Trp-Gln-Pro-Ser(SEQ ID NO.1)，该药物为治疗MUC4蛋白引起的疾病的药物。
进一步地，编码靶向多肽ZP-16的核苷酸序列为：5’-AGAAGGCTGCCACCACTGCCGAAAATCCCAATGCAC-3’(SEQ ID NO.2)。
进一步地，靶向多肽ZP-16能够与MUC4蛋白α链VNTR结构域上的一段氨基酸序特异性结合，该氨基酸具体序列为：GVSLFPYGADAGDLEFVRRTVDFTSPLFKPATGFPLGSSLRDSLYFTDNGQIIFPESDYQIFSYPNPLPTGFTGRDPVALVAPFWDDADFSTGRGTTFYQEYETFYGEHS。
一种含有上述靶向多肽ZP-16的多肽荧光成像组合物ZP-16-Cy5。
一种用于治疗MUC4蛋白引起的疾病的试剂盒，包括上述靶向多肽ZP-16，以及试剂盒中的常规成分。
一种用于治疗MUC4蛋白引起的疾病的试剂盒，包括上述荧光成像组合物，以及试剂盒中的常规成分。
一种上述靶向多肽ZP-16的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将MUC4蛋白溶液与噬菌体结合，分离与板上包被的MUC4结合的噬菌体多肽，获得第一轮筛选的噬菌体；
(2)将大肠杆菌接种于LB液体培养基中震荡培养，当菌体处于对数前期时，将第一轮筛选的噬菌体加入到大肠杆菌的培养物中，恒温震荡振荡培养4～5小时，分离得到第一轮筛选噬菌体的扩增物；
(3)以步骤(2)所得产物为基础，重复步骤(1)和步骤(2)所述过程，分离得到第二轮筛选噬菌体的扩增物；
(4)以步骤(3)所得产物为基础，继续重复步骤(1)和步骤(2)所述过程即可。
一种治疗MUC4蛋白引起的疾病的药物，包括以上述靶向多肽ZP-16作为活性物质成分，以及该靶向多肽在药学上可接受的辅助成分。
本发明的有益效果为：
1、本发明以特异性高表达于胰腺癌的MUC4蛋白为靶标，利用噬菌体展示肽库技术获得MUC4的亲和靶向多肽ZP-16，该短肽分子量小，特异性强，生物相容性好，对MUC4蛋白具有高亲和力和靶向性，对MUC4蛋白的结合能力于MUC4抗体相当，克服了现有技术以抗体分子作为靶向剂无法穿透细胞膜的技术问题。
2、同时本发明所述短肽通过化学修饰合成的荧光成像组合物ZP-16-Cy5，在体内外均具有对MUC4蛋白良好的靶向性和特异性。特别是在体内，通过荷瘤裸鼠尾静脉注射ZP-16-Cy5，该组合物能够快速高效到达肿瘤位置进行长时间成像(160min)，进一步表明该组合物分子量小，特异性和靶向性高，在动物体内具有良好的生物相容性和稳定性。克服了现有技术以荧光抗体分子作为体内靶向剂价格昂贵、稳定性差、分子量大以及靶向性差的技术问题。
3、本发明所述靶向多肽ZP-16以及其荧光成像组合物ZP-16-Cy5，作为高表达MUC4蛋白相关疾病的早期诊断、靶向成像以及治疗系统具有良好的应用前景。
附图说明
图1为ELISA检测噬菌体多肽与MUC4的结合能力结果图；
图2为MUC4对噬菌体融合多肽与固相包被MUC4结合的抑制率检测曲线图；
图3为靶向多肽ZP-16与MUC4的亲和力检测曲线图；
图4为多肽荧光探针ZP-16-Cy5 HPLC检测图；
图5为多肽荧光探针ZP-16-Cy5 MS检测图；
图6为1G8-FITC免疫荧光实验检测结果图；
图7为ZP-16-Cy5免疫荧光实验检测结果图；
图8为ZP-16-Cy5、1G8-FITC和BxPC-3免疫荧光共定位检测结果图；
图9为ZP-16-Cy5与人胰腺癌组织免疫荧光组织化学实验检测结果图；
图10为ZP-16-Cy5和1G8-FITC与人胰腺癌组织免疫荧光共定位检测结果图；
图11为小鼠接种BxPC-3(高表达MUC4)后的尾部皮下出瘤状况；
图12为小鼠接种U87 10(低表达MUC4)后的尾部皮下出瘤状况；
图13为ZP-16-Cy5在BxPC-3荷瘤裸鼠的体内成像图；
图14为ZP-16-Cy5在U87荷瘤裸鼠的体内成像图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1MUC4靶向短肽的筛选
用噬菌体随机十二肽库(Ph.D.-12TM，展示在噬菌体PⅢ蛋白N端的12肽库，库容1.5×1013pfu/mL购自New England Bio Labs公司)与MUC4蛋白结合，收集与MUC4结合的噬菌体，经大肠杆菌扩增后用于下一轮的亲和淘选。经过三轮筛选过程后，收集第三轮洗脱下来的噬菌体感染大肠杆菌并扩增。通过蓝白斑实验挑取蓝色单克隆噬菌斑用于DNA的提取及测序。
1.第一轮筛选与扩增
(1)用10μg/mL MUC4蛋白溶液包被2孔，每孔准备1.0×1011pfu的噬菌体与其结合，倾倒除去未结合噬菌体，用0.2mol/L的Glycine-HCl(pH＝2.2)和1mg/mL BSA混合液来分离与板上包被的MUC4结合的噬菌体多肽，获得了第一轮筛选的噬菌体。
(2)将大肠杆菌ER2738单克隆接种于20mL LB液体培养基中震荡培养，当菌体处于对数前期时，将大部分第一轮筛选的噬菌体加入到大肠杆菌的培养物中，恒温震荡振荡培养约4.5小时。通过离心-沉淀-离心得到噬菌体沉淀，此即为第一轮筛选噬菌体的扩增物。此扩增物大部分用于下一轮的筛选，少部分用于噬菌体的滴度测定。
2.第二轮筛选与扩增
筛选的基本方法与第一轮筛选与扩增一致。根据第一轮噬菌体筛选物扩增后的滴度测定结果，将第一轮扩增淘选物中1-2×1011pfu的噬菌体量投入到第二轮的筛选中。MUC4靶蛋白的浓度减少到5μg/mL，4℃包被时间延长为2天，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.3％(v/v)。获得的第二轮淘选物部分用于扩增，部分用于滴度测定。
3.第三轮筛选
筛选的基本方法同第一轮筛选一致。根据第二轮噬菌体筛选物扩增后的滴度测定结果，将第二轮扩增淘选物中1-2×1011pfu的噬菌体量投入到第三轮的筛选中。MUC4靶蛋白的浓度减少到2μg/mL，4℃包被时间延长为3天，在清洗步骤中将Tween-20的浓度增至0.5％(v/v)。获得的第三轮淘选物用于滴度测定和挑取噬菌体单克隆，并对3次筛选结果进行汇总，其结果见表1。
表1噬菌体随机12肽库对MUC4亲和短肽的筛选结果
从表1中可以看出回收率是逐步提高的。
4.提取单克隆噬菌体及测序
挑取密度适中，长势较好的蓝色单克隆噬菌斑16个(编号为Z1-Z16)送上海生工公司测序，其结果见表2。
表2噬菌体表面展示肽测序结果总结
5.ELISA定性检测所选噬菌体多肽与MUC4的结合性
ELISA定性检测MUC4靶蛋白与16个噬菌体多肽的结合能力，其结果见图1，图1中包括1～16组条形图，每组条形图中均包括两条柱形图，且每组条形图中的左侧柱形图均为MUC4检测结果，右侧柱形图均为BSA检测结果。
如图1所示，扣除空白值后的结果显示这些克隆能与MUC4蛋白结合，以450nm处的吸光值高于阴性对照2倍作为阳性噬菌体克隆，其中与MUC4蛋白结合较强的阳性噬菌体克隆有13个(Z1，Z3-7，Z9-13，Z15-16)，而Z2、Z14、Z8与MUC4的结合力较差。
实施例2MUC4靶向短肽的功能鉴定
经过三轮固相筛选，获得了3个短肽序列，其中短肽ZP-16出现的频次高达81％，且Elisa鉴定结果表明含有ZP-16序列的噬菌体克隆能与MUC4高亲和力结合，而其它的噬菌体克隆结合力较差。这一结果进一步证实了短肽序列VHWDFRQWWQPS为优势序列。
1、液相中的MUC4对噬菌体融合多肽与包被的MUC4结合的抑制
液相中的MUC4与板上固相包被的MUC4竞争性结合阳性噬菌体多肽，根据450nm处测得的吸光度值求得阳性克隆的抑制率，其结果见图2。
如图2所示，竞争抑制实验结果显示，随着液相中MUC4浓度的减少，其干扰固相包被的MUC4与噬菌体克隆结合的能力逐渐减弱，对固相MUC4与噬菌体多肽结合的抑制率逐渐降低。
2、亲和常数测定
用ELISA法测定合成靶向多肽ZP-16(VHWDFRQWWQPS)与MUC4的亲和力。MUC4蛋白以4个稀释度包被酶标板，然后以初始浓度为8μg/mL的合成多肽2倍倍比稀释后分别与MUC4结合，酶标仪测定其OD值。根据测定结果，以ZP-16的浓度对数为横坐标，OD值为纵坐标，作多肽ZP-16与MUC4的结合曲线，其结果见图3。
如图3所示，图中M1、M2、M3、M4分别代表MUC4浓度为20、40、80、160ng/mL与ZP-16的反应曲线。根据结合曲线推导出OD值为50％时ZP-16的浓度，将此浓度带入Beatty的变形公式Ka＝D(n-1)/2(n[Ab']-[Ab])，计算出ZP-16的结合常数为5.21±0.53×106M-1。
实施例3短肽荧光成像组合物ZP-16-Cy5的合成与鉴定
委托上海生工公司在多肽ZP-16的缬氨酸羧基末端通过4个聚乙二醇(PEG)基团标记上Cy5(Cy5是一种红色的吲哚类菁染料)后制备成多肽荧光探针(ZP-16-Cy5)，通过色谱和质谱鉴定组合物纯度及分子量。以抗MUC4单克隆荧光抗体(1G8-FITC)为对照，通过直接免疫荧光技术和激光共聚焦技术进一步鉴定其与胰腺癌细胞株和人胰腺癌组织MUC4的结合情况，实验证明ZP-16可以结合表达MUC4的肿瘤细胞，其特异性与抗MUC4荧光抗体(1G8-FITC)相似，ZP-16可以结合表达MUC4的临床肿瘤组织，且与1G8-FITC重叠性较好。
1、多肽荧光探针ZP-16-Cy5的表征
ZP-16-Cy5经HPLC和MS鉴定：纯度为99.89％(见图4)，分子量为2558.1(见图5)。
2、ZP-16-Cy5和1G8-FITC与各胰腺癌细胞株的结合
1G8-FITC免疫荧光实验结果(见图6)：BxPC-3细胞呈强绿色荧光，CFPAC-1、Capan-1、PANC-1、HPAF-Ⅱ的绿色荧光稍弱，PC-12、U87仅显微弱绿色荧光。经Image J软件半定量分析得到MUC4表达由高到低的细胞依次为BxPC-3、CFPAC-1、Capan-1、PANC-1、HPAF-Ⅱ、PC-12、U87。
ZP-16-Cy5免疫荧光实验结果(见图7)：BxPC-3细胞呈强红色荧光，CFPAC-1、Capan-1、HPAF-Ⅱ、PANC-1的红色荧光稍弱，PC-12、U87仅见微弱红色荧光。经ImageJ软件分析后，平均荧光强度值由高到低的细胞依次为BxPC-3、CFPAC-1、Capan-1、HPAF-Ⅱ、PANC-1、PC-12、U87。ZP-16-Cy5与各细胞株结合的荧光强弱顺序和1G8-FITC基本一致。
3、ZP-16-Cy5和1G8-FITC与BxPC-3免疫荧光共定位
ZP-16-Cy5和1G8-FITC与BxPC-3一起孵育1h后，激光共聚焦观察结果显示(见图8)：其中，ZP-16-Cy5为红色荧光，1G8-FITC与BxPC-3为绿色荧光，ZP-16-Cy5和1G8-FITC均能与BxPC-3结合，且红色荧光和绿色荧光的强度和分布相近，且两者Merge之后重合度较高。
4、ZP-16-Cy5与人胰腺癌组织的结合
所选组织切片HE染色后，证实所选石蜡组织标本均为相应病理组织。IHC结果采用半定量分级方式评判：光镜下观察，MUC4以胞浆和胞膜出现棕黄色颗粒为阳性(见图9)。随机选择10-20个视野，高倍镜下计数200个肿瘤细胞，结合阳性细胞率(阳性细胞率＝阳性细胞数/200)和染色强度采用半定量计分法进行分析。阳性细胞率：≤1％为0分，1％-10％为1分，11％-50％为2分，>50％为3分。染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项指标计分的乘积作为判断标准：0-1分为阴性，2-9分为阳性。胰腺癌和低级别纤维粘液样肉瘤MUC4表达阳性，正常胰腺组织MUC4表达阴性。
1G8-FITC免疫荧光组织化学实验结果与IHC结果相似(见图9)，具体为：胰腺癌肿瘤细胞呈强绿色荧光，低级别纤维黏液样肉瘤肿瘤细胞荧光较强，正常胰腺组织细胞荧光微弱。
ZP-16-Cy5免疫荧光组织化学实验结果与1G8-FITC结果相似(见图9)，具体为：胰腺癌肿瘤细胞呈强红色荧光，低级别纤维黏液样肉瘤肿瘤细胞荧光较强，正常胰腺组织细胞荧光微弱。
ZP-16-Cy5和1G8-FITC与人胰腺癌组织免疫荧光共定位结果(见图10)，具体为：胰腺癌肿瘤细胞在激光共聚焦1G8-FITC通路下呈强绿色荧光，在ZP-16-Cy5通路下呈强红色荧光，而正常胰腺组织细胞在1G8-FITC通路和ZP-16-Cy5通路下均呈黑色；同时，ZP-16-Cy5和1G8-FITC的荧光分布及强度相似，且两者Merge之后重合度较高。
实施例4短肽荧光成像组合物ZP-16-Cy5体内荧光成像
BALB/c-nu小鼠接种BxPC-3(高表达MUC4)和U87 10(低表达MUC4)天左右后，尾部皮下见肿瘤结节，出瘤率达100％(分别见图11和图12)，3～4周肿瘤增大至1.0cm左右。
BxPC-3荷瘤鼠尾静脉注射ZP-16-Cy5(4nmol/20gWT)9min后，瘤体出现荧光，随时间的增加，瘤体的荧光强度逐渐增加，55min达高峰后逐渐减弱(见图13)，180min消失，有明显的荧光信号聚集过程。整个动态荧光显像约3-4h，早期肝脏的荧光和心脏荧光较强，30min后肠道逐渐出现荧光，直至180min后全身只剩肠道留有荧光。
U87荷瘤裸鼠尾静脉注射探针(4nmol/20gWT)5min后，瘤体显现荧光(见图14)，随后荧光有一定增强，但未见像胰腺癌裸鼠种植瘤那样明显荧光信号聚集过程，且种植瘤荧光信号明显低于实验组。综上结果表明多肽ZP-16可以在活体内特异性靶向高表达MUC4的胰腺癌肿瘤组织。
序列表
<110> 川北医学院
<120> 一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP-16在制备药物中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 噬菌体(phage E)
<400> 1
Val His Trp Asp Phe Arg Gln Trp Trp Gln Pro Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 噬菌体(phage E)
<400> 2
agaaggctgc caccactgcc gaaaatccca atgcac 36
Claims (3)
1.一种与MUC4蛋白特异性结合的靶向多肽ZP-16在制备治疗胰腺癌药物中的用途，其特征在于，所述靶向多肽ZP-16的氨基酸序列为Val-His-Trp-Asp-Phe-Arg-Gln-Trp-Trp-Gln-Pro-Ser。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，编码靶向多肽ZP-16的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向多肽ZP-16能够与MUC4蛋白中α链VNTR结构域上的氨基酸序列特异性结合。
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