CN108440671B - 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽 - Google Patents

一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽 Download PDF

Info

Publication number
CN108440671B
CN108440671B CN201810165364.3A CN201810165364A CN108440671B CN 108440671 B CN108440671 B CN 108440671B CN 201810165364 A CN201810165364 A CN 201810165364A CN 108440671 B CN108440671 B CN 108440671B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
dri
cells
tat
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810165364.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108440671A (zh
Inventor
谭拥军
张振旺
余景卫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xinsheng Kangyuan Biopharmaceutical Co Ltd Changsha
Original Assignee
Xinsheng Kangyuan Biopharmaceutical Co Ltd Changsha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xinsheng Kangyuan Biopharmaceutical Co Ltd Changsha filed Critical Xinsheng Kangyuan Biopharmaceutical Co Ltd Changsha
Priority to CN201810165364.3A priority Critical patent/CN108440671B/zh
Publication of CN108440671A publication Critical patent/CN108440671A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108440671B publication Critical patent/CN108440671B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了来源于FOXM1蛋白氮端106‑126位21个氨基酸残基序列的多肽及其合成方法，提供了一种开发多肽类抗肿瘤药物的候选者。所述肽段具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中SEQ ID NO：1；2）将序列表中SEQ ID NO：1取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基，实现抑制肿瘤的多肽。本发明依照序列表中SEQ ID NO：1氨基酸序列所制备的具有穿膜能力的多肽，表现出对多种肿瘤细胞的抑制作用。

Description

一种来源于FOXM1蛋白的抗肿瘤多肽
技术领域
本发明属于多肽药物和肿瘤学领域，涉及一种来源于FOXM1蛋白的抗肿瘤多肽的合成及其用途。
背景技术
从多种人瘤样本的基因表达分析中发现，转录因子FOXM1在肿瘤细胞中表达增高，检测其表达水平已被用于多种肿瘤的诊断和预后（US7056674、7081340、7308364、7526387、7531300、CN201510355817.5）。从基因功能角度，FOXM1首先被确认是一个调控细胞周期和细胞增殖的蛋白（Mol Cell Biol 1997. 17: 1626-1641）。在细胞增殖过程中，FOXM1参与调节细胞周期相关的多个基因转录，从而控制细胞的DNA复制与有丝分裂过程（Mol CellBiol 1999. 19: 8570-8580, Proc Natl Acad Sci U S A 2002. 99: 16881-16886, MolCell Biol 2005. 25: 10875-10894），还与DNA损伤修复有关（Mol Cell Biol 2007. 27:1007-1016, Cell Prolif 2010. 43: 494-504），抑制其表达能有效终止细胞周期、阻断细胞生长（Proc Natl Acad Sci U S A 2002. 99: 16881-16886, Mol Cell Biol 2005.25: 10875-10894, Genes Dev 2004. 18: 830-850, Developmental Biology 2004.276: 74-88, Proc Natl Acad Sci U S A 2001. 98: 11468-11473）。此外，FOXM1参与了细胞干性维持（Nucleic Acids Res 2010. 38: 8027-8038），抑制FOXM1导致无法获得诱导型多能干细胞，是诱导型多能干细胞重编程过程中的必须因子（PLoS One 2014. 9:e92304）。同时，FOXM1是刺激肿瘤细胞发生上皮间质转化的关键分子，抑制FOXM1可阻止癌细胞转移（Cancer Lett 2013. 340: 104-112）。在活体水平，不同器官中有条件敲除FOXM1可抑制肝癌、肺癌、结直肠癌等实体瘤的发生和发展（Genes Dev 2004. 18: 830-850,Cancer Res 2006. 66: 2153-2161, Gastroenterology 2007. 132: 1420-1431）。由于FOXM1在刺激细胞增殖、增强DNA损伤修复能力、促进细胞迁移、维持细胞干性等方面发挥主导作用，抑制FOXM1可有效抑制肿瘤的发生和发展，因此FOXM1被认为是肿瘤治疗药物开发的有效靶标（Biochim Biophys Acta 2007. 1775: 92-102）。以FOXM1为靶基因，通过腺病毒介导特异性干扰FOXM1的表达、实现肿瘤基因治疗的可能性已在多种实体瘤（肝癌、乳腺癌、鼻咽癌等）基因治疗研究中被证实（J Gene Med 2012. 14: 231-240, Cancer GeneTher 2013. 20: 117-124, Cancer Gene Ther 2014. 21: 133-138）。抑制FOXM1的小分子药物筛选工作也有进展，其中，Thiostrepton、抗菌素Siomycin A等小分子化合物被发现能选择性抑制FOXM1的转录活性，从而抑制了肿瘤（PLoS One 2009. 4: e5592, Nat Commun2014. 5: 5165, Mol Cancer Ther 2008. 7: 2022-2032, Cancer Res 2006. 66: 9731-9735）。本发明以FOXM1为靶标，开发抑制FOXM1活性和功能的蛋白多肽类药物，用于预防、治疗或延缓人类肿瘤。
总结开发针对FOXM1的肽段、实现肿瘤治疗的方法，包括以下已公开的发明：1）源自 FOXM1 的肽与HLA-A2结合，用以活化可杀死癌细胞的人杀伤 T 细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL），为高水平表达FOXM1的癌症患者提供癌症免疫治疗的手段（CN201510127580.5、US201514729752、CN201080017145.2）。2）以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库筛选获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽，该类多肽可潜在作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断（CN201010515471.8）。3）我们选定FOXM1蛋白序列中的1-234位氨基酸，制备重组穿膜蛋白肽用于开发抗肿瘤蛋白类药物，专利申请已公开（CN201610439054.7）。4）我们只选定FOXM1蛋白序列中的1-138位氨基酸制备重组穿膜蛋白肽，能有效抑制多种肿瘤细胞，已申请专利（CN201711138488.4）。
以胞内靶标开发的抗肿瘤蛋白多肽类药物都需要进入肿瘤细胞发挥作用，因此必须具备穿透细胞膜进入细胞的能力。细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是由氨基酸组成且具有穿透细胞膜能力的多肽，最早从人HIV-1的TAT蛋白中发现，该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段（Proc Natl Acad Sci U S A 1991. 88: 1864-1868, Cell1988. 55: 1189-1193）；此后，其他天然蛋白也被发现包含穿膜能力的肽段（J Biol Chem1994. 269: 10444-10450）。以此为基础，人们相继筛选和开发了包含不同天然蛋白穿膜肽序列的嵌合体穿膜肽（如transportan）（FASEB J 1998. 12: 67-77）和纯人工合成的穿膜肽（如多聚精氨酸肽段R8或R9等）（J Biol Chem 2001. 276: 5836-5840），并可对其加以修饰提高稳定性和穿膜效率（Nucleic Acids Res 2011. 39: 3972-3987）。由于其具备穿膜能力，穿膜肽一经发现就被认为可用于介导生物活性物质、特别是大分子量的蛋白质、核酸等分子进入细胞发挥作用，成为一种具有导入效率高、细胞对象类型广、细胞毒性低、方法简便等突出优点的药物递送方法（Ther Deliv 2013. 4: 573-591）（CN200680049953、200810155949）。只识别特定类型肿瘤细胞、具有细胞选择性的穿模肽也被筛选获得，可介导生物活性物质进入某种特定肿瘤细胞、而不会进入正常或其他种类肿瘤细胞（NatureCommunication 2012. 3: 951-963）。一般认为，穿膜肽介导药物进入细胞的模式主要通过是能量依赖型的细胞内吞机制（J Biol Chem 2003. 278: 585-590），也有研究表明可通过直接细胞膜转位（J Biol Chem 2009. 284: 33957-33965）或物理内吞方式进入细胞（IntJ Biochem Cell Biol 2012. 44: 869-875），随后逃逸出内涵体并释放于细胞质中（Int JBiochem Cell Biol 2012. 44: 869-875），实现药物功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：本发明以FOXM1为靶标开发蛋白多肽类抗肿瘤药物，具体地，是从FOXM1蛋白序列中选定其氮端106-126位的21个氨基酸残基序列，通过化学合成制备包含此序列的多肽，证明此多肽能抑制肿瘤细胞，成为抗肿瘤蛋白多肽药物的候选者。
本发明与已公开发明的区别，体现在从FOXM1蛋白序列中选定其氮端106-126位的21个氨基酸，证明此段多肽能抑制肿瘤细胞。天然FOXM1蛋白的氮端能够抑制FOXM1的转录活性（Oncogene 2008. 27: 1696-1704, Mol Cell Biol 2008. 28: 3076-3087），并介导了FOXM1与肿瘤促进因子Smad3的相互作用，这一蛋白互作对肿瘤进程具有重要影响（JClin Invest 2014. 124: 564-579），因此在肿瘤细胞中增高FOXM1-氮端的特定蛋白区段，能竞争性阻碍FOXM1与Smad3的互作，从而干预FOXM1的促瘤功能。另外，FOXM1蛋白受多种信号通路调节，如Cdk1等磷酸激酶可磷酸化FOXM1蛋白的氮端，激活FOXM1的转录活性（J BiolChem 2009. 284: 30695-30707），因此增高FOXM1-氮端的特定蛋白区段，可充当竞争性底物，阻碍促瘤信号通路对FOXM1的修饰活化作用。我们在前期工作中选定FOXM1蛋白序列中的1-234位氨基酸，制备重组穿膜蛋白肽，验证其可以有效抑制FOXM1的转录活性，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，相关结果已在专利申请中公开（CN201610439054.7）。更进一步，我们只选定FOXM1蛋白序列中的1-138位氨基酸制备重组穿膜蛋白肽，也能有效抑制FOXM1的转录活性，抑制多种肿瘤细胞，并申请专利（CN201711138488.4）。
本发明以此为基础，发明人通过在肿瘤细胞中过表达FOXM1蛋白序列中106-126位21个氨基酸多肽，证实其可抑制FOXM1的转录活性，将此段多肽序列命名为M1-21。与人工合成穿膜肽R9相融合，采用化学固相合成方法，制备了R9-M1-21多肽。实验证实，R9-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞，对多种肿瘤细胞，如肺癌肿瘤细胞株A549、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231等，发挥抑制作用。为提高多肽药物的稳定性，采用化学固相合成PEG修饰的R9-M1-21多肽（PEG-R9-M1-21），证实PEG-R9-M1-21比R9-M1-21能更加有效地抑制肿瘤细胞。为进一步增强多肽稳定性，合成中采取D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型多肽（DRI-R9-M1-21），发现DRI-R9-M1-21抑制肿瘤细胞的作用浓度比R9-M1-21降低近10倍，表明DRI-R9-M1-21的抑瘤效率显著提高。同时，证实DRI-R9-M1-21对多种肿瘤细胞，如肺癌肿瘤细胞株A549、肝癌肿瘤细胞株HepG2、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7等，发挥了抑制作用。在此基础上，发明人采用天然TAT穿膜肽替换人工合成R9穿膜肽，化学固相合成DRI型的TAT-M1-21多肽（DRI-TAT-M1-21），证实DRI-TAT-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞，并对多种肿瘤细胞，如肺癌肿瘤细胞株A549、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-30等，发挥抑制作用。进一步实验表明，DRI-TAT-M1-21可有效抑制肿瘤细胞的迁移和集落形成能力，显示其能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、成瘤等多方面功能。从DRI-TAT-M1-21的抑瘤机制上，发明人提供了证据表明，其可通过结合FOXM1，抑制FOXM1转录活性及FOXM1下游靶基因表达，从而实现DRI-TAT-M1-21的抑瘤效果。为确立相关多肽的成药性，发明人分析了DRI-TAT-M1-21在野生型小鼠中的耐受剂量和抗原性，其耐受剂量可达药物/体重比200mg/Kg，无明显毒性，抗原性较低，并发现DRI-TAT-M1-21比DRI-R9-M1-21的具有更低的溶血性，显示DRI-TAT-M1-21具有良好的成药性。更进一步，运用裸鼠移植瘤模型，发明人证实DRI-TAT-M1-21在活体中可抑制肿瘤形成。为研究DRI-TAT-M1-21在野生型动物背景下的抑瘤效果，发明人首先证实DRI-TAT-M1-21可对BALB/c小鼠来源的乳腺癌细胞株4T1发挥抑制作用，并运用野生型BALB/c小鼠建立4T1细胞移植瘤模型，证实DRI-TAT-M1-21在野生型动物模型中抑制肿瘤形成。为说明本发明的M1-21多肽通过取代、缺失、插入添加一个、两个或数个氨基酸还具备抑瘤作用的可能性，发明人合成了从M1-21序列中缺失10个氨基酸的DRI型R9-M1-11多肽（DRI-R9-M1-11），证实DRI-R9-M1-11对多种肿瘤细胞，如肝癌肿瘤细胞株HepG2、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7等具有抑制作用，保持了抑瘤能力。
更具体地，本发明提供了如下。
（1） 一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为来源于FOXM1蛋白序列中106-126位的21个氨基酸残基构成的多肽，其序列如序列表中SEQ ID NO：1序列所示。
（2） （1）中的多肽，取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，实现抗肿瘤的功能。
（3） 编码（1）所述多肽的DNA序列。
（4） 根据（3）所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
（5） 含（3）所述DNA序列的表达载体。
（6） 合成（1）所述多肽的方法，是将含所述多肽序列与穿膜肽序列融合，合成得到具有穿膜能力的多肽。
（7） 根据（6）所述的方法，其特征在于：其中穿膜肽可以是多聚精氨酸R9穿膜肽或天然TAT穿膜肽或其他穿膜肽。
（8） 根据（6）或（7）所述的方法，其特征在于：为增强多肽稳定性而修饰获得的多肽，如合成中采取D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型多肽或运用PEG修饰获得的多肽。
（9） 如（6）或（7）所述的方法用于制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。
（10） 一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为（1）所述多肽。
附图说明
图 1显示了哺乳动物细胞表达载体（pCMV-M1-21）质粒图谱，在肿瘤细胞中转染pCMV-M1-21质粒可抑制FOXM1的转录活性。
图 2显示了采用化学固相合成R9-M1-21多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。
图 3显示了FITC荧光基团标记的R9-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞，R9-M1-21多肽对肺癌肿瘤细胞株A549 、MDA-MB-231的抑制作用。
图 4显示了采用化学固相合成PEG-R9-M1-21多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。
图 5显示了PEG-R9-M1-21多肽与R9-M1-21多肽对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231发挥抑制作用的浓度差异。
图 6显示了采用化学固相合成DRI-R9-M1-21多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。
图 7显示了DRI-R9-M1-21多肽与R9-M1-21多肽对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231发挥抑制作用的浓度差异。
图 8显示了DRI-R9-M1-21多肽对肺癌肿瘤细胞株A549、肝癌肿瘤细胞株HepG2、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用。
图 9显示了采用化学固相合成DRI-TAT-M1-21多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。
图 10显示了FITC荧光基团标记的DRI-TAT-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞。
图 11显示了DRI-TAT-M1-21多肽对肺癌肿瘤细胞株A549、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7、ZR-75-30的抑制作用。
图 12显示了DRI-TAT-M1-21多肽抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的迁移能力。
图 13显示了DRI-TAT-M1-21多肽抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的集落形成能力。
图 14显示了DRI-TAT-M1-21多肽能结合FOXM1并抑制FOXM1转录活性及其下游靶基因Cdc25B的表达。
图 15显示了野生型小鼠中DRI-TAT-M1-21多肽的耐受剂量分析、抗原性分析及DRI-TAT-M1-21多肽和DRI-R9-M1-21多肽的溶血性对比分析。
图 16 显示了裸鼠移植瘤模型中DRI-TAT-M1-21多肽抑制肿瘤形成。
图 17显示了DRI-TAT-M1-21多肽对小鼠乳腺癌细胞株4T1的抑制作用。
图 18 显示了野生型BALB/c小鼠4T1细胞移植瘤模型中DRI-TAT-M1-21多肽抑制肿瘤形成。
图 19显示了采用化学固相合成DRI-R9-M1-11多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。
图 20显示了DRI-R9-M1-11多肽对肝癌肿瘤细胞株HepG2、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例 1，FOXM1蛋白序列中106-126位21个氨基酸多肽可抑制FOXM1的激活转录能力。
1，FOXM1蛋白序列中106-126位21个氨基酸多肽（M1-21）的哺乳动物细胞表达载体（pCMV-M1-21）的构建。按DNA合成标准方法合成M1-21氨基酸序列对应的双链DNA的正反链，并包含XbaI/BamHI限制性内切酶位点及N端6个His氨基酸（His-tag），正链序列为：GCG GGATCC ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC TTC ATC CTC ATC AGC TGT GGG GGA GCC CCA ACTCAG CCT CCA GGA CTC CGG CCT CAA ACC CAA TGA TCT AGA GCG，反链序列为：CGC TCTAGA TCA TTG GGT TTG AGG CCG GAG TCC TGG AGG CTG AGT TGG GGC TCC CCC ACA GCTGAT GAG GAT GAA GTG ATG GTG ATG GTG ATG CAT GGA TCC CGC。所合成的单链等量混合，94℃变性处理10min，自然冷却至室温，-20℃冻存备用。对所得双链DNA及pcDNA3.1载体进行酶切处理，运用XbaI/BamHI限制性内切酶分别切出双链DNA及载体的粘性末端，并对酶切好的双链DNA和载体进行连接反应。取感受态DH5α大肠杆菌置于冰上完全溶解，加入100ng连接产物混匀，冰上孵育30min。42℃热激90sec后冰上放置2min。加入1mL的LB培养基，37℃慢摇45min。将菌涂布LB平板(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃培养过夜。挑取单克隆，接种到3mL的LB培养基(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃振荡培养8hr，收集菌体提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定并测序，获得pCMV-M1-21表达载体（质粒图谱见图1A）。
2，在肿瘤细胞中过表达M1-21可抑制FOXM1的转录活性。将pCMV-FOXM1真核表达质粒（200ng）、pCdc25B promoter-Luciferase报告基因质粒（1.6μg）及pCMV-M1-21表达质粒（1μg）共转染HEK293T肿瘤细胞，48hr后检测荧光素酶报告基因的水平，证实M1-21对FOXM1转录活性的抑制效果（图1B）。对应的细胞样本用于制备细胞裂解液，运用WesternBlotting分别检测Cdc25B、FOXM1（Santa Cruz SC-502抗体识别FOXM1）与M1-21（anti-His抗体识别M1-21所携带的His-标签）蛋白的表达水平，同时检测beta-actin蛋白水平作为上样对照（图1C），显示过表达M1-21可抑制FOXM1靶基因Cdc25B的表达。
实施例 2， R9-M1-21多肽化学固相合成工艺。
采用化学固相合成法，合成R9-M1-21多肽（RRR RRR RRR FIL ISC GGA PTQ PPGLRP QTQ）。以10毫克产物合成为例说明，更大规模合成可按标准工艺进行放大。
1，主要原料和试剂。Fmoc-Gln(Trt)-OH(谷氨酰胺)、Fmoc-Thr(But)-OH(苏氨酸)、Fmoc-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)、Fmoc-Leu-OH(亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-Ala-OH(丙氨酸)、Fmoc-Cys(Trt)-OH(半胱氨酸)、Fmoc-Ser(Tbu)-OH(丝氨酸)、Fmoc-Ile-OH(异亮氨酸)、Fmoc-Phe-OH(苯丙氨酸)、2-Chlorotrityl Chloride Resin(2氯树脂)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DCM(二氯甲烷)、乙腈、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、TIS(三异丙基硅烷)、EDT(1,2-乙二硫醇)、乙醚、哌啶、乙醇、茚三酮、苯酚、吡啶。
2，固相合成方法及步骤。
2.1合成路线工艺流程。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤 素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点 氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱 Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把 多肽从树脂上切割下来，形成裸露的羧基。具体路线如下图所示：
Figure RE-GDA0001681587370000081
Figure RE-GDA0001681587370000091
再进行后续纯化。
2.2树脂的溶胀。称取二氯树脂0.39g（合成目的肽为0.0078mmol，所用二氯树脂的取代度为0.2mmol/g，按照10倍过量，则所需的二氯树脂质量为0.0078/0.2*10=0.39g），放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升DCM，振荡30min，活化待用。
2.3连接首个氨基酸。抽滤掉DCM溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的Fmoc-Gln(Trt)-OH，再加入10倍树脂摩尔量的DIEA，最后加入少量的DMF溶解，振荡1h。反应完后用DMF和DCM交替清洗6遍。
2.4脱保护。加入20毫升20%哌啶/DMF溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20%哌啶/DMF溶液，振荡15min。
2.5检测。抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护。
2.6首次清洗。依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。
2.7缩合。加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Thr(But)-OH，3倍树脂摩尔量的HBTU，均用少量的DMF溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的DIEA，反应30min。
2.8检测。抽掉DMF，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，此时若不变色则为阳性，说明缩合完全。若变蓝色则反应未完成，需重新缩合。
2.9第二次清洗。依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。
2.10肽链的延伸。按照以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸。
2.11氨基酸侧链脱保护与树脂的切割。合成R9-M1-21多肽序列为RRR RRR RRRFIL ISC GGA PTQ PPG LRP QTQ，其中含有的侧链保护基有：Pbf、Trt、Tbu、Boc、But，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是TFA，所以脱保护和切割树脂可以同时进行。配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：TFA(94.5%)、水(2%)、EDT(2.5%)、TIS(1%)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后常温挥干，即得粗品肽。
2.12HPLC纯化。（1）溶解。将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50%的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。（2）过滤。用0.45μm滤膜过滤溶解液。（3）分析。取3μl溶液用分析级HPLC分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间30min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95%，乙腈5%，结束梯度为：水5%，乙腈95%。（4）制备。将溶解好的样品做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度为：水95%，乙腈5%，结束梯度为：水25%，乙腈75%，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
3，R9-M1-21合成产品的质谱鉴定和纯度鉴定。
3.1质谱鉴定分析。利用ESI-MS进行质谱鉴定，测得合成所得R9-M1-21成品的实际分子量，质谱图见图2A。通过质谱检测分析共得到3个带有不同电荷的目标峰，分别为：[M+5H]5H+质核比为719.03，其实测分子量为719.03*5 – 5 = 3590.15，[M+6H]6H+质核比为599.24，其实测分子量为599.24*6 – 6 = 3589.44，[M+7H]7H+质核比为513.74，其实测分子量为513.74*7 – 7 = 3589.18，M1-21的理论分子量为3586.25，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。
3.2HPLC分析。采用LC3000型高效液相色谱仪，色谱分析条件：C18，反相，4.6mm*150mm，梯度洗脱。起始梯度为5%A+95%B，结束梯度为30%A+70%B，时间是30min，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为214nm，进样量为10μl。流动相A为0.1%三氟乙酸在100%乙腈，流动相B为0.1%三氟乙酸在100%水。结果见图2B。R9-M1-21成品经分析确定出峰时间为10.359的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到95.88%。
实施例 3，R9-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞。
采用实施例2中所描述的化学固相合成法，合成FITC荧光基团标记的R9-M1-21多肽，并用其处理HEK293T肿瘤细胞（50μM）。4hr后，PBS清洗，4%甲醛固定细胞样品。荧光显微镜观察该多肽在细胞内的分布（400X），证实FITC荧光基团标记的R9-M1-21多肽能有效穿膜并分布于细胞质和细胞核（图3A）。
实施例4，R9-M1-21多肽抑制肺癌肿瘤细胞株A549。
为验证R9-M1-21对肺癌细胞增殖的抑制作用，选择肺癌A549细胞，运用商品化的Cell Counting Kit（CCK）试剂盒考察R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的R9-M1-21（0、20、40、50、60、80、100μM）处理细胞，再培养24hr。向每孔加入10μLCCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-Control多肽处理细胞，作为阴性对照组。所获A549细胞的CCK细胞活力曲线见图3B。结果表明，与对照组样本相比，R9-M1-21可明显抑制肺癌A549细胞的增殖。
实施例 5，R9-M1-21多肽抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231。
为验证R9-M1-21对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，选择乳腺癌MDA-MB-231细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液(100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的R9-M1-21（0、20、40、50、60、80μM）处理细胞，再培养24hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK 溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK 溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-Control多肽处理细胞，作为阴性对照组。所获MDA-MB-231细胞的CCK细胞活力曲线见图3C。R9-M1-21（50μM）处理24hr后的细胞形态变化见图3D。结果表明，与对照组样本相比，R9-M1-21可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。
实施例 6， PEG-R9-M1-21多肽的合成。
采用实施例2中所描述的化学固相合成法，合成PEG修饰的R9-M1-21多肽PEG-R9-M1-21（RRR RRR RRR FIL ISC GGA PTQ PPG LRP QTQ-PEG）。主要原料和试剂中增加了Fmoc-PEG8-CH2CH2COOH。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最 后 接Fmoc-PEG8-CH2CH2COOH（链接方式参考常规氨基酸）并脱保护，而后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。
对PEG-R9-M1-21合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。本实施例中尝试对R9-M1-21修饰了PEG8（分子量为423.43）。利用ESI-MS进行质谱鉴定，测得合成所得PEG-R9-M1-21成品的实际分子量，质谱图见图4A。通过质谱检测分析共得到2个带有不同电荷的目标峰，分别为：[M+3H]3H+质核比为1337.8，其实测分子量为1337.8*3 – 3 = 4010.4，[M+4H]4H+质核比为1003.7，其实测分子量为1003.7*4 – 4 = 4010.8， PEG-R9-M1-21的理论分子量为3587.23 + 423.43 = 4010.66，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图4B。R9-M1-21成品经分析确定出峰时间为9.083的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到78.34%。
实施例 7，PEG-R9-M1-21多肽比R9-M1-21多肽更有效地抑制肿瘤细胞。
选择乳腺癌MDA-MB-231细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察PEG-R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响，并设置R9-Control、R9-M1-21处理组对照。在96 孔板中接种细胞悬液(100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的PEG-R9-M1-21（0、20、40、60、80μM）处理细胞，再培养24hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK 溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK 溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-Control、R9-M1-21处理细胞，作为对照组。所获MDA-MB-231细胞的CCK细胞活力曲线见图5A。固定浓度PEG-R9-M1-21（50μM）处理细胞，在1d、2d、3d后分别进行CCK检测，获得细胞生长曲线见图5B。结果表明，PEG-R9-M1-21多肽比R9-M1-21多肽更有效地抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。
实施例 8， DRI-R9-M1-21多肽的合成。
采用实施例2中所描述的化学固相合成法，合成DRI型的R9-M1-21多肽DRI-R9-M1-21 [d-(RRR RRR RRR QTQ PRL GPP QTP AGG CSI LIF)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(But)-OH(苏氨酸)、Fmoc-D-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH(亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-D-Ala-OH(丙氨酸)、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(半胱氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH(丝氨酸)、Fmoc-D-Ile-OH(异亮氨酸)、Fmoc-D-Phe-OH(苯丙氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。
对DRI-R9-M1-21合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用ESI-MS进行质谱鉴定，测得合成所得DRI-R9-M1-21成品的实际分子量，质谱图见图6A。通过质谱检测分析共得到3个带有不同电荷的目标峰，分别为：[M+5H]5H+质核比为718.33，其实测分子量为718.33*5– 5 = 3586.65，[M+6H]6H+质核比为599.43，其实测分子量为599.43*6 – 6 = 3590.58，[M+7H]7H+质核比为513.54，其实测分子量为513.54*7 – 7 = 3587.78，DRI-R9-M1-21理论分子量为3586.25，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图6B。DRI-R9-M1-21成品经分析确定出峰时间为14.412的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到94.38%。
实施例 9，DRI-R9-M1-21多肽比R9-M1-21多肽更有效地抑制肿瘤细胞。
选择乳腺癌MDA-MB-231细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察DRI-R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响，并设置R9-Control、R9-M1-21处理组对照。在96 孔板中接种细胞悬液(100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的PEG-R9-M1-21（4、8、16、32、48、60μM）处理细胞，再培养24hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力。对应浓度的R9-Control、R9-M1-21处理细胞，作为对照组。所获MDA-MB-231细胞的抑制结果见图7。结果表明，DRI-R9-M1-21多肽比R9-M1-21多肽更有效地抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞。
实施例 10，DRI-R9-M1-21多肽抑制肺癌肿瘤细胞株A549、肝癌肿瘤细胞株HepG2、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7。
为验证DRI-R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择肺癌肿瘤细胞株A549、肝癌肿瘤细胞株HepG2、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察DRI-R9-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的DRI-R9-M1-21（0、0.5、1、2、4、8、16、20、24、28、32、36μM）处理细胞，再培养12hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，所获CCK细胞活力曲线见图8。结果表明， DRI-R9-M1-21可明显抑制多种肿瘤细胞的增殖。
实施例 11， DRI-TAT-M1-21多肽的合成。
采用实施例2中所描述的化学固相合成法，合成DRI型的TAT-M1-21多肽DRI-TAT-M1-21 [d-(GRR RQR RKK R QTQ PRL GPP QTP AGG CSI LIF)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(But)-OH(苏氨酸)、Fmoc-D-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH(亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-D-Ala-OH(丙氨酸)、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(半胱氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH(丝氨酸)、Fmoc-D-Ile-OH(异亮氨酸)、Fmoc-D-Phe-OH(苯丙氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(赖氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。
对DRI-TAT-M1-21合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用ESI-MS进行质谱鉴定，测得合成所得DRI-TAT-M1-21成品的实际分子量，质谱图见图9A。通过质谱检测分析共得到2个带有不同电荷的目标峰，分别为：[M+4H]4H+质核比为891.55，其实测分子量为891.55*4– 4 = 3562.2，[M+5H]5H+质核比为713.34，其实测分子量为713.34*5 – 5 = 3561.7，DRI-TAT-M1-21理论分子量为3560.22，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图9B。DRI-TAT-M1-21成品经分析确定出峰时间为9.382的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到89.93%。
实施例 12，DRI-TAT-M1-21多肽可有效进入肿瘤细胞。
采用实施例11中所描述的化学固相合成法，合成FITC荧光基团标记的DRI-TAT-M1-21多肽，并用其处理MDA-MB-231肿瘤细胞（30μM）。4hr后，PBS清洗，4%甲醛固定细胞样品。荧光显微镜观察该多肽在细胞内的分布（400X），证实FITC荧光基团标记的MDA-MB-231多肽能有效穿膜并分布于细胞质和细胞核（图10）。
实施例 13，DRI-TAT-M1-21多肽抑制肺癌肿瘤细胞株A549、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7和ZR-75-30。
为验证DRI-TAT-M1-21对肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择肺癌肿瘤细胞株A549、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7和ZR-75-30细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察DRI-TAT-M1-21对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的DRI-TAT-M1-21（0、1、2、4、8、16、28、32、36、40、60μM）处理细胞，再培养12hr。向每孔加入10µlCCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力。对应浓度的DRI-TAT-Control处理细胞，作为对照组。所获CCK细胞活力曲线见图11A（A549）、图11B（Hela）、图11C（MDA-MB-231）、图11D（MCF-7）、图11E（ZR-75-30）。结果表明，DRI-R9-M1-21可明显抑制多种肿瘤细胞的增殖。
实施例 14，DRI-TAT-M1-21多肽抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的迁移能力。
为验证DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤细胞的迁移，运用划痕实验考察DRI-TAT-M1-21对肿瘤细胞迁移表型的影响。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，消化吹散后，高密度接种细胞培养板，细胞贴壁后密度为100%。用200μl移液枪头在培养的细胞上划出划痕。用不同浓度的DRI-TAT-M1-21（8、30μM）进行处理细胞样本，DRI-TAT-Control（30μM）处理的细胞作为对照。48hr后显微镜下观察和拍照，对比获得DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤细胞迁移的结果，显示DRI-TAT-M1-21可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的迁移（图12A）。收集细胞（30μM处理）制备RNA样本，逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测细胞迁移相关基因E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的表达水平。结果表明，与对照处理的样本相比，DRI-TAT-M1-21明显增高了E-cadherin的表达，明显抑制了Vimentin、的表达（图12B）。收集细胞（30μM处理）制备蛋白样本，运用Western Blotting实验进一步证实了相关结果（图12B）。
实施例 15，DRI-TAT-M1-21多肽抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的集落形成。
运用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成率，考察DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤细胞集落形成的能力。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用不同浓度的DRI-TAT-M1-21（0、4、8μM）进行处理，12hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，在用新鲜培养基进行重悬，使细胞成为单细胞悬液，通过细胞计数，接种250个细胞于6孔板中，平行设置3个重复样品。于37℃细胞培养箱中培养14 天后，吸去培养基，用1xPBS洗3遍，加70%的无水乙醇室温固定30min。吸去乙醇，加500μL的0.1%结晶紫，使其均匀覆盖于细胞，37℃培养箱染色20min。染色完成后，用1xPBS洗涤多余的结晶紫染液，自然晾干，拍照，计算克隆形成率：细胞克隆形成率=细胞克隆个数/接种细胞个数x100%。未进行DRI-TAT-M1-21处理的细胞作为阳性对照，对比获得DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤细胞集落形成的结果，表明DRI-TAT-M1-21可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的体外成瘤能力（图13）。
实施例 16，DRI-TAT-M1-21多肽结合FOXM1并抑制FOXM1转录活性及其下游靶基因Cdc25B的表达。
运用Pull-down实验证实DRI-TAT-M1-21能结合FOXM1。选取生长状态良好的HEK293T 肿瘤细胞，转染pCMV-FOXM1表达质粒，制备获得含FOXM1蛋白的细胞裂解液。采用实施例11中所描述的化学固相合成法，合成Biotin基团标记的DRI-TAT-M1-21多肽（Biotin-D-TAT-M1-21）。取500µg细胞裂解液蛋白样品、10µg Biotin-D-TAT-M1-21与20μLstreptavidin-珠4℃孵育2hr，800rpm、4℃离心5min，去上清，用800μL的PBS洗涤5次，洗涤后加入20μL的PBS，并加入4μL 5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于95℃变性10min，用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。将蛋白样品转至PVDF膜，使用FOXM1抗体检测FOXM1全长蛋白，验证Biotin-D-TAT-M1-21与 FOXM1全长蛋白相互作用。结果表明，与未加入Biotin-D-TAT-M1-21的对照样本相比，可明显观察到其与细胞裂解液中的FOXM1全长蛋白发生相互作用（图14A）。
为证实在均相体系中DRI-TAT-M1-21与FOXM1发生结合，采用实施例11中所描述的化学固相合成法，合成FITC荧光基团标记的DRI-TAT-M1-21多肽（FITC-M1-21），并运用大肠杆菌表达系统制备纯化FOXM1全长蛋白。在Binding buffer中（20mM Tris-Cl，50mM KCl，10% Glycerol，0.5mM EDTA，0.2mM DTT，pH 7.6），将FOXM1全长蛋白与FITC-D-TAT-M1-21混合（FOXM1全长蛋白：FITC-M1-21的摩尔比分别为 0：1、0.5：1、1：1、2：1、4：1），冰上孵育30min。配置4%的非变性PAGE胶（0.5X TBE，4% Acry/Bis，5% Glycerol，0.15% APS，0.05%TEMED）。以0.5X TBE为电泳缓冲液、100V预电泳30min后上样。120V电泳30min，用Kodak荧光成像仪，选取激发波长465nm，发射波长535nm成像。结果表明，在均相体系中DRI-TAT-M1-21与FOXM1发生结合（图14B）。
运用凝胶电泳迁移阻滞实验（EMSA）证实DRI-TAT-M1-21与FOXM1全长蛋白在DNA上发生结合。探针合成：（1）FOXM1结合荧光探针：Forward strand（5’-FAM-TTT GTT TAT TTGTTT GTT TAT TTG-3’）、Reverse strand（5’-FAM-CAA ATA AAC AAA CAA ATA AAC AAA-3’）；（2）FOXM1结合冷探针：Forward strand（5’-TTT GTT TAT TTG TTT GTT TAT TTG-3’）、Reverse strand（5’-CAA ATA AAC AAA CAA ATA AAC AAA-3’）。所合成的单链等量混合，94℃变性10min，自然冷却至室温，-20℃保存。将FOXM1结合荧光探针（50nM）与2μg的FOXM1全长蛋白混合入Binding buffer（20mM Tris-Cl，50mM KCl，10% Glycerol，0.5mM EDTA，0.2mM DTT，pH 7.6），冰上孵育30min。加入100倍过量的FOXM1结合冷探针（5000nM）作为竞争反应，确认结合的特异性。为验证DRI-TAT-M1-21结合，反应中额外加入DRI-TAT-M1-21（DRI-TAT-M1-21：FOXM1 全长蛋白的摩尔比分别为 0.5：1、1：1、2：1）。并设置FOXM1结合荧光探针（50nM）和DRI-TAT-M1-21（80ng）混合的对照组，表明DRI-TAT-M1-21无法单独与探针结合。配置4%的非变性PAGE胶（0.5X TBE，4% Acry/Bis，5% Glycerol，0.15% APS，0.05%TEMED）。以0.5X TBE为电泳缓冲液、100V预电泳30min后上样。120V电泳30min，用Kodak荧光成像仪，选取激发波长465nm，发射波长535nm成像。结果表明，与对照处理的样本相比，显示DRI-TAT-M1-21与FOXM1全长蛋白在DNA上发生结合（图14C）。
运用含Cdc25B 启动子（-1kb）介导的荧光素酶报告基因质粒，与FOXM1表达质粒共转染细胞，荧光素酶报告基因检测实验表明，DRI-TAT-M1-21处理（8μM）对FOXM1的转录活性具有抑制作用。HEK293T细胞转染前一天传至12孔细胞培养板内，待细胞密度长至70-80%时，进行脂质体转染实验。取重组质粒pCdc25Bpro-Luc与pRL-CMV、pCMV-FOXM1混合，补充DMEM培养基至100μL。在另一管中加入5μL DNA Transfection Reagent，补充DMEM培养基至100μL混匀。将混合并充分混匀，室温静置20min，加入到细胞中，37℃培养24hr。用DRI-TAT-M1-21（8μM）进行处理24hr，吸弃12孔板中培养基，PBS轻轻洗涤两次。每孔加入200μL 1×PLB裂解液（Passive Lysis Buffer），放置于摇床上剧烈摇动20min。收集细胞裂解，12,000rpm离心30sec，取上清置于冰上待检测。取12支EP管，每管加入10μL LARII（LuciferaseAsssay Substrate与Luciferase Assay BufferII直接混合），加入10μL细胞裂解液，轻轻混匀，于GLOMA luminometer发光检测仪上读取数值A。取出EP管加入新鲜配制的Stop&GloReagent（Stop&Glo Substrate：Stop&Glo Buffer=1：50）10μL，混匀放入仪器中检测，得到数值B（所有样品加入到检测的时间须一致）；计算三次实验所得A/B均值即可反应出荧光素酶相对表达量，表示启动子的转录活性。结果表明，与对照处理的样本相比，DRI-TAT-M1-21对FOXM1的转录活性具有抑制作用（图14D）。
运用Western Blotting实验，表明DRI-TAT-M1-21能抑制FOXM1对Cdc25B表达的激活能力。选取生长状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，转染重组质粒pCMV-FOXM1，24hr后用DRI-TAT-M1-21（8μM）处理细胞，24hr后Western Blotting检测胞内的FOXM1、Cdc25B的蛋白水平，同时检测β-actin蛋白水平作为上样对照。结果表明，DRI-TAT-M1-21不影响FOXM1的蛋白表达水平，但显著抑制了Cdc25B的表达（图14E）。
实施例 17，野生型小鼠中DRI-TAT-M1-21的耐受剂量分析。
运用健康成年的野生型ICR/JCL小鼠（6周龄），分析小鼠对DRI-TAT-M1-21的耐受剂量。采用腹腔注射（i.p.）方式，分别注射不同剂量的DRI-TAT-M1-21（1.4mg/只、4mg/只，每组3只小鼠，经计算对应的剂量/体重分别为60-80mg/Kg、160-200mg/Kg），对照组为PBS腹腔注射。连续观察小鼠的饮食、活动等情况共14天，未发现小鼠出现异常或死亡。表明野生型小鼠能够耐受高剂量的DRI-TAT-M1-21（图15A）。
实施例 18，野生型BALB/c小鼠中DRI-TAT-M1-21多肽的抗原性分析。
为检测DRI-TAT-M1-21的免疫原性，运用健康成年的野生型BALB/c小鼠（6周龄），采用腹腔注射方式，在0天、7天、14天、21天分4次注射相同剂量的DRI-TAT-M1-21（4mg/Kg体重），并同时设置空白对照组。分别在DRI-TAT-M1-21免疫后，每周（1-8周）一次采集血清样本，按标准方法进行ELISA，检测由DRI-TAT-M1-21免疫产生的抗体的效价。其中，96孔ELISA板用DRI-TAT-M1-21多肽（8μg/孔）作为抗原包被，血清样本用PBS稀释（1：200）。按ELISA标准方法完成待测血清孵育、二抗孵育、显色等步骤后，每孔加终止液，于ELISA检测仪中测定OD490吸光度值。所获结果见图15B。对比相同实验条件下其他具有显著抗原活性的重组蛋白的OD490吸光度值一般高于2（结果未显示），DRI-TAT-M1-21的OD490吸光度最大值小于0.3，表明DRI-TAT-M1-21在野生型小鼠中的免疫原性很低。
实施例 19， DRI-TAT-M1-21多肽和DRI-R9-M1-21多肽的溶血性对比分析。
为比较DRI-TAT-M1-21多肽和DRI-R9-M1-21多肽对正常细胞的毒性，进行这两种多肽对红细胞的溶血性分析。从野生型小鼠心脏抽取血液5ml，加入0.2ml抗凝剂EDTA，PBS洗涤、离心至上清液不显红色，取1ml加入50ml的PBS，获得2%红细胞。用PBS溶液调整DRI-TAT-M1-21多肽和DRI-R9-M1-21多肽浓度（800、400、200、100、50、25μg/ml）。将0.5ml的多肽与0.5ml的2%红细胞溶液混合，室温条件下静止3hr，1000rpm离心3min。取上清100μl加入96孔板，检测OD570吸光度值。以水为阳性对照（全溶血），PBS为阴性对照（非溶血）。计算溶血率（%）=（样品吸光度值-阴性对照吸光度值）/（阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值）×100%。通常将溶血率大于5%视为溶血。所获结果见图15C，显示DRI-R9-M1-21的溶血性较强，DRI-TAT-M1-21在低浓度时不溶血，浓度高于200μg/ml后有一定的溶血性（均小于10%），表明DRI-TAT-M1-21对正常细胞的毒性低于DRI-R9-M1-21。
实施例 20，裸鼠移植瘤模型中DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤形成。
运用乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射裸鼠皮下形成移植瘤（1X106 cells/注射）。1天后腹腔注射DRI-TAT-M1-21（注射剂量4mg/Kg），同时设置PBS腹腔注射对照组（每组4只裸鼠）。分别于细胞注射后15天、25天、35天测量移植瘤大小（图16A）。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积，并统计数据列表。与对照组相比，DRI-TAT-M1-21处理组裸鼠均未出现移植瘤形成（图16B）。对肿瘤细胞移植后35天的裸鼠进行拍照，获得不同组别裸鼠的照片，显示对照组裸鼠移植瘤发生明显，而DRI-TAT-M1-21处理组未见明显肿瘤发生（图16C）。
实施例 21，DRI-TAT-M1-21多肽抑制小鼠乳腺癌细胞株4T1。
为验证DRI-TAT-M1-21对小鼠来源的肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择来源于BALB/c小鼠的乳腺癌4T1细胞，运用商品化的Cell Counting Kit（CCK）试剂盒考察DRI-TAT-M1-21对小鼠肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的DRI-TAT-M1-21（0、1、2、4、8、16、24、28、32、40、60μM）处理细胞，再培养12hr。向每孔加入10μL CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的DRI-TAT-Control多肽处理细胞，作为阴性对照组。所获细胞活力曲线见图17，与对照组样本相比，DRI-TAT-M1-21可明显抑制小鼠乳腺癌4T1细胞的增殖。
实施例 22，DRI-TAT-M1-21处理小鼠乳腺癌4T1细胞抑制了其在野生型BALB/c小鼠皮下形成移植瘤的能力。
为验证DRI-TAT-M1-21抑制肿瘤细胞在野生型小鼠活体中形成移植瘤的能力，运用BALB/c小鼠皮下成瘤实验考察DRI-TAT-M1-21处理后4T1细胞成瘤效率。选取生长状态良好的小鼠乳腺癌4T1细胞，用DRI-TAT-M1-21（8μM）进行处理，加药24hr时后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，用PBS进行重悬。选取4周龄雌性BALB/c小鼠，分为对照组（注射DRI-TAT-Control多肽处理的细胞）和实验组（注射DRI-TAT-M1-21处理的细胞），注射1X106细胞（200μL），拔针后局部按压30sec，防止细胞悬液漏出。继续饲养，分别在第2、4、6、8、10、12、14天测量移植瘤大小，并在第14天拍照。与对照相比，DRI-TAT-M1-21可明显抑制小鼠乳腺癌4T1细胞在野生型小鼠活体中形成移植瘤的能力（图18）。
实施例 23， DRI-R9-M1-11多肽的合成。
采用实施例2中所描述的化学固相合成法，合成DRI型的R9-M1-11多肽DRI-TAT-M1-11 [d-( RRR RRR RRR TPA GGC SIL IF)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH(谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(But)-OH(苏氨酸)、Fmoc-D-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH(亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH(甘氨酸)、Fmoc-D-Ala-OH(丙氨酸)、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(半胱氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH(丝氨酸)、Fmoc-D-Ile-OH(异亮氨酸)、Fmoc-D-Phe-OH(苯丙氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH(赖氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。
对DRI-R9-M1-11合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用ESI-MS进行质谱鉴定，测得合成所得DRI-R9-M1-11成品的实际分子量，质谱图见图19A。通过质谱检测分析得到目标峰为：[M+4H]4H+质核比为621.29，其实测分子量为621.93*4 – 4 = 2483.72，DRI-R9-M1-11理论分子量为2484.0，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图19B。DRI-R9-M1-11成品经分析确定出峰时间为11.127的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到96.37%。
实施例 24，DRI-R9-M1-11多肽抑制肝癌肿瘤细胞株HepG2、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7。
为验证DRI-R9-M1-11对肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择肝癌肿瘤细胞株HepG2、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7，运用商品化的CCK试剂盒考察DRI-R9-M1-11对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的DRI-R9-M1-11（0、1、2、4、8、16、28、32、36、40、60μM）处理细胞，再培养12hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力。对应浓度的DRI-R9-Control处理细胞，作为对照组。所获CCK细胞活力曲线见图20。结果表明，DRI-R9-M1-11可明显抑制多种肿瘤细胞的增殖。
序列表
<110> 长沙新生康源生物医药有限公司
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu
1 5 10 15
Arg Pro Gln Thr Gln
20
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
aaattcatcc tcatcagctg tgggggagcc ccaactcagc ctccaggact ccggcctcaa 60
acc 63

Claims (8)

1.一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为序列表中SEQ ID NO：1序列所示多肽。
2.一种序列表中SEQ ID NO：1序列所示多肽在制备抗肿瘤制剂中的用途。
3.编码序列表中SEQ ID NO：1序列所示多肽的DNA序列。
4.如权利要求3所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
5.含权利要求3或4所述的DNA序列的表达载体。
6.如权利要求2所述的用途，是将所述多肽序列与穿膜肽序列融合，合成得到具有穿膜能力的多肽使用。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：其中穿膜肽可以是多聚精氨酸R9穿膜肽或天然TAT穿膜肽或其他穿膜肽。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于：为增强多肽稳定性合成中采取D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型多肽或运用PEG修饰获得的多肽。
CN201810165364.3A 2018-03-05 2018-03-05 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽 Active CN108440671B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810165364.3A CN108440671B (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810165364.3A CN108440671B (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108440671A CN108440671A (zh) 2018-08-24
CN108440671B true CN108440671B (zh) 2020-03-06

Family

ID=63192655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810165364.3A Active CN108440671B (zh) 2018-03-05 2018-03-05 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108440671B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500457B (zh) * 2020-11-02 2022-06-17 长沙新生康源生物医药有限公司 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2010002002A (es) * 2007-08-20 2010-03-11 Oncotherapy Science Inc Peptido foxm1 y agente medicinal que lo contiene.
CN105999227B (zh) * 2016-08-12 2019-08-06 湖南大学 FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表达及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN108440671A (zh) 2018-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9907857B2 (en) Peptide having cell membrane penetrating activity
CN109575140A (zh) 靶向pd-1或pd-l1且靶向vegf家族的双靶向融合蛋白及其用途
WO2009032477A2 (en) Vegfr-1/nrp-1 targeting peptides
JP2008503216A5 (zh)
CN112500457B (zh) 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽
CN110511269B (zh) 一种与muc4蛋白特异性结合的靶向多肽zp-16在制备药物中的用途
CN104130315A (zh) 一种特异靶向her2蛋白的多肽
CN111303300A (zh) 一种降解crept多肽抑制剂及其在抑制胰腺癌细胞增殖与肿瘤发生过程中的应用
CN105085631A (zh) 一种特异靶向her2蛋白的多肽及其应用
CN107827970B (zh) 一种抑制foxm1的抗肿瘤蛋白肽
CN108440671B (zh) 一种来源于foxm1蛋白的抗肿瘤多肽
CN111793134A (zh) 一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂
CN112409447B (zh) 一种靶向识别膜联蛋白a2的亲和短肽及其制备方法与用途
CN112028982B (zh) 一种靶向pd-l1的共价多肽抑制剂及其制备方法和应用
CN105085632A (zh) 一种特异靶向egfr蛋白的多肽及其应用
CN117098770A (zh) 针对sort1的多肽化合物及其药物偶联物
CN106589062B (zh) 靶向Grb2蛋白的抗肿瘤共价多肽抑制剂及其制备方法和应用
CN104177476A (zh) 一种靶向人癌细胞的多肽及其应用
Wolf et al. The ring size of monocyclic ET‐1 controls selectivity and signaling efficiency at both endothelin receptor subtypes
CN117756909A (zh) 改进的抗衰老化合物及其在癌症治疗中的用途
KR101323669B1 (ko) 암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드
CN113214360B (zh) 一种rhamm拮抗多肽及其衍生物与应用
CN112063640A (zh) 靶向人源化cea的嵌合抗原受体及其用途
CN117534730A (zh) 一种抑制foxm1转录活性的抗肿瘤多肽筛选及其用途
CN116621946B (zh) 多肽circ1946-109aa作为食管鳞癌预后标志物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant