CN112500457B - 一种双重靶向foxm1/cdk1的抗肿瘤多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了来源于FOXM1蛋白碳端689‑748位60氨基酸残基序列的多肽及其合成方法，以及将其序列进一步筛选后得到的M1‑20多肽的合成方法，提供了数种开发多肽类抗肿瘤药物的候选者。所述肽段具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2；2）将序列表中SEQ ID NO：2取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基，得到如序列表中SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4多肽，实现抑制肿瘤。本发明依照序列表中SEQ ID NO：1‑4氨基酸序列所制备的具有穿膜能力的多肽，表现出对多种肿瘤细胞的抑制作用。

Description

一种双重靶向FOXM1/CDK1的抗肿瘤多肽

技术领域

本发明属于多肽药物和肿瘤学领域，涉及到来源于FOXM1蛋白碳端的抗肿瘤多肽的合成及其用途。

背景技术

根据TCGA数据库分析发现，转录因子FOXM1在多种恶性肿瘤中异常高表达，与恶性肿瘤的分期和不良预后有关。失调的FOXM1表达是恶性肿瘤中的早期事件，与恶性肿瘤形成及恶化中的许多病理变化密切相关，FOXM1被认为是一个治疗恶性肿瘤的新靶标（AsianPac J Cancer Prev 2015. 16: 23-29）。FOXM1是一种经典的与细胞增殖相关的转录因子，通过调节细胞周期相关基因的转录，影响细胞有丝分裂、细胞周期和DNA 损伤修复（MolCell Biol 1999. 19: 8570-8580, Proc Natl Acad Sci U S A 2002. 99: 16881-16886, Mol Cell Biol 2005. 25: 10875-10894, Mol Cell Biol 2007. 27: 1007-1016, Cell Prolif 2010. 43: 494-504），干扰其表达可以有效阻滞细胞周期进程、抑制细胞生长。同时，FOXM1过表达也会导致上皮-间质转化，促进肿瘤细胞迁移、侵袭和转移（Oncotarget 2017. 8: 68180-68190）；而FOXM1表达降低则能够有效抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移能力（Cancer Lett 2013. 340: 104-112, Oncol Lett 2020. 19: 77-82）。FOXM1通过调节DNA损伤应答，使肿瘤细胞对治疗药物产生耐药性（Oncogene 2010.29: 2983-2995, Cancer Research 2010. 70: 5054-5063, Molecular Cancer Research2010. 8: 24-34），导致治疗失败。此外，FOXM1在维持肿瘤干细胞特性方面发挥着重要作用（J Exp Clin Cancer Res 2019. 38: 264, Front Oncol 2018. 8: 483,Gastroenterology 2015. 149: 1006-16.e9）。因此，FOXM1蛋白水平为肿瘤的诊断、评估、预后等提供一个重要指标（Biochim Biophys Acta 2007. 1775: 92-102），抑制FOXM1活性也成为癌症治疗的一种潜在策略。目前，研究人员已发现多种FOXM1抑制剂，包括有小分子化合物，如FDI-6、RCM-1（Nat Commun 2014. 5: 5165, Science Signaling 2017. 10:eaai8583）；抗生素类，如硫链丝菌素、盐霉素 A（Cell Cycle 2011. 10: 4341-4342, PLoSOne 2009. 4: e5592, Mol Cancer Ther 2008. 7: 2022-2032, Cancer Res 2006. 66:9731-9735）；蛋白多肽类药物，如p19^ARF26-44、9R-P201、M1-138（Genes Dev 2004. 18: 830-50, Nucleic Acids Research 2010. 38: 8027-8038, Eur J Pharmacol 2017. 796:175-89, Theranostics 2019. 9: 2882-2896），它们通过抑制FOXM1的功能，阻抑了肿瘤的发展。

细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK），属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，是参与细胞周期调节的关键激酶。根据其功能不同主要分为两类，一类参与细胞周期调控，主要包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等；另一类参与转录调节，主要包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11等。其中，CDK1被认为是所有真核细胞细胞分裂的必要条件，它可以分别与周期蛋白Cylcin A、Cyclin B形成复合体，促进细胞周期中的G1/S、G2/M进程。许多研究表明CDK1的过表达与肿瘤发展及不良预后有关（Oncotarget 2016. 7: 49481-49497, BMCCancer 2014. 14: 951），可以作为多种类型癌症的生物标志物（Hereditas 2020. 157:29, Cancer Genet 2020. 245: 27-34, Oncol Lett 2020. 20: 60, Front Genet 2019.10: 695, J Cancer Res Clin Oncol 2020. 146: 1463-1472）。因此，筛选靶向CDK1的抑制剂是实现肿瘤治疗的潜在途径之一。抑制CDK1激酶活性，可以实现细胞周期阻滞（Neuropharmacology 2014. 86: 219-27、Cell Death Discov 2020. 6: 70）；另外，还可以通过抑制活化的CDK1激酶与其底物蛋白的结合实现细胞周期抑制（Cancer Res 2018.78: 6561-6574）。相对于CDK2、CDK4/6等其他CDK激酶抑制剂，CDK1抑制剂对过度表达MYC和P53突变的肿瘤细胞具有更好的抑制活性（Int J Oncol 2018. 53: 1667-1680）。在细胞周期进程中，FOXM1也作为底物被CDK1的磷酸化，激活其转录活性，刺激细胞周期G1/S和G2/M相关基因的转录，进而维持细胞周期的正常进行（Science 2018. 361: 806-810）。本发明以FOXM1为出发点，开发出抑制FOXM1功能的多肽类药物，用于预防、治疗或延缓人类肿瘤。由于FOXM1是CDK1的磷酸化底物，我们发现该多肽也可与CDK1结合，阻止CDK1与FOXM1的结合，进而抑制CDK1的功能，达到抑制肿瘤的目的。

总结开发针对FOXM1的肽段、实现肿瘤治疗的方法，包括以下已公开的发明：1）源自FOXM1 的肽与HLA-A2结合，用以活化可杀死癌细胞的人杀伤 T 细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL），为高水平表达FOXM1的癌症患者提供癌症免疫治疗的手段（CN201510127580.5、US201514729752、CN201080017145.2）。2）以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库筛选获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽，该类多肽可潜在作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断（CN201010515471.8）。3）我们选定FOXM1蛋白序列中的1-234位氨基酸，制备重组穿膜蛋白肽用于开发抗肿瘤蛋白类药物，专利已授权（ZL201610439054.7）。4）我们只选定FOXM1蛋白序列中的1-138位氨基酸制备重组穿膜蛋白肽，能有效抑制多种肿瘤细胞，专利申请已公开（CN201711138488.4），且相关成果已发表科研论文（Theranostics 2019. 9: 2882-2896）。5）我们从FOXM1蛋白序列中的1-138位氨基酸序列进一步筛选，发现其中106-126位21个氨基酸残基具有明显抑瘤效果，用于开发抗肿瘤多肽药物M1-21，专利已授权（ZL201810165364.3）。

总结针对CDK1为靶点开发抑制剂、实现肿瘤治疗的方法，多为小分子化合物（CN201910441888、CN201710422317），目前尚未检索到以CDK1为靶点的多肽类抑制剂。

一般情况下，多肽分子量大、亲脂性低，无法独立穿过细胞膜，不能直接进入细胞达到治疗目的。细胞穿膜肽是由不超过30个氨基酸残基组成，可以有效将多肽、蛋白质、DNA等大分子带入细胞，且不会破坏细胞膜的完整性（Bioorg Med Chem Lett 2018. 28: 378-381, Trends Biochem Sci 2015. 40: 749-764）。天然的细胞穿膜肽TAT，从人免疫缺陷病毒（HIV-1）蛋白中鉴定获得（Pharmacol Ther 2015. 154: 78-86），是一种发现最早、研究最多的阳离子型CPP，能有效地将大分子运输到细胞中，甚至能直接运输到细胞核中（MolPharm 2017. 14: 3644-3659, Proc Natl Acad Sci U S A 1991. 88: 1864-1868, Cell1988. 55: 1189-1193）。TAT还可以显著优化目的蛋白的溶解性、降低药物的敏感性以及提高药物的利用率，是迄今使用领域广且效果佳的穿膜肽。其他天然存在的蛋白也被发现具有跨膜能力的肽段（J Biol Chem 1994. 269: 10444-10450），以此为基础，研究人员设计并开发了融合不同天然穿膜肽序列的嵌合体穿膜肽（如transportan）（FASEB J 1998. 12:67-77）和纯人工设计的穿膜肽（如多聚精氨酸肽段R9等）（J Biol Chem 2001. 276: 5836-5840），通过人工改造并加以修饰进一步提高了其稳定性和穿膜效率（Nucleic Acids Res2011. 39: 3972-3987）。基于其穿膜效率高、细胞对象类型广、细胞毒性低、方法简便等优点，细胞穿膜肽已成为一种广泛使用的药物递送载体（Ther Deliv 2013. 4: 573-591、CN200680049953、200810155949）。细胞穿膜肽的穿膜方式目前公认的主要分为两类，一类是非能量依赖方式直接穿膜，利用与细胞膜上磷脂双分子层等成分的相互作用，通过反转微团模式、地毯模式、打孔模式、质膜稀疏模式等方式进入细胞（J Biol Chem 2009. 284:33957-33965, Int J Biochem Cell Biol 2012. 44: 869-875）；另一类是能量依赖的内吞作用进入细胞，具体可以分为：依赖网格蛋白的内吞作用、依赖小窝蛋白/脂筏的内吞作用、无需载体蛋白介导的内吞作用、大胞饮作用等四种方式（J Biol Chem 2003. 278:585-590）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：本发明以FOXM1为出发点开发蛋白多肽类抗肿瘤药物，具体地，首先是从FOXM1蛋白序列中筛选得到FOXM1碳端689-748位的60个氨基酸残基序列，利用原核表达纯化系统制备得到该序列多肽，并证明其能抑制肿瘤细胞生长。通过进一步筛选，我们发现该序列中709-728位20个氨基酸残基具有明显抑瘤作用，利用化学合成制备包含此序列的多肽，同时证明此多肽可抑制肿瘤细胞，成为抗肿瘤多肽药物的候选者。

本发明与已公开发明的区别，体现在发现FOXM1蛋白序列中碳端的689-748位的60个氨基酸能抑制肿瘤细胞，其核心活性序列具体位于709-728位氨基酸残基，此段多肽同样可以抑制肿瘤细胞。FOXM1蛋白主要由三个功能域组成，分别是：氮端自主抑制区（NRD）、DNA结合区（DBD结构域）、碳端转录激活区（TAD）（Biochim Biophys Acta 2012. 1819: 28-37,Nat Rev Cancer 2013. 13: 482-495）。FOXM1氮端折叠后与碳端转录激活区结合，抑制其转录激活作用（Oncogene 2008. 27: 1696-1704, Elife 2019. 8: e46131）。多个细胞周期相关激酶可以磷酸化FOXM1，引起蛋白构象变化，氮端与碳端的结合消失，从而释放碳端转录激活区。已知的FOXM1激活下游靶基因转录的机制包括：1）通过其DBD结构域直接结合靶基因的启动子，由碳端TAD招募转录复合体（含RNA聚合酶的Basic Complex），激活基因转录，2）FOXM1不直接结合靶基因的启动子，其活化后的氮端与MuvB复合体结合，由MuvB复合体结合靶基因的启动子，从而激活下游基因转录（Nucleic Acids Res 2010. 38: 4527-4538, Genes Dev 2012. 26: 474-489）。本发明肽段筛选自FOXM1的碳端，按照上述FOXM1激活靶基因转录机制的认识，一方面，发明肽段可以与转录复合体互作，从而竞争性抑制FOXM1招募转录复合体；另一方面，发明肽段可以与氮端互作，从而阻断FOXM1氮端与MuvB复合体的结合，也会抑制FOXM1激活转录的功能，实现抑癌目的。另外，CDK1是磷酸化FOXM1的重要激酶（Nat Cell Biol 2008. 10: 1076-1082, Mol Cell Biol 2008. 28: 3076-3087），而本发明肽段中存在CDK1磷酸化位点，具有结合CDK1的潜能，有望成为CDK1磷酸激酶活性的抑制多肽，通过竞争性结合CDK1，抑制CDK1的功能，使FOXM1或其他促癌蛋白底物不能被CDK1磷酸化激活，实现抑癌目的。

本发明以此为基础，发明人通过在肿瘤细胞中过表达FOXM1蛋白序列中689-748位60个氨基酸多肽，证实其可抑制FOXM1的转录活性。另一方面，该多肽同FOXM1竞争与CDK1的结合，并抑制CDK1的磷酸激酶活性。将FOXM1蛋白序列中689-748位氨基酸残基与细胞穿膜肽TAT融合，利用原核表达蛋白纯化系统成功制备得到重组穿膜蛋白肽（命名为M1-60）。实验证实，M1-60可有效进入肿瘤细胞，对多种类型肿瘤细胞，如人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7、小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1等，均具有抑制作用。进一步，从FOXM1蛋白序列中筛选验证709-728位20个氨基酸残基是其抑癌药效核心活性序列。采用化学固相合成方法，制备融合了TAT的第709-728位氨基酸多肽，命名为L-M1-20，发现其同样可以抑制多种类型肿瘤细胞。为进一步增强多肽的稳定性，合成中使用D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型多肽（命名为M1-20），发现M1-20抑制肿瘤细胞的作用浓度比L-M1-20降低近10倍，表明M1-20的抑瘤效果显著提高。将药效核心活性序列中氨基酸残基L709、S715、L716都替换为A后（命名为M1-20mut），其抑瘤效果较M1-20显著降低，因此，本发明中M1-20mut被作为对照肽使用。发明人证实M1-20能够抑制多种肿瘤细胞，如肺癌肿瘤细胞株A549、肝癌肿瘤细胞株HepG2、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7、小鼠乳腺癌细胞4T1等。进一步实验表明，M1-20能够明显抑制肿瘤细胞的迁移和克隆形成能力，表明其可以抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、成瘤等多方面功能。从抑瘤机制上，发明人提供证据表明，M1-20可以抑制FOXM1激活转录的功能，实现抑癌目的；同时，M1-20还可以通过竞争性结合CDK1，抑制CDK1磷酸激酶活性，使FOXM1或其他促癌蛋白底物不能被CDK1磷酸化激活，从而实现M1-20的抑瘤效应。为探讨M1-20的成药性，发明人分析了M1-20在野生型小鼠中的耐受剂量，其耐受剂量可达药物/体重比150 mg/Kg，无明显毒性，无明显溶血反应，显示M1-20具有良好的成药性。更进一步，利用裸鼠移植瘤模型，发明人证实M1-20在活体中可抑制肿瘤的生长。为研究M1-20在野生型动物背景下的抑瘤效果，发明人运用野生型BALB/c小鼠建立4T1细胞皮下移植瘤模型，证实M1-20在野生型动物模型中抑制肿瘤生长。为研究M1-20对荷瘤小鼠生存率的影响，发明人运用野生型BALB/c小鼠建立4T1细胞尾静脉移植瘤模型，证实M1-20在野生型动物模型中可以显著提高荷瘤小鼠的存活时间。为说明本发明的M1-20多肽通过取代、缺失、插入添加一个、两个或数个氨基酸还具备抑瘤作用的可能性，将药效核心活性序列中氨基酸残基I719和I723替换为L，通过化学固相合成优化肽（命名为M1-20high），证实M1-20high比M1-20具有更强的抑瘤效果。另外，发明人合成了从药效核心活性序列中缺失12个氨基酸且额外增加7个氨基酸的DRI型多肽（包含FOXM1蛋白序列702-716位15个氨基酸残基，命名为M1-15），证实M1-15对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231仍具有抑制作用，保持了抑瘤能力。

更具体地，本发明提供了如下。

（1） 一种抗肿瘤的药物，它的起始活性成分为来源于FOXM1蛋白序列中689-748位的60个氨基酸残基构成的多肽，其序列如序列表中SEQ ID NO：1序列所示。

（2） 对（1）中的多肽进一步筛选，得到核心活性序列为709-728位的20个氨基酸，其序列如序列表中SEQ ID NO：2序列所示，实现抗肿瘤的功能。取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，其序列如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4序列所示，保留抗肿瘤的功能。

（3） 编码（1）或（2）所述多肽的DNA序列。

（4） 根据（3）所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：5-8所示。

（5） 含（3）所述DNA序列的表达载体。

（6） 合成（1）所述多肽的方法，是将含所述多肽序列与穿膜肽序列融合，利用原核纯化系统制备得到具有穿膜能力的多肽。

（7） 合成（2）所述多肽的方法，是将含所述多肽序列与穿膜肽序列融合，固相合成得到具有穿膜能力的多肽。

（8） 根据（6）或（7）所述的方法，其特征在于：其中穿膜肽可以是天然TAT穿膜肽或多聚精氨酸R9穿膜肽或其他穿膜肽。

（9） 根据（6）或（7）或（8）所述的方法，其特征在于：为增强多肽稳定性而修饰获得的多肽，如合成中采取D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型多肽或运用PEG修饰获得的多肽。

（9） 如（6）或（7）或（8）所述的方法用于制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。

（10） 一种抗肿瘤的药物，它的起始活性成分为（1）所述多肽，核心活性成分为（2）所述多肽。

附图说明

图 1 显示了哺乳动物细胞表达载体（pCMV-Flag-FOXM1_689-748-GFP）质粒图谱，在肿瘤细胞中转染pCMV-Flag-FOXM1_689-748-GFP质粒可抑制FOXM1的转录活性。

图 2 显示了FOXM1_689-748可以与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1发挥作用。

图 3 显示了通过大肠杆菌诱导表达系统，利用GST标签纯化体系和凝血酶切割技术制备得到重组蛋白TAT-FOXM1_689-748（即M1-60），同时制备得到融合表达细胞穿膜肽TAT的重组蛋白（GST-TAT）作为对照。

图 4 显示了M1-60多肽对小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7的抑制作用，以及M1-60抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1和人宫颈癌肿瘤细胞株Hela的迁移能力。

图 5 显示了M1-60多肽抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的克隆形成能力。

图 6 显示了裸鼠移植瘤模型中M1-60多肽抑制肿瘤形成。

图 7 显示了709-728位氨基酸残基是M1-60的核心活性成分。

图 8显示了采用化学固相合成L-M1-20多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。

图 9 显示了L-M1-20多肽对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的抑制作用。

图 10 显示了采用化学固相合成M1-20多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。

图 11 显示了FITC荧光基团标记的M1-20多肽可有效进入肿瘤细胞。

图 12 显示了M1-20多肽对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、肺癌肿瘤细胞株A549的抑制作用。

图 13 显示了M1-20多肽抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、宫颈癌肿瘤细胞株Hela和小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1的迁移能力。

图 14 显示了M1-20多肽抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的克隆形成能力。

图 15 显示了M1-20多肽抑制FOXM1转录活性及其下游基因PLK1和Cdc25B的表达。

图 16 显示了M1-20多肽与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1发挥作用。

图 17 显示了野生型小鼠中M1-20多肽的耐受剂量分析和溶血性对比分析。

图 18 显示了裸鼠移植瘤模型中M1-20多肽抑制肿瘤形成。

图 19 显示了裸鼠移植瘤模型中M1-20多肽抑制增殖、EMT相关基因的蛋白表达及RNA水平。

图 20 显示了野生型BALB/c小鼠4T1细胞皮下移植瘤模型中M1-20多肽抑制肿瘤形成。

图 21 显示了野生型BALB/c小鼠4T1细胞尾静脉移植瘤模型中M1-20多肽可以延长荷瘤小鼠的存活时间。

图 22 显示了采用化学固相合成M1-20high多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。

图 23 显示了M1-20多肽与M1-20high多肽对人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7发挥抑制作用的浓度差异。

图 24 显示了采用化学固相合成M1-15多肽的质谱分析鉴定图和HPLC分析图。

图 25 显示了M1-15多肽对人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的抑制作用。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例 1，FOXM1蛋白序列中689-748位60个氨基酸多肽可抑制FOXM1的转录激活能力。

1，FOXM1蛋白序列中689-748位60个氨基酸多肽的哺乳动物细胞表达载体（pCMV-Flag-FOXM1_689-748-GFP）的构建。按DNA合成标准方法合成该序列对应的上下游引物，并包含XbaI/EcoRI限制性内切酶位点及N端Flag标签（8个氨基酸），上游引物为：GCT CTA GAA TGGATT ACA AGG ATG ACG ACG ATA AGC CGG AGC CAC AGG TTT CT，下游引物为：GCG AAT TCCTGT AGC TCA GGA ATA AAC T。以FOXM1基因为模板，通过模板与上游引物和下游引物的特异性结合进行延伸，从而大量扩增出FOXM1（689-748）目的基因片段。对所得目的基因片段及pcDNA3.1-GFP载体进行酶切处理，运用XbaI/EcoRI限制性内切酶，分别切出目的基因及载体的粘性末端，并对酶切后的目的基因和载体进行连接反应。取50μl感受态DH5α大肠杆菌置于冰上完全溶解，加入5μl连接产物混匀，冰上孵育20min。42℃热激45sec后冰上放置2min。加入200μl无抗生素的LB培养基，37℃、220rpm培养45min。将菌涂布于LB固体培养基上(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，接种到3mL的LB液体培养基(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃振荡培养12-16hr，收集菌体提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定并测序，获得pCMV-Flag-FOXM1_689-748-GFP表达载体（质粒图谱见图1A）。

2，在肿瘤细胞中过表达FOXM1_689-748可抑制FOXM1的转录活性。将pCMV-FOXM1真核表达质粒（300ng）、pPLK1 promoter-Luciferase报告基因质粒（1μg）、PRL（20ng）及pCMV-Flag-FOXM1_689-748-GFP表达质粒（300ng）共转染Hela肿瘤细胞，48hr后检测荧光素酶报告基因的水平，证实FOXM1_689-748对FOXM1转录活性的抑制效果（图1B）。对应的细胞样品用于制备细胞裂解液，运用Western Blotting分别检测PLK1、FOXM1蛋白的表达水平，同时检测beta-actin蛋白水平作为上样对照（图1B），显示过表达FOXM1_689-748可抑制FOXM1靶基因PLK1的表达。

实施例 2，FOXM1_689-748可以与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1发挥作用。

为验证FOXM1_689-748与CDK1互作，采用GST pull down实验，通过纯化带有GST标签的FOXM1_689-748，同时收集MDA-MB-231细胞裂解液，然后将GST-Beads及纯化的蛋白与细胞裂解液4ºC共同孵育4hr，离心收集GST-Beads，用PBS洗3次以充分洗去未结合的蛋白，最后加入50μl PBS，加入5×loading buffer，100℃变性10min。运用Western Blotting实验检测，发现GST-FOXM1_689-748与CDK1互作（图2A）。同时运用CO-IP实验检测，通过在293T细胞中转染pcDNA3.1-Flag-FOXM1_689-748-GFP，收集细胞裂解液，利用Flag Affinity Gel拖Flag-FOXM1_689-748-GFP及其互作蛋白，通过Western Blotting实验检测再次验证FOXM1_689-748与CDK1互作（图2B）。此外，为验证FOXM1_689-748可以与FOXM1竞争性结合CDK1，通过在293T细胞中共转pcDNA3.1-His-CDK1、pcDNA3.1-FOXM1及不同量的pcDNA3.1-Flag-FOXM1_689-748-GFP质粒（1μg、3μg、5μg），收集细胞裂解液，利用His-Beads去拖His-CDK1及其互作蛋白，通过Western Blotting实验检测发现FOXM1_689-748可以与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1与底物结合而发挥作用（图2C-D）。

实施例 3，M1-60多肽重组蛋白制备。

采用原核表达纯化体系，利用GST标签及其所带的凝血酶识别切割位点纯化GST重组蛋白并将GST标签蛋白切除。

1，FOXM1蛋白序列中689-748位60个氨基酸多肽的原核细胞表达载体（pGEX-4T2-FOXM1_689-748-TAT）的构建。按DNA合成标准方法合成对应的上下游引物，并包含BamHI/XhoI限制性内切酶位点及C端细胞穿膜肽TAT（11个氨基酸），上游引物为：GCG GAT CCA TGT CCCCGG AGC CAC AGG TT，下游引物为：GCC TCG AGC TAA CGG CGA CGC TGA CGA CGT TTT TTACGG CCA TAC TGT AGC TCA GGA AT。以FOXM1基因为模板，通过模板与上游引物和下游引物的特异性结合进行延伸，从而大量扩增出TAT-FOXM1（689-748）目的基因片段。对所得目的基因片段及pGEX-4T2载体进行酶切处理，运用BamHI/XhoI限制性内切酶分别切出目的基因及载体的粘性末端，并将酶切后的目的基因和载体22℃连接2hr。取50μl感受态DH5α大肠杆菌置于冰上完全溶解，加入5μl连接产物混匀，冰上孵育20min。42℃热激45sec后冰上放置2min。加入200μl无抗生素的LB培养基，37℃、220rpm培养45min。将菌涂布于LB固体培养基上(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，接种到3mL的LB液体培养基(含25μg/mL 氨苄青霉素)，37℃振荡培养12-16hr，收集菌体提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定并测序，获得pGEX-4T2-FOXM1_689-748-TAT表达载体（质粒图谱见图3A）。此外，对照质粒pGEX-4T2-TAT直接合成TAT序列引物，上游引物为：GAT CCT ATG GCC GTA AAA AACGTC GTC AGC GTC GCC GTC TCG AGG，下游引物为：TCG AGA CGG CGA CGC TGA CGA CGTTTT TTA CGG CCA TAG GAT CCG，上下游引物1：1混合退火结合后，直接与酶切后的pGEX-4T2连接，接着转化，鉴定，获得pGEX-4T2-TAT质粒（质粒图谱见图3B）。将以上获得的质粒转化到感受态BL21大肠杆菌表达菌株中，挑选单克隆过夜培养后，保存菌种，以便后续蛋白纯化使用。

2，M1-60重组蛋白的纯化。取1中表达菌液于20ml 含氨苄LB液体培养基中，在37℃摇床中220 rpm培养10-15h。将已培养好的菌液转移到500ml LB液体培养基进行扩大培养，并加入相应浓度的抗生素，37℃，220rpm，培养2.5hr。同时取25ml过夜培养后的菌液，8000rpm离心5min，收集菌体沉淀，加入适量PBS漂洗一次，再加入5ml的PBS重悬菌体，加入溶菌酶使其终浓度达到200-400µg/ml，置于冰中并在水平摇床上摇晃30min，使用20%的功率超声10min（超4s，停3s），8000rpm离心5min，收集上清，测量蛋白浓度并做好标记，加入5×loading buffer于98℃金属浴变性10min后-20℃保存备用，用做考马斯亮蓝染色的未诱导对照组。待扩大培养的细菌OD值达到0.8左右，加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.8mM，25℃，220rpm，过夜诱导表达。4000rpm、离心20min，收集诱导后的菌体。根据收集到的每克细菌沉淀湿重按照1g/2-5ml的比例加入PBS，于振荡器振荡，充分重悬混匀菌体。加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶并混匀，放于冰浴中在摇床上孵育30min。然后使用20%功率在冰水浴中超声30min（超4s，停3s）裂解细菌。4℃，10000rpm离心20min，取上清裂解液于另一干净的管中，置于冰上。另外取50μl裂解上清，加入5×loading buffer于98℃变性10min后保存备用，留作考马斯亮蓝染色的诱导后对照组。将试剂盒中的GST-tag Purification Resin混合均匀，取出1ml装入到的空的亲和层析柱中，打开纯化柱下面的盖子，使储存液在重力作用下流出，然后往柱内凝胶中轻轻加入0.5-1ml裂解缓冲液（PBS）以平衡凝胶，重复平衡3-4次，待裂解缓冲液流出后，用盖子封住纯化柱下端的流出口，加入3ml细菌裂解液上清，再将上面的进样口塞住，把纯化柱置于4ºC摇床缓慢摇动孵育60min。孵育完毕后去除上端的塞子，打开纯化柱下端的盖子，使柱里面的细菌裂解液上清在重力作用下流出，收集50μl流穿液变性后备用留作后续分析使用。把多余的还未孵育的细菌诱导后的裂解上清液进行过柱，并收集流穿液，流穿液重复过柱5-6次使目的蛋白充分与凝胶结合。接着洗柱，轻轻加入1ml裂解缓冲液过柱洗涤未结合的杂蛋白，并收集50μl穿流液，变性后用于后续分析。重复洗柱6-8次。洗柱过程中同时可以检测穿流液中的蛋白浓度，以判断增加或减少洗涤的次数。如果后续检测纯化的目的蛋白纯度较低，可以自行调整增加洗柱的次数。最后柱上酶切GST标签，在纯化柱中加入1ml酶切buffer，重复该操作3-4次以平衡体系。用盖子封住纯化柱下端流出口，加入0.5ml酶切buffer，同时加入8μl凝血酶，用塞子封住上端进样口，置于摇床缓慢摇动，室温酶切2.5hr。GST-TAT为对照蛋白，无需酶切。收集的穿流液即纯化的目的蛋白，加入0.5ml酶切buffer过柱洗涤，重复2次，收集穿流液即为无GST标签的目的蛋白M1-60，测量穿流液蛋白浓度做好标记，分别另取30-50μl穿流液变性后考染备用，其余加入20%甘油保存于-80℃冰箱中待用。考染结果如图3C所示，利用以上方法可以获得纯度较高的M1-60和GST-TAT重组蛋白。

实施例 4，M1-60多肽抑制小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7的生长。

为验证M1-60对肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7，运用商品化的CellCounting Kit（CCK）试剂盒考察M1-60对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液(100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的M1-60（0、1、2、4、6、8、12、16μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10% CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4hr。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK8溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK8溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK8溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的GST-TAT处理细胞，作为阴性对照组。所得细胞的CCK8细胞活力曲线见图4A。结果表明，与对照组样本相比，M1-60多肽可明显抑制小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7的增殖。

实施例 5，M1-60多肽抑制小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的迁移。

为验证M1-60抑制肿瘤细胞的迁移，运用划痕实验考察M1-60对肿瘤细胞迁移表型的影响。选取处于对数生长期状态良好的人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1，消化吹散后，高密度接种细胞培养板，细胞贴壁后密度为100%。用200μl移液枪头在培养的细胞上划出划痕。用不同浓度的M1-60（5、8、8μM）分别处理细胞样本，相应浓度的GST-TAT（5、8、8μM）处理细胞作为对照。分别在12、16、6hr后显微镜下观察和拍照，对比获得M1-60抑制肿瘤细胞迁移的结果，显示M1-60可明显抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、人宫颈癌肿瘤细胞株Hela、小鼠乳腺癌肿瘤细胞株4T1的迁移（图4B）。收集231细胞（5μM处理）制备RNA样本，逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测细胞迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的转录水平。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-60明显增高了E-cadherin的mRNA水平，明显抑制了Vimentin的mRNA水平（图4C）。收集231细胞（5μM处理）制备蛋白样本，运用Western Blotting实验进一步证实了相关结果（图4D）。

实施例 6，M1-60多肽抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的集落形成。

运用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成率，考察M1-60抑制肿瘤细胞集落形成的能力。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用M1-60（2μM）进行处理，12hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，在用新鲜培养基进行重悬，使细胞成为单细胞悬液，通过细胞计数，接种250个细胞于6孔板中。于37℃细胞培养箱中培养14天后，吸去培养基，用1xPBS洗3遍，加入4%多聚甲醛室温固定30min。吸去多聚甲醛，加500μL的0.1%结晶紫，使其均匀覆盖于细胞，37℃培养箱染色20min。染色完成后，用1xPBS洗涤多余的结晶紫染液，自然晾干，拍照，计算克隆形成率：细胞克隆形成率=细胞克隆个数/接种细胞个数x100%。未进行M1-60处理的细胞和GST-TAT（2μM）处理组作为阳性对照，对比获得M1-60抑制肿瘤细胞集落形成的结果，表明M1-60可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的体外成瘤能力（图5A）。同时，收集231细胞（5μM处理）制备RNA样本，逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测细胞中FOXM1及其相关基因CDC25B的转录水平。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-60明显抑制了FOXM1、CDC25B的mRNA水平（图5B）。收集231细胞（5μM处理）制备蛋白样本，运用Western Blotting实验进一步证实了相关结果，同时与增殖相关基因PCNA、CDK1的蛋白水平也明显降低（图5C）。

实施例 7，裸鼠移植瘤模型中M1-60抑制肿瘤形成。

运用乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射裸鼠皮下形成移植瘤（1X10⁶ cells/注射）。待1周后出现明显的肿瘤结节，开始腹腔注射M1-60（注射剂量20mg/Kg），设置PBS腹腔注射对照组（每组3只裸鼠），每隔一天给药一次，同时测量小鼠体重和移植瘤大小。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积（图6A），并统计数据列表。与对照组相比，M1-60处理组裸鼠体重未有明显变化，移植瘤体积明显减小（图6B-D）。同时，收集裸鼠皮下瘤，进行组织匀浆充分研磨，离心收集上清。运用Western Blotting实验检测，结果表明相比对照组，M1-60给药处理后肿瘤细胞中FOXM1及其相关靶基因PLK1蛋白水平均有所下调，与增殖相关的基因PCNA、CDK1蛋白水平也有下降，EMT相关基因E cad表达上调，vim蛋白水平下调（图6E），结果进一步证实M1-60可以抑制裸鼠移植瘤的形成。

实施例 8，709-728位氨基酸残基是M1-60的核心活性成分。

为进一步优化M1-60多肽序列，寻找其核心活性位点，将肽链分为三段，利用固相化学合成的方法，分别合成三段多肽，质谱和HPLC结果见图7A-C。多肽的理论分子量分别为3403.9、3571.2、3706.08，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致。经HPLC鉴定通过积分可看出其纯度可分别达到98.91%、93.36%、93.46%。为了验证短肽对肿瘤细胞增殖的抑制作用，选择人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231，运用商品化的CellCountig Kit（CCK）试剂盒考察三段短肽对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的三段多肽（0、5、10、15、20、30、40、50、60μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10% CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4hr。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK8溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK8溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK8溶液而没有药物溶液孔的吸光度。所得细胞的CCK8细胞活力曲线见图7D。结果表明，709-728位氨基酸残基可明显抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的增殖，是M1-60发挥作用的核心活性成分。

实施例 9，L-M1-20多肽化学固相合成工艺。

采用化学固相合成法，合成L-M1-20天然多肽（RKK RRQ RRR GLD TMN DSL SKILLD ISF PGL）。以10毫克产物合成为例说明，更大规模合成可按标准工艺进行放大。

1，主要原料和试剂。

Fmoc-Gln(Trt)-OH (谷氨酰胺)、Fmoc-Thr(tBu)-OH (苏氨酸)、Fmoc-Pro-OH (脯氨酸)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH (精氨酸)、Fmoc-Leu-OH (亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH (甘氨酸)、Fmoc-Ile-OH (异亮氨酸)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH (天冬氨酸)、Fmoc-Ser(Tbu)-OH (丝氨酸)、Fmoc-Phe-OH (苯丙氨酸)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (赖氨酸)、Fmoc-Asn(Trt)-OH (天冬酰胺)、Fmoc-Met-OH (甲硫氨酸)、2-Chlorotrityl Chloride Resin (2氯树脂)、DMF (N,N-二甲基甲酰胺)、DCM (二氯甲烷)、乙腈、HBTU (苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、DIEA (N,N-二异丙基乙胺)、TFA (三氟乙酸)、TIS (三异丙基硅烷)、EDT (1,2-乙二硫醇)、乙醚、哌啶、乙醇、茚三酮、苯酚、吡啶。

2，固相合成方法及步骤。

2.1 合成路线工艺流程。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，形成裸露的羧基。

2.2 树脂的溶胀。称取二氯树脂0.39g（合成目的肽为0.0078μmol，所用二氯树脂的取代度为0.2mmol/g，按照10倍过量，则所需的二氯树脂质量为0.0078/0.2*10=0.39g），放入反应柱里，然后在反应柱里加入20毫升DCM，振荡30min，活化待用。

2.3 连接首个氨基酸。抽滤掉DCM溶剂，加入1.05倍树脂摩尔量的Fmoc-Leu-OH，再加入10倍树脂摩尔量的DIEA，最后加入少量的DMF溶解，振荡1h。反应完后用DMF和DCM交替清洗6遍。

2.4 脱保护。加入20毫升20%哌啶/DMF溶液，5min后抽掉。再加入20毫升20%哌啶/DMF溶液，振荡15min。

2.5 检测。抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应，可以继续接下一个氨基酸，如果不变色则为阴性，需要重新脱保护。

2.6 首次清洗。依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。

2.7 缩合。加入3倍树脂摩尔量的Fmoc-Gly-OH，3倍树脂摩尔量的HBTU，均用少量的DMF溶解，立刻加入10倍树脂摩尔量的DIEA，反应30min。

2.8 检测。抽掉DMF，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，吡啶，苯酚各一滴，105℃-110℃加热5min，此时若不变色则为阳性，说明缩合完全。若变蓝色则反应未完成，需重新缩合。

2.9 第二次清洗。依次用15毫升DMF，15毫升甲醇，15毫升DMF分别清洗两次。

2.10 肽链的延伸。按照以上方法重复操作，依次接完剩余的氨基酸。

2.11 氨基酸侧链脱保护与树脂的切割。合成L-M1-20多肽序列为RKK RRQ RRRGLD TMN DSL SKI LLD ISF PGL，其中含有的侧链保护基有：Pbf、Trt、Tbu、Boc、tBu、Trt、OtBu，这几种保护基在酸性条件下不稳定，而切割树脂用的是TFA，所以脱保护和切割树脂可以同时进行。配置切割液15ml，其中各组分的体积比为：TFA(94.5%)、水(2%)、EDT(2.5%)、TIS(1%)。将树脂装入烧瓶中，恒温(30℃)振荡2h。将裂解液用氮气尽量吹干，然后倒入离心管中，缓慢倒入乙醚。封口并放入离心机中离心5min，倒掉上清液，下方为白色固体。再用乙醚洗6次，然后真空冷冻抽干，即得粗品肽。

2.12 HPLC纯化。（1）溶解。将粗品肽放入器皿中，用30-50ml浓度为50%的乙腈水溶液完全溶解，可以稍微超声2min。（2）过滤。用0.45μm滤膜过滤溶解液。（3）分析。取3μl溶液用分析级HPLC分析粗品以便于后续制备。流动相是水和乙腈，时间100min，梯度洗脱，先将HPLC用起始梯度平衡5min然后进样，起始梯度为：水95%，乙腈5%，结束梯度为：水30%，乙腈70%。（4）制备。将溶解好的样品做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度为：水95%，乙腈5%，结束梯度为：水50%，乙腈50%，梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。

3，L-M1-20合成产品的质谱鉴定和纯度鉴定。

3.1 质谱鉴定分析。利用MALDI TOF进行质谱鉴定，测得合成所得L-M1-20成品的实际分子量，质谱图见图8A。通过质谱检测分析得到目标峰分子量为3572.764，L-M1-20的理论分子量为3571.15，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。

3.2 HPLC分析。采用LC3000型高效液相色谱仪，色谱分析条件：C18，反相，4.6mm*150mm，梯度洗脱。起始梯度为5%A+95%B，结束梯度为30%A+70%B，时间是100min，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为214nm，进样量为10μl。流动相A为0.05%三氟乙酸在100%乙腈，流动相B为0.05%三氟乙酸在100%水。结果见图8B。L-M1-20成品经分析确定出峰时间为68.305的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到74.840%。

实施例 10， L-M1-20多肽抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231。

为验证L-M1-20对癌细胞增殖的抑制作用，选择乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231，运用商品化的CCK8试剂盒考察L-M1-20对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液(100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的L-M1-20（0、20、40、60、80、100μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10% CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4h。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK8溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK8溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK8溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的TAT多肽处理细胞，作为阴性对照组。所获MDA-MB-231细胞的细胞活力曲线见图9。结果表明，与对照组样本相比，L-M1-20可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。

实施例 11， M1-20多肽的合成。

采用实施例9中所描述的化学固相合成法，合成DRI型多肽M1-20[d-(GRR RQR RKKRLG PFS IDL LIK SLS DNM TDL)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH (谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(tBu)-OH (苏氨酸)、Fmoc-D-Pro-OH(脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH (亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH (甘氨酸)、Fmoc-D-Ile-OH (异亮氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH (天冬氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH (丝氨酸)、Fmoc-D-Phe-OH (苯丙氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (赖氨酸)、Fmoc-D-Asn(Trt)-OH (天冬酰胺)、Fmoc-D-Met-OH (甲硫氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。

对M1-20合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用MALDI TOF进行质谱鉴定，测得合成所得M1-20成品的实际分子量，质谱图见图10A。通过质谱检测分析得到1个目标峰，分子量为3572.457，M1-20理论分子量为3571.15，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图10B。M1-20成品经分析确定出峰时间为28.878的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到93.46%。

实施例 12，M1-20多肽可有效进入肿瘤细胞。

采用实施例9中所描述的化学固相合成法，合成FITC荧光基团标记的M1-20多肽，并用其处理MDA-MB-231乳腺癌细胞（20μM）。12hr后，PBS清洗，4%甲醛固定细胞样品。荧光显微镜观察该多肽在细胞内的分布（400X），证实FITC荧光基团标记的M1-20多肽能有效穿膜进入细胞中（图11A）。

实施例 13，M1-20多肽抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、肺癌肿瘤细胞株A549。

为验证M1-20对癌细胞增殖的抑制作用，选择乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和MCF-7、宫颈癌肿瘤细胞株Hela、肺癌肿瘤细胞株A549细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察M1-20对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的M1-20（0、10、20、40、60、80μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10%CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4h。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK8溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK8溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK8溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的M1-20mut突变多肽处理细胞，作为阴性对照组。M1-20（40μM）处理24hr后的细胞形态变化见图11B。所获MDA-MB-231、MCF-7、Hela和A549细胞的细胞活力曲线见图12A-D。结果表明，与对照组样本相比，M1-20可明显抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例 14，M1-20多肽抑制宫颈癌肿瘤细胞株Hela、乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的迁移。

为验证M1-20多肽抑制肿瘤细胞的迁移，运用划痕实验考察M1-20多肽对肿瘤细胞迁移表型的影响。选取处于对数生长期状态良好的人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和人宫颈癌肿瘤细胞株Hela，消化吹散后，高密度接种细胞培养板，细胞贴壁后密度为100%。用200μl移液枪头在培养的细胞上划出划痕。用不同浓度的M1-20（20、40μM）分别处理细胞样本，相应浓度的M1-20mut突变多肽（20、40μM）处理细胞作为对照。分别在5、22hr后显微镜下观察和拍照，对比获得M1-20抑制肿瘤细胞迁移的结果，显示M1-20可明显抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231和人宫颈癌肿瘤细胞株Hela的迁移（图13A-B）。收集231细胞（20μM处理）制备蛋白样本，运用Western Blotting实验检测，结果表明M1-20明显增高了E-cadherin的蛋白水平，明显抑制了Vimentin的蛋白水平（图13C）。

实施例 15，M1-20多肽抑制人乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的集落形成。

运用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成率，考察M1-20抑制肿瘤细胞集落形成的能力。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用M1-20（10μM）进行处理，12hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，在用新鲜培养基进行重悬，使细胞成为单细胞悬液，通过细胞计数，接种250个细胞于6孔板中。于37℃细胞培养箱中培养14 天后，吸去培养基，用1xPBS洗3遍，加入4%多聚甲醛室温固定30min。吸去多聚甲醛，加500μL的0.1%结晶紫，使其均匀覆盖于细胞，37℃培养箱染色20min。染色完成后，用1xPBS洗涤多余的结晶紫染液，自然晾干，拍照，计算克隆形成率：细胞克隆形成率=细胞克隆个数/接种细胞个数x100%。未处理的细胞和M1-20mut（10μM）处理组作为对照，对比获得M1-20抑制肿瘤细胞集落形成的结果，表明M1-20可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的体外成瘤能力（图14A）。同时，收集231细胞（20μM处理）制备蛋白样本，运用Western Blotting实验检测，结果表明，M1-20明显抑制了FOXM1、PLK1的蛋白水平，同时与增殖相关基因PCNA、CDK1的蛋白水平也明显降低（图14B），进一步证实了M1-20可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的增殖能力。

实施例 16，M1-20多肽抑制FOXM1的转录激活能力。

将pCMV-FOXM1真核表达质粒（400ng）、pCDC25B promoter-Luciferase报告基因质粒（1.2μg）和PRL（20ng）表达质粒共转染293T肿瘤细胞，8hr后更换细胞培养基，同时实验组加入M1-20（10μM），对照组加入M1-20mut（10μM），24hr后检测荧光素酶报告基因的水平，证实M1-20对FOXM1转录激活CDC25B具有抑制作用（图15A）。同时，在Hela细胞中共转pCMV-FOXM1真核表达质粒（400ng）、pPLK1 promoter-Luciferase报告基因质粒（1.2μg）和PRL（20ng）表达质粒，8hr后更换细胞培养基，同时实验组加入M1-20（20μM），对照组加入M1-20mut（20μM），24hr后检测荧光素酶报告基因的水平，同样证实M1-20抑制FOXM1转录调节PLK1（图15B）。上述结果表明，M1-20多肽抑制FOXM1转录激活下游基因的能力。

实施例 17，M1-20多肽与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1发挥作用。

为验证M1-20与CDK1互作，采用 pull down实验，将M1-20多肽的N端进行生物素标记得到生物素化多肽（biotin-M1-20），同时收集MDA-MB-231细胞裂解液，然后将Streptavidin Agarose Resins及生物素标记多肽与细胞裂解液4ºC共同孵育2-4hr，离心收集Resins，用Washing buffer洗3次以充分洗去未结合的蛋白，最后加入50μl Washingbuffer，加入5×loading buffer，100℃变性10min。运用Western Blotting实验检测，发现M1-20与CDK1互作（图16A）。同时运用CO-IP实验检测，通过在293T细胞中转染pcDNA3.1-Flag-CDK1和pcDNA3.1-FOXM1质粒，收集细胞裂解液，在裂解液中分别加入不同浓度的biotin-M1-20多肽，利用Flag Affinity Gel拖Flag-CDK1及其互作蛋白，通过WesternBlotting实验检测再次验证M1-20可以与FOXM1竞争性结合CDK1（图16B）。此外，通过在Hela细胞中转染pcDNA3.1-FOXM1质粒，8hr后更换细胞培养基，同时加入biotin-M1-20（20μM）处理细胞，24hr后提取细胞质和细胞核蛋白。运用Western Blotting实验检测，结果表明细胞核中CDK1、FOXM1水平明显下调。这一系列结果表明M1-20多肽与FOXM1竞争性结合CDK1，进而抑制CDK1发挥作用（图16C）。

实施例 18，野生型小鼠中M1-20的耐受剂量分析。

运用健康成年的野生型BALB/c小鼠（6周龄），分析小鼠对M1-20的耐受剂量。采用腹腔注射（i.p.）方式，分别注射不同剂量的M1-20（2.2mg/只、3.4mg/只，每组3只小鼠，经计算对应的剂量/体重分别为90-110mg/Kg、140-160mg/Kg），对照组为PBS腹腔注射。连续观察小鼠的饮食、活动等情况共14天，未发现小鼠出现异常或死亡。表明野生型小鼠能够耐受高剂量的M1-20（图17A）。

实施例 19，M1-20多肽的溶血性分析。

为比较M1-20多肽对正常细胞的毒性，进行M1-20多肽对红细胞的溶血性分析。从野生型小鼠心脏抽取血液1ml，加入40μl抗凝剂EDTA，PBS洗涤、离心至上清液不显红色，取1ml加入50ml的PBS，获得2%红细胞溶液。用生理盐水调整M1-20多肽浓度（800、400、200、100、50、25μg/ml）。将250μl的多肽与250μl的2%红细胞溶液混合，室温条件下静止3hr，1000rpm离心3min。取上清100μl加入96孔板，检测OD₅₉₅吸光度值。以水为阳性对照（全溶血），生理盐水为阴性对照（非溶血）。计算溶血率（%）=（样品吸光度值-阴性对照吸光度值）/（阳性对照吸光度值-阴性对照吸光度值）×100%。通常将溶血率大于5%视为溶血。所获结果见图17B，显示M1-20多肽在低浓度时不溶血，浓度较高时有一定的溶血性（均小于10%），表明M1-20多肽在正常给药剂量范围下对细胞无毒性。

实施例 20，裸鼠移植瘤模型中M1-20抑制肿瘤形成。

运用乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射裸鼠皮下形成移植瘤（1X10⁶ cells/注射）。1周后待出现明显的肿瘤结节，开始腹腔注射M1-20（注射剂量45mg/Kg），同时设置生理盐水腹腔注射对照组（每组3只裸鼠），每隔一天给药一次，同时测量小鼠体重和移植瘤大小（实验设计方案见图 18A）。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积，并统计数据列表。与对照组相比，M1-20处理组裸鼠体重未有明显变化（图18B），移植瘤体积明显减小（图18C-E）。收集裸鼠皮下瘤，提取RNA，逆转录为cDNA，进行RT-PCR检测发现FOXM1及其下游靶基因CDC25B、PLK1的RNA水平均有所下调，与增殖相关的基因CDK1、CCNB1的RNA水平也呈现下调（图19A）。同时，将肿瘤进行组织匀浆充分研磨，离心收集上清。运用Western Blotting实验检测，结果表明相比对照组，M1-20给药处理后肿瘤细胞中FOXM1蛋白水平均有所下调，与增殖相关的基因PCNA、CDK1蛋白水平也有下降，EMT相关基因E cad表达上调，Vim、Twist、Slug蛋白水平下调（图19B），结果进一步证实M1-20可以抑制裸鼠移植瘤的形成。

实施例 21，野生型BALB/c小鼠模型中M1-20抑制肿瘤形成。

运用小鼠乳腺癌4T1细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射BALB/c小鼠皮下形成移植瘤（1X10⁶ cells/注射）。1周后待出现明显的肿瘤结节，开始腹腔注射M1-20（注射剂量45mg/Kg），同时设置生理盐水腹腔注射对照组和M1-20 mut对照组（每组6只鼠），每隔一天给药一次，同时测量小鼠体重和移植瘤大小。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积（图20A），并统计数据列表。与对照组相比，M1-20处理组裸鼠移植瘤体积明显减小（图20B-C），进一步证实M1-20可以抑制肿瘤形成。

实施例 22，野生型BALB/C小鼠转移瘤模型中M1-20延长小鼠存活时间。

运用小鼠乳腺癌4T1细胞，采用尾静脉注射（i.v.）方式，注射BALB/c小鼠尾静脉形成转移瘤（1X10⁵ cells/注射）。3天后，开始腹腔注射M1-20（注射剂量20mg/Kg），同时设置生理盐水腹腔注射对照组（每组6只鼠），每隔一天给药一次，同时测量小鼠体重和移植瘤大小。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积（图21A），并统计数据列表。与对照组在实验后期出现体重下降和死亡相比，M1-20处理组裸鼠体重未有明显变化（图21B），存活时间明显延长（图21C）。通过解剖对照组小鼠发现已出现明显的肺部转移，证实M1-20可以抑制转移瘤形成进程（图21D），延长小鼠存活时间。

实施例 23，M1-20high多肽的合成。

采用实施例9中所描述的化学固相合成法，合成DRI型的M1-20high多肽（DRI-TAT-M1-20 I719L I723L ）[d-(GRR RQR RKK RLG PFS LDL LLK SLS DNM TDL)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH (谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(tBu)-OH (苏氨酸)、Fmoc-D-Pro-OH (脯氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH (亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH (甘氨酸)、Fmoc-D-Ala-OH (丙氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH (天冬氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH (丝氨酸)、Fmoc-D-Phe-OH (苯丙氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (赖氨酸)、Fmoc-D-Asn(Trt)-OH (天冬酰胺)、Fmoc-D-Met-OH (甲硫氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。

对M1-20high合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用MALDI TOF进行质谱鉴定，测得合成所得M1-20high成品的实际分子量，质谱图见图22A。通过质谱检测分析得到目标峰，分子量为3571.769，M1-20high理论分子量为3571.15，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图22B。M1-20high成品经分析确定出峰时间为65.062的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到86.568%。

实施例 24，M1-20high多肽比M1-20多肽更有效地抑制肿瘤细胞。

选择乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞，运用商品化的CCK8试剂盒考察M1-20high对肿瘤细胞增殖的影响，并设置M1-20处理组做对照。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的M1-20、M1-20high（0、10、20、40、60、80μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10% CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4h。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力。所获MDA-MB-231和MCF-7细胞的抑制结果见图23。结果显示M1-20high多肽实现抑瘤IC50浓度低于M1-20多肽，表明M1-20high多肽比M1-20多肽更有效地抑制乳腺癌细胞。

实施例 25，M1-15多肽的合成。

采用实施例9中所描述的化学固相合成法，合成DRI型的M1-15多肽 [d-(GRK KRRQRR RLS DNM TDL VLG ETL S)]。主要原料和试剂中的氨基酸全部采用D-型氨基酸，包括：Fmoc-D-Gln(Trt)-OH (谷氨酰胺)、Fmoc-D-Val-OH、Fmoc-D-Gln(Trt)-OH (谷氨酰胺)、Fmoc-D-Thr(tBu)-OH (苏氨酸)、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (精氨酸)、Fmoc-D-Leu-OH (亮氨酸)、Fmoc-Gly-OH (甘氨酸)、Fmoc-D-Asp(OtBu)-OH (天冬氨酸)、Fmoc-D-Ser(Tbu)-OH(丝氨酸)、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH (赖氨酸)、Fmoc-D-Asn(Trt)-OH (天冬酰胺)、Fmoc-D-Met-OH (甲硫氨酸)。本方法选用的树脂载体为2氯树脂，树脂上的活性位点为卤素氯，多肽固相合成首先将树脂溶胀，再将第一个氨基酸的C端羧基与树脂上的活性位点氯反应，待首个氨基酸接在树脂上以后，进行脱水缩合接第二个氨基酸，缩合完成后再脱Fmoc保护。按照设计的氨基酸序列重复操作，依次接完其余的氨基酸，最后用切割试剂把多肽从树脂上切割下来，即得粗品肽。进一步用高效液相色谱（HPLC）将粗品提纯。

对M1-15合成产品进行质谱鉴定和纯度鉴定。利用MALDI TOF进行质谱鉴定，测得合成所得M1-15成品的实际分子量，质谱图见图24A。通过质谱检测分析得到目标峰，分子量为2986.731，M1-15理论分子量为2986.4，质谱实际测得的分子量误差均在允许误差0.1%内，即两者一致，证明成功合成。采用高效液相色谱仪，色谱分析果见图24B。M1-15成品经分析确定出峰时间为56.608的最高峰为面积最大峰，此处为产物可达到的纯度，通过积分可看出其纯度达到71.752%。

实施例 26，M1-15多肽抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231。

选择乳腺癌MDA-MB-231细胞，运用商品化的CCK8试剂盒考察M1-15对肿瘤细胞增殖的影响，并设置TAT-Control做对照。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO₂）预培养12hr后，用不同浓度的M1-15（0、10、20、40、60、80μM）处理细胞，每组三个重复，继续培养36hr。用巴斯德管吸去孔中原有的培养基，加入含10% CCK8的培养基，放于培养箱中孵育1-4h。可随时观察培养基中的颜色变化，待每组之间观察到有明显差异时即可进行检测。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力。对应浓度的TAT-Control处理细胞，作为对照组。所获MDA-MB-231细胞的抑制结果见图25。结果表明，M1-15多肽可有效地抑制乳腺癌MDA-MB-231。

序列表

<110> 长沙新生康源生物医药有限公司

<120> 一种双重靶向FOXM1/CDK1的抗肿瘤多肽

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 70

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Ser Pro Glu Pro Gln Val Ser Gly Leu Ala Ala Asn Arg Ser Leu Thr

1 5 10 15

Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu

20 25 30

Leu Asp Ile Ser Phe Pro Gly Leu Asp Glu Asp Pro Leu Gly Pro Asp

35 40 45

Asn Ile Asn Trp Ser Gln Phe Ile Pro Glu Leu Gln Arg Lys Lys Arg

50 55 60

Arg Gln Arg Arg Arg Gly

65 70

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 2

Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Ile Leu Leu Asp Ile Ser

1 5 10 15

Phe Pro Gly Leu

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 3

Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu Ser Lys Leu Leu Leu Asp Leu Ser

1 5 10 15

Phe Pro Gly Leu

20

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 4

Ser Leu Thr Glu Gly Leu Val Leu Asp Thr Met Asn Asp Ser Leu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 180

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 5

tccccggagc cacaggtttc tggccttgca gccaatcgtt ctctgacaga aggcctggtc 60

ctggacacaa tgaatgacag cctcagcaag atcctgctgg acatcagctt tcctggcctg 120

gacgaggacc cactgggccc tgacaacatc aactggtccc agtttattcc tgagctacag 180

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 6

ctggacacaa tgaatgacag cctcagcaag atcctgctgg acatcagctt tcctggcctg 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 7

ctggacacaa tgaatgacag cctcagcaag ctgctgctgg acctgagctt tcctggcctg 60

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 8

tctctgacag aaggcctggt cctggacaca atgaatgaca gcctc 45

Claims (8)

1.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物含有序列表中SEQ ID NO：1序列所示活性成分多肽或含有序列表中SEQ ID NO：2序列所示核心活性成分多肽。

2.序列表中SEQ ID NO：1序列所示多肽或SEQ ID NO：2序列所示多肽在制备抗肿瘤制剂中的用途。

3.序列表中SEQ ID NO：3序列所示多肽或SEQ ID NO：4序列所示多肽在制备抗肿瘤制剂中的用途。

4.编码序列表中SEQ ID NO：1-4序列所示多肽的DNA序列，其特征在于：分别由序列表中SEQ ID NO：5-8所示。

5.含权利要求4所述DNA序列的表达载体。

6.如权利要求2或权利要求3所述的用途，是将SEQ ID NO：2-4序列所述多肽序列与穿膜肽序列融合，得到具有穿膜能力的多肽使用。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：其中穿膜肽可以是多聚精氨酸R9穿膜肽或天然TAT穿膜肽或其他穿膜肽。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于：合成SEQ ID NO：2-4序列所述多肽中采取D型氨基酸替换并肽键翻转策略而获得DRI型的多肽。

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