CN107827970B - 一种抑制foxm1的抗肿瘤蛋白肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了来源于FOXM1蛋白、包含其氮端1‑138位氨基酸残基序列的蛋白肽段，提供了一种抑制FOXM1功能、开发蛋白多肽类抗肿瘤药物的候选者。所述蛋白肽段具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1）序列表中SEQ ID NO：1；2）将序列表中SEQ ID NO：1取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基，实现抑制或降低FOXM1的活性和功能的蛋白肽。本发明依照序列表中SEQ ID NO：1氨基酸序列所制备的具有穿膜能力的重组蛋白，表现出对多种肿瘤细胞的抑制作用。

Description

一种抑制FOXM1的抗肿瘤蛋白肽
技术领域
本发明属于基因工程学和肿瘤学领域，涉及一种抑制FOXM1的抗肿瘤蛋白肽的表达及其用途。
背景技术
从多种人瘤样本的基因表达分析中发现，转录因子FOXM1在肿瘤细胞中表达增高，检测其表达水平已被用于多种肿瘤的诊断和预后（US7056674、7081340、7308364、7526387、7531300、CN201510355817.5）。从基因功能角度，FOXM1首先被确认是一个调控细胞周期和细胞增殖的蛋白（Mol Cell Biol 1997. 17: 1626-1641）。在细胞增殖过程中，FOXM1参与调节细胞周期相关的多个基因转录，从而控制细胞的DNA复制与有丝分裂过程（Mol CellBiol 1999. 19: 8570-8580, Proc Natl Acad Sci U S A 2002. 99: 16881-16886, MolCell Biol 2005. 25: 10875-10894），还与DNA损伤修复有关（Mol Cell Biol 2007. 27:1007-1016, Cell Prolif 2010. 43: 494-504），抑制其表达能有效终止细胞周期、阻断细胞生长（Proc Natl Acad Sci U S A 2002. 99: 16881-16886, Mol Cell Biol 2005.25: 10875-10894, Genes Dev 2004. 18: 830-850, Developmental Biology 2004.276: 74-88, Proc Natl Acad Sci U S A 2001. 98: 11468-11473）。此外，FOXM1参与了细胞干性维持（Nucleic Acids Res 2010. 38: 8027-8038），抑制FOXM1导致无法获得诱导型多能干细胞，是诱导型多能干细胞重编程过程中的必须因子（PLoS One 2014. 9:e92304）。同时，FOXM1是刺激肿瘤细胞发生上皮间质转化的关键分子，抑制FOXM1可阻止癌细胞转移（Cancer Lett 2013. 340: 104-112）。在活体水平，不同器官中有条件敲除FOXM1可抑制肝癌、肺癌、结直肠癌等实体瘤的发生和发展（Genes Dev 2004. 18: 830-850,Cancer Res 2006. 66: 2153-2161, Gastroenterology 2007. 132: 1420-1431）。由于FOXM1在刺激细胞增殖、增强DNA损伤修复能力、促进细胞迁移、维持细胞干性等方面发挥主导作用，抑制FOXM1可有效抑制肿瘤的发生和发展，因此FOXM1被认为是肿瘤治疗药物开发的有效靶标（Biochim Biophys Acta 2007. 1775: 92-102）。以FOXM1为靶基因，通过腺病毒介导特异性干扰FOXM1的表达、实现肿瘤基因治疗的可能性已在多种实体瘤（肝癌、乳腺癌、鼻咽癌等）基因治疗研究中被证实（J Gene Med 2012. 14: 231-240, Cancer GeneTher 2013. 20: 117-124, Cancer Gene Ther 2014. 21: 133-138）。抑制FOXM1的小分子药物筛选工作也有进展，其中，Thiostrepton、抗菌素Siomycin A等小分子化合物被发现能选择性抑制FOXM1的转录活性，从而抑制了肿瘤（PLoS One 2009. 4: e5592, Nat Commun2014. 5: 5165, Mol Cancer Ther 2008. 7: 2022-2032, Cancer Res 2006. 66: 9731-9735）。本发明以FOXM1为靶标，开发抑制FOXM1活性和功能的蛋白多肽类药物，用于预防、治疗或延缓人类肿瘤。
总结开发针对FOXM1的肽段、实现肿瘤治疗的方法，包括以下已公开的发明：1）源自 FOXM1 的肽与HLA-A2结合，用以活化可杀死癌细胞的人杀伤 T 细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL），为高水平表达FOXM1的癌症患者提供癌症免疫治疗的手段（CN201510127580.5、US201514729752、CN201080017145.2）。2）以FoxM1c的DNA结合区原核重组质粒诱导表达获得的蛋白为靶标，从噬菌体随机肽库筛选获得一组靶向FoxM1c的高效结合多肽，该类多肽可潜在作为先导分子用于肿瘤等相关疾病的治疗药物研发和诊断（CN201010515471.8）。3）我们选定FOXM1蛋白序列中的1-234位氨基酸，制备重组穿膜蛋白肽用于开发抗肿瘤蛋白类药物，专利申请已公开（CN201610439054.7）。
以胞内靶标开发的抗肿瘤蛋白多肽类药物都需要进入肿瘤细胞发挥作用，因此必须具备穿透细胞膜进入细胞的能力。细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是由氨基酸组成且具有穿透细胞膜能力的多肽，最早从人HIV-1的TAT蛋白中发现，该蛋白中包含具有穿膜能力的特殊肽段（Proc Natl Acad Sci U S A 1991. 88: 1864-1868, Cell1988. 55: 1189-1193）；此后，其他天然蛋白也被发现包含穿膜能力的肽段（J Biol Chem1994. 269: 10444-10450）。以此为基础，人们相继筛选和开发了包含不同天然蛋白穿膜肽序列的嵌合体穿膜肽（如transportan）（FASEB J 1998. 12: 67-77）和纯人工合成的穿膜肽（如多聚精氨酸肽段R8或R9等）（J Biol Chem 2001. 276: 5836-5840），并可对其加以修饰提高稳定性和穿膜效率（Nucleic Acids Res 2011. 39: 3972-3987）。由于其具备穿膜能力，穿膜肽一经发现就被认为可用于介导生物活性物质、特别是大分子量的蛋白质、核酸等分子进入细胞发挥作用，成为一种具有导入效率高、细胞对象类型广、细胞毒性低、方法简便等突出优点的药物递送方法（Ther Deliv 2013. 4: 573-591）（CN200680049953、200810155949）。只识别特定类型肿瘤细胞、具有细胞选择性的穿模肽也被筛选获得，可介导生物活性物质进入某种特定肿瘤细胞、而不会进入正常或其他种类肿瘤细胞（NatureCommunication 2012. 3: 951-963）。一般认为，穿膜肽介导药物进入细胞的模式主要通过是能量依赖型的细胞内吞机制（J Biol Chem 2003. 278: 585-590），也有研究表明可通过直接细胞膜转位（J Biol Chem 2009. 284: 33957-33965）或物理内吞方式进入细胞（IntJ Biochem Cell Biol 2012. 44: 869-875），随后逃逸出内涵体并释放于细胞质中（Int JBiochem Cell Biol 2012. 44: 869-875），实现药物功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：本发明以FOXM1为靶标开发蛋白多肽类抗肿瘤药物，具体地，是从FOXM1蛋白序列中选定其氮端1-138位氨基酸，制备FOXM1-氮端（1-138 aa）重组蛋白，证明此段蛋白肽能抑制肿瘤细胞，成为抗肿瘤蛋白多肽药物的候选者。
本发明与已公开发明的区别，体现在从FOXM1蛋白序列中选定其氮端1-138位氨基酸，证明此段蛋白肽能抑制肿瘤细胞。天然FOXM1蛋白的氮端能够抑制FOXM1的转录活性（Oncogene 2008. 27: 1696-1704, Mol Cell Biol 2008. 28: 3076-3087），并介导了FOXM1与肿瘤促进因子Smad3的相互作用，这一蛋白互作对肿瘤进程具有重要影响（J ClinInvest 2014. 124: 564-579），因此在肿瘤细胞中增高FOXM1-氮端蛋白区段，能竞争性阻碍FOXM1与Smad3的互作，从而干预FOXM1的促瘤功能。另外，FOXM1蛋白受多种信号通路调节，如Cdk1等磷酸激酶可磷酸化FOXM1蛋白的氮端，激活FOXM1的转录活性（J Biol Chem2009. 284: 30695-30707），因此增高FOXM1-氮端蛋白区段，可充当竞争性底物，阻碍促瘤信号通路对FOXM1的修饰活化作用。我们在前期工作中选定FOXM1蛋白序列中的1-234位氨基酸，制备重组穿膜蛋白肽，验证其可以有效抑制FOXM1的转录活性，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，相关结果已在前一个专利申请中公开（CN201610439054.7）。
本发明以此为基础，本发明人结合多聚精氨酸R9穿膜肽，构建了穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-138aa）的原核表达质粒；采用原核表达系统和His标签亲和纯化手段，规模化制备穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-138aa）的重组蛋白（命名为M1-138）。本发明人选择了不同类型的肿瘤细胞（肺癌A549、肝癌HepG2、乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7等）开展实验，研究M1-138的不同处理剂量对肿瘤细胞的抑制效果，证实了M1-138对肿瘤细胞的抑制作用。选择乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞为例，证实M1-138重组蛋白能够抑制肿瘤细胞的迁移能力、集落形成能力，并抑制了肿瘤细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的能力。为探讨M1-138如何抑制FOXM1功能，本发明人开展了系列实验，证明M1-138重组蛋白能结合FOXM1并抑制FOXM1转录活性及其下游靶基因Cdc25B的表达；同时发现M1-138重组蛋白能结合Smad3、阻断FOXM1与Smad3之间的互作，并抑制Smad3的转录活性。更进一步，M1-138重组蛋白处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞后，导致细胞迁移、细胞增殖等相关基因和重要转录因子的表达改变。为建立M1-138重组蛋白作为潜在抗瘤药物的成药性，本发明人证实野生型小鼠能够耐受高剂量的M1-138重组蛋白，并运用裸鼠移植瘤模型，证实M1-138重组蛋白能够抑制肿瘤形成和肿瘤进展。
更具体地，本发明提供了如下。
（1）一个来源于FOXM1蛋白氮端的片段，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
（2） （1）中的蛋白片段，取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸，实现抑制或降低FOXM1的活性和功能。
（3） 编码（1）所述蛋白片段的DNA序列。
（4） 根据（3）所述的DNA序列，其特征在于：其DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
（5） 含（3）所述DNA序列的表达载体。
（6） 一种表达（1）所述蛋白片段的方法，是将含所述蛋白片段的DNA序列与表达穿膜肽的DNA序列形成融合开放阅读框，构建重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有穿膜能力的所述蛋白片段。
（7） 根据（6）所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为pHis-M1-138-R9。
（8） 根据（6）或（7）所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌时，需加入IPTG进行诱导表达，所加入IPTG的浓度为8μM，诱导时间为20小时,诱导温度为20℃。
（9） 如（6）所述的方法用于制备治疗和/预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物中的用途。
（10） 一种抗肿瘤的药物，它的活性成分为（1）所述蛋白片段。
附图说明
图 1显示了R9穿膜肽融合人FOXM1蛋白氮端（1-138aa）的重组蛋白M1-138的表达载体图谱。
图 2显示了重组蛋白M1-138的规模化纯化制备。
图 3显示了M1-138重组蛋白对肺癌肿瘤细胞株A549的抑制作用。
图 4显示了M1-138重组蛋白对肝癌肿瘤细胞株HepG2的抑制作用。
图 5显示了M1-138重组蛋白对乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7的抑制作用。
图 6显示了M1-138重组蛋白抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的迁移能力。
图 7显示了M1-138重组蛋白抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的集落形成能力。
图 8显示了M1-138重组蛋白处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞抑制了其在裸鼠皮下形成移植瘤的能力。
图 9显示了M1-138重组蛋白能结合FOXM1并抑制FOXM1转录活性及其下游靶基因Cdc25B的表达。
图 10显示了M1-138重组蛋白能结合Smad3、阻断FOXM1与Smad3之间的互作，并抑制Smad3的转录活性。
图 11显示了M1-138重组蛋白处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞后，荧光定量PCR检测细胞迁移、细胞增殖等相关基因的表达改变。
图 12显示了M1-138重组蛋白处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞后，荧光定量PCR检测控制肿瘤细胞的重要转录因子基因的表达改变。
图 13显示了野生型ICR/JCL小鼠中M1-138重组蛋白的耐受剂量分析。
图 14 显示了裸鼠移植瘤模型中M1-138重组蛋白抑制肿瘤形成。
图 15 显示了裸鼠移植瘤模型中M1-138重组蛋白抑制肿瘤进展。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例 1，原核表达载体pHis-M1-138-R9的构建。
1，His-M1-138-R9基因片段的扩增。设计引物，PCR扩增基因片段，引物序列为：引物1（上游引物）：GCG CCC ATG GTG CAT CAC CAT CAC CAT CAC ATG AAA ACT AGC CCC CGTCG，引物2（下游引物）：GCG GGA TCC CTA CCT TCT CCT TCT CCT TCT CCT TCT CCT CAGGGT CAC TTC TGT C。以pcDNA3.1-FOXM1为模板，在引物1和引物2的引导下PCR扩增M1-138反应体系为：克隆质粒pcDNA3.1-FOXM1（80ng/μL）1μL、10X PCR Buffer（ThermoScientific）5μL、dNTPs（2mM each）5μL、MgSO4溶液（25mM）4μL、KOD-Plus-Neo（1.0U/μL）1μL、引物1（100μM）1μL、引物2（100μM）1μL、DMSO 2μL，加去离子水补充至反应体系50μL。PCR反应条件：先94℃ 5min；再95℃ 30sec、57℃ 30sec、68℃ 50sec，共30个循环；然后68℃10min，4℃ 5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化扩增的目的片段，纯化产物溶于40μL TE缓冲液中，-20℃冻存备用。
2，PCR产物及pET-15b载体的酶切处理。利用NcoI、BamHI限制性内切酶切出克隆片段的粘性末端。酶切体系：目的片段（150ng/μL）或pET-15b质粒（150ng/μL）6.7μL、NcoI（Thermo Scientific）0.5μL、BamHI（Thermo Scientific）0.5μL、10X FastDigest Buffer（Thermo Scientific）1μL，加去离子水至总体积10μL，37℃水浴反应30min。
3，原核表达载体pHis-M1-138-R9的获得。将步骤2获得的目的片段和载体进行连接，连接体系及反应条件为：酶切载体5.63μL、目的片段2.36μL、T4 DNA Ligase（5U/μL）1μL、10X T4 DNA Ligase buffer（TOYOBO）1μL，加去离子水至反应体系10μL。22℃反应20min，-20℃冻存备用。取一管DH5α大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化后，加入1μL的连接片段，混匀，冰上放置30min，42℃热激45sec，冰上放置2min；加入1mL的LB培养基，37℃放置45min；取200μL涂布LB平板（氨苄青霉素浓度为25μg/mL），37℃培养过夜（12-16hr）；挑取单克隆，接种到5mL的LB培养液(含25μg/mL氨苄青霉素) 37℃振荡培养过夜（12-16hr）。提取质粒，NcoI、BamHI酶切鉴定，保种并分装测序。pHis-M1-138-R9原核表达质粒图谱见图1。
实施例 2，规模化纯化的M1-138重组蛋白。
1，M1-138重组蛋白的诱导表达。将原核表达载体pHis-M1-138-R9转化大肠杆菌Rostta DE3感受态细胞，37℃培养过夜（12-16hr），随机挑选单克隆，接种到5mL的LB培养基（含 25μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素）, 37℃振荡培养6-8hr。将菌液加到100mL的LB培养液（含25 μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素）37℃振荡培养过夜（12-16hr），取菌液检测OD600值，调整OD600值至0.8-1，加入IPTG诱导剂（终浓度8μM），20℃诱导振荡培养20hr。4000rpm离心20min收集菌体，用15mL Binding Buffer（20mM Na3PO4, 500mM NaCl, 20mMimidazole, pH 7.4）重悬菌体，超声40min（超3sec，停2sec）破碎菌体。用Ni-Beads（GE）亲和纯化系统进行纯化（按照商品化Ni-Beads亲和纯化实验流程）。
2，重组蛋白M1-138的规模化纯化。运用原核诱导表达系统扩大培养规模，获得细菌裂解液。通过AKTA purifier蛋白纯化仪结合His-tag亲和纯化手段，采用不同洗脱强度收集纯化蛋白，实现规模化纯化制备重组蛋白M1-138，并获得纯化过程的HPLC分析谱图（图2A，箭头所示该重组蛋白吸收峰）。SDS-PAGE凝胶电泳方法检测蛋白制备不同阶段的蛋白样品，上样量均为10μg（图2B，箭头所示M1-138重组蛋白）。
实施例3，M1-138重组蛋白抑制肺癌肿瘤细胞株A549。
为验证M1-138对肺癌细胞增殖的抑制作用，选择肺癌A549细胞，运用商品化的Cell Counting Kit（CCK）试剂盒考察M1-138对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的M1-138（0.5、1、2、4、8、16、20、24、28、32、36μM）处理细胞，再培养12 hr。向每孔加入10μL CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-GFP重组蛋白处理细胞，作为阴性对照组。所获A549细胞的CCK细胞活力曲线见图3。结果表明，与GFP对照组样本相比，M1-138可明显抑制肺癌A549细胞的增殖。
实施例 4， M1-138重组蛋白抑制肝癌肿瘤细胞株HepG2。
为验证M1-138对肝癌细胞增殖的抑制作用，选择肝癌HepG2细胞，运用商品化的Cell Counting Kit（CCK）试剂盒考察M1-138对肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的M1-138（0.5、1、2、4、8、16、20、24、28、32、36μM）处理细胞，再培养12hr。向每孔加入10μL CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK 溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK 溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-GFP重组蛋白处理细胞，作为阴性对照组。所获HepG2细胞的CCK细胞活力曲线见图3。结果表明，与GFP对照组样本相比，M1-138可明显抑制肝癌HepG2细胞的增殖。
实施例 5，M1-138重组蛋白抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231、MCF-7。
为验证M1-138对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，选择乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞，运用商品化的CCK试剂盒考察M1-138对这两种肿瘤细胞增殖的影响。在96 孔板中接种细胞悬液 (100μL，4000个细胞/孔)。将培养板放在培养箱（37℃，5%CO2）预培养12hr后，用不同浓度的M1-138（0.5、1、2、4、8、16、20、24、28、32、36μM）处理细胞，再培养12 hr。向每孔加入10µl CCK的WST-8试剂，在培养箱内孵育1-4hr，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算待检细胞的细胞活力，细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)] ×100，其中，A(加药)：细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度、A(空白)：有培养基、CCK 溶液而没有细胞孔的吸光度、A(未加药)：细胞、CCK 溶液而没有药物溶液孔的吸光度。对应浓度的R9-GFP重组蛋白处理细胞，作为阴性对照组。所获MDA-MB-231、MCF-7细胞的CCK细胞活力曲线见图5。结果表明，与GFP对照处理的样本相比，M1-138可明显抑制乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞的增殖。
实施例 6，M1-138重组蛋白抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的迁移。
为验证M1-138抑制肿瘤细胞的迁移，运用Transwell实验考察M1-138对肿瘤细胞迁移表型的影响。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用不同浓度的M1-138（0、4、8μM）进行处理，12hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，加入含有1%FBS的完全培养基，1000rpm，4℃，离心5min。再用含有1% FBS的新鲜培养基重悬细胞，使细胞成为单个的细胞悬液，然后进行细胞计数，稀释细胞至浓度为5x105cells/ml。将200μL（含1x105个细胞）的细胞悬液接种Transwell实验用细胞培养板，加到Tanswell板的上室中，并在下室中加入500μL含有10%FBS的细胞培养基，细胞培养箱中37℃培养24hr。将Tanswell板的上室用70%乙醇固定30min，用棉签擦去上室中没有发生迁移的细胞，将上室倒置风干。在24孔板中加入500μL的0.1%的结晶紫，再将小室放在上面，使细胞浸在结晶紫溶液中，37℃培养箱内孵育30min。将孵育完的小室取出，用1xPBS进行洗涤，完全洗去多余的染液。在通风处将小室倒置风干，体式倒置显微镜下观察和拍照。24孔板中加入500μL的33%的醋酸，将小室浸泡其中，震荡30min，充分溶解细胞。吸取100μL的24孔板中的液体，加入96孔板中，在酶标仪570nm处测量OD值，间接测定迁移细胞的数量（每一样品重复3次）。未进行M1-138处理的细胞作为阳性对照，对比获得M1-138抑制肿瘤细胞迁移的结果，显示M1-138可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的迁移（图6）。
实施例 7，M1-138重组蛋白抑制乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞的集落形成。
运用平板克隆形成实验检测细胞的克隆形成率，考察M1-138抑制肿瘤细胞集落形成的能力。选取处于对数生长期状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用不同浓度的M1-138（0、4、8μM）进行处理，12hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，在用新鲜培养基进行重悬，使细胞成为单细胞悬液，通过细胞计数，接种250个细胞于6孔板中，平行设置3个重复样品。于37℃细胞培养箱中培养14 天后，吸去培养基，用1xPBS洗3遍，加70%的无水乙醇室温固定30min。吸去乙醇，加500μL的0.1%结晶紫，使其均匀覆盖于细胞，37℃培养箱染色20min。染色完成后，用1xPBS洗涤多余的结晶紫染液，自然晾干，拍照，计算克隆形成率：细胞克隆形成率=细胞克隆个数/接种细胞个数x100%。未进行M1-138处理的细胞作为阳性对照，对比获得M1-138抑制肿瘤细胞集落形成的结果，表明M1-138可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的体外成瘤能力（图7）。
实施例8，M1-138重组蛋白处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞抑制了其在裸鼠皮下形成移植瘤的能力。
为验证M1-138抑制肿瘤细胞在活体中形成移植瘤的能力，运用裸鼠皮下成瘤实验考察M1-138处理后肿瘤细胞成瘤效率。选取生长状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用M1-138（8μM）进行处理，加药12hr时后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，用PBS进行重悬。选取4周龄雌性裸鼠，分为对照组（注射PBS处理的MDA-MB-231细胞）和实验组（注射M1-138处理的MDA-MB-231细胞），裸鼠局部皮肤消毒，每只裸鼠背部注射三个位点，每位点注射1X107细胞（200μL），拔针后局部按压30sec，防止细胞悬液漏出。继续饲养，分别在第1、15、35、55天测量移植瘤大小，并在第55天拍照。与对照组相比，M1-138可明显抑制乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231的体内成瘤能力（图8）。
实施例 9，M1-138重组蛋白结合FOXM1并抑制FOXM1转录活性及其下游靶基因Cdc25B的表达。运用Pull-down实验证实M1-138能结合FOXM1。
选取生长状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，用不同浓度的M1-138（0、8μM）进行处理，24hr后用0.25%胰酶进行消化，吹散，离心，用PBS进行重悬，洗涤2次，收集各组细胞样本，加入IP裂解液进行细胞的裂解，冰上静置30min，12000rpm、4℃离心15min，取上清获得蛋白样品。取500µg蛋白样品与20μL Ni-珠4℃孵育2hr，800rpm、4℃离心5min，去上清，用800μL的PBS洗涤5次，洗涤后加入20μL的PBS，并加入4μL 5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于95℃变性10min，用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。将蛋白样品转至PVDF膜，使用FOXM1抗体检测FOXM1全长蛋白，验证M1-138与 FOXM1全长蛋白相互作用。结果表明，与未进行M1-138处理的对照样本相比，可明显观察到M1-138在MDA-MB-231细胞中与FOXM1全长蛋白发生相互作用（图9 A）。
运用凝胶电泳迁移阻滞实验（EMSA）证实M1-138与FOXM1全长蛋白结合。探针合成：（1）FOXM1结合荧光探针：Forward strand（5’-FAM-TTT GTT TAT TTG TTT GTT TAT TTG-3’）、Reverse strand（5’-FAM-CAA ATA AAC AAA CAA ATA AAC AAA-3’）；（2）FOXM1结合冷探针：Forward strand（5’-TTT GTT TAT TTG TTT GTT TAT TTG-3’）、Reverse strand（5’-CAA ATA AAC AAA CAA ATA AAC AAA-3’）。所合成的单链等量混合，94℃变性10min，自然冷却至室温，-20℃保存。将FOXM1结合荧光探针（50nM）与2μg的FOXM1全长蛋白混合，加入Binding buffer（20mM Tris-Cl，50mM KCl，10% Glycerol，0.5mM EDTA，0.2mM DTT，pH7.6），冰上孵育30min。加入100倍过量的FOXM1结合冷探针（5000nM）作为竞争反应，确认结合的特异性。为验证M1-138结合，反应中额外加入M1-138（M1-138：FOXM1 重组蛋白的摩尔比分别为 0.25：1、0.5：1、1：1）。并设置FOXM1结合荧光探针（50nM）和M1-138（2µg）混合的对照组，表明M1-138无法单独与探针结合。配置4%的非变性PAGE胶（0.5X TBE，4% Acry/Bis，5% Glycerol，0.15% APS，0.05% TEMED）。以0.5X TBE为电泳缓冲液、100V预电泳30min后上样。120V电泳30min，用Kodak荧光成像仪，选取激发波长465nm，发射波长535nm成像。结果表明，与对照处理的样本相比，显示M1-138与FOXM1全长蛋白结合（图9 B）。
运用含FOXM1结合基序（6x）的启动子或Cdc25B 启动子（-1kb）介导的荧光素酶报告基因质粒，与FOXM1表达质粒共转染细胞，荧光素酶报告基因检测实验表明，M1-138处理（2、4μM）对FOXM1的转录活性具有抑制作用。HEK293T细胞转染前一天传至12孔细胞培养板内，待细胞密度长至70-80%时，进行脂质体转染实验。取重组质粒p6xFOXM1 Binding-Luc或pCdc25Bpro-Luc，与pRL-CMV、pCMV-FOXM1混合，补充DMEM培养基至100μL。在另一管中加入5μL DNA Transfection Reagent，补充DMEM培养基至100μL混匀。将混合并充分混匀，室温静置20min，加入到细胞中，37℃培养24hr。用不同浓度的M1-138（2、4μM）进行处理24hr，吸弃12孔板中培养基，PBS轻轻洗涤两次。每孔加入200μL 1×PLB裂解液（Passive LysisBuffer），放置于摇床上剧烈摇动20min。收集细胞裂解，12,000rpm离心30sec，取上清置于冰上待检测。取12支EP管，每管加入10μL LARII（Luciferase Asssay Substrate与Luciferase Assay BufferII直接混合），加入10μL细胞裂解液，轻轻混匀，于GLOMAluminometer发光检测仪上读取数值A。取出EP管加入新鲜配制的Stop&Glo Reagent（Stop&Glo Substrate：Stop&Glo Buffer=1：50）10μL，混匀放入仪器中检测，得到数值B（所有样品加入到检测的时间须一致）；计算三次实验所得A/B均值即可反应出荧光素酶相对表达量，表示启动子的转录活性。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138对FOXM1的转录活性具有抑制作用（图9 C）。
运用Western Blotting实验，表明M1-138处理（4、8μM）能抑制FOXM1对Cdc25B表达的激活能力。选取生长状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，转染重组质粒pCMV-FOXM1，24hr后用不同浓度M1-138重组蛋白（4、8μM）处理细胞，24hr后Western Blotting检测胞内的FOXM1、Cdc25B、M1-138重组蛋白（Santa Cruz SC-500抗体识别FOXM1氮端）的蛋白水平，同时检测β-actin蛋白水平作为上样对照。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138不影响FOXM1的蛋白表达水平，但显著抑制了Cdc25B的表达（图9 D）。
实施例 10，M1-138重组蛋白能结合Smad3、阻断FOXM1与Smad3之间的互作，并抑制Smad3的转录活性。
用M1-138（0、8μM）处理 MDA-MB-231乳腺癌细胞，24小时后收集样本制备细胞裂解液，与Ni珠孵育pull-down蛋白，Western Blotting检测样品中的Smad3、M1-138蛋白水平。含His标签R9-GFP作为阴性对照。结果表明，与对照样本相比，M1-138可以与Smad3蛋白发生相互作用（图10 A）。
在MDA-MB-231乳腺癌细胞中高表达in vivo生物素标记的FOXM1全长蛋白，24hr后收集样本制备细胞裂解液，加入不同剂量的M1-138（2、4、8μM）并进行链霉亲和素pull-down实验。结果表明，与对照样本相比，M1-138可以干扰 FOXM1与Smad3蛋白相互作用（图10 B）。
构建含Smad3结合基序（6x）启动子介导的荧光素酶报告基因质粒，与 Smad3 表达质粒共转染细胞，荧光素酶报告基因检测实验表明，M1-138（4、8μM）对Smad3的转录活性具有抑制作用。运用HEK293T细胞进行脂质体转染，取重组质粒p6xSmad3 Binding-Luc与pRL-CMV、pCMV-Smad3混合，加入DNA Transfection Reagent，后加入到细胞中，置于37℃恒温细胞培养箱中培养24hr后。用不同浓度的M1-138（4、8μM）进行处理，加药24hr后，加入PLB裂解液（Passive Lysis Buffer），放置于摇床上剧烈摇动20min。收集细胞裂解进行荧光素酶报告基因活性检测。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138对Smad3的转录活性具有抑制作用（图10 C）。
运用Western Blotting实验表明，M1-138处理（4、8μM）不改变Smad3的蛋白水平，但能抑制Smad3对其靶基因Slug表达的激活能力。选取生长状态良好的乳腺癌肿瘤细胞株MDA-MB-231细胞，转染重组质粒pCMV-Smad3，24hr后用不同浓度M1-138（4、8μM）处理细胞，24hr后Western Blotting检测胞内的Slug、Smad3、M1-138重组蛋白的蛋白水平，同时检测β-actin蛋白水平作为上样对照。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138不影响Smad3的蛋白表达水平，但显著抑制了Slug的表达（图10 D）。
实施例 11，M1-138重组蛋白影响肿瘤细胞迁移、增殖等相关基因的表达。
运用M1-138（8μM）和R9-GFP对照蛋白（8μM）处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，12小时后收集细胞制备RNA样本，逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测细胞迁移相关基因E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和细胞增殖相关基因CyclinB1的表达水平。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138明显增高了E-cadherin的表达，明显抑制了Vimentin、N-cadherin和CyclinB1的表达，提供了M1-138促进细胞迁移和增殖的证据（图11）。
实施例 12，M1-138重组蛋白影响肿瘤细胞相关重要转录因子的表达。
运用M1-138（8μM）和R9-GFP对照蛋白（8μM）处理乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，12小时后收集细胞制备RNA样本，逆转录为cDNA，荧光定量PCR检测肿瘤细胞相关转录因子FOXM1、Smad3、Twist、Slug、和Snail的表达水平。结果表明，与对照处理的样本相比，M1-138明显抑制了Slug和Snail的表达，但对FOXM1、Smad3、Twist的表达没有明显影响（图12）。
实施例 13，野生型小鼠能够耐受高剂量的M1-138重组蛋白。
运用健康成年的野生型ICR/JCL小鼠（6周龄），分析小鼠对M1-138的耐受剂量。采用腹腔注射（i.p.）方式，分别注射不同剂量的M1-138（0.4mg/只、0.8mg/只、1mg/只、1.2mg/只，每组3只小鼠，经计算对应的剂量/体重分别为20mg/Kg、40mg/Kg、50mg/Kg、60mg/Kg），对照组为PBS腹腔注射。连续观察小鼠的饮食、活动等情况共14天，未发现小鼠出现异常或死亡。进一步将M1-138重组蛋白注射剂量提高到180mg/Kg，也未发现小鼠死亡。表明野生型小鼠能够耐受高剂量的M1-138（图 13）。
实施例 14，裸鼠移植瘤模型中M1-138重组蛋白抑制肿瘤形成。
运用乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射裸鼠皮下形成移植瘤（1X106 cells/注射）。1天后腹腔注射M1-138重组蛋白（注射剂量4mg/Kg），同时设置PBS腹腔注射对照组（每组4只裸鼠）。分别于细胞注射后15天、25天、35天测量移植瘤大小（图 14 A）。按实验设计方案跟踪观察记录移植瘤体积，并统计数据列表。与对照组相比，M1-138重组蛋白处理组除在15天时间点观察到一只裸鼠出现移植瘤并在随后时间点发生消退外，其他裸鼠均未出现移植瘤形成（图 14 B）。对肿瘤细胞移植后35天的裸鼠进行拍照，获得不同组别裸鼠的照片，显示对照组裸鼠移植瘤发生明显，而M1-138处理组未见明显肿瘤发生（图 14 C）。
实施例 15，裸鼠移植瘤模型中M1-138重组蛋白抑制肿瘤进展。
运用乳腺癌肿瘤MDA-MB-231细胞，采用皮下注射（i.h.）方式，注射裸鼠皮下形成移植瘤（1X106 cells/注射），细胞注射35天后，移植瘤体积均>500 mm3。采用瘤内注射方式注射M1-138重组蛋白（注射剂量4mg/Kg），同时设置PBS瘤内注射对照组，每天注射一次，连续注射7天。停药后测量移植瘤大小，跟踪观察记录14天（实验方案见图 15 A）。将跟踪观察记录移植瘤的结果绘制肿瘤生长曲线，与对照组相比，M1-138重组蛋白处理明显抑制了肿瘤的生长（图 15 B）。实验终止时对不同组别的裸鼠和收获的肿瘤进行拍照，获得不同组别裸鼠和移植瘤的照片，显示M1-138重组蛋白处理组移植瘤的生长受到明显抑制（图 15 C）。
序列表
<110> 长沙新生康源生物医药有限公司
<120> 一种抑制FOXM1的抗肿瘤蛋白肽
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 138
<212> PRT
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
Met Lys Thr Ser Pro Arg Arg Pro Leu Ile Leu Lys Arg Arg Arg Leu
1 5 10 15
Pro Leu Pro Val Gln Asn Ala Pro Ser Glu Thr Ser Glu Glu Glu Pro
20 25 30
Lys Arg Ser Pro Ala Gln Gln Glu Ser Asn Gln Ala Glu Ala Ser Lys
35 40 45
Glu Val Ala Glu Ser Asn Ser Cys Lys Phe Pro Ala Gly Ile Lys Ile
50 55 60
Ile Asn His Pro Thr Met Pro Asn Thr Gln Val Val Ala Ile Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ala Asn Ile His Ser Ile Ile Thr Ala Leu Thr Ala Lys Gly Lys
85 90 95
Glu Ser Gly Ser Ser Gly Pro Asn Lys Phe Ile Leu Ile Ser Cys Gly
100 105 110
Gly Ala Pro Thr Gln Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gln Thr Gln Thr Ser
115 120 125
Tyr Asp Ala Lys Arg Thr Glu Val Thr Leu
130 135
<210> 2
<211> 414
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
atgaaaacta gcccccgtcg gccactgatt ctcaaaagac ggaggctgcc ccttcctgtt 60
caaaatgccc caagtgaaac atcagaggag gaacctaaga gatcccctgc ccaacaggag 120
tctaatcaag cagaggcctc caaggaagtg gcagagtcca actcttgcaa gtttccagct 180
gggatcaaga ttattaacca ccccaccatg cccaacacgc aagtagtggc catccccaac 240
aatgctaata ttcacagcat catcacagca ctgactgcca agggaaaaga gagtggcagt 300
agtgggccca acaaattcat cctcatcagc tgtgggggag ccccaactca gcctccagga 360
ctccggcctc aaacccaaac cagctatgat gccaaaagga cagaagtgac cctg 414

Claims (4)

1.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为穿模肽融合序列表中SEQID NO：1序列所示蛋白肽的重组蛋白,所述蛋白肽的编码DNA序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述穿膜肽是多聚精氨酸R9穿膜肽。
2.一种如权利要求1所述重组蛋白在制备抗肿瘤制剂中的用途。
3.一种含权利要求1所述重组蛋白的DNA序列的表达载体。
4.一种表达权利要求1所述重组蛋白的方法，是将含所述蛋白肽的DNA序列与表达穿膜肽的DNA序列形成融合开放阅读框，构建重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有穿膜能力的所述重组蛋白，其特征在于：其中穿膜肽是多聚精氨酸R9穿膜肽，所述重组表达载体为pHis-M1-138-R9。
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