CN116655742A

CN116655742A - 一个mCD137亲和肽moe-70及其应用

Info

Publication number: CN116655742A
Application number: CN202211597207.2A
Authority: CN
Inventors: 闫中义; 郭向前; 张璐; 孙风杰; 谢龙祥
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-08-29

Abstract

本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一个mus CD137（mCD137）亲和肽moe‑70及其应用。所述亲和肽moe‑70包括12个D型氨基酸，氨基酸序列为：ARFCKQHKLKFW。本申请中，针对CD137靶点，发明人通过相关分子模拟及药物设计软件（MOE），模拟筛选获得了理论上与mCD137蛋白亲和力比较强的系列十二肽。进一步地，采用Fmoc固相合成法发明人合成了这些多肽，并进一步通过构建瞬时表达mCD137蛋白的细胞，对这些筛选所得多肽与mCD137蛋白的亲和能力进行了检测判定。最后，结合小鼠实验结果，初步明确了moe‑70多肽对结直肠癌的防治表现出较好的应用潜力。

Description

一个mCD137亲和肽moe-70及其应用

技术领域

本申请属于肿瘤防治技术领域，具体涉及一个mus CD137亲和肽moe-70及其应用。

背景技术

结直肠癌（CRC）是世界上排名第三的常见癌症类型，每年有超过185万确诊病例和85万死亡病例。临床上，依据CRC所呈现的组织学亚型可分为：粘液型、髓质型、印戒细胞型、腺鳞型、梭形细胞型、微乳头型及其他罕见类型等，依据其沿结肠的位置进行分类，可分为近端结肠癌和远端结肠癌。临床中，结直肠癌的标准常规治疗方式包括手术、化疗和放疗。但由于这些传统疗法不能特异性靶向癌细胞，且由于化疗的毒副作用，因此使得结直肠癌患者的预后较差。

一般认为，CRC的发生是由于细胞内癌基因、肿瘤抑制基因和与DNA修复机制相关基因的突变，它的致病机制可能包括三种不同的分子途径：染色体不稳定性(CIN)、微卫星不稳定性 (MSI)和CpG岛甲基化表型(CIMP)途径。而随着相关发病机制和人体免疫机制的深入研究，目前已有包括贝伐珠单抗、西妥昔单抗和帕尼单抗、以及瑞戈菲尼等靶向药物用来通过增强机体的抗肿瘤免疫来改善CRC治疗效果。同时，也有一些其他治疗手段，例如双特异性抗体、过继细胞疗法、免疫刺激细胞因子和疫苗等用于结直肠癌的防治研究。

免疫疗法作为肿瘤防治方法之一，其主要技术原则是通过人为的方法来恢复、增强人体的免疫细胞功能，特别是利用肿瘤特异性细胞毒性T细胞来治疗恶性肿瘤。因其良好安全性、普适性等优点，近年来得到了快速发展。

实际研究和应用中，在不同类型的肿瘤免疫疗法中，免疫检查点的确定是相关肿瘤防治首先需要解决的技术问题。目前研究较为普遍的免疫检查点分子有：靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)、程序性细胞死亡受体1 (PD-1) 、LAG3、TIGIT、TIM3、B7H3、CD39、CD73和腺苷A2A受体等等。

I型跨膜蛋白CD137，又称为4-1BB，是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员。已有研究表明，CD137在活化的T细胞、Treg细胞、NK细胞、单核细胞、DC和肿瘤内皮细胞等细胞中均有表达；其对应配体CD137L则是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要由活化的抗原呈递细胞表达，包括B细胞、DC和巨噬细胞。相关研究表明，CD137可通过作用于肿瘤微环境中的各种免疫细胞来调节免疫系统，进而发挥抗肿瘤作用；换言之，CD137免疫靶点在癌症治疗中有着重要的作用。

发明内容

本申请基于CD137免疫靶点，筛选获得了一个亲和肽moe-70，从而以期为相关肿瘤（癌症）的防治奠定一定技术基础。

本申请所提供的技术方案简述如下。

一个mCD137亲和肽moe-70，其氨基酸序列（12个D型氨基酸）如SEQ ID No.1所示，具体从氨基端到羧基端的氨基酸序列为：ARFCKQHKLKFW，即：H-Dal-Dar-Dpn-Dcy-Dly-Dgn-Dhi-Dly-Dle-Dly-Dpn-Dtr-OH。

所述亲和肽moe-70的制备方法，可采用Fmoc固相合成法制备获得。

所述亲和肽moe-70在制备肿瘤防治药剂中的应用，用于肿瘤（癌症）的防治，所述肿瘤（癌症），具体例如为结直肠癌。

药物分类中，一般将氨基酸分子数量不足一百的药品称之为多肽类。而由于多肽类药物具有分子量小、较抗体更容易生产、且不易产生免疫副反应等的优点，因此是现有肿瘤防治的重点研究方向之一。

本申请中，针对mCD137靶点，发明人通过相关分子模拟及药物设计软件（MOE），模拟筛选获得了理论上与mCD137蛋白亲和力比较强的系列十二肽。进一步地，采用Fmoc固相合成法发明人合成了这些多肽，并进一步通过构建瞬时表达mCD137蛋白的细胞，对这些筛选所得多肽与mCD137蛋白的亲和能力进行了检测判定。最后，结合小鼠实验结果，初步明确了moe-70蛋白对结直肠癌的防治表现出较好的应用潜力。基于这些结果，一方面为相关癌症的防治奠定了一定技术基础，同时，也为相关多肽药物分子设计、以及其他类型肿瘤（癌症）的防治提供了较好借鉴和指导。

附图说明

图1为筛选过程中筛选所得多肽与mus CD137分子对接模式图，其中：（a）筛选所得Top100多肽与mus CD137的对接位点图；（b）本申请moe-70与mus CD137的精确分子对接图；

图2为合成制备的在N端添加了含有D^biotinGG-(即：D^biotin-Gly-Gly-)连接子的多肽moe-22、moe-25和moe-70的质谱鉴定结果，其中：（a）moe-22质谱图（理论分子量：1856.19）；（b）moe-25质谱图（理论分子量：1958.28）；（c）moe-70质谱图（理论分子量：1932.33）；

图3为对mCD137基因的PCR扩增产物的电泳检测结果；

图4为pIRES2-mCD137重组质粒结构示意图；

图5为质粒转染细胞后的荧光检测图；

图6为多肽moe-22、moe-25和moe-70与mCD137蛋白亲和力检测结果；可以看出：mCD137抗体与mCD137蛋白具有亲和性；IgG同型对照抗体和GA对照肽与mCD137蛋白没有亲和性；moe-22、moe-25和moe-70均能亲和表达mCD137蛋白的细胞，但不能亲和转入空载体的细胞；

图7为利用MTT实验对多肽moe-22、moe-25和moe-70的毒性作用情况评估结果；其中：（a）moe-22在100 μM时影响了细胞的增殖；（b）moe-25在200 μM时影响细胞的增殖；（c）moe-70同样在100 μM时影响细胞的增殖；

图8为moe-22、moe-25和moe-70与靶蛋白亲和效果的浓度梯度依赖实验情况；其中：（a）mCD137抗体、IgG同型对照抗体和GA对照肽与mCD137蛋白的亲和效果；（b）moe-22与mCD137蛋白的亲和效果与多肽浓度成梯度依赖性；（c）moe-25与mCD137蛋白的亲和效果与多肽浓度成梯度依赖性；（d）moe-70与mCD137蛋白的亲和效果与多肽浓度成梯度依赖性，且亲和效果接近饱和；

图9为多肽对小鼠肿瘤模型的实际应用统计效果；其中：（a）小鼠体重变化图；（b）小鼠肿瘤体积变化图；（c）肿瘤解剖图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

MC38细胞系（小鼠结直肠癌细胞）、HEK293T细胞、pIRES2-EGFP载体，均为现有医学生物研究中常用生物材料，可由公开渠道获得，申请人作为高校研究机构，长期保存有相关研究材料；

Top10感受态大肠杆菌，购自近岸蛋白质科技有限公司；

C57BL/6N小鼠为6-8周龄的雌性鼠，购自北京维通利华公司；

主要实验试剂：

EcoRⅠ、BamHⅠ限制性内切酶，New England Biolabs公司产品；

胰蛋白酶，上海碧云天生物技术有限公司产品；

反转录试剂盒，贝贝生物公司产品；

质粒提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司产品；

胶回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；

mCD137抗体、mIgG1抗体和SA抗体，购自赛默飞世尔科技有限公司；

主要实验仪器：

CytoFLEX 流式细胞仪，贝克曼库尔特公司产品；

荧光显微镜，MoticamPr公司产品；

Waters高效液相色谱仪，购自沃特世科技有限公司；

GC-MS气相质谱仪，购自深圳市美程精密电子有限公司。

实施例1

需要说明的是，本申请所请求保护的多肽为利用相关软件和数据库筛选获得，因此本实施例首先就相关软件及数据库等背景情况简要说明如下。

筛选软件：MOE软件（Molecular Operating Environment），购自上海大库数据中心，版本号：MOE2016.0802。

虚拟12肽库构建：

首先，MOE软件中，Protein Builder模块下，选择D型氨基酸，构建3D结构；随后，在Protein design模块下，选择ResidueScan，Display选项设置为All Residues，每一个位点选择18种D型氨基酸（除去D型ILE和非D型的氨基酸Gly），Site Limit分别设置为12，进行多位点同时突变，同时勾选Properties选项，计算每一个多肽的稳定性；最后，多肽库生成后，去除重复的12肽，构建获得库容为456832个的D型12肽库。具体MOE软件运行情况及所构建12肽库不再展示。总体上，所构建的D型12肽库库容较大，而且稳定性较好，因此可以用于后续的虚拟筛选。

筛选针对对象：

基于现有技术获得 Mus musculus CD137（mCD137）氨基酸序列如下（256个氨基酸序列）：

MGNNCYNVVVIVLLLVGCEKVGAVQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVLTLFLALTSALLLALIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYE。

需要说明的是，筛选所用mCD137氨基酸的结晶结构采用的是RCSB-PDB晶体结构（ID：6MKZ）中的B链氨基酸（为便于筛选应用，通过对其结构中CD137序列及水分子进行删除方式以进行结构优化，仅保留B链结构）。

基于MOE软件的虚拟筛选结果，初步筛选获得了上百条在理论上与靶蛋白有较强亲和力的多肽（部分模拟结果如图1所示）。仅就部分具体多肽序列结果说明如下（非本申请保护目的的多肽序列不再详述）：

moe-22：

氨基酸序列（N端到C端）：ARTCHQHKLKFF，分子量1515.81 g/mol，S（亲和力）-58.060623，Stability（稳定性） -44.41599269。多肽合成制备过程中，在N端添加了含有D^biotinGG-(即：D^biotin-Gly-Gly-)连接子形成了： D ^biotin GG- ARTCHQHKLKFF，其分子量为1856.19 g/mol。

氨基酸序列（N端到C端）：ARDCHQWKLKFW，分子量1617.9 g/mol，S（亲和力）-57.756157，Stability（稳定性）-48.00582629。多肽合成制备过程中，在N端添加了含有D^biotinGG-(即：D^biotin-Gly-Gly-)连接子形成了： D ^biotin GG- ARDCHQWKLKFW，其分子量为1958.28 g/mol。

（如SEQ ID No.1所示）：

氨基酸序列（N端到C端）：ARFCKQHKLKFW, 分子量1591.95 g/mol，S（亲和力）-55.764534，Stability（稳定性）-44.50276267。多肽合成制备过程中，在N端添加了含有D^biotinGG-(即：D^biotin-Gly-Gly-)连接子形成了： D ^biotin GG- ARFCKQHKLKFW，其分子量为1932.33 g/mol。

需要强调的是，相关氨基酸均为D型氨基酸。

基于上述筛选结果，为进一步筛选和检验评估所得多肽的实际应用前景，发明人采用Fmoc固相合成法合成制备了相关多肽。

采用Fmoc固相合成法进行多肽合成时，其实质是一个重复添加氨基酸的过程，合成顺序从C端向N端，合成过程中，先将第一个氨基酸C端以共价键的形式与树脂相连，随后脱去N端保护基后，即能与下一个活化的氨基酸游离羧基形成肽键，重复这一过程，直至肽链合成完毕，最后将其从树脂上切割下来，并分离纯化（例如采用HPLC技术）获得目的多肽。具体操作参考现有技术即可（例如参考：《Clec9a亲和肽的筛选及其靶向DC的免疫活性研究》，闫中义，郑州大学2016博士论文），不再赘述。

采用高效液相色谱仪对初步合成所得粗肽进行分离纯化时，moe-22和moe-70是用20%-80%-80%-20%乙腈/水的梯度溶解纯化，moe-25是用35%-75%-75%-35%乙腈/水的梯度溶解纯化。纯化后质谱结果如图2所示（moe-22和moe-70的2号峰为正确峰，moe-25的1号峰为正确峰），可以看出，合成的三个多肽的理论分子量与 ESI-MS 测定的分子量一致。

需要说明的是，如前提及，多肽合成制备过程中，为便于后续实验检测，采用生物素（Biotin，分子量仅为244道尔顿的小分子)，对合成多肽进行了标记（生物素标记对蛋白构象影响几乎可忽略，可较好保持多肽蛋白的天然活性）。

还需说明的是，相关合成制备过程中，作为对照和参考，发明人同时制备了一条对照肽（GA肽），具体氨基酸序列如下：

GA肽：GAGAAGGAGGGG-GGK ^biotin，分子量，1099.15g/mol

实施例2

在实施例1初步筛选及合成制备相关多肽基础上，为进一步考察相关筛选所得多肽与mCD137蛋白的亲和力，发明人首先构建了过表达mCD137蛋白的细胞，并通过流式筛选方式（流式筛选过程中，生物素与链霉亲和素（SA）具有非常高的亲和力，并具有级联放大效应，可较好保证流式检测的灵敏性和精确性）初步明确了相关多肽与mCD137的亲和能力。具体实验过程简介如下。

（一）过表达mCD137蛋白细胞构建

（1）获得小鼠mCD137基因

首先以小鼠眼周血为样品提取获得RNA，进一步反转录制备获得cDNA，并进行PCR扩增制备获得mCD137基因。具体操作可参考如下。

以小鼠眼周血为样品提RNA时：

采取小鼠眼周血样品，4 ℃、3000 rpm离心3 min后，弃上清；

加入红细胞裂解液吹打均匀，静置5 min后，4 ℃、3000 rpm离心5 min，弃上清（此时能观察到白细胞沉淀），可重复此操作再次对红细胞进行裂解一次后，用PBS洗涤1次并离心后弃上清；

向白细胞中加入1 mL的Trizol,吹打混匀，置于冰上5 min后，加入200 μL氯仿，剧烈震荡数秒，冰上再放置3 min后，4 ℃、12000 rpm离心15 min；

小心吸取400 μL上清到新的无RNA酶离心管中，加入400 μL的异丙醇并混合均匀，-20 ℃放置30 min后，4 ℃、12000 rpm离心15 min；

弃上清，用1 mL DEPC水配制的75%的酒精洗涤沉淀，直至白色沉淀漂浮，4 ℃、8000 rpm离心5 min；

吸弃上清，将沉淀晾干后，加入30 μL DEPC水溶解沉淀（即为所提取RNA），取0.5 μL样品在NANO-Drop上测浓度（确保满足使用需要）后，直接进行后续实验或者-80 ℃保存。

基于所提取RNA反转录制备cDNA时：

参考试剂盒说明书进行相关操作即可，反转录体系可参考设计如下：

RNA，1 ng-2 μg；

RT Mix(2×)，10 μL；

Reverse Transcriptase，1 μL；

ddH₂O(RNase and DNase Free)，补充至20 μL；

PCR仪中，42 ℃孵育60 min，然后72 ℃加热5 min终止反应，测定浓度和纯度后（确保满足反应要求），直接进行后续实验操作或者-20 ℃保存。

基于上述所制备cDNA为模板进行PCR扩增时，具体引物设计如下：

mCD137 F：5'-CAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCATGGGAAACAACTGTTACAAC-3'，

mCD137 R：5'-GGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACAGCTCATAGCCTCCTC-3'；

50μl反应体系参考如下：

5×PS Buffer, 10 μL；

dNTP，4 μL；

F引物，1 μL；

R引物，1 μL；

cDNA，1 μL；

PCR酶PrimeStar，0.5 μL；

ddH₂O，32.5 μL；

PCR反应程序参考为：98 ℃、2 min；98 ℃、10 s，59 ℃、15 s，72 ℃、1 min，35 个循环；72 ℃、10 min；扩增产物直接进行后续电泳检测或者4 ℃保存（mCD137基因扩增电泳结果如图3所示）。

mCD137基因的具体序列（771bp）：

atgggaaacaactgttacaacgtggtggtcattgtgctgctgctagtgggctgtgagaaggtgggagccgtgcagaactcctgtgataactgtcagcctggtactttctgcagaaaatacaatccagtctgcaagagctgccctccaagtaccttctccagcataggtggacagccgaactgtaacatctgcagagtgtgtgcaggctatttcaggttcaagaagttttgctcctctacccacaacgcggagtgtgagtgcattgaaggattccattgcttggggccacagtgcaccagatgtgaaaaggactgcaggcctggccaggagctaacgaagcagggttgcaaaacctgtagcttgggaacatttaatgaccagaacggtactggcgtctgtcgaccctggacgaactgctctctagacggaaggtctgtgcttaagaccgggaccacggagaaggacgtggtgtgtggaccccctgtggtgagcttctctcccagtaccaccatttctgtgactccagagggaggaccaggagggcactccttgcaggtccttaccttgttcctggcgctgacatcggctttgctgctggccctgatcttcattactctcctgttctctgtgctcaaatggatcaggaaaaaattcccccacatattcaagcaaccatttaagaagaccactggagcagctcaagaggaagatgcttgtagctgccgatgtccacaggaagaagaaggaggaggaggaggctatgagctgtga。

（2）构建mCD137基因真核表达载体

以pIRES2-EGFP质粒为基础，重组步骤（1）中克隆所得mCD137基因。具体操作可参考如下。

首先，对步骤（1）中的PCR扩增产物进行电泳检测，切胶后回收目的基因（参考试剂盒说明书进行相关操作即可）。

随后，对pIRES2-EGFP质粒进行EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，并进一步利用连接酶连接以重组mCD137基因；

最后，转化、筛选（该质粒同时具有氨苄和卡那抗性）以获得过表达mCD137蛋白的重组质粒。

对pIRES2-EGFP质粒进行双酶切时，50μl酶切体系参考如下：

EcoRⅠ 内切酶，1 μL；

BamHⅠ 内切酶，1 μL；

质粒，10 μg；

10×Buffer，补至50 μL；

37 ℃酶切30min；酶切结束后，电泳检测、并切胶回收酶切产物。

连接酶连接时，10μl连接体系参考如下：

Quick-Clone，4 μL；

酶切后的质粒，10 ng；

目的基因片段，30 ng；

ddH₂O，补足至10 μL；

混合均匀后，55 ℃水浴加热20 min，再30 ℃水浴加热45min以完成连接。

转化合筛选时，具体操作参考如下：

将上述酶连产物加入100 μL Top10感受态大肠杆菌中，冰上放置孵育30 min后，42 ℃水浴热激45 s，立即冰水浴2-3 min；随后，加900 μL LB液体培养基，37 ℃、220 rpm震荡培养1 h；

5000 rpm离心3 min后，弃掉900 μL上清，（LB液体培养基）重悬菌体后，涂在卡那板上，37 ℃、倒置培养12-16 h；

培养结束后，挑取阳性单克隆菌斑，转接于3 mL的含有千分之一卡那的LB液体培养基中，37 ℃、220 rpm震荡培养15 h，随后进行菌液PCR鉴定，并进一步提取质粒进行测序鉴定，确保质粒重组正确（改造后重组质粒结构图如图4所示）。

（3）转染以构建获得过表达mCD137蛋白细胞

将步骤（2）重组正确质粒转染HEK293T细胞，以构建获得过表达mCD137蛋白细胞。转染操作时，参考转染试剂说明书进行相关操作即可，或者可具体参考如下：

在1.5 mL的EP管中加入500 μL无血清无双抗的纯DMEM，滴加30 μL转染试剂PEI，震荡混匀，室温静置5 min；

将100 μL所提取的重组正确的质粒(浓度100 ng/μL)加入一支新的离心管中，然后将上述混合转染试剂混合液滴加到质粒中，吹气泡混匀，室温孵育20 min；

将孵育好的质粒混合液滴加到汇合度为60%-70%的HEK293T细胞中，轻轻摇匀，24h后给细胞换液（37 ℃预热的完全培养基），荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况（结果如图5所示）并继续培养至48 h后收细胞进行后续流式检测。

（二）流式检测评估合成多肽与细胞亲和性

以上述步骤（一）中构建的超表达mCD137蛋白细胞为实验细胞，评估实施例1筛选合成相关多肽与mCD137的亲和力情况。具体实验操作参考如下。

将前述步骤（一）中转染48 h后的293T细胞培养物用胰酶进行消化后，并加1 mL的DMEM完全培养基以终止消化后，1000 rpm离心3 min，弃上清（转染mCD137质粒的293T细胞作为实验组，同步地，以转染空载质粒的293T细胞作为对照组）；细胞沉淀用PBS洗涤一次并离心后，用PBS重悬293T细胞并计数；

实验组和对照组分别取5×10⁵个293T细胞，加入10 μL待评的合成肽溶液（事先用PBS溶解, 用量100 μM），冰上孵育30 min；然后加1 mL PBS，2000 rpm离心2 min（以洗去未结合多肽，可洗两次以确保清洗效果）；

加入50 μL PBS和0.5 μL SA（链霉亲和素）抗体，冰上孵育30 min后，加1 mL PBS，2000 rpm离心2 min（以洗去多余的SA抗体），最后加入300 μL PBS，上流式检测亲和效果。

同步地，阳性对照：实验组细胞加0.5 μL mCD137抗体；阴性对照：对照组细胞加0.5 μL mCD137抗体；同型对照：两组细胞分别加0.5 μL mIgG1抗体，上机检测抗体效果。

相关抗体检测结果如图6所示，可以看出，mCD137抗体与mCD137蛋白具有亲和性；IgG同型对照抗体和GA对照多肽与mCD137蛋白没有亲和性，且moe-22、moe-25和moe-70均表现出与mCD137蛋白的亲和能力。

实施例3

在实施例2对初步模拟筛选所得多肽与mCD137蛋白亲和力有所明确基础上，为进一步评估考察筛选所得多肽的实际应用前景，发明人进行了进一步的体外细胞实验和体内的肿瘤模拟实验，具体实验情况简介如下。

（一）体外细胞实验

以MC38细胞系（小鼠结直肠癌细胞）为例，发明人对mCD137蛋白亲和肽的毒性、浓度依赖性等情况进行了进一步实验评估。具体实验情况简介如下。

（1）细胞毒性情况

将MC38细胞培养至汇合度70%时，消化、铺96孔板，每孔100 μL细胞液（细胞浓度2×10⁴个/mL）；

细胞培养生长24 h后，吸弃培养液，每孔加入200 μL多肽，多肽浓度梯度设置为（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μM，DMEM完全培养基稀释），每个多肽的浓度设置4个复孔；

继续培养48 h后，吸弃培养基，避光条件下，每孔加200 μL MTT工作液（MTT母液配制：0.25 g MTT溶于50 mL PBS中，过滤除菌，避光；MTT工作液配制：DMEM纯培养基：MTT母液=10:1）；

继续培养4 h后，吸弃MTT，避光加DMSO，200 μL/孔，10 min后用酶标仪测量吸光度值。

实验结果如图7所示。分析可以看出：三种肽在浓度低于100 μM时对MC38细胞均未表现出明显的毒性作用，但moe-22和moe-70在浓度为100 μM时，影响了细胞的增殖，而moe-25在浓度为200 μM时则影响了细胞增殖。

（2）浓度依赖情况

参考前述实验操作，将多肽浓度调整为：12.5、25、50、100μM四个浓度，然后进行流式检测以评估浓度依赖情况。

实验结果如图8所示。可以看出，多肽的浓度越大，其与mCD137蛋白的亲和能力越强，最后趋于饱和，也即，在一定浓度范围内，筛选所得多肽与mCD137蛋白的亲和能力呈现一定的浓度依赖性（其中，moe-70在浓度为50 μM时，其与靶蛋白的亲和力即基本达到饱和）。

（二）活体动物实验

通过构建结直肠癌模型小鼠，发明人对相关多肽的应用效果进行了进一步检测评估，具体实验情况简介如下。

将小鼠随机分为4组（每组5只）：生理盐水组、moe-22组、moe-25组和moe-70组；

用1 mL的注射器吸100 μL细胞（MC38细胞，生理盐水调整细胞浓度为1×10⁷/mL）液皮下注射到小鼠的右上侧背部，每只小鼠打1×10⁶个细胞；

接种后第三天，在小鼠背部形成明显可触摸的肿瘤时，测量肿瘤体积，并使用公式( L1²×L2 )/2计算体积，其中L1是最短直径；

之后两天称一次体重，每天以2 mg/Kg的剂量尾静脉注射多肽药物，第30天解剖小鼠。

小鼠生长情况统计如图9所示。分析可以看出：相较于moe-22、moe-25，moe-70显著抑制了肿瘤的生长，且小鼠的体重没有明显变化，表现出较好的应用前景。

（需要补充说明的是，实验过程中，对于moe-22，由于小鼠个体之间的差异，一只C57BL/6N小鼠在接受moe-22治疗的过程中死亡，因此最终30天解剖结果有所缺失；而对于moe-25治疗后所导致的小鼠肿瘤体积长得较快这种现象，初步推测认为可能是多肽的脱靶效应造成的）。

Claims

1.一个mCD137亲和肽moe-70，其特征在于，所述亲和肽moe-70包括12个D型氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体从氨基端到羧基端的氨基酸序列为：ARFCKQHKLKFW。

2.权利要求1所述亲和肽moe-70的制备方法，其特征在于，采用Fmoc固相合成法制备。

3.权利要求1所述亲和肽moe-70在制备肿瘤防治药剂中的应用，其特征在于，用于肿瘤的防治。

4.如权利要求3所述亲和肽moe-70在制备肿瘤防治药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤，具体为结直肠癌相关肿瘤。