CN116813778A - 一种靶向中期因子mdk的d4纳米抗体及其衍生物和应用 - Google Patents
一种靶向中期因子mdk的d4纳米抗体及其衍生物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向中期因子MDK的D4纳米抗体及其衍生物和应用。所述纳米抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，通过免疫组化鉴定胰腺导管腺癌中高表达MDK蛋白，证明MDK可以作为胰腺导管腺癌潜在的靶蛋白，通过对人源MDK蛋白的纯化鉴定，并经过3轮噬菌体筛选，得到与人源和鼠源MDK都结合的D4纳米抗体。亲和力使用Elisa和Biocore同时进行鉴定，也证明了结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向中期因子MDK的D4纳米抗体及其衍生物和应用。
背景技术
近年来，与抗体偶联的小分子药物被称为抗体-药物偶联物(antibody–drugconjugates,ADC))，已被用作一种肿瘤治疗策略。在这种新的抗体疗法出现后，治疗癌症的效果较传统疗法得到了显著提升。ADC药物是一类新兴的分子，是由抗体、连接头和细胞毒性药物组成的靶向生物药剂。当ADC与抗原阳性的癌细胞或组织结合时，它们会被内化，然后裂解连接头，细胞毒性药物可通过局部扩散或渗透进入细胞或肿瘤基质诱导有效的抗肿瘤作用。迄今为止，已有十几种ADC药物获得FDA批准，包括2011年用于CD30阳性淋巴瘤的本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、2013年用于HER-2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)和2019年用于局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的恩诺单抗(enfortumab vedotin)。而戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan)和玛贝妥单抗(belantamab mafodotin)于2020年分别获得FDA批准用于治疗TROP2阳性乳腺癌和复发或难治性多发性骨髓瘤。
肿瘤微环境由包括肿瘤细胞在内的各种细胞成分和细胞外基质组成。大量证据表明，肿瘤细胞通过分泌各种生长因子到细胞外基质中来促进肿瘤的生长和侵袭。此外，它们还会导致大多数实体瘤的产生免疫抑制性的肿瘤微环境。尽管目前全球有100多种ADC药物正在用于治疗各种癌症的临床试验，但大多数ADC药物已被设计为直接靶向癌细胞。具有高基质含量的实体瘤，例如胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)，对当前疗法反应不佳，这也限制了患者的生存。因此，开发有效识别细胞外基质成分的ADC药物对PDAC的治疗具有重大的意义。
纳米抗体(nanobody，nb)是骆驼和鲨鱼血液中存在一种新型抗体，只有两条重链与Fc段构成。由于缺少轻链和常规重链的第一个恒定域(CH1)，nb也称为单域抗体(singledomain antibody,scAb)。Nb的结合位点由重链的可变区(variable domain of the heavychain of the HcAbs，VHH)构成，是目前得到的具有完整生物学功能的最小单位抗体，相对分子质量约为15kDa，是常规抗体的十分之一左右。这一特殊结构使其不但保留了传统抗体的优势，同时也具备了一些新的功能。首先，由于纳米抗体具有较小的分子量，其比传统抗体展现出更好的组织穿透性；其次，纳米抗体有比传统抗体更长的CDR3序列，该序列可以灵活的调节和构象扩展，使它能够到达常规抗体无法接近的表位。再者，纳米抗体基因序列与人VH基因家族III序列有高度的同源性，因此免疫原性较低，与人体具有很好的相容性；而且纳米抗体可以使用大肠杆菌系统进行表达纯化，使得制备成本极大地降低。
噬菌体展示筛选技术是一种快速、高通量的筛选与特定靶分子结合的多肽或抗体片段的方法。将多肽、蛋白或抗体片段表达在噬菌体外壳蛋白上，利用噬菌体在宿主菌中快速复制的生物特性，可以在较短的时间内通过几轮的结合-漂洗-洗脱-扩增筛选，获得与靶标分子结合的多肽、蛋白或抗体片段。因此，近年来，噬菌体展示纳米抗体库被广泛地用来筛选鉴定各种靶标的纳米抗体，通过筛选构建好的天然纳米抗体文库或者免疫驼类后制备的免疫噬菌体纳米抗体文库，可以快速获得和靶标蛋白结合的纳米抗体。
发明内容
为了解决上述问题，本发明基于噬菌体纳米抗体文库，筛选得到一条与人源和鼠源MDK蛋白高亲和力的纳米抗体，并验证了它们与人源和鼠源MDK蛋白的结合情况。。
本发明的第一个方面提供了一种靶向中期因子MDK的D4纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示。
进一步的，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个方面提供了一种靶向中期因子MDK的D4纳米抗体的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该纳米抗体的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的编码基因也可以包括与SEQ ID NO.2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO.5。
本发明的第三个方面提供了一种含有所述编码基因的重组表达载体。
进一步的，所述重组表达载体中的载体为病毒载体和非病毒载体中的至少一种。其中，非病毒载体包括质粒载体和噬菌体载体。具体地，所述质粒载体可以但不限于为真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等。其中，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。优选为慢病毒载体，例如pCDH质粒、pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个，但不限于此。
本发明的第四个方面提供了一种含有所述编码基因的表达体系。
进一步的，该表达体系为原核表达体系或真核表达体系。
本发明的第五个方面提供了一种纳米抗体在制备治疗或诊断MDK升高的有关肿瘤的药物中的应用，所述MDK升高的有关肿瘤包括胰腺癌。
本发明的第六个方面提供了一种纳米抗体与功能分子相缀合得到的衍生物，所述的功能分子包括小分子药物、细胞毒性药物、生物活性蛋白、放射性同位素或荧光染料中的一种或多种。
所得到衍生物能够应用于制备肿瘤分子影像诊断的试剂或治疗肿瘤的药物；或者是将以及衍生物应用于制备诊断或治疗MDK升高的有关肿瘤。
本发明的第七个方面提供了一种药物组合物，包括所述的衍生物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在一些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗肿瘤药物。
在一些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性抗体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、或衍生物与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、表达载体、或衍生物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
本发明的第八个方面提供了一种诊断试剂盒，包括所述的衍生物。
本发明的第九个方面提供了一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测待测样品中MDK存在情况的方法，包括以下步骤：以所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为MDK的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中MDK的存在情况。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、表达载体、衍生物或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗肿瘤药物)联合使用。
本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、表达载体、衍生物或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
本文所用的术语“纳米抗体”是指包含了抗体中单个可变域的片段，也称为纳体(Nanobody)。和完整的抗体一样，它可以选择性的和特定抗原结合。与完整抗体的150－160kDa的质量相比，单域抗体则显得小得多，大约只有12－15kDa。第一个单域抗体是从骆驼的重链抗体中人造工程制作出来的，称为“VHH区段”。
术语“氨基酸序列”是指氨基酸相互连接形成肽链(或多肽)的顺序，氨基酸序列只能按照一个方向读取。氨基酸有100多种不同类型，其中20种常用，本发明不排除氨基酸链上有其他物质，例如糖类、脂类等修饰，本发明也不限于20中常用的氨基酸。
术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA中碱基的排列顺序，即在DNA中为A、T、G、C的排列顺序，或者在mRNA中A、U、G、C的排列顺序，也包括rRNA、tRNA、mRNA中碱基的排列顺序。应该理解，本发明请求保护的抗体基因除了DNA序列外，也涵盖RNA(rRNA、tRNA、mRNA)以及它们的互补序列。
术语“重组表达载体(Expression vectors)”是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。本发明包括但不限于原核细胞表达载体、真核细胞表达载体或其它细胞表达载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、通过免疫组化鉴定胰腺导管腺癌中高表达MDK蛋白，证明MDK可以作为胰腺导管腺癌潜在的靶蛋白。
2、通过对人源MDK蛋白的纯化鉴定，并经过3轮噬菌体筛选，得到与人源和鼠源MDK都结合的D4纳米抗体。亲和力使用Elisa和Biocore同时进行鉴定，也证明了结果的可靠性。
综上所述，使用以上技术可以证明纳米抗体D4可以有效识别人源和鼠源的MDK蛋白。
附图说明
图1为肿瘤细胞系MDK的表达情况，其中A为MDK蛋白在肝癌和胰腺癌细胞系上的表达，B为MDK蛋白表达水平的定量分析。
图2为人源和鼠源MDK蛋白表达纯化后电泳考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹验证。
图3为MDK纳米抗体筛选、纯化及验证结果，其中A，以人源MDK蛋白靶点，进行三轮噬菌体纳米抗体文库的筛选，显示文库被高度富集；B，表达纯化了D4和对照C9纳米抗体，获得高纯度D4和对照C9纳米抗体，大小分别为15kD和18kD左右；使用HA标签抗体进行WB检测，证实纳米抗体蛋白表达正确；C，ELISA检测D4纳米抗体与人源MDK蛋白的结合，发现D4纳米抗体显示结合活性。D，ELISA检测D4纳米抗体与鼠源MDK蛋白的结合，发现D4纳米抗体显示结合活性。
图4为Biacore检测纳米抗体与人源MDK蛋白的亲和常数，A：纳米抗体D4与人源MDK蛋白的亲和力为142.2nM，B：纳米抗体D4与鼠源MDK蛋白的亲和力为32.5nM。
图5为Dot blot实验分析D4纳米抗体可识别MDK阳性细胞系(KPC细胞)裂解液中的MDK抗原。
图6-9为D4纳米抗体修饰的纳米颗粒在荷瘤小鼠体内的靶向性分析，其中，图6为对照PCP纳米颗粒和D4-MDK纳米抗体修饰的纳米颗粒在KPC胰腺癌小鼠中的成像，图7为对两组小鼠器官和肿瘤组织进行解剖和成像，图8为对照PCP-纳米颗粒和D4-MDK纳米抗体修饰的纳米颗粒在肿瘤部位的荧光信号分析，图9为对照PCP-纳米颗粒和D4-MDK纳米抗体修饰的纳米颗粒在器官和肿瘤部位的荧光信号分析。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：纳米抗体的制备
1.体外验证MDK表达情况(蛋白质印迹法Western Blotting,WB)
取处于生长期的HEK-293、HEP-1、HEP G2、Hepa 1-6、HuH-7、ASPC-1、PANC02 andKPC细胞系。置于冰上预冷10分钟，PBS清洗3遍并晾干。使用预先加入PMSF、蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA强效裂解液充分裂解上述细胞。12000rpm离心5min后收集上清，并按照1:4加入loading buffer于95℃煮沸5min变形蛋白。取配制好的10％SDS-PAGE胶，电泳分离至蛋白marker充分分离后，将细胞裂解液转印至PVDF膜上。10％脱脂奶粉封闭1小时后，按照1:100稀释MDK抗体并于4℃冰箱内孵育过夜。TBST清洗三遍，孵育二抗并再次以TBST溶液清洗3遍。ECL显影曝光。
2.MDK纳米抗体的筛选及验证
1)人源和鼠源MDK蛋白表达纯化
设计并合成人源和鼠源MDK蛋白基因并表达纯化蛋白用于纳米抗体筛选。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，拟通过不同浓度的IPTG在16℃低温进行诱导条件摸索；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；d)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKTA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次；e)，根据电泳结果确定目的蛋白纯度，BCA法测定蛋白浓度。
2)纳米抗体筛选
采用免疫管法对天然的羊驼源噬菌体展示纳米抗体文库进行筛选，所选择的噬菌体展示库容量为2x109。筛选步骤如下：a)，将人源MDK蛋白按50μg/mL浓度包被在免疫管上，进行3轮富集筛选；b)，使用第三轮噬菌体洗脱液铺板，随机挑取96个单克隆进行ELISA验证，以ELISA读数大于对应BSA读数3倍且读数大于0.5为阳性标准；c)，经过2次噬菌体ELISA鉴定的阳性单克隆进行测序确定序列信息；d)，根据测序信息设计并合成筛选到的纳米抗体，通过大肠杆菌进行表达纯化；e)，利用ELISA亲和性实验来初步鉴定纳米抗体的亲和力，选择亲和力较好的纳米抗体，表达纯化后进行表面等离子共振(surface plasmonresonance，SPR)测定亲和常数。
3)纳米抗体的纯化表达
将纳米抗体基因序列克隆入PET-14B载体，同时融合表达血凝素标签(hemagglutinin HA tag)用于后续检测。表达纯化步骤如下：a)，为防止形成包涵体和蛋白降解，使用0.2mM浓度的IPTG在16℃低温进行诱导；b)，根据预实验诱导条件进行大量诱导表达，高压破菌仪工作条件1000W进行破菌；c)，17000g，4℃离心30min，取上清与Ni填料4℃共孵育1小时；g)，Ni柱纯化后进行分子筛分离，AKTA参数设置0.5mL流速/分钟，每1mL收集一次。
4)纳米抗体的ELISA实验
将HA标签融合到纳米抗体基因编码序列里，表达具有HA标签的纳米抗体，ELISA板包被人源和鼠源MDK蛋白，封闭，之后加入各种浓度的纳米抗体在室温孵育1小时，PBS漂洗3次，anti-HA抗体室温孵育1小时后，辣根过氧化物酶标记的抗HA抗体放大信号，TMB显色，同时做无关纳米抗体的对照和无关蛋白抗原的空白对照。
5)表面等离子共振实验
此实验用来验证在体外表达纯化的纳米抗体与体外纯化的抗原蛋白直接相互作用，并计算二者的平衡常数。纯化抗原蛋白被固定在芯片上，不同浓度的纳米抗体被顺序加入来分析与抗原蛋白的亲和力，记录360秒内的反应信号，制作动力学曲线，计算各相关参数。
6)斑点印迹实验(Dot blot)
使用含有PMSF、蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA强效裂解液提取MDK阳性细胞KPC的总蛋白，BCA定量。取硝酸纤维膜，使用铅笔画出1cm3小格。按照0、0.1、0.2、0.4及0.8μg梯度配制5μL待检溶液并滴入小格内。室温晾干。10％脱脂奶粉封闭1小时后，使用4％ BSA按照20μg/mL浓度配制纳米抗体工作液15mL。将纳米抗体工作液与硝酸纤维膜置入10cm皿内，4℃孵育过夜。PBST清洗3遍，按照1:1000比例加入与辣根过氧化物偶联的anti-HA抗体室温孵育1小时。再次PBST清洗。ECL显影曝光。
7)Midkine纳米抗体修饰的纳米材料的成像研究
将肿瘤体积约400mm3的KPC胰腺癌荷瘤小鼠随机分成2组(n＝3)。静脉内注射200μl Cy5.5修饰的PCP纳米颗粒(nanoparticle，NPs)(40μg/mL)或D4 MDK Nb-PCP NPs(40μg/mL)，分别在4h,8h,12h,16h和24h用体内成像系统(IVIS,PerkinElmer，美国)对小鼠进行扫描。它们在注射后24小时被处死，并对肿瘤与主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)进行成像。最后对荧光强度进行分析。
实验结果
(1)体外验证表达MDK的表达情况。
如图1A、B所示，本发明利用蛋白质印迹检测到胰腺癌细胞系MDK的高表达。
(2)人源和鼠源MDK蛋白的表达纯化。
人源和鼠源MDK蛋白分子量分别约为17kD和16kD，较适合作为纳米抗体筛选的靶蛋白。密码子优化后合成人源MDK基因进行大肠杆菌诱导表达纯化，为了避免蛋白降解和包涵体的产生，用0.2mM的IPTG在16℃低温过夜进行诱导，最后通过Ni柱和分子筛纯化后本实施例得到了高纯度的目的蛋白，利用人源MDK蛋白进行后续纳米抗体筛选(图2)。
(3)MDK纳米抗体的筛选鉴定。
首先对人源MDK蛋白进行了噬菌体纳米抗体文库的筛选，三轮筛选之后，文库富集超过50倍(图3A)，从第三轮所得文库挑取约200个克隆进行两次噬菌体ELISA作初步验证，初步鉴定出1个阳性克隆，命名为D4。进而表达纯化这个纳米抗体和对照纳米抗体C9并进行anti-HA WB检测证实蛋白的正确性(图3B，3C)，之后进行直接的ELISA验证，确认这个纳米抗体与MDK蛋白具有结合活性(图3D)。
(4)D4纳米抗体的亲和力检测
本发明使用biacore，进一步检测了D4克隆与人源MDK蛋白的亲和力常数，发现D4纳米抗体与人源和鼠源MDK蛋白的亲和力分别为142.2nM和32.5nM(图4A、B)。
(5)D4纳米抗体靶向MDK抗原的体外实验研究
通过Dot blot实验，发现纯化所得纳米抗体D4可有效识别MDK阳性细胞裂解液中MDK抗原。其表现为斑点信号强度与细胞裂解液蛋白量间的线性关联。综上，纳米抗体D4可有效识别人源和鼠源MDK抗原。
(6)纳米抗体靶向MDK抗原的体内实验研究
荧光活体成像结果(图6-9)显示，D4-MDK纳米抗体修饰的纳米颗粒在肿瘤部位富集的荧光信号明显强于对照纳米颗粒，两组在小鼠各个对照器官中的分布无明显差异，而D4-MDK纳米抗体修饰的纳米颗粒在肿瘤部位富集更明显。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向中期因子MDK的D4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示。
2.根据权利要求1所述的D4纳米抗体，其特征在于，该纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
3.一种权利要求1所述靶向中期因子MDK的D4纳米抗体的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种含有如权利要求3所述编码基因的重组表达载体。
5.一种含有如权利要求3所述编码基因的表达体系。
6.一种根据权利要求1所述的D4纳米抗体在制备治疗或诊断MDK升高的有关肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述MDK升高的有关肿瘤包括胰腺癌。
7.一种根据权利要求1所述的D4纳米抗体与功能分子相缀合得到的衍生物，其特征在于，所述的功能分子包括小分子药物、细胞毒性药物、生物活性蛋白、放射性同位素或荧光染料中的一种或多种。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求7所述的衍生物以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.一种诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的衍生物。
10.一种用于非疾病诊断和治疗目的的检测待测样品中MDK存在情况的方法，其特征在于，包括以下步骤：以权利要求1所述的纳米抗体作为MDK的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中MDK的存在情况。
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