KR101216008B1 - 바이포달 펩타이드 바인더 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더, 그리고 그의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 KD 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다. 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바이포달 펩타이드 바인더{Bipodal Peptide Binder}
본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
항체는 B 세포가 생산하는 혈장단백질의 일종인 면역글로불린 단백질로써 외부에서 들어온 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원을 비활성화하거나 무력화시킨다. 이러한 항원-항체 반응의 특이성과 고도의 친화도 및 수천만 종류의 항원을 구별할 수 있는 항체의 다양성을 응용하여 오늘날 진단제와 치료제 등을 포함하는 많은 종류의 항체 제품이 출현하게 되었다. 현재 FDA에서는 21개의 단일클론항체를 승인하였으며 리턱시맵(Rituximab) 및 헤르셉틴(Herceptin)과 같은 항체는 다른 치료에서 전혀 반응을 보이지 않던 환자들의 50% 이상에서 효과를 보인바 있으며 실질적으로 여러 연구에서 단일클론항체를 이용하여 림프종, 대장암 또는 유방암 등에 성공적인 임상치료를 보여주고 있다. 치료용 항체의 전체 시장 규모는 2004년 100억 달러 규모에서 2010년에는 300억 달러로 연평균 20%의 성장률을 보일 것으로 추정하고 있으며, 그 시장 규모는 기하급수적으로 증가할 것으로 추정되고 있다. 항체를 이용한 신약개발이 활발해지는 이유는 약품의 개발기간이 짧으며 투자비용이 작고 부작용을 쉽게 예측할 수 있기 때문이다. 또한 항체는 생약이어서 인체가 거의 영향을 받지 않으며 체내에서의 반감기가 저 분자량 약품에 비하여 압도적으로 길어서 환자에게 친화적이다. 이러한 유용성에도 불구하고 인간에서 단일클론항체는 외래 항원으로 인식하여 심한 알레르기 반응 또는 과민반응을 일으키기도 한다. 또한, 이러한 항암 기능의 단클론 항체를 임상적으로 사용할 경우 생산 단가가 높기 때문에 치료제로서의 가격이 급격히 상승한다는 단점이 있으며, 항체를 배양하는 방법 및 정제 방법 등 광범위한 분야의 기술들이 각종 지적 소유권에 의해 보호받고 있기 때문에 비싼 라이센싱비를 지불해야 한다.
따라서 이 문제를 해결하기 위해서 미국을 중심으로 유럽연합에서 항체 대체 단백질 개발이 태동기에 있다. 항체 대체 단백질은 항체와 같이 불변영역과 가변영역을 가질 수 있도록 만든 재조합 단백질로 크기가 작고 안정한 단백질의 일정부분을 무작위 서열의 아미노산으로 바꾸어 라이브러리를 만들고 이를 표적물질에 대해 스크리닝을 하여 높은 친화력과 좋은 특이성을 가진 물질을 찾을 수 있다. 예를 들어 항체 대체 단백질중 아비머(avimer)와 아피바디(affibody)는 표적물질에 대해 피코몰(picomole) 정도의 친화력을 가진 예시가 보고되어 있다. 이런 항체 대체 단백질은 크기가 작고 안정해서 암세포에 깊이 침투 가능하며 일반적으로 면역반응을 적게 일으킨다고 보고되어 있다. 그리고 무엇보다도 광범위한 항체 특허 문제에서 벗어 날 수 있으며 박테리아에서 쉽게 대량정제 할 수 있기 때문에 생산단가가 낮아 경제적으로 항체보다 큰 장점을 가진다. 현재 개발된 항체 대체 단백질은 40개가 있으나 이 중 벤처 회사나 다국적 제약회사에서 상용화를 시도하고 있는 항체 대체 단백질은 피브로넥틴 타입 Ⅲ 도메인, 리포칼린, LDLR-A 도메인, 크리스탈린, 프로테인 A, 안키린 리피트(Ankyrin repeat), BPTI 라는 단백질을 이용하고 있으며 타겟에 대한 피코몰에서 수 나노몰정도의 높은 친화력을 가지고 있다. 그 중 애드넥틴(Adnectin), 아비머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인은 현재 FDA 임상 실험이 진행 중이다.
본 발명은 지금까지의 단백질을 이용한 항체대체 단백질과는 다른 펩타이드 기반 항체대체 단백질에 초점을 맞추었다. 펩타이드는 항체에 비해 적절한 약물동력학, 대량생산성, 낮은 독성, 항원성 억제 및 낮은 생산 단가 등으로 인해 현재 항체 치료제를 대체하여 다양하게 활용되고 있다. 치료용 약으로서의 펩타이드의 장점은 생산 단가가 낮고, 안전성 및 반응성이 높으며, 특허 로얄티가 상대적으로 저렴하고, 원하지 않는 면역시스템에 덜 노출되어 펩타이드 자체에 대한 항체 생산을 억제 할 수 있으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확하다는 것이다. 그러나 대부분의 펩타이드는 항체에 비해 특정 단백질 타켓에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 여러 응용분야에 사용되지 못하는 단점이 있다. 따라서, 펩타이드의 단점을 극복할 수 있는 새로운 펩타이드 기반 항체 대체 단백질 개발에 대한 요구가 당업계에 대두되고 있다. 이에 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 높은 친화성으로 특이적 결합이 가능한 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 이는 현재 매우 많은 타겟에 대해 보고된 낮은 친화력를 가진 펩타이드를 이용하여 빠른 시간안에 높은 친화성 및 특이성을 가진 신약후보를 만들 수 있는 기술이 될 것으로 기대된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화성(affinity)으로 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 타겟 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더를 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 타겟 분자에 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생물학적 타겟 분자에 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 제조방법을 제공한다:
다음의 단계를 포함하는 타겟에 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder)의 제조방법:
(a) (i) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성되는 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); (ⅱ) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 제공하는 단계;
(b) 상기 라이브러리와 타겟을 접촉시키는 단계; 그리고,
(c) 상기 타겟과 결합된 바이포달 펩타이드 바인더를 선택하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및 (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더를 제공한다.
본 발명자들은 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화성(affinity)으로 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 비교적 리지드(rigid)한 펩타이드 골격을 가지는 구조안정화 부위의 양 말단에 무작위적(random)으로 펩타이드를 결합시키고, 이 두 펩타이드를 공동으로 타겟 분자에 결합시키는 경우에는 크게 증가된 결합능 및 특이성을 가지는 바이포달 펩타이드 바인더를 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 기본적인 전략은 리지드한 펩타이드 골격의 양 말단에 타겟에 결합되는 펩타이드를 연결하는 것이다. 이 경우 리지드한 펩타이드 골격은 바이포달 펩타이드 바이더의 전체적인 구조를 안정화시키는 작용을 하며, 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ가 타겟 분자에 결합되는 것을 강화시킨다.
본 발명에서 이용 가능한 구조안정화 부위는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 포함하며, 가닥간(interstrand) 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 비공유결합이 형성되는 단백질 구조 모티프들을 포함한다. 가닥간 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합에 의한 형성되는 비공유결합은 구조안정화 부위의 견고성(rigidity)에 기여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위에서의 가닥간(interstrand) 비공유결합은 수소결합, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용 또는 이들의 조합을 포함한다.
선택적으로, 구조화안정화 부위에 공유결합이 있을 수 있다. 예를 들어, 구조화안정화 부위에 이황화결합을 형성시켜 구조안정화 부위의 견고성을 더 증가시킬 수 있다. 이러한 공유결합에 의한 견고성 증가는 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟에 대한 특이도 및 친화도를 고려하여 부여한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결되어 있다. 본 명세서에서 가닥을 언급하면서 사용되는 용어 “링커”는 가닥과 가닥을 연결시켜 주는 물질을 의미한다. 예컨대, 구조안정화 부위로서 β-헤어핀이 이용되는 경우에는 β-헤어핀에 있는 턴 서열이 링커의 역할을 하며, 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 루이신 지퍼의 두 C-말단을 연결하는 물질(예컨대, 펩타이드 링커)이 링커의 역할을 한다.
링커는 패러럴, 안티패러럴 또는 패러럴과 안티패러럴 아미노산 가닥들을 연결한다. 예컨대, 패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 2개의 가닥(바람직하게는 2개의 가닥), 패러럴 및 안티패러럴 방식으로 정렬된 최소 3개의 가닥(바람직하게는 3개의 가닥)을 링커가 연결하게 된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 링커는 턴 서열 또는 펩타이드 링커이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 턴 서열은 β-턴, γ-턴, α-턴, π-턴 또는 ω-loop이다(Venkatachalam CM (1968), Biopolymers, 6, 1425-1436; Nemethy G and Printz MP. (1972), Macromolecules, 5, 755-758; Lewis PN et al., (1973), Biochim . Biophys . Acta, 303, 211-229; Toniolo C. (1980) CRC Crit . Rev. Biochem ., 9, 1-44; Richardson JS. (1981), Adv . Protein Chem ., 34, 167-339; Rose GD et al., (1985), Adv . Protein Chem ., 37, 1-109; Milner-White EJ and Poet R. (1987), TIBS, 12, 189-192; Wilmot CM and Thornton JM. (1988), J. Mol. Biol ., 203, 221-232; Milner-White EJ. (1990), J. Mol . Biol ., 216, 385-397; Pavone V et al. (1996), Biopolymers, 38, 705-721; Rajashankar KR and Ramakumar S. (1996), Protein Sci ., 5, 932-946). 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 턴 서열은 β-턴이다.
턴 서열로서 β-턴이 이용되는 경우, 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다(B. L. Sibanda et al., J. Mol . Biol ., 1989, 206, 4, 759-777; B. L. Sibanda et al., Methods Enzymol ., 1991, 202, 59-82).
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 턴 서열로서 이용될 수 있는 것은 H. Jane Dyson et al., Eur . J. Biochem . 255:462-471(1998)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 턴 서열로 이용될 수 있는 것은 다음의 아미노산 서열을 포함한다: X-Pro-Gly-Glu-Val; Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다).
본 발명의 일 구현예에 따라, 구조안정화 부위로서 β-쉬트 또는 루이신 지퍼가 이용되는 경우, 패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥 또는 안티패러럴 방식으로 정렬된 2개의 가닥을 펩타이드 링커가 연결하는 것이 바람직하다.
펩타이드 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 이용 가능하다. 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션(flexible extended conformation)에 적용될 수 있는 능력; (b) 생물학적 타겟 분자와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 생물학적 타겟 분자와 상호작용하는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. Thr 및 Ala과 같은 다른 중성 아미노산들도 링커 서열에 포함될 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46( 1985); Murphy et al., Proc . Natl . Acad Sci. USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 펩타이드 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼이고, 보다 바람직하게는 구조안정화 부위는 β-헤어핀 또는 링커로 연결된 β-쉬트이며, 가장 바람직하게는 β-헤어핀이다.
본 명세서에서 용어 “β-헤어핀”은 두 개의 β 가닥을 포함하는 가장 간단한 단백질 모티프를 의미하며, 이 두 개의 β 가닥은 서로 안티패러럴한 정렬을 나타낸다. 이 β-헤어핀에서 두 개의 β 가닥은 일반적으로 턴 서열에 의해 연결된다.
바람직하게는, β-헤어핀에 적용되는 턴 서열은 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ', 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, 보다 바람직하게는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, 보다 더 바람직하게는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이며, 가장 바람직하게는 타입 I' 턴 서열이다. 또한, X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)으로 표시되는 턴 서열도 β-헤어핀에 이용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 타입 I 턴 서열은 Asp-Asp-Ala-Thr-Lys-Thr이고, 타입 I' 턴 서열은 Glu-Asn-Gly-Lys이며, 타입 Ⅱ 턴 서열은 X-Pro-Gly-Glu-Val; 또는 Ala-X-Gly-Glu-Val (X는 20개의 아미노산으로부터 선택된다)이고, 타입 Ⅱ' 턴 서열은 Glu-Gly-Asn-Lys 또는 Glu-D-Pro-Asn-Lys이다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,914,123호 및 Andrea G. Cochran et al., PNAS, 98(10):5578-5583)에 개시되어 있는 트립토판 지퍼, WO 2005/047503에 개시되어 있는 주형-고정된 β-헤어핀 미멕틱, 미국 특허 제5,807,979호에 개시되어 있는 β-헤어핀 변형체들이 잘 알려져 있다. 이외에도, β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드는 Smith & Regan (1995) Science 270:980-982; Chou & Fassman (1978) Annu. Rev. Biochem. 47:251-276; Kim & Berg (1993) Nature 362:267-270; Minor & Kim (1994) Nature 367:660-663; Minor & Kim (1993) Nature 371:264-267; Smith et al. Biochemistry (1994) 33:5510-5517; Searle et al. (1995) Nat. Struct. Biol. 2:999-1006; Haque & Gellman (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2303-2304; Blanco et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:5887-5888; de Alba et al. (1996) Fold. Des. 1: 133-144; de Alba et al. (1997) Protein Sci. 6:2548-2560; Ramirez-Alvarado et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3:604-612; Stanger & Gellman (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:4236-4237; Maynard & Searle (1997) Chem. Commun. 1297-1298; Griffiths-Jones et al. (1998) Chem. Commun. 789-790; Maynard et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120:1996-2007; 및 Blanco et al. (1994) Nat. Struct. Biol. 1:584-590에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
β-헤어핀 콘포메이션을 갖는 펩타이드를 구조안정화 부위로 이용하는 경우, 가장 바람직하게는 트립토판 지퍼를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 트립토판 지퍼는 다음 일반식 I로 표시된다:
*일반식 I
X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 바람직하게는, 상기 일반식 I에서 X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
보다 더욱 더 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser이고, X2 및 X'2는 Thr이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I' 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys이다.
가장 바람직하게는, 일반식 I에서 X1은 Ser이고, X2 및 X'2는 Thr이며, X3는 Trp이고, X4는 타입 I' 턴 서열 (ENGK) 또는 타입 Ⅱ' 턴 서열(EGNK)이고, X5는 Trp이며, X6는 Trp이고, X7는 Lys이다.
본 발명에 적합한 트립토판 지퍼의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제1서열 내지 제3서열 및 제5서열 내지 제10서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용가능한 β-헤어핀 펩타이드는 단백질 G의 B1 도멘인으로부터 유래된 펩타이드, 즉 GB1 펩타이드이다.
본 발명에서 GB1 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅱ로 표시된다:
일반식 Ⅱ
X1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4
X1은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X2는 Gln 또는 Thr이며, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
보다 바람직하게는, 일반식 Ⅱ의 구조안정화 부위는 다음 일반식 II'으로 표시된다:
일반식 Ⅱ
X1-Trp-Thr-Tyr-X2-Phe-Thr-Val-X3
X1은 Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X2는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X3는 Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에 적합한 GB1 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제4서열 및 제14서열 내지 제15서열에 기재되어 있다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 β-헤어핀 펩타이드는 HP 펩타이드이다. 본 발명에서 HP 펩타이드가 이용되는 경우, 바람직하게는 구조안정화 부위는 다음 일반식 Ⅲ으로 표시된다:
일반식 Ⅲ
X1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
X1은 Lys 또는 Lys-Lys이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 Val 또는 Thr이며, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Ala이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7은 Glu 또는 Gln-Glu이다.
본 발명에서 구조안정화 부위로서 이용 가능한 또 다른 β-헤어핀 펩타이드는 다음 일반식 Ⅳ로 표시된다:
일반식 Ⅳ
X1-X2-X3-Trp-X4
X1은 Lys-Thr 또는 Gly이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
일반식 III 및 IV의 β-헤어핀의 예시적인 아미노산 서열은 서열목록 제11서열 내지 제12서열, 제15서열 및 제16서열 내지 제19서열에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면, 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 이용할 수 있다. β-쉬트 구조에서 패러럴 또는 안티패러럴한, 바람직하게는 안티패러럴한 두 개의 아미노산 가닥이 뻗은 구조(extended form)로 되어 있으며, 아미노산 가닥 사이에 수소 결합이 형성된다.
β-쉬트 구조에서 두 개의 아미노산 가닥의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결된다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있다. 턴-서열이 링커로 이용되는 경우, β-턴 서열이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼가 이용될 수 있다. 루이신 지퍼는 패러럴한 2개의 α-사슬의 다이머화를 야기하는 보존성 펩타이드 도메인이며, 일반적으로 유전자 발현에 관여하는 단백질에 발견되는 다이머화 도메인이다("Leucine scissors". Glossary of Biochemistry and Molecular Biology (Revised). (1997). Ed. David M. Glick. London: Portland Press; Landschulz WH, et al. (1988) Science 240:1759-1764). 루이신 지퍼는 일반적으로 헵태드(heptad) 반복 서열을 포함하며, 루이신 잔기가 4번째 또는 5번째에 위치해 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 루이신 지퍼는 LEALKEK, LKALEKE, LKKLVGE, LEDKVEE, LENEVAR 또는 LLSKNYH의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 이용되는 루이신 지퍼의 구체적인 예를 서열목록 제39서열에 기재되어 있다. 루이신 지퍼의 각각의 반은 짧은 α-사슬로 이루어져 있으며, α-사슬간의 직접적인 루이신 접촉이 있다. 전사인자에 있는 루이신 지퍼는 일반적으로 소수성 루이신 지퍼 부위 및 염기성 부위(DNA 분자의 주 그루브와 상호작용하는 부위)로 이루어져 있다. 본 발명에서 루이신 지퍼가 이용되는 경우에는 염기성 부위는 반드시 필요로 하지 않는다. 루이신 지퍼 구조에서 두 개의 아미노산 가닥(즉, 두 개의 α-사슬)의 인접한 두 말단은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커로서는 상술한 다양한 턴-서열 또는 펩타이드 링커가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 루이신 지퍼의 구조에 영향을 미치지 않는 펩타이드 링커가 이용된다.
상술한 구조안정화 부위의 양 말단에는 무작위 아미노산 서열이 결합된다. 상기 무작위 아미노산 서열이 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 형성한다. 본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 구조안정화 부위의 양쪽 말단에 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ를 연결하여 바이포달 방식으로 펩타이드 바인더를 제작하는 것이다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 서로 협동적으로(cooperatively) 타겟에 결합함으로써, 타겟에 대한 친화도를 크게 증가시킨다.
타겟 결합 부위 I의 아미노산 개수 n은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합 부위 Ⅱ의 아미노산 개수 m은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 2-100의 정수, 보다 바람직하게는 2-50의 정수, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-20의 정수, 가장 바람직하게는 3-10의 정수이다.
타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 개수의 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ에는 서로 각각 다른 또는 동일한 아미노산 서열이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서로 각각 다른 아미노산 서열이 포함된다.
타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함되는 아미노산 서열은 선형의 아미노산 서열 또는 환형의 아미노산 서열이다. 타겟 결합 부위의 펩타이드 서열의 안정성을 증가시키기 위하여, 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 포함되는 아미노산 서열 중에서 적어도 하나의 아미노산 잔기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 변형될 수 있다.
생물학적 타겟 분자에 결합되는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 생체 내 생리학적 반응의 조절, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ(보다 바람직하게는, 구조안정화 부위, 보다 더 바람직하게는 구조안정화 부위의 링커)에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있다. 상기 기능성 분자의 예는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 바이오약물은 인슐린, IGF-1(insulin-like growth factor 1), 성장호르몬, 에리쓰로포이에틴, G-CSFs (granulocyte-colony stimulating factors), GM-CSFs (granulocyte/macrophage-colony stimulating factors), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 알파 및 베타, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 인터루킨-2, EGFs (epidermal growth factors), 칼시토닌(calcitonin), ACTH (adrenocorticotropic hormone), TNF (tumor necrosis factor), 아토비스반(atobisban), 부세레린(buserelin), 세트로렉릭스(cetrorelix), 데스로레린(deslorelin), 데스모프레신(desmopressin), 디노르핀 A (dynorphin A) (1-13), 엘카토닌(elcatonin), 엘레이도신(eleidosin), 엡티피바타이드(eptifibatide), GHRH-II(growth hormone releasing hormone-II), 고나도레린(gonadorelin), 고세레린(goserelin), 히스트레린(histrelin), 류프로레린(leuprorelin), 라이프레신(lypressin), 옥트레오타이드(octreotide), 옥시토신(oxytocin), 피트레신(pitressin), 세크레틴(secretin), 신칼라이드(sincalide), 테르리프레신(terlipressin), 티모펜틴(thymopentin), 티모신(thymosine) α1, 트리프토레린(triptorelin), 바이발리루딘(bivalirudin), 카르베토신(carbetocin), 사이클로스포린, 엑세딘(exedine), 란레오타이드(lanreotide), LHRH (luteinizing hormone-releasing hormone), 나파레린(nafarelin), 부갑상선 호르몬, 프람린타이드(pramlintide), T-20 (enfuvirtide), 타이말파신(thymalfasin), 지코노타이드, RNA, DNA, cDNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA가 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ는 다양한 타겟에 결합하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에 의해 타겟팅 될 수 있는 것은, 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포 및 조직과 같은 생물학적 타겟, 화합물, 금속 또는 비금속 물질을 포함하며, 바람직하게는 생물학적 타겟이다.
타겟 결합 부위가 결합하는 생물학적 타겟은, 바람직하게는 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당단백질,핵산, 탄수화물, 프로테오글리칸, 지질 또는 당지질이다.
예를 들어, 타겟 결합 부위가 결합하는 생화학물질은 다양한 생체 내 대사산물(예컨대, ATP, NADH, NADPH, 탄수화물 대사산물, 지질 대사산물 및 아미노산 대사산물)을 포함한다.
타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 효소, 리간드, 수용체, 바이오마커, 호르몬, 전사인자, 성장인자, 면역글로블린, 신호전달단백질, 결합단백질, 이온 채널, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인 및 혈액 응고 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 상세하게는, 바이포달 펩타이드 바인더의 타겟은 Fibronectin extra domain B(ED-B), VEGF(vascular endothelial growth factor), VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin), MyD88, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), HER2/neu, CD20, CD33, CD52, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), IgE (Immunoglobulin E), CD11A (α-chain of lymphocyte function-associated antigen 1), CD3, CD25, Glycoprotein IIb/IIIa, 인테그린, AFP(Alpha-fetoprotein), β2M (Beta2-microglobulin), BTA(Bladder Tumor Antigens), NMP22, Cancer Antigen 125, Cancer Antigen 15-3, 칼시토닌, Carcinoembryonic Antigen, Chromogranin A, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Human Chorionic Gonadotropin, Neuron-Specific Enolase, PSA(Prostate-Specific Antigen), PAP(Prostatic Acid Phosphatase) 및 Thyroglobulin을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 핵산 분자는 gDNA, mRNA, cDNA, rRNA(ribosomal RNA), rDNA(ribosomal DNA) 및 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 탄수화물은 생체 내 탄수화물로서, 단당류, 이당류, 삼당류 및 다당류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 타겟 결합 부위가 결합하는 예시적인 지질은, 지방산, 트리아실글라이세롤, 스핑고지질, 강글리오사이드 및 콜레스테롤를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 세포 표면에 노출된 생체 분자(예컨대, 단백질)에 결합할 수도 있지만, 세포 내 생체 분자(예컨대, 단백질)에도 결합하여 생체 분자의 활성을 조절할 수 있다.
바이포달 펩타이드 바인더가 세포 내 단백질을 타겟팅 하는 경우, 바람직하게는 바이포달 펩타이드 바인더는 추가적으로 세포막투과 펩타이드(CPP)를 포함한다.
상기 CPP는 당업계에 공지된 다양한 CPP를 포함하며, 예를 들어 HIV-1 Tat 단백질, Tat 펩타이드 유사체(예컨대, 올리고알지닌), ANTP 펩타이드, HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유래된 MTS 펩타이드, Penetratin, Transportan 또는 Pep-1 펩타이드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CPP를 바이포달 펩타이드에 결합시키는 방법은 다양한 방법이 있으며, 예를 들어 바이포달 펩타이드의 구조 안정화 부위에 있는 루프 부분의 라이신 잔기와 CPP를 공유결합 시킨다.
세포 내에는 생리 활성에 중요한 역할을 하는 많은 타겟 단백질이 있으며, CPP가 결합된 바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 유입되어 이 타겟 단백질에 결합하여 활성을 조절(예컨대, 억제)한다. 하기 실시예 19는 바이포달 펩타이드 바인더의 세포 내 단백질에 대한 타겟팅의 구체적인 예를 보여준다. MyD88은 TLR 4, 인터루킨 1 수용체, RAC1, IRAK2 및 IRAK1와 상호작용하는 세포 내 단백질로 잘 알려져 있다. MyD88에 결합 특이성이 있는 CPP-바이포달 펩타이드 바인더는 세포 내로 들어가서 MyD88의 기능을 억제함으로써, MMP-13의 발현을 효과적으로 차단하고 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 전형적으로 "N-타겟 결합 부위 I-구조안정화 부위의 한 가닥-링커-구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 Ⅱ-C"의 컨스트럭트를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에서 타겟 결합 부위 I과 구조안정화 부위의 한 가닥 사이 및/또는 구조안정화 부위의 다른 가닥-타겟 결합 부위 Ⅱ 사이에는, 타겟 결합 부위와 구조안정화 부위 간의 상호 구조적 영향을 차단하는 구조영향 억제부위(structure influence inhibiting region)를 포함한다. 회전 부위에는 펩타이드 분자에서 φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산이 위치한다. 바람직하게는, φ와 ψ의 회전이 비교적 자유로운 아미노산은 글라이신, 알라닌 및 세린이다. 구조영향 억제부위에는 1-10개, 바람직하게는 1-8개, 보다 바람직하게는 1-3개의 아미노산 잔기가 위치할 수 있다.
상술한 컨스트럭트를 갖는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 이 라이브러리에서 바이포달 펩타이드 바인더는 무작위 서열을 갖게 되며, 이는 타겟 결합 부위 I 및/또는 타겟 결합 부위 Ⅱ의 어떤 위치에서도 서열 선호도(sequence preference)가 없거나 또는 지정(또는 고정)된 아미노산 잔기가 없다는 것을 의미한다.
예를 들어, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 고상지지체(예컨대, 폴리스틸렌 또는 폴리아크릴아미드 수지) 상에서 실시되는 스플리트-합성 방법(Lam et al. (1991) Nature 354:82; WO 92/00091)에 따라 구축될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 세포 표면 전시(cell surface display)방식(예컨대, 파아지 디스플레이, 박테리아 디스플레이 또는 이스트 디스플레이)으로 구축된다. 바람직하게는, 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리는 플라스미드, 박테리오파아지, 파아지미드, 이스트, 박테리아, mRNA 또는 라이보좀을 기반으로 하는 디스플레이방법을 통하여 제작될 수 있다.
파아지 디스플레이는 파아지의 표면 상의 코트 단백질에 융합된 단백질 형태로 다양한 폴리펩타이드를 디스플레이하는 기술이다(Scott, J. K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386; Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)). 필라멘트성 파아지(예컨대, M13)의 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ에 발현하고자 하는 유전자를 융합시켜 무작위 펩타이드를 디스플레이한다.
파이지 디스플레이에는 파아지미드가 이용될 수 있다. 파아지미드는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및 박테리오파아지의 인터제닉(intergenic) 부위의 한 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 이 파아지미드에 클로닝된 DNA 단편은 플라스미드처럼 증식된다.
바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 파아지 디스플레이 방식으로 구축하는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: (i) 파아지 코트 단백질(예컨대, M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ 코트 단백질)을 코딩하는 유전자와 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 유전자가 융합된 융합 유전자; 및 상기 융합 유전자에 작동적으로 결합된 전사 조절 서열(예컨대, lac 프로모터)을 포함하는 발현 벡터의 라이브러리를 제작하는 단계; (ⅱ) 상기 발현 벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 단계; (ⅲ) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 형성시켜 융합 단백질이 표면에 디스플레이 되도록 하는 단계; (ⅳ) 생물학적 타겟 분자와 상기 바이러스 파티클을 접촉시켜 파티클을 타겟 분자에 결합시키는 단계; 및 (v) 타겟 분자에 결합하지 않은 파티클을 분리하는 단계.
파아지 디스플레이를 이용하여 펩타이드 라이브러리를 구축하고 이들 라이브러리를 스크리닝 하는 방법은 미국 특허 제5,723,286호, 제5,432,018호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,498,530호, 제5,770,434호, 제5,734,018호, 제5,698,426호, 제5,763,192호 및 제5,723,323호에 개시되어 있다.
바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제작하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 공지의 파아지미드 또는 파아지 벡터(예컨대, pIGT2, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1, m663, fdtetDOG, pHEN1, pComb3, pComb8, pCANTAB 5E (Pharmacia), LamdaSurfZap, pIF4, PM48, PM52, PM54, fdH 및 p8V5)에 바이포달 펩타이드 바인더를 유전자를 삽입시켜 발현 벡터를 제작할 수 있다.
대부분의 파아지 디스플레이 방법이 필라멘트성 파아지를 이용하여 실시되지만, 람다 파아지 디스플레이(WO 95/34683; 미국 특허 제5,627,024호), T4 파아지 디스플레이(Ren et al. (1998) Gene 215:439; Zhu (1997) CAN 33:534) 및 T7 파아지 디스플레이(미국 특허 제5,766,905호)도 바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리를 구축하는 데 이용될 수 있다.
벡터 라이브러리를 적합한 숙주 세포에 도입시키는 방법은 다양한 형질전환 방법에 따라 실시될 수 있으며, 가장 바람직하게는 전기천공(electroporation) 방법에 따라 실시된다(참조: 미국 특허 제5,186,800호, 제5,422,272호, 제5,750,373호). 본 발명에 적합한 숙주는 세포는 E. coli와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주세포는 형질전환 전에 컴피턴스 세포로 준비하는 것이 바람직하다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 형질전환된 세포의 선별은 일반적으로 항생제(예컨대, 테트라사이클린 및 암피실린)를 포함하는 배지에서 배양하여 실시된다. 선별된 형질전환 세포를 헬퍼 파아지의 존재 하에서 추가적으로 배양하여 재조합 파아지 또는 파아지미드 바이러스 파티클을 생성시킨다. 상기 헬퍼 파아지 파아지로 적합한 것은, Ex 헬퍼 파아지, M13-KO7, M13-VCS 및 R408을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
생물학적 타겟 분자와 결합하는 바이러스 파티클의 선별은 통상적으로 바이오패닝 과정을 통하여 실시될 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Clackson and Lowman, Phage Display, Oxford University Press(2004)).
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더의 구체적인 예는 서열목록 제20서열-제38서열 및 제40서열-제41서열에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자 이외에 상기 핵산 분자에, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자의 5‘-방향쪽에 시그널 서열(예컨대, pelB)를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 바이포달 펩타이드 바인더가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열(예컨대, myc tag)을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 파아지 코트 단백질, 바람직하게는 M13과 같은 필라멘트성 파아지의 유전자 Ⅲ 또는 유전자 Ⅷ 코트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 박테리아의 복제원점(예컨대, ColE1) 및/또는 박테리오파아지의 복제원점을 포함한다. 한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 바람직하게는 E. coli와 같은 그람 음성 박테리아 세포이며, 적합한 E. coli 숙주는 JM101, E. coli K12 strain 294, E. coli strain W3110 및 E. coli XL-1Blue (Stratagene)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (미국 특허 제5,186,800호, 제5,422,272호, 제5,750,373호) 등에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 KD 값(해리상수)을 나타내어, 생물학적 타겟 분자에 매우 높은 친화도를 나타내는 펩타이드를 제공한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 모노포달 방식으로 제작된 바인더와 비교하여 바이포달 펩타이드 바인더는 약 102-105배 (바람직하게는, 약 103-104배) 높은 친화도를 나타낸다.
본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 신규한 컨스트럭트를 갖는 바이포달 펩타이드 바인더를 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조안정성 부위의 양 말단에 결합되어 있는 이격된(distal) 두 개의 타겟 결합 부위는 서로 협동적으로(cooperatively), 시너직(synergetically)하게 타겟에 결합한다.
(ⅲ) 이에, 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 매우 낮은 수준(예컨대, nM 수준)의 KD 값(해리상수)을 나타내어, 타겟에 매우 높은 친화도를 나타낸다.
(iv) 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더는 의약으로서의 용도를 가질 뿐만 아니라, 생체 내 물질의 검출, 인 비보 분자 이미징, 인 비트로 세포 이미징 및 약물전달용 타겟팅을 하는 데 이용될 수 있으며, 에스코트 분자로도 이용될 수 있다.
도 1a는 구조안정화 부위로서 β-헤어핀(hairpin)을 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1b는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 β-쉬트를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1c는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 1d는 구조안정화 부위로서 링커로 연결된 루이신-리치 모티프(leucine-rich motif)를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더(bipodal-peptide binder)의 모식도를 나타낸다.
도 2는 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 클로닝하기 위한 전략을 나타낸다. pIGT2 파이지미드 벡터 맵에서, pelB 시그널서열, myc tag은 목적 유전자가 파아지의 표면에 잘 발현되었는지를 확인하기 위한 태깅 서열이다. 프로모터로서 lac 프로모터가 이용되었다.
도 3은 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 인풋 파아지에 대한 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA의 바이오패닝 결과를 나타낸다.
도 4는 피르로넥틴 ED-B 바이오패닝 과정 중 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 바이오패닝의 3차 단계에서 회수한 60개의 재조합 파아지의 ED-B 및 BSA에 대한 ELISA 결과이다.
도 5a는 피르로넥틴 ED-B 단백질에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5b는 VEGF에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5c는 VCAM1에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5d는 nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 5e는 HSA(Human Serum Albumin)에 결합하는 특정 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 6a은 피르로넥틴 ED-B에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다. 왼쪽 막대부터 스트랩타비딘, ED-B, 아세틸콜린 α1, BSA, VCAM, TNF-α, 트롬빈, 미오글로불린, 리소자임 및 비스파틴에 대한 결과이다.
도 6b은 VEGF에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6c은 VCAM1에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6d은 nAchR 단편 펩타이드에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6e은 HSA에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6f은 MyD88에 대해 특이성 검사를 하기 위해 바이포달 펩타이드 바인더를 가지고 있는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해 ELISA를 수행하여 흡광도를 측정한 결과이다.
도 7은 바이포달 펩타이드 바인더의 공동 작용 효과의 증명을 위한 친화력을 측정한 결과이다.
도 8은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 여러 β-헤어핀 모티프로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 9은 바이포달 펩타이드 바인더에서 구조 안정화 부위를 트립토판 지퍼 대신 루이신 지퍼로 바꾸어 바이포달 펩타이드 바인더의 친화력을 측정한 결과이다.
도 10은 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화 결과이다. 시간에 경과함에 따라서 암에 바이포달 펩타이드 바인더가 축적됨이 보인다. 각각의 장기를 분리해서 형광을 측정했을 때도 암에 상당부분 축적됨이 보인다.
도 11은 세포 내에 존재하는 MyD88의 활성을 억제하는 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 효과를 증명한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
실시예 1: 라이브러리의 제작
바이포달 펩타이드 바인더 유전자 제작 및 파아지미드 벡터에의 삽입
두 개의 올리고뉴클레오티드 Beta-F1 (5'-TTCTATGCGGCCCAGCTGGCC (NNK)6GGATCTTGGACATGGGAAAACGGAAAA-3') 및 Beta-B1 (5'-AACAGTTTCTGCGGCCGCTCCTCC TCC(MNN)6TCCCTTCCATGTCCATTTTCCGTT-3')(N은 A, T, G 또는 C; K는 G 또는 T; M은 C 또는 A)를 합성하였다. 이중 사슬을 만들기 위해서 Beta-F1 4 μM, Beta-B1 4 μM, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(Takara, Seoul, Korea) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 총 25개 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5분, 60 싸이클: 30℃에서 30초, 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분)을 하여 이중 사슬로 만든 후 PCR 정제 키트(GeneAll, Seoul, Korea) 를 이용하여 정제하여, 바이포달 펩타이드 바인더 유전자를 얻었다. 바이포달 펩타이드 바인더에 삽입시킬 유전자를 pIGT2 파아지미드 벡터(Ig therapy, Chuncheon, Korea) 에 연결하기 위해 인서트 유전자와 pIGT2 파아지미드 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 11 ㎍의 인서트 DNA를 SfiI(New England Biolabs(NEB, Ipswich) 및 NotI(NEB, Ipswich)으로 각각 4시간 씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 40 ㎍의 pIGT2 파아지미드 벡터를 SfiI 및 NotI으로 각각 4시간 씩 반응시킨 후 CIAP(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)(NEB, Ipswich)를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 UV-가시광선 분광기(Ultrospec 2100pro, Amersham Bioscience)로 정량하여 2.9 ㎍의 인서트 유전자를 T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 pIGT2 파아지미드 벡터 12 ㎍과 18℃에서 15시간 동안 연결한 후, 에탄올로 침전시켜 TE 버퍼 100 ㎕로 DNA를 용해시켰다.
컴피턴트 세포의 준비
E. coli XL1-BLUE 세포(American Type Culture Collection, Manassas, USA)를 LB 아가-플레이트에 선상 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 후 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양하였다. 배양된 10 ㎖의 세포들을 2 ℓ의 LB 배지에 접종하고 같은 방식으로 600 nm의 파장에서 흡광도가 0.3-0.4가 될 때까지 배양하였다. 배양된 플라스크를 30분 동안 얼음에 방치한 후, 4℃ 에서 4,000× g로 20분 동안 원심 분리하여 가라앉은 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 현탁시켰다. 이것을 다시 같은 방법으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 1 ℓ의 냉각된 멸균 증류수로 재현탁시키고 같은 방식으로 10% 글리세롤 용액 40 ㎖로 세척을 반복하여 원심 분리한 후, 마지막으로 10% 글리세롤 용액 4 ㎖으로 현탁시킨 후, 200 ㎕씩 분주하여 액체 질소에 냉동시킨 뒤 -80℃에 보관하였다.
전기 천공법
파아지미드 벡터 12 ㎍과 바이포달 펩타이드 바인더에 인서트 DNA 2.9 ㎍을 연결 반응시킨 100 ㎕를 25개로 분주하여 전기 천공을 수행하였다. 컴피턴트 세포를 얼음 위에서 녹이고, 200 ㎕의 컴피턴트 세포를 연결 반응시킨 용액 4 ㎕와 혼합한 후, 냉각하여 준비된 0.2 cm의 큐벳에 넣은 뒤 1분 동안 얼음 위에 두었다. 전기 천공기 (BioRad, Hercules, CA)를 200 Ω에서 25 μF 및 2.5 kV의 조건으로 프로그램하고 준비된 큐벳의 물기를 제거하고 전기 천공기에 위치시킨 후 펄스를 주었다(시간 상수는 4.5-5 msec). 이후 즉시 37℃로 준비한 20 mM의 글루코오스가 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지에 넣고 얻어진 총 25 ㎖의 세포를 100 ㎖ 시험관에 옮겼다. 한 시간 동안 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양한 후 라이브러리의 개수를 측정하기 위해 10 ㎕를 희석해서 암피실린 아가 배지에 도말하였다. 남은 세포를 1 ℓ의 LB에 20 mM 글루코오스 및 50 ㎍/㎖의 암피실린을 넣고 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 4℃ 에서 4,000×g로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 40 ㎖의 LB로 재현탁시킨 후 글리세롤을 최종 농도 20% 이상 넣고 -80℃에 보관하였다.
라이브러리에서 재조합 파아지 생산과 PEG 침전
-80℃에 저장된 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 500 ㎖ 플라스크에 100 ㎖의 LB 액체배지에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM의 글루코오스를 넣은 후, -80℃ 에 보관된 라이브러리 1 ㎖을 추가하여 한 시간 동안 37℃에서 150 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 여기에 1×1011 pfu의 Ex 헬퍼 파아지(Ig therapy, Chuncheon, Korea)를 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 1,000×g로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 여기에 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 LB 액체배지 100 ㎖을 넣고 하루 동안 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 3,000×g로 10분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액 100 ㎖에 PEG/NaCl 25 ㎖을 혼합하고 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 10,000×g로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 2 ㎖의 PBS(pH 7.4)로 펠렛을 재현탁시켰다.
실시예 2: 단백질의 준비
실시예에 이용할 피르로텍틴(Fibronectin) ED-B, VEGF(vascular endothelial growth factor), VCAM1(vascular cell adhesion molecule-1), nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor), HSA(Human serum albumin) 및 MyD88를 다음과 같이 준비하였다.
피브로넥틴 ED -B 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입
한국생명공학 연구원에서 부분적인 인간의 피브로넥틴 ED-B(ID=KU017225) 유전자를 공급받았다. 프라이머 EDB_F1(5'-TTCATAACATATGCCAGAGGTGCCCCAA-3') 및 EDB_B1(5'-ATTGGATCCTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGGGGCACTCTCGCCGCCATTAATGAGAGTGATAACGCTGATATCATAGTCAATGCCCGGCTCCAGCCCTGTG-3')을 합성하여, EDB-F1 20 pmol, EDB-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(10 U) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5분, 30 싸이클: 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 94℃에서 30초)을 하여 EDB 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. EDB 인서트 유전자를 pET28b 벡터(Novagen)에 연결하기 위해 EDB 인서트 유전자 및 pET28b 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 ㎍의 인서트 DNA를 BamHI(NEB, Ipswich) 및 NdeI(NEB, Ipswich)로 4시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 또한, 약 2 ㎍의 pIGT2 파아지미드 벡터를 BamHI 및 NdeI로 3시간씩 반응시킨 후 CIAP를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후, PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.
VEGF121 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입
싸이토카인 은행(Jeonju, Korea)에서 부분적인 인간의 VEGF(ID=G157) 유전자를 공급받았다. 프라이머 VEGF_F1(5'-ATAGAATTCGCACCCATGGCAGAA-3') 및 VEGF_B1(5'-ATTAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACAATTTTCTTGTCTTGC-3')을 합성하여, VEGF-F1 20 pmol, VEGF-B1 20 pmol, 2.5 mM dNTP 혼합액 4 ㎕, ExTaq DNA 중합효소 1 ㎕(10 U) 및 10×PCR 버퍼 5 ㎕를 혼합하여 총 50 ㎕가 되도록 증류수를 첨가한 혼합액을 만들었다. 이 혼합액을 PCR 반응(94℃에서 5분, 30 싸이클: 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 94℃에서 30초)을 하여 VEGF 인서트로 만든 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. VEGF 인서트 유전자를 pET32a 벡터(Novagen)에 연결하기 위해 VEGF 인서트 유전자 및 pET32a 벡터에 제한효소를 처리하였다. 약 2 ㎍의 인서트 DNA를 EcoRI(NEB, Ipswich) 및 HindIII(NEB, Ipswich)로 4시간씩 반응시킨 후 PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.
VCAM1 유전자 제작 및 발현 벡터에의 삽입
한국생명공학 연구원에서 인간의 VCAM1 유전자를 공급받았다. VCAM1 인서트 유전자를 pET32a 벡터에 연결하기 위해 VCAM1 인서트 유전자 및 pET32a 벡터에 제한효소를 처리하였다. 이들을 벡터와 인서트가 약 1:3의 몰 비율이 되도록 첨가하고, T4 DNA 리가아제(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 18℃에서 10시간 동안 연결시키고, XL-1 컴피턴트 세포에 형질전환을 한 후, 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 플라스미드 프랩 키트(GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 시퀀싱을 하여 클로닝이 성공했는지 여부를 확인하였다.
피브로넥틴 ED -B의 발현 및 정제
피브로넥틴 ED-B를 클로닝한 pET28b 벡터를 BL21 세포에 형질 전환한 후 카나마이신이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 50 ㎖의 LB 배지에 옮겨 3시간 배양하였다. 배양한 E. coli를 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 2 ℓ의 LB에 접종하고 OD=0.6-0.8까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 8시간 동안 배양하였다. 4,000×g로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 15,000×g로 1시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진(Elpisbio, Daejeon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 N-말단 His-tag ED-B 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼(GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 순도 높은 ED-B 단백질을 얻었다. 바이오패닝을 위해 ED-B 단백질에 바이오틴을 연결하였다. 6 ㎎의 설포-NHS-SS-바이오틴(PIERCE, Illinois, USA) 및 1.5 ㎎의 ED-B 단백질을 상온에서 0.1 M 소듐 보레이트(pH 9.0) 하에 2시간 동안 반응시키고, 반응이 되지 않은 설포-NHS-SS-바이오틴을 제거하기 위해 단백질을 Superdex75 컬럼 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 바이오틴-EDB 단백질을 정제하였다.
VEGF121 와 VCAM1 - Trx 의 발현 및 정제
VEGF121 와 VCAM1를 클로닝한 pET32a 벡터를 각각 AD494 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 5 ㎖의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 50 ㎖의 LB 배지에 옮겨 3시간 배양하였다. 배양한 E. coli를 암피실린(25 ㎍/㎖)이 포함된 2 ℓ의 LB에 접종하고 OD=0.6-0.8까지 배양하였다. 이후 1 mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 37℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하면서 8시간 동안 배양하였다. 4,000×g로 20분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 15,000×g로 1시간 동안 원심 분리하여 상층액을 Ni-NTA 친화성 레진(Elpisbio, Daejeon, Korea)에 결합시킨다. 라이시스 버퍼로 레진을 세척한 후 일루션 버퍼(50 mM 소듐 포스페이트(pH 8.0), 300 mM NaCl 및 300 mM 이미다졸)을 이용하여 Trx-VEGF121 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Superdex75 컬럼(GE Healthcare, United Kingdom) 및 PBS(pH 7.4) 버퍼를 이용하여 겔 여과법(gel filtration)으로 순도 높은 VEGF-Trx와 VCAM1-Trx 단백질을 얻었다. 순수한 VEGF을 얻기 위하여 트롬빈으로 VEGF와 Trx 사이를 잘라 VEGF121을 얻었다.
한편, HSA는 Genetex 회사(Irvine)에서 구매하여 이용하였다. nAchR(Nicotinic acetylcholine receptor)의 단편 펩타이드인 biotin-SGEWVIKEARGWKHWVFYSCCPTTPYLDITYH (32 mer)는 애니젠(Korea, Kwangju)에서 합성하였다. Human MyD88은 Santa Cruz Biotechnology(sc-4540 WB)(California)에서 구매하였다.
실시예 3: 바이오 패닝 방법
Biotin 피르로넥틴 ED -B 단백질과 Biotin - nAchR 펩타이드의 바이오 패닝 방법
2 ㎖의 스트랩타비딘(10 ㎍/㎖)을 96웰 ELISA 플레이트(Corning)의 40개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 20개의 웰에만 0.1%의 PBST(tween-20)로 3회 세척한 후, 바이오틴 ED-B와 바이오틴 nAchR (10 ㎍/㎖)를 각각 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 이후 40개의 웰 모두를 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕을 혼합하여 스트랩타비딘 및 BSA에 결합하는 파아지들을 제거하기 위해 스트랩타비딘에 BSA 코팅했던 20개의 웰에 넣어 1시간 동안 27℃에 두었다. 상층액을 회수하여 ED-B와 nAchR 가 결합한 20개의 웰에 옮겨 27℃에서 45분 동안 방치하였다. 20개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.5% PBST로 15회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×1010 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 25회 및 35회(0.5% PBST) 증가시켰다.
VEGF 와 VCAM1 - Trx 와 Human serum albumin ( HSA ), MyD88 의 바이오 패닝 방법
VEGF와 VCAM1-trx와 HSA와 MyD 88(5 ㎍/㎖)을 96웰 ELISA 플레이트(Corning)의 10개의 웰에 50 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지 포함용액 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕을 혼합하여 VEGF와 VCAM1-Trx와 HSA 가 결합한 10개의 웰에 옮겨 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 10개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.1% PBST로 10회 세척한 뒤 0.2 M 글리신/HCl(pH 2.2) 1 ㎖을 각 웰당 50 ㎕씩 넣어 20분간 파아지를 용리시키고 1 ㎖을 튜브에 모아 여기에 2M Tris-base(pH 9.0) 150 ㎕를 넣어 용액을 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 일루트 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 XL-1 BLUE 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 10 ㎖의 E. coli XL1-BLUE 세포와 섞어 37℃에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스를 혼합한 후, 2×1010 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 40 ㎖ LB 액체 배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4,000×g, 20분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하였다. 상층액에 8 ㎖의 5x PEG/NaCl[20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 첨가한 후 4℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 원심분리 후 PEG 용액을 완전히 제거하고 1 ㎖의 PBS 용액으로 파아지 펩타이드 펠렛을 녹인 다음 2차 바이오패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 20회 및 30회(0.1% PBST) 증가시켰다.
실시예 4: 피르로넥틴 ED -B의 인풋 파아지의 ELISA
바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 각 인풋 파아지의 ELISA를 스트랩타비딘, BSA 및 ED-B에 대해 수행하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 10 ㎍/㎖ 스트랩타비딘을 각 웰당 50 ㎕씩 18개의 웰에 넣고 10 ㎍/㎖ BSA를 각 웰당 50 ㎕씩 9 개의 웰에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 스트랩타비딘이 있는 18개의 웰 중 9개의 웰만 0.1% PBST(tween-20)로 3회 세척하고, 바이오틴 ED-B(10 ㎍/㎖)를 넣고 상온에서 1시간 동안 두었다. 이후 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 바이포달 펩타이드 바인더 재조합 파아지인 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 인풋 파아지 800 ㎕ 및 10% BSA 200 ㎕를 혼합하여 100 ㎕씩 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 웰에 각각 3웰 씩 분주하고 27℃에서 1시간 30분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 10회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 27℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 퍼옥시다아제의 기질인 테트라메틸벤지딘(TMB)(BD Science) 용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 5: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA , MyD88 단백질에 특이적인 파아지 펩타이드 검색(파아지 ELISA)
아웃풋 파아지/인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 XL1-BLUE 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 60개를 2 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하여 OD=0.8-1에서 5×109 pfu의 Ex 헬퍼 파아지를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 200 rpm의 속도로 혼합하며 배양하였다. 배양액을 1,000×g로 10분 동안 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 침전된 세포들을 암피실린(50 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 포함된 1 ㎖의 LB 액체배지로 재현탁하여 30℃에서 200 rpm의 속도로 혼합하며 하루 동안 배양하였다. 배양액을 10,000×g, 20분 및 4℃의 조건으로 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2%의 탈지 우유를 넣고 이를 파아지 펩타이드 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5 ㎍/㎖의 Fibronectin ED-B, VEGF, VCAM1, Nicotinic acetylcholine receptor(nAchR), Human serum albumin, MyD88 을 각 웰당 50 ㎕씩 30개의 웰에 넣고, 또한 10 ㎍/㎖의 BSA을 각 웰당 50 ㎕씩 30개의 웰에 넣어 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰을 0.1% PBST로 3회 세척하고 PBS로 희석한 2% 탈지 우유를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 펩타이드 용액 100 ㎕씩을 모든 웰에 분주하고 27℃에서 1시간 30분 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 27℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 TMB용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100 ㎕의 1 M HCl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 BSA에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 파아지를 XL1 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크를 4 ㎖의 LB-암피실린(50 ㎍/㎖) 배양액에 접종한 후 37℃에서 하루 동안 진탕 배양하여 플라스미드 프랩 키트을 이용하여 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Genotech, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 벡터 시퀀스인 5'-GATTACGCCAAGCTTTGGAGC-3'을 사용하였다.
실시예 6: 피르로넥틴 ED -B, VEGF , nAchR 바인딩 어세이
DNA 시퀀싱에서 중복되어 나온 ED-B, VEGF, nAchR에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더 펩타이드를 합성(애니젠, 한국)을 하였다. 친화도의 측정은 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 이용하여 수행하였다. ED-B 와 nAchR은 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore)에 바이오틴-EDB을 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. VEGF는 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하였다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB, Uppsala, Sweden)로 친화도를 계산하였다.
실시예 7: 암 바이오마커인 피르보넥틴 ED -B에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화
암에 많이 분포하는 피르로넥틴 ED-B를 타겟하는 바이포달 펩타이드 바인더(펩타이드 2)에 Cy5.5-NHS 형광다이(flurorescence dye)(Amersham Pharmacia, Piscataway)을 50 mM 소듐 보레이트 완충액(pH 9.7)에서 12시간동안 상온 반응 시켰다. 반응 후에 Sephadex G25(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 Cy5.5와 바이포달 펩타이드 바인더-Cy5.5를 분리하였다. Balb/c 누드 마우스에 Human U87MG(ATCC) 2 x 106 cell을 피하에 넣어 암을 10일 동안 키운 후에 0.5 nmol의 바이포달 펩타이드 바인더-Cy5.5을 정맥주사로 넣은 다음 IVIS(Caliper Life Sience, Hopkinton)로 형광을 측정하였다. 이 실험은 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 동물에서 암에 축적이 됨을 증명하는 결과이며 실제 암 진단제로서의 응용성을 보여준다(도 11).
실시예 8: 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제 실험
MyD88 은 세포내에 존재하는 단백질이기 때문에 바이포달 펩타이드 바인더의 loop의 라이신 (lysine) 잔기를 이용하여 세포투과펩타이드(cell penetrating peptide)인 9개의 아지닌(arginine)(애니젠, 한국)을 EDC/NHS(Sigma)를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더에 공유결합시켜 세포 투과를 가능하게 만들었다. MyD88의 활성이 활성화되면 MMP-13의 양의 증가하기 때문에 MMP-13의 양을 측정하면 MyD88의 활성이 억제되는지 판별할 수 있다. MyD88의 활성을 활성화 시키는 IL-1beta(10 ng/ml)(R&D systems, Minneapolis MN)를 연골세포에 처리하였다. 그 다음 MyD88에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더(표 3f의 펩타이드 1)를 연골세포에 10 μM 처리하고 12시간 후에 mRNA을 분리한 다음 MMP-13과 GAPDH에 대해 RT-PCR을 진행하였다. 또한 연골세포를 파괴하여 세포 내 단백질을 얻은 다음 Anti-MMP 13 항체(Abcam, ab3208, Cambridge)와 세미 드라이 transfer 기계(Amersham Bioscience, Piscataway)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하여 MMP-13의 양을 측정하였다.
실험 결과
실시예 9: 바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리의 제작
바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로는 안정한 베타-헤어핀 모티프를 사용하였다. 특히 트립토판-트립토판 아미노산의 상호 작용에 의해 베타-헤어핀 모티프 구조를 안정하게 이루어 주는 트립토판 지퍼(Andrea et al., Proc . Natl. Acad . Sci . 98:5578-5583(2001))을 이용하였다. 뼈대인 트립토판 지퍼의 N- 및 C-말단 부분에 각각 6개 아미노산을 무작위로 배열함으로써 두 부분에 가변적 부위를 생성하였다(도 1a). 이를 바이포달 펩타이드 바인더라고 명명하였으며 양쪽의 가변적 부위를 가지고 있어 항원에 공동작용으로 붙을 수 있어 높은 친화력 및 특이성을 가질 수 있다. 또한, 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위는 도 1b 내지 도 1e와 같이 여러 가지로 구성될 수 있다.
합성한 2개의 무작위 서열 올리고뉴클레오티드를 PCR 반응을 통해 이중 사슬로 만든 후 제한효소인 SfiI 및 NotI으로 자른 후 pIGT2 파아지미드 벡터에 클로닝을 하여 8×108 이상의 라이브러리를 구축하였다(도 2).
실시예 10: 바이오 패닝 결과
바이포달 펩타이드 바인더 라이브러리를 피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 단백질에 대해 3-5차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각 패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파아지/인풋 파아지의 비율을 결정하였다(표 1a).
[표 1a]
Figure 112011071280756-pat00001
[표 1b]
Figure 112011071280756-pat00002
[표 1c]
Figure 112011071280756-pat00003
[표 1d]
Figure 112011071280756-pat00004
[표 1e]
Figure 112011071280756-pat00005
[표 1f]
Figure 112011071280756-pat00006

실시예 11: 피브로넥틴 ED -B의 인풋 파아지의 파아지 ELISA 결과
바이포달 펩타이드 바인더의 라이브러리의 각 인풋 파아지를 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA에 대해 ELISA를 수행하였다. 첫 번째 인풋 파아지의 반응성은 ED-B, 스트랩타비딘 및 BSA 모두 흡광도가 비슷하나, 두 번째 인풋 파아지부터 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 5.1배, BSA에 비해 3.4배 높았다. 마지막 세 번째 인풋 파아지에서는 ED-B 흡광도가 스트랩타비딘에 비해 22배, BSA에 비해 15배 높은 반응성을 보여 ED-B에 대해 성공적으로 바이오 패닝이 이루어짐을 알 수 있다(도 3 및 표 2).
[표 2]
Figure 112011071280756-pat00007

실시예 12: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA 및 MyD88 에 대해 특이적인 파아지 펩타이드 검색(파아지 ELISA) 및 시퀀싱
각 라이브러리의 패닝 단계중 아웃풋/인풋의 비율이 가장 높은 단계에서 회수한 파아지를 플라크 형태로 확보하였다. 각 플라크로부터 60개의 파아지를 증폭시킨 후 BSA에 대해 ELISA를 수행하였다(도 4). BSA에 비해 흡광도가 높은 클론들을 선택하여 DNA 시퀀싱을 의뢰하였다. 이로부터 중복된 각각의 단백질에 특이적인 펩타이드 시퀀스를 얻었다(표 3).
[표 3a]
Figure 112011071280756-pat00008
[표 3b]
Figure 112011071280756-pat00009
[표 3c]
Figure 112011071280756-pat00010
[표 3d]
Figure 112011071280756-pat00011
[표 3e]
Figure 112011071280756-pat00012
[표 3f]
Figure 112011071280756-pat00013

실시예 13: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR 및 HSA 의 친화도의 측정
피브로넥틴 ED-B, VEGF, VCAM1, nAchR 및 HSA에 대한 상기 펩타이드를 합성하여 SPR Biacore system(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 친화도를 측정하였다. 피브로넥틴 ED-B에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1은 620 nM를 나타내었고, 펩타이드 2는 75 nM를 나타내었으며, 펩타이드 3은 2.5 μM을 나타내었다(도 5a). VEGF에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1은 60 nM, 펩타이드 2는 326 nM을 나타냈다(도 5b). VCAM1의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1은 318 nM을 보였다(도 5c). nAchR의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1은 73 nM을 보였다(도 5d). HSA의 단편 펩타이드에 대한 친화도를 측정한 결과 펩타이드 1은 115 nM을 보였다(도 5e).
실시예 14: 피브로넥틴 ED -B, VEGF , VCAM1 , nAchR , HSA 및 MyD88 에 대한 특이성 분석
각각의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 파아지를 여러 단백질에 대해서 특이성 검사를 ELISA을 이용하여 시행하였다. 96-웰 ELISA 플레이트에 각각의 단백질을 5 ㎍/㎖을 50 ㎕씩 웰에 넣고 다음날 0.1% PBST(Tween-20)로 3회 세척하고 2% BSA를 사용하여 상온에서 2시간 동안 블로킹을 한 후, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 여기에 본 발명의 펩타이드를 가지는 재조합 파아지를 2% BSA와 잘 혼합하여 100 ㎕씩 10개의 단백질이 결합되어 있는 웰에 분주하고 27℃에서 2시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 5회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이션 항-M13 항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 27℃에서 1시간 반응시켰다. 0.1% PBST로 5회 세척한 후 TMB용액 100 ㎕를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 1M HCl 100 ㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 6a에서 볼 수 있듯이, 바이포달 펩타이드 바인더에서 찾은 ED-B에 특이적인 표 3a의 펩타이드 2는 다른 단백질의 흡광도와 비교할 때 30배 이상의 차이를 나타내었으며 이는 펩타이드 2 시퀀스가 ED-B에 대해서 특이적임을 나타내는 결과이다. 도 6b-6f에서 볼 수 있듯이, 표 3b-3f 각각의 펩타이드 1에 대한 특이성 분석 결과, 이들 각각의 펩타이드는 VEGF, VCAM1, nAchR, HSA 및 MyD88에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 15: SPR ( Surface Plasmon Resonance )의 공동 작용 효과 확인
바이포달 펩타이드 바인더의 항원에 대한 공동 작용 효과를 증명하기 위해서 친화력이 가장 좋은 표 3a의 ED-B에 대한 펩타이드 2의 N- 및 C-말단 한쪽 부위만 각각 제거한 펩타이드를 합성하여 친화력을 측정하였다. N-말단 부분은 592 μM을 가지며 C-말단 부분은 12.8 μM을 나타내었다(도 7). 바이포달 펩타이드 바인더에서 양발(bipodal)을 가지고 있음으로써 나타내는 공동 작용 효과는 43 nM의 친화력임을 증명하였다(도 5a).
실시예 16: 다른 β-헤어핀에 대한 바인딩 어세이
트립토판 지퍼 이외에 다른 β-헤어핀 골격인 GB1m3 및 HP7에 ED-B에 특이적으로 결합하는 Peptide2의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 즉, 트립토판 지퍼를 포함한 바이포달 펩타이드 바인더의 시퀀스는 HCSSAVGSWTWENGKWTWKGIIRLEQ 이며 GB1m3을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKKWTYNPATGKFTVQEGIIRLEQ이고, HP7을 포함한 바이포달 펩타이드 바인더는 HCSSAVGKTWNPATGKWTEGIIRLEQ이다. 각 펩타이드의 친화도는 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 측정하였다. 스트랩타비딘 SA 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 비오틴-EDB를 2,000 RU 만큼 흘려주어 고정시켰다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)를 사용하였고 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 여러 농도로 동력학을 측정한 후 BIAevaluation으로 친화도를 계산하였다. 친화도를 측정한 결과 GB1m3가 70 nM, HP7이 84 nM로 트립토판 지퍼(43 nM)와 비슷한 친화력을 가짐을 확인하였다(도 8). 이는 모든 안정한 β-헤어핀 모티프가 구조 안정화 부위로서 가능함을 증명하는 결과이다.
실시예 17: 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더에 대한 바인딩 어세이
β-헤어핀 골격 대신 구조안정화 부위로서 루이신 지퍼에 ED-B에 특이적으로 결합하는 펩타이드2의 N-말단 시퀀스(HCSSAV)와 C-말단 시퀀스(IIRLEQ)를 가지도록 CSSPIQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 및 IIRLEQGGSMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER 펩타이드를 합성하였다(애니젠, 한국). 두 펩타이드를 다이머로 만든 다음 BIAcore X(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 친화도를 측정하였다. 친화도를 측정한 결과, 루이신 지퍼는 5 μM의 친화도를 나타내었고 이는 트립토판 지퍼(43 nM)의 비슷한 친화도보다 떨어지는 친화도이기는 하지만 루이신 지퍼도 바이포달 펩타이드 바인더의 구조 안정화 부위로서 기능할 수 있음을 알 수 있다(도 9).
실시예 18: 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED -B에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 암 표적화
암에 많이 분포하는 피브로넥틴 ED-B를 타겟팅 하는 바이포달 펩타이드 바인더에 Cy5.5 형광다이를 붙인 다음 Human U87MG 암이 있는 쥐에 정맥주사로 투여하여 IVIS 기계를 이용하여 바이포달 펩타이드 바인더가 암에 타겟하는 지 형광을 확인하였다(도 10). 실험 결과, 암 바이오마커인 피브로넥틴 ED-B에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더는 암 조직에 축적되는 것이 관찰되었으며, 이는 본 발명의 바이포달 펩타이드 바인더가 인 비보 이미징에 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 19: 세포내에 존재하는 MyD88 에 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 활성 억제
세포 내에 존재하는 MyD88의 활성을 억제하는 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더의 효과를 증명한 결과이다(도 11). 바이포달 펩타이드 바인더에 세포투과 펩타이드(cell penetrating peptide)를 붙이면 세포 안으로 들어 갈 수 있다. 이를 IL-1beta를 처리한 연골세포(chondrocytes)에 10 μM의 MyD88 특이적인 바이포달 펩타이드 바인더을 처리하였을 때 MyD88의 활성이 억제됨을 MMP-13의 mRNA와 단백질이 감소되는 것으로 확인하였다. 이는 바이포달 펩타이드 바인더를 이용하여 세포 내 타겟의 활성을 억제할 수 있음을 보여준 결과이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (20)

  1. (a) 가닥간(interstrand) 비공유결합이 형성된 패러럴(parallel), 안티패러럴(antiparallel) 또는 패러럴(parallel)과 안티패러럴(antiparallel) 아미노산 가닥들을 포함하는 구조 안정화 부위(structure stabilizing region); 및
    (b) 상기 구조 안정화 부위의 양 말단에 결합되어 있고 무작위적으로 선택된 각각 n 및 m개의 아미노산을 포함하는 타겟 결합 부위 I(target binding region I) 및 타겟 결합 부위 Ⅱ(target binding region Ⅱ)를 포함하는 타겟에 특이적으로 결합하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위에 형성된 가닥간 비공유결합은 수소결합, 정전기적 상호작용, 소수성상호작용, 반데르 발스 상호작용, 파이-파이 상호작용, 양이온-파이 상호작용 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위의 아미노산 가닥들은 링커로 연결된 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀, 링커로 연결된 β-쉬트, 루이신 지퍼 또는 링커로 연결된 루이신 지퍼, 루이신 리치 모티프인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위는 β-헤어핀인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제1서열 내지 제19서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 서열목록 제2서열, 제14서열 또는 제18서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
    일반식 I
    X1-Trp(X2)X3-X4-X5(X'2)X6-X7
    X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His, Val, Ile, Phe 또는 Tyr이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 Ⅱ로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
    일반식 Ⅱ
    X1-Trp-X2-Tyr-X3-Phe-Thr-Val-X4
    X1은 Arg, Gly-Glu 또는 Lys-Lys이고, X2는 Gln 또는 Thr이며, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Gln, Thr-Glu 또는 Gln-Glu이다.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 Ⅲ으로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
    일반식 Ⅲ
    X1-X2-X3-Trp-X4-X5-Thr-X6-X7
    X1은 Lys 또는 Lys-Lys이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 Val 또는 Thr이며, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X5는 Trp 또는 Ala이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7은 Glu 또는 Gln-Glu이다.
  11. 제 5 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 다음 일반식 Ⅳ로 표시되는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더:
    일반식 Ⅳ
    X1-X2-X3-Trp-X4
    X1은 Lys-Thr 또는 Gly이고, X2는 Trp 또는 Tyr이고, X3는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ, 타입 Ⅱ' 또는 타입 Ⅲ 또는 타입 Ⅲ' 턴 서열이고, X4는 Thr-Glu 또는 Gly이다.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 β-헤어핀은 상기 일반식 I에서 X1은 Ser 또는 Gly-Glu이고, X2 및 X'2는 서로 독립적으로 Thr, His 또는 Val이며, X3는 Trp 또는 Tyr이고, X4는 타입 I, 타입 I', 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅱ' 서열이고, X5는 Trp 또는 Phe이며, X6는 Trp 또는 Val이고, X7는 Lys 또는 Thr-Glu이다.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I의 아미노산 개수 n은 2-20인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 Ⅱ의 아미노산 개수 m은 2-20인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 결합 부위 I 및 타겟 결합 부위 Ⅱ는 타겟에 공동으로 작용하여 결합하는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 구조 안정화 부위, 타겟 결합 부위 I 또는 타겟 결합 부위 Ⅱ에 추가적으로 기능성 분자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 기능성 분자는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블, 화학약물, 바이오약물, 세포막투과 펩타이드(CPP) 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟은 생화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 세포, 조직, 화합물, 금속 또는 비금속 물질인 것을 특징으로 하는 바이포달 펩타이드 바인더.
  19. 상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 바이포달 펩타이드 바인더를 코딩하는 핵산 분자.
  20. 상기 제 19 항의 핵산 분자를 포함하는 바이포달 펩타이드 바인더의 발현용 벡터.
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