DE60133190T2

DE60133190T2 - Verbindungen und verfahren zur behandlung und diagnose von chlamydia-infektionen

Info

Publication number: DE60133190T2
Application number: DE60133190T
Authority: DE
Inventors: Ajay Seattle BHATIA; Peter Seattle PROBST; Erika Jean Seattle STROMBERG
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: US20030175700A1; WO2001081379A3; DE60133190D1; EP1278855A2; ES2303525T3; US7384638B2; EP1278855B1; ATE389020T1; US20040137007A1; EP2192128A3; EP2192128A2; WO2001081379A2; CA2407114A1; AU2001255596A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Nachweis und die Behandlung von Chlamydieninfektion. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die Polypeptide enthalten, umfassend ein Chlamydia-Antigen, und die Verwendung solcher Polypeptide für die Serodiagnose und Behandlung von Chlamydiainfektion.
Hintergrund der Erfindung
Chlamydien sind intrazelluläre bakterielle Pathogene, die für eine große Vielzahl von wichtigen menschlichen und tierischen Infektionen verantwortlich sind. Chlamydia trachomatis ist einer der häufigsten Gründe für sexuell übertragene Erkrankungen und kann zu Pelvic Inflammatory Disease (PID) führen, welche in Eileiter-Obstruktion und Infertilität resultiert. Chlamydia trachomatis kann auch eine Rolle bei männlicher Infertilität spielen. 1990 wurden die Kosten für die Behandlung von PID in den USA auf 4 Milliarden Dollar geschätzt. Trachom aufgrund von okulärer Infektion mit Chlamydia trachomatis ist die Hauptursache für verhinderbare Blindheit weltweit. Chlamydia pneumonia ist eine Hauptursache für akute Atemwegsinfektionen bei Menschen und man glaubt auch, dass es eine Rolle bei der Pathogenese von Artherosklerose und insbesondere koronarer Herzerkrankung spielt. Von Individuen mit einem hohen Antikörpertiter gegen Chlamydia pneumonia wurde gezeigt, dass es doppelt so wahrscheinlich ist, dass sie an einer koronaren Herzerkrankung leiden wie seronegative Individuen. Chlamydieninfektionen stellen so ein signifikantes Gesundheitsproblem sowohl in den USA wie auch weltweit dar.
Die Datenbank-EMBL-Zugangsnummer AE 001333 (22. Juli 1998) durch Stephens et al. offenbart Chlamydia trachomatis Sektion 60 von 87 des kompletten Genoms.
Chlamydien-Infektion ist oft asymptomatisch. Zum Beispiel kann zu dem Zeitpunkt, an dem eine Frau medizinische Aufmerksamkeit für PID sucht, bereits ein irreversibler Schaden aufgetreten sein, der zur Infertilität führt. Daher verbleibt so ein Bedarf auf dem Fachgebiet für verbesserte Impfstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verhinderung und Behandlung von Chlamydiainfektionen. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt weiter andere verwandte Vorteile bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen für die Diagnose und Therapie von Chlamydiainfektion bereit. Bei einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend:

(a) ein Polypeptid, umfassend:
(i) die Aminoshuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder
(b) ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß (a);

Bestimmte Teile und andere Varianten sind immunogen, so dass die Fähigkeit der Variante, mit antigen-spezifischen Antiseren zu reagieren, im Wesentlichen nicht vermindert wird.
Bei einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend ein Fusionsprotein, umfassend ein Polypeptid, umfassend:

(i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist;

In anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine Zusammensetzung umfassen, umfassend:

(a) ein Polypeptid, umfassend:
(i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder
(b) ein Polynucleotid, das das Polypeptid von (a) codiert und einen physiologisch akzeptablen Träger.

Die Erfindung stellt auch Impfstoffe für prophylaktische und therapeutische Zwecke bereit, umfassend eine Zusammensetzung, umfassend:

(a) ein Polypeptid, umfassend:
(i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder
(b) ein Polynucleotid, das das Polypeptid von (a) codiert, und ein Immunstimulans, z. B. ein Adjuvans.

Auch bereitgestellt wird die Verwendung von:

(a) einem Polypeptid, umfassend:
(i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder
(b) einem Polynucleotid, das das Polypeptid von (a) codiert;

Sequenzidentifikatoren
SEQ ID Nr. 1 stellt eine DNA-Sequenz dar, identifiziert für Klon E4-A2-39 (CT10 positiv), das 1.311 bp ist und den gesamten OLR für CT460 (SWIB) und einen partiellen OLR für CT461 (yael) enthält.
SEQ ID Nr. 2 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E2-B10-52 (CT10 positiv) dar, die 1.516 bp Insert aufweist, das partielle OLRs für die Gene CT827 (nrdA-Ribonucleosidreduktase große Kette) und CT828 (ndrB-Ribonucleosidreduktase kleine Kette) enthält. Diese Gene wurden in einem Ct L2-Bibliothek-Screening nicht identifiziert.
SEQ ID Nr. 3 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E1-B1-80 (CT10 positiv) (2.397 bp) dar, die partielle OLRs für verschiedene Gene, CT812 (pmpD), CT015 (phoH ATPase), CT016 (hypothetisches Protein) und pGpl-D (C. trachomatis Plasmidgen) enthält.
SEQ ID Nr. 4 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E4-F9-4 (CT10, CL8, CT1, CT5, CT13 und CHH037 positiv) dar, die ein 1.094 bp Insert enthält, das einen partiellen OLR für das Gen CT316 (L7/L12 ribosomales Protein) wie auch einen partiellen OLR für Gen CT315 (RNA-Polymerase beta) aufweist.
SEQ ID Nr. 5 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E2-H6-40 (CT3 positiv) dar, die ein 2.129 pb Insert aufweist, das den gesamten OLR für das Gen CT288 und sehr kleine Fragmente der Gene CT287 und CT298 enthält. Die Gene in diesem Klon wurden nicht bei dem Screening mit einer Ct L2-Bibliothek identifiziert.
SEQ ID Nr. 6 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E5-D4-2 (CT3, CT10, CT1, CT5, CT12 und CHH038 positiv) dar, die ein 1.828 bp Insert aufweist, das einen partiellen OLR für Gen CT378 (pgi), kompletten OLR für Gen CT377 (ltuA) und einen kompletten OLR für das Gen CT376 (Malatdehydrogenase) enthält. Zusätzlich identifizierten die Patientenlinien CT10, CT1, CT5, CT12 und CHH037 ebenfalls diesem Klon.
SEQ ID Nr. 7 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E6-C1-31 (CT3 positiv) dar, die ein 861 b Insert aufweist, das einen partiellen OLR für Gen CT858 enthält.
SEQ ID Nr. 8 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E9-E11-76 (CT3 postitiv) dar, die ein 763 pb Insert enthält, das eine Amino-terminale Region des Gens für CT798 (Glycogensynthase) ist. Dieses Gen wurde in einem vorherigen Screening mit einer Ct L2-Bibliothek nicht identifiziert.
SEQ ID Nr. 9 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E2-A9-26 (CT1 positiv) dar, die einen Teil des Gens für OLR-3, das auf dem Plasmid in Chlamydia trachomatis gefunden wird, enthält.
SEQ ID Nr. 10 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E2-G8-94 (CT1 positiv) dar, die das Carboxy-terminale Ende von Lpda-Gen wie auch einen partiellen OLR für CT556 aufweist.
SEQ ID Nr. 11 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E1-H1-14 (CT1 positiv) dar, die ein 1.474 pb Insert aufweist, welches den Amiono-terminalen Teil eines Lpda-OLRs auf dem komplementären Strang enthält.
SEQ ID Nr. 12 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E1-A5-53 (CT1 positiv) dar, die ein 2.017 bp Insert enthält, das einen Amino-terminalen Teil des OLRs für dnaK-Gen auf den komplementären Strang, einen partiellen OLR für das grpE-Gen (CT395) und einen partiellen OLR für CT166 enthält.
SEQ ID Nr. 13 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E3-A1-50 (positiv auf der CT1-Linie) dar, die 1.199 bp ist und einen Carboxy-terminalen Teil des OLRs für CT622 enthält.
SEQ ID Nr. 14 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E3-E2-22 dar, die 877 bp aufweist, enthaltend einen kompletten OLR für CT610 auf dem komplementären Strang und diese wurde auf den CT3- wie auch CT10-Linien positiv war.
SEQ ID Nr. 15 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E5-E2-10 (CT10 positiv) dar, die 427 bp ist und einen partiellen OLR für das hauptsächliche äußere Membranprotein omp 1 enthält.
SEQ ID Nr. 16 stellt die DNA-Sequenz für Klon E2-D5-89 (516 bp) dar, die ein CT10-postives Klon ist, das einen partiellen OLR für pmpD-Gen (CT812) enthält.
SEQ ID Nr. 17 stellt die DNA-Sequenz für Klon E4-G9-75 (CT10 positiv) dar, die 723 pb ist und einen partiellen OLR für die Amino-terminale Region des pmpH-Gens (CT872) enthält.
SEQ ID Nr. 18 stellt die DNA-Sequenz für Klon E3-F2-35 (CT10, CT3, CT11 und CT13 positives 1.377 pb Insert) dar, die einen partiellen OLR für das tRNA-Trp(CT322)-Gen und einen kompletten OLR für das Gen secE (CT321) enthält.
SEQ ID Nr. 19 stellt die DNA-Sequenz für Klon E5-A11-8 (CT10 positiv 1.736 bp) dar, die den vollständigen OLR für groES (CT111) und einen Hauptanteil des OLRs für groEL (CT110) enthält.
SEQ ID Nr. 20 stellt die DNA-Sequenz für Klon E7-H11-61 (CT3 positiv 1.735 bp) dar, die partielle Inserts für fliA (CT061), tyrS (CT062), TSA (CT603) und ein hypothetisches Protein (CT602) aufweist.
SEQ ID Nr. 21 stellt eine DNA-Sequenz für Klon E6-C8-95 dar, die ein 731 bp Insert enthält, das unter Verwendung der Donor-Linien CT3-, CT1- und CT12-Linie identifiziert wurde.
Dieses Insert weist eine Carboxy-terminale Hälfte für das Gen für den 60 kDa OLR auf.
SEQ ID Nr. 22 stellt die DNA-Sequenz für Klon E4-D2-79 (CT3 positiv) dar, die ein 1.181 bp Insert enthält, das ein partieller OlR für das nrdA-Gen ist. Der OLR für dieses Gen wurde auch von Klon E2-B10-52 (CT10 positiv) identifiziert.
SEQ ID Nr. 23 stellt die DNA-Sequenz für Klon E1-F9-79 (167 bp; CT11 positiv) dar, die einen partiellen OLR für das Gen CT133 auf dem komplementären Strang enthält. CT133 wird als eine rRNA-Methylase vorhergesagt.
SEQ ID Nr. 24 stellt die DNA-Sequenz für Klon E2-G12-52 (1.265 bp; CT11 positiv) dar, die einen partiellen OLR für clpB, eine Protease ATPase, enthält.
SEQ ID Nr. 25 stellt die DNA-Sequenz für Klon E4-H3-56 (463 bp Insert; CT1 positiv) dar, die einen partiellen OLR für das TSA-Gen (CT603) auf dem komplementären Strang enthält.
SEQ ID Nr. 26 stellt die DNA-Sequenz für Klon E5-E9-3 (CT1 positiv) dar, die ein 636 bp Insert enthält, das partiell den OLR für dnaK-ähnliches Gen codiert. Ein Teil dieser Sequenz wurde auch in Klon E1-A5-53 identifiziert.
SEQ ID Nr. 27 stellt die Serovar E-DNA-Sequenz von CT875 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 28 stellt die Serovar E-DNA-Sequenz von CT622 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 29 stellt die DNA-Sequenz für Klon E3-B4-18 (CT1 positiv) dar, die 1.224 pb Insert enthält, das 4 OLRs enthält. Der vollständige OLR für CT772 und die partiellen OLRs von CT771, CT191 und CT190.
SEQ ID Nr. 30 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-E10-51 (CT10 positiv) dar, die ein 883 bp Insert enthält, das zwei partielle OLRs, CT680 und CT679, enthält.
SEQ ID Nr. 31 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-D5-8 (CT10, CT1, CT4 und CT11 positiv) dar, die ein 393 bp Insert enthält, das den partiellen OLR für CT680 enthält.
SEQ ID Nr. 32 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E7-B1-16 (CT10, CT3, CT5, CT11, CT13 und CHH037 positiv) dar, die ein 2.577 bp Insert enthält, das drei OLRs, zwei vollständige OLRs für CT694 und CT695 und den dritten, der den N-terminalen Teil von CT969 enthält, enthält.
SEQ ID Nr. 33 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-G2-93 (CT10 positiv) dar, die ein 554 bp Insert enthält, das einen partiellen OLR für CT178 enthält.
SEQ ID Nr. 34 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E5-A8-85 (CT1 positiv) dar, die ein 1.433 bp Insert enthält, das zwei partielle OLRs für CT875 und CT001 enthält.
SEQ ID Nr. 35 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E10-C6-45 (CT3 positiv) dar, die ein 196 bp Insert enthält, das einen partiellen OLR für CT827 enthält.
SEQ ID Nr. 36 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E7-H11-10 (CT3 positiv) dar, die ein 1.990 bp Insert enthält, das die partiellen ORLs für CT610 und CT613 und den vollständigen OLRs von CT611 und CT612 enthält.
SEQ ID Nr. 37 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-F7-11 (CT3 und CT10 positiv) dar, die ein 2.093 bp Insert enthält. Es enthält eine große Region von CT609, einen vollständigen OLR für CT610 und einen vollständigen OLR für CT611.
SEQ ID Nr. 38 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-A3-31 (CT1 positiv) dar, die ein 1.834 bp Insert enthält, das eine große Region von CT622 enthält.
SEQ ID Nr. 39 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E1-G9-23 (CT3 positiv) dar, die ein 1.180 bp Insert enthält, das fast den gesamten OLR für CT798 enthält.
SEQ ID Nr. 40 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E4-D6-21 (CT3 positiv) dar, die ein 1.297 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs für CT329 und CT327 und den kompletten OLR von CT328 enthält.
SEQ ID Nr. 41 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-F3-18 (CT1 positiv) dar, die ein 1.141 bp Insert enthält, das den partiellen OLR von CT871 enthält.
SEQ ID Nr. 42 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E10-B2-57 (CT10 positiv) dar, die ein 822 bp Insert enthält, das den kompletten OLR von CT066 enthält.
SEQ ID Nr. 43 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-F3-7 (CT1 positiv) dar, die ein 1.643 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs von CT869 und CT870 enthält.
SEQ ID Nr. 44 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E10-H8-1 (CT3 und CT10 positiv) dar, die ein 1.862 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs von CT871 und CT 872 enthält.
SEQ ID Nr. 45 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-D10-46 (CT1, CT3, CT4, CT11 und CT12 positiv) dar, die ein 1.666 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs für CT770 und CT773 und die vollständigen OLRs für CT771 und CT722 enthält.
SEQ ID Nr. 46 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-D8-19 (CT1 positiv) dar, die ein 2.010 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs, OLR3 und OLR6, und die vollständigen OLRs, OLR4 und OLR5, enthält.
SEQ ID Nr. 47 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E4-C3-40 (CT10 positiv) dar, die ein 2.044 bp Insert enthält, das den partiellen OLR für CT827 und einen vollständigen OLR für CT828 enthält.
SEQ ID Nr. 48 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-H6-10 (CT12 positiv) dar, die ein 3.743 bp Insert enthält, das die partiellen OLRs für CT223 und CT229 und die vollständigen OLRs für CT224, CT225, CT226, CT227 und CT228 enthält.
SEQ ID Nr. 80 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT872 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 81 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT828 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 82 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT827 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 83 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT812 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 84 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT798 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 85 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT681 (MompF) in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 86 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT603 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 87 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT460 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 88 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT322 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 89 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT321 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 90 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT289 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 91 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT288 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 92 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT287 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 93 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT133 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 94 stellt die Serovar D DNA-Sequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT113 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 95 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT872 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 96 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT828 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 97 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT827 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 98 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT812 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 99 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT798 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 100 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT681 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 101 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT603 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 102 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT460 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 103 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT322 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 104 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT321 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 105 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT289 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 106 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT288 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 107 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT287 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 108 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT133 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 109 stellt die Serovar D Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT113 in voller Länge dar.
SEQ ID Nr. 114 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E7-B12-65 (CHH037 positiv) dar, die ein 1.179 bp Insert enthält, das den vollständigen OLR für 376 enthält.
SEQ ID Nr. 115 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E4-H9-83 (CHH037 positiv) dar, die den partiellen OLR für das Hitzeschock-Protein GroEL (CT110) enthält.
SEQ ID Nr. 116 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-B10-52 (CHH037 positiv) dar, die den partiellen OLR für das Gen yscC (CT674) enthält.
SEQ ID Nr. 117 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E7-A7-79 (CHH037 positiv) dar, die den vollständigen OLR für das histonähnliche Entwicklungsgen hctA (CT743) und einen partiellen OLR für das rRNA-Methyltransferasegen ygcA (CT742) enthält.
SEQ ID Nr. 118 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-D11-18 (CHH037 positiv) dar, die den partiellen OLR für hctA (CT743) enthält.
SEQ ID Nr. 119 stellt die DNA-Sequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E hypothetische Protein CT694 dar.
SEQ ID Nr. 120 stellt die DNA-Sequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E hypothetische Protein CT695 dar.
SEQ ID Nr. 121 stellt die DNA-Sequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E L/1 ribosomale Protein dar.
SEQ ID Nr. 122 stellt die Aminosäuresequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E hypothetische Protein CT694 dar.
SEQ ID Nr. 123 stellt die Aminosäuresequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E hypothetische Protein CT695 dar.
SEQ ID Nr. 124 stellt die Aminosäuresequenz für das Chlamydia trachomatis Servovar E L/1 ribosomale Protein dar.
SEQ ID Nr. 125 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-A6-15 (CT3 positiv) dar, die den partiellen OLR für das pmpB-Gen (CT413) enthält.
SEQ ID Nr. 126 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-D10-87 (CT1 positiv) dar, die die partiellen OLRr für die hypothetischen Gene CT388 und CT389 enthält.
SEQ ID Nr. 127 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-D6-43 (CT3 positiv) dar, die den partiellen OLRs für das CT858 enthält.
SEQ ID Nr. 128 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-D10-4 (CT1 positiv) dar, die den partiellen OLR für pGP3-D und OLR, der auf dem Plasmid pGHL1 codiert wird, enthält.
SEQ ID Nr. 129 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-G8-7 (CT1 positiv) dar, die die partiellen OLRs für das CT557 (LpdA) und CT558 (LipA) enhält.
SEQ ID Nr. 130 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-F11-32 (CT1 positiv) dar, die den partiellen OLR für pmpD (CT812) enthält.
SEQ ID Nr. 131 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-F8-5 (CT12 positiv) dar, die den vollständigen OLR für den 15 kDa OLR (CT442) und einen partiellen OLR für den 60 kDA OLR (CT443) enthält.
SEQ ID Nr. 132 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-G4-39 (CT12 positiv) dar, die den partiellen OLR für den 60 kDa OLR (CT443) enthält.
SEQ ID Nr. 133 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E9-D1-16 (CT10 positiv) dar, die den partiellen OLR pmpH (CT872) enthält.
SEQ ID Nr. 134 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E3-F3-6 (CT1 positiv) dar, die die partiellen OLRs für die Gene accB (CT123) L1 ribosomal (CT125) und S9 ribosomal (CT126) enthält.
SEQ ID Nr. 135 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E2-D4-70 (CT12 positiv) dar, die den partiellen OLR für das pmpC-Gen (CT414) enthält.
SEQ ID Nr. 136 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E5-A1-79 (CT1 positiv) dar, die den partiellen OLR für ydhO (CT127), einen vollständigen OLR für S9 ribosomales Gen (CT126), einen vollständigen OLR für das L1 ribosomale Gen (CT125) und einen partiellen OLR für accC (CT124) enthält.
SEQ ID Nr. 137 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E1-F7-16 (CT12, CT3 und CT11 positiv) dar, die den partiellen OLR für das ftsH-Gen (CT841) und den gesamten OLR für das pnp-Gen (CT842) enthält.
SEQ ID Nr. 138 stellt die DNA-Sequenz für den Klon E1-D8-62 (CT12 positiv) dar, die die partiellen OLRs für das ftsH-Gen (CT841) und für das pnp-Gen (CT842) enthält.
SEQ ID Nr. 139 stellt die Aminosäuresequenz für das Serovar E Protein CT622 dar.
SEQ ID Nr. 140 stellt die Aminosäuresequenz für das Serovar E Protein CT875 dar.
Beschreibung der veranschaulichenden Ausführungsarten
Wie oben erwähnt wurde, richtet sich die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf Zusammensetzungen für die Diagnose und Behandlung von Chlamydiainfektion. Bei einem Aspekt beinhalten die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Polypeptide, die (i) die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 bestimmt wurde; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist, umfassen.
Polynucleotidzusammensetzungen
Wie hier verwendet, bezeichnen die Begriffe „DNA-Segment" und „Polynucleotid" ein DNA-Molekül, das frei von gesamter genomischer DNA einer speziellen Art isoliert wurde. Daher bezieht sich eine DNA-Segment, das ein Polypeptid codiert, auf ein DNA-Segment, das ein oder mehrere Codierungssequenzen enthält, aber dennoch im Wesentlichen von der gesamt-genomischen DNA der Art, von der das DNA-Segment erhalten wurde, wegisoliert oder frei gereinigt wurde. Mit eingeschlossen in die Begriffe „DNA-Segment" und „Polynucleotid" sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente solcher Segmente und auch rekombinante Vektoren, einschließlich z. B. Plasmide, Cosmide, Phagemide, Phagen, Viren und dergleichen.
Es wird von den Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass DNA-Segmente mit Nutzen bei dieser Erfindung genomische Sequenzen, extragenomische und Plasmid-codierte Sequenzen und kleinere gentechnisch hergestellte Gensegmente, die Proteine, Polypeptide, Peptide und dergleichen exprimieren oder adaptiert sein können, um sie zu exprimieren, beinhalten. Solche Segmente können natürlich isoliert oder synthetisch durch Menschenhand modifiziert sein.
„Isoliert", wie es hier verwendet wird, bedeutet, dass ein Polynucleotid im Wesentlichen von anderen Codierungssequenzen entfernt vorliegt, und dass das DNA-Segment nicht große Teile von nicht verwandter codierender DNA, wie große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder Polypeptid-codierende Regionen, enthält. Dies bezieht sich natürlich auf das DNA-Segment, wie es ursprünglich isoliert wurde, und schließt nicht Gene oder Codierungsregionen aus, die später zu dem Segment durch Menschenhand hinzugefügt wurden.
Wie es von dem bewanderten Fachmann erkannt werden wird, können die Polynucleotide einzelsträngig (Codierungs- oder Gegensinn) oder doppelsträngig sein und sie können DNA (genomisch, cDNA oder synthetisch) oder RNA-Moleküle sein. RNA-Moleküle beinhalten HnRNA-Moleküle, die Introns enthalten und zu einem DNA-Molekül auf eine eins-zu-eins-Weise korrespondieren, und mRNA-Moleküle, die keine Introns enthalten. Zusätzliche Codierungs- oder Nicht-Codierungssequenzen können, aber müssen nicht, innerhalb eines Polynucleotids von Nutzen bei der vorliegenden Erfindung vorliegen und ein Polynucleotid kann, aber muss nicht, an andere Moleküle und/oder Trägermaterialien gebunden sein.
Polynucleotide können eine native Chlamydia-Sequenz umfassen oder können eine Variante oder ein biologisches oder antigenes funktionelles Äquivalent einer solchen Sequenz umfassen. Polynucleotidvarianten können ein oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen und/oder Insertionen enthalten, wie weiter unten beschrieben wird, vorzugsweise solcher Art, dass die Immunogenität des codierten Polypeptids relativ zu einem nativen Chlamydia-Protein nicht verringert wird. Der Effekt auf die Immunogenität des codierten Polypeptids kann im Allgemeinen beurteilt werden, wie hier beschrieben wird. Der Begriff „Varianten" umfasst auch homologe Gene von xenogenem Ursprung.
Wenn Polynucleotid- oder Polypeptidsequenzen verglichen werden, merkt man, dass zwei Sequenzen „identisch" sind, wenn die Sequenz der Nucleotide oder Aminosäure in den zwei Sequenzen die gleiche ist, wenn sie für maximale Korrespondenz ausgerichtet werden, wie unten beschrieben wird. Vergleiche zwischen zwei Sequenzen werden typischerweise durch Vergleich der Sequenzen über ein Vergleichsfenster durchgeführt, um lokale Bereiche der Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein „Vergleichsfenster" bezieht sich auf ein Segment von mindestens ungefähr 20 fortlaufenden Positionen, gewöhnlich 30 bis ungefähr 75, 40 bis ungefähr 50, wobei eine Sequenz zu einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl von fortlaufenden Positionen verglichen wird, nachdem die zwei Sequenzen optimal ausgerichtet wurden.
Die optimale Ausrichtung von Sequenzen für den Vergleich kann unter Verwendung des Megalign-Programms in der Lasergene Suite of Bioinformatics Software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) unter Verwendung von vorgegebenen Parametern durchgeführt werden. Dieses Programm verkörpert verschiedene Ausrichtungsschemata, die in den folgenden Quellenangaben beschrieben werden: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in Proteins – Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (Hrsg.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington CD Bd. 5, Anh. 3, S. 345–358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, S. 626–645, Methods in Enzymology, Bd. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5: 151–153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4: 11–17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor. 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406–425; Sneath, P. H. A. und Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80: 726–730.
Alternativ kann die optimale Ausrichtung von Sequenzen zum Vergleich durch den lokalen Identitätsalgorithmus von Smith und Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482, durch den Identitäts-Ausrichtungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, durch die Suche nach Ähnlichkeitsverfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST; FASIA und TFASTA in der Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung durchgeführt werden.
Ein bevorzugtes Beispiel für Algorithmen, die für die Bestimmung von Prozent Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet sind, sind die BLAST und BLAST 2.0 Algorithmen, die in Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389–3402 bzw. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 beschrieben werden. BLAST und BLAST 2.0 können zum Beispiel mit den Parametern, die hier beschrieben werden, verwendet werden, um Prozent Sequenzidentität für die Polynucleotide und Polypeptide von Nutzen bei der Erfindung zu bestimmen. Die Software für die Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich durch das National Center for Biotechnology Information erhältlich. Bei einem veranschaulichenden Beispiel können kumulative Punktzahlen für Nucleotidsequenzen unter Verwendung der Parameter M (Belohnungspunktzahl für ein Paar von passenden Resten; immer > 0) und N (Strafpunktzahl für nicht passende Reste; immer < 0) berechnet werden. Für Aminosäuresequenzen kann eine Bewertungsmatrix verwendet werden, um die kumulative Punktzahl zu berechnen. Die Ausweitung der Worttreffer in jeder Richtung wird aufgehalten, wenn: die kumulative Ausrichtungspunktzahl um mehr als die Menge X von dem maximal erreichten Wert abfällt; die kumulative Punktzahl aufgrund der Anhäufung von ein oder mehreren negativ bewerteten Restausrichtungen 0 oder weniger erreicht; oder das Ende von einer Sequenz erreicht wird. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und die Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen) verwendet als Voreinstellungen eine Wortlänge (W) von 11 und Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (siehe Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) Ausrichtungen, (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = –4 und einen Vergleich beider Stränge.
Vorzugsweise wird der „Prozentsatz an Sequenzidentität" durch Vergleich von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Positionen bestimmt, wobei der Teil der Polynucleotid- oder Polypeptidsequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (sprich Lücken) von 20% oder weniger, normalerweise 5 bis 15% oder 10 bis 12% im Vergleich mit den Referenzsequenzen (die keine Additionen oder Deletionen umfassen) für die optimale Ausrichtung der zwei Sequenzen umfassen können. Der Prozentsatz wird durch Bestimmung der Anzahl von Positionen, an denen die identischen Nucleinsäurebasen oder Aminosäurereste in beiden Sequenzen auftreten, um die Anzahl von passenden Positionen zu ergeben, Division der Anzahl von passenden Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen in der Referenzsequenz (sprich der Fenstergröße) und Multiplikation der Ergebnisse mit 100, um den Prozentsatz an Sequenzidentität zu ergeben, berechnet.
Demnach verwendet die vorliegende Erfindung Polynucleotid- und Polypeptidsequenzen mit substantieller Identität zu den Sequenzen, die hier offenbart werden, sprich diejenigen, die eine mindestens 90%ige, 95%ige, 96%ige, 97%ige, 98%ige oder 99%ige oder höhere Sequenzidentität im Vergleich mit einer Polynucleotid- oder Polypeptidsequenz von Nutzen bei dieser Erfindung umfassen, wobei die Verfahren verwendet werden, die hier beschrieben werden (z. B. BLAST-Analyse unter Verwendung von Standardparametern, wie unten beschrieben wird). Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass diese Werte geeignet eingestellt werden können, um korrespondierende Identität von Proteinen, die durch zwei Nucleotidsequenzen kodiert werden, durch Berücksichtigung von Codon-Degeneration, Aminosäure-Ähnlichkeit, Leserahmen-Positionierung und dergleichen zu bestimmen.
Bei zusätzlichen Ausführungsarten verwendet die vorliegende Erfindung isolierte Polynucleotide und Polypeptide, die verschiedene Längen von fortlaufenden Strecken von Sequenz umfassen, die identisch oder komplementär zu einer oder mehreren der Sequenzen, die hier offenbart werden, sind. Zum Beispiel werden durch diese Erfindung Polynucleotide bereitgestellt, die mindestens 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 oder 1.000 oder mehr fortlaufende Nucleotide von einer oder mehreren der Sequenzen, die hier offenbart werden, wie auch alle mittleren Längen, die dazwischen liegen, umfassen. Es wird einfach verstanden werden, dass „mittlere Längen" in diesem Zusammenhang irgendeine Länge zwischen den aufgeführten Werten bedeuten, wie 50, 51, 52, 53 etc.; 100, 101, 102, 103 etc.; 150, 151, 152, 153 etc.; einschließlich aller ganzen Zahlen von 200–500; 500–1.000 und dergleichen.
Die Polynucleotide von Nutzen bei der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon, unabhängig von der Länge der codierenden Sequenz selbst, können mit anderen DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymorten, multiplen Klonierungsorten oder Codierungssegmenten und dergleichen verbunden werden, so dass ihre Gesamtlänge beträchtlich varriieren kann. Es wird daher überlegt, dass ein Nucleinsäurefragment von fast jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Einfachheit der Herstellung und Verwendung bei dem beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokoll limitiert ist. Zum Beispiel werden veranschaulichende DNA-Segmente mit Gesamtlänge von ungefähr 10.000, ungefähr 5.000, ungefähr 3.000, ungefähr 2.000, ungefähr 1.000, ungefähr 500, ungefähr 200, ungefähr 100, ungefähr 50 Basenpaaren in Länge und dergleichen (einschließlich allen mittleren Längen) als nützlich bei vielen Anwendungen dieser Erfindung überlegt.
Kleine Polynucleotidsegmente oder Fragmente können einfach durch z. B. direktes Synthetisieren des Fragmentes durch chemische Mittel, wie es gewöhnlich unter Verwendung eines automatisierten Oligonucleotid-Synthetisierers ausgeübt wird, hergestellt werden. Fragmente können auch durch Anwendung von Nucleinsäure-Reproduktionstechnologien, wie der PCR^TM-Technologie von U.S. Patent 4,683,202 , durch Einführung ausgewählter Sequenzen in rekombinante Vektoren für rekombinante Produktion und durch rekombinante DNA-Techniken, die im Allgemeinen denjenigen mit Bewanderung auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind, erhalten werden.
Polynucleotid-Identifizierung und -Charakterisierung
Polynucleotide können durch irgendeine einer Vielzahl von gut eingeführten Techniken identifziert, hergestellt und/oder manipuliert werden. Zum Beispiel kann ein Polynucleotid durch Screening eines Mikroarrays von cDNAs auf Chlamydia-Expression identifiziert werden. Solche Screenings können z. B. unter Verwendung eines Synteni Microarrays (Palo Alto, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (und im Wesentlichen wie durch Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10614–10619, 1996 und Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150–2155, 1997 beschrieben wird) durchgeführt werden. Alternativ können Polynucleotide aus cDNA amplifiziert werden, die aus Zellen hergestellt wurde, die die Proteine, die hier beschrieben werden, exprimieren. Solche Polynucleotide können über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Für diesen Ansatz können Sequenzspezifische Primer, basierend auf den Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, designed werden, und sie können erworben oder synthetisiert werden.
Ein amplifizierter Teil eines Polynucleotids von Nutzen bei der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein Gen in vollständiger Länge von einer geeigneten Bibliothek (z. B. Chlamydia-cDNA-Bibliothek) unter Verwendung von gut bekannten Techniken zu isolieren. Bei solchen Techniken wird eine Bibliothek (cDNA oder genomisch) unter Verwendung von einer oder mehreren Polynucleotidsonden oder Primern, die für die Amplifizierung geeignet sind, gescreent. Vorzugsweise wird eine Bibliothek so größenselektiert, dass sie größere Moleküle beinhaltet. Random-primed Bibliotheken können auch für die Identifizierung von 5'- und Stromaufwärts-Regionen von Genen bevorzugt werden. Genomische Bibliotheken werden für den Erhalt von Introns und verlängerten 5'-Sequenzen bevorzugt.
Für Hybridierunstechniken kann eine partielle Sequenz unter Verwendung von gut bekannten Techniken markiert werden (z. B. durch Nick-Translation oder Endmarkierung mit ³²P). Eine bakterielle oder Bakteriophagen-Bibliothek wird dann im Allgemeinen durch Hybridisierungsfilter, die denaturierte bakterielle Kolonien (oder Rasen, die Phagen-Plaques enthalten) enthalten, mit der markierten Sonde gescreent (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridisierende Kolonien oder Plaques werden ausgewählt und expandiert und die DNA wird für die weitere Analyse isoliert. cDNA-Klone können analysiert werden, um die Menge von zusätzlicher Sequenz durch z. B. PCR unter Verwendung eines Primers für die partielle Sequenz und eines Primers für den Vektor bestimmt werden. Restriktionskarten und partielle Sequenzen können erzeugt werden, um einen oder mehrere überlappende Klone zu identifizieren. Die vollständige Sequenz kann unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden, die die Erzeugung einer Reihe von Deletionsklonen involvieren können. Die resultierenden überlappenden Sequenzen können dann zu einer einzelnen fortlaufenden Sequenz zusammengefügt werden. Ein cDNA-Moleküls vollständiger Länge kann durch Verbindung von geeigneten Fragmenten unter Verwendung von gut bekannten Techniken erzeugt werden.
Alternativ gibt es zahlreiche Amplifikationstechniken für den Erhalt einer Codierungssequenz in voller Länge aus einer partiellen cDNA-Sequenz. Bei solchen Techniken wird die Amplifikation im Allgemeinen über PCR durchgeführt. Es kann irgendeines einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits verwendet werden, um den Amplifikationsschritt durchzuführen. Primer können z. B. unter Verwendung von Software, die auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, designed werden. Primer sind vorzugsweise 22–30 Nucleotide lang, weisen einen GC-Gehalt von mindestens 50% auf und binden sich an die Zielsequenz bei Temperaturen von ungefähr 68°C bis 72°C. Die amplifizierte Region kann wie oben beschrieben sequenziert und überlappende Sequenzen können zu einer fortlaufenden Sequenz zusammengefügt werden.
Eine solche Amplifikationstechnik ist inverse PCR (siehe Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), die Restriktionsenzyme verwendet, um ein Fragment in der bekannten Region des Gens zu erzeugen. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligation zirkularisiert und auf eine Matrize für PCR mit divergenten Primern, die aus der bekannten Region stammen, verwendet. Bei einem alternativen Ansatz können Sequenzen, die zu einer partiellen Sequenz benachbart liegen, durch Amplifikation mit einem Primer zu einer Linkersequenz und einem Primer, der für eine bekannte Region spezifisch ist, gewonnen werden. Die amplifizierten Sequenzen werden typischerweise einer zweiten Runde der Amplifikation mit demselben Linker-Primer und einem zweiten Primer, der für die bekannte Region spezifisch ist, unterworfen. Eine Variation von dieser Vorgehensweise, die zwei Primer verwendet, die die Extension in verschiedene Richtungen von der bekannten Sequenz initiieren, wird in WO 96/38591 beschrieben. Eine andere solche Technik ist als eine „schnelle Amplifikation von cDNA-Enden" oder RACE bekannt. Diese Technik involviert die Verwendung eines inneren Primers und eines äußeren Primers, der mit einer polyA-Region oder Vektorsequenz hybridisiert, um Sequenzen zu identifizieren, die 5' und 3' einer bekannten Sequenz liegen. Zusätzliche Techniken beinhalten Capture-PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111–19, 1991) und Walking-PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19: 3055–60, 1991). Andere Verfahren, die Amplifikation verwenden, können auch verwendet werden, um eine cDNA-Sequenz in voller Länge zu erhalten.
Unter bestimmten Umständen ist es möglich, eine cDNA-Sequenz voller Länge durch Analyse von Sequenzen, die in einer Expressed Sequenz Tag(EST)-Datenbank, wie derjenigen, die von GenBank erhältlich ist, bereitgestellt werden, zu erhalten. Die Suche nach überlappenden ESTs kann im Allgemeinen unter Verwendung von gut bekannten Programmen (z. B. NCBI BALST-Suchen) durchgeführt werden und solche ESTs können verwendet werden, um eine fortlaufende Sequenz vollständiger Länge zu erzeugen. DNA-Sequenzen vollständiger Länge können auch durch Analyse von Genomfragmenten erhalten werden.
Polynucleotidexpression in Wirtszellen
Polynucleotidsequenzen oder Fragmente davon, die Polypeptide von Nutzen bei der Erfindung kodieren, oder Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon, können in rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden, um die Expression eines Polypeptids in geeigneten Wirtszellen zu lenken. Aufgrund der innewohnenden Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen dieselbe oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, hergestellt werden, und diese Sequenzen können verwendet werden, um ein gegebenes Polypeptid zu klonieren und zu exprimieren.
Es wird von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden, dass es in einigen Fällen vorteilhaft sein kann, Polypeptid codierende Nucleotidsequenzen, die nicht natürlich auftretende Codons besitzen, herzustellen. Zum Beispiel können Codons, die von einem bestimmten prokaryoten oder eukaryoten Wirt bevorzugt werden, ausgewählt werden, um die Rate an Proteinexpression zu steigern oder ein rekombinantes RNA-Transkript mit erwünschten Eigenschaften, wie einer Halbwertszeit, die länger ist, als diejenige eines Transkriptes, das aus der natürlich auftretenden Sequenz erzeugt wurde, herzustellen.
Darüber hinaus können die Polynucleotidsequenzen von Nutzen bei der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, gentechnisch verändert werden, um Polypeptid-codierende Sequenzen aus einer Vielzahl von Gründen zu verändern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Änderungen, die die Klonierung, die Weiterverarbeitung und/oder Expression des Genproduktes modifizieren. Zum Beispiel kann DNA-Neukombination durch zufällige Fragmentierung und PCR-Neuzusammenbau von Genfragmenten und synthetischen Oligonucleotiden verwendet werden, um die Nucleotidsequenzen gentechnisch zu verändern. Zusätzlich kann ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden, um neue Restriktionsorte einzuführen, Glycosilierungsmuster zu verändern, Kodon-Präferenz zu ändern, Splicevarianten herzustellen oder Mutationen einzuführen usw.
Bei einer anderen Ausführungsart der Erfindung können natürliche, modifizierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenzen an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Ein Fusionsprotein kann auch gentechnisch hergestellt werden, um einen Spaltungsort zu entfalten, der zwischen der Polypeptid codierenden Sequenz und der heterologen Proteinsequenz liegt, so dass das Polypeptid gespalten und von dem heterologen Rest weg gereinigt werden kann.
Sequenzen, die ein erwünschtes Polypeptid codieren, können im Ganzen oder teilweise unter Verwendung von chemischen Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (siehe Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215–223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225–232), synthetisiert werden. Alternativ kann das Protein selbst unter Verwendung von chemischen Verfahren hergestellt werden, um die Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder eines Teils davon zu synthetisieren. Zum Beispiel kann Peptidsynthese unter Verwendung von verschiedenen Festphasen-Techniken (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269: 202–204) durchgeführt werden und automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung des ABI431A Peptidsynthetisierers (Perkin Elmer, Palo Alto, CA) erreicht werden.
Ein neu synthetisiertes Peptid kann im Wesentlichen durch präparative Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (z. B. Creighton, Tl. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, SH Freeman and Co., New York, N. Y.) oder andere vergleichbare Techniken, die auf dem Fachgebiet erhältlich sind, gereinigt werden. Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z. B. das Edman Abbau-Verfahren) bestätigt werden. Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz eines Polypeptids oder irgendeines Teiles davon unter Verwendung von direkter Synthese verändert und/oder Verwendung von chemischen Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen oder irgendeinem Teil davon kombiniert werden, um ein variantes Polypeptid herzustellen.
Um ein erwünschtes Polypeptid zu exprimieren, können die Nucleotidsequenzen, die das Polypeptid codieren, oder funktionelle Äquivalente, in einen geeigneten Expressionsvektor, sprich einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten Codierungssequenz enthält, inseriert werden. Es können Verfahren, die denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die ein Polypeptid von Interesse codieren, und geeignete Transkriptions- und Translations-Kontrollelemente enthalten.
Diese Verfahren beinhalten in vitro rekombinante DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo genetische Rekombination. Solche Techniken werden in Sambrook, J. et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., und Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., beschrieben.
Es kann eine Vielzahl von Epressionsvektor/Wirtssystemen verwendet werden, um Polynucleotidsequenzen zu enthalten und zu exprimieren. Diese beinhalten, sind aber nicht limitiert auf, Mikroorganismen, wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid, oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert wurden; Hefen, die mit Hefe-Expressionsvektoren transformiert wurden; Insektenzellsysteme, die mit Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus) infiziert wurden; Pflanzenzellsysteme, die mit Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus, CaMV; Tabak-Mosaikvirus, TMV) oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z. B. Ti- oder pBR322-Plasmiden) transformiert wurden oder Tierzellsysteme.
Die „Kontrollelemente" oder „regulatorischen Sequenzen", die in einem Expressionsvektor vorliegen, sind diejenigen nicht translatierten Regionen der Vektorverstärker, Promotoren, 5' und 3' untranslatierten Regionen, die mit Wirts-zellulären Proteinen in Wechselwirkung treten, um Transkription und Translation auszuführen. Solche Elemente können in ihrer Stärke und Spezifität variieren. Abhängig von dem Vektorsystem und dem Wirt, der verwendet wird, kann jedwede Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiven und induzierbaren Promotoren, verwendet werden. Wenn in bakteriellen Systemen kloniert wird, können z. B. induzierbare Promotoren, wie der Hybrid lacZ-Promotor von dem pBluescript Phagemid (Stratagene, La Jolla, Calif.) oder PSPORT1-Plasmid (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) und dergleichen verwendet werden. In Säugerzellsystemen werden im Allgemeinen Promotoren für Säugergene oder von Säugerviren bevorzugt. Wenn es notwendig ist, eine Zelllinie zu erzeugen, die zahlreiche Kopien der Sequenz, die ein Polypeptid codiert, enthält, können Vektoren, die auf SV40 oder EBV basieren, vorteilhaft mit einem geeigneten selektierbaren Marker verwendet werden.
In Bakteriensystemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren abhängig von der Verwendung, die für das exprimierte Polypeptid vorgesehen ist, ausgewählt werden. Wenn große Mengen benötigt werden, können z. B. Vektoren verwendet werden, die hochgradige Expresssion von Fusionsproteinen, die einfach gereinigt werden können, lenken. Solche Vektoren beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf die multifunktionellen E. coli Klonierungs- und Expressionsvektoren, wie Bluescript (Stratagene), in denen die Sequenz, die das Polypeptid von Interesse codiert, in den Vektor im Rahmen mit Sequenzen für das Amino-terminale Met und die darauf folgenden 7 Reste von beta-Galactosidase ligiert ist, so dass ein Hybridprotein hergestellt wird; pIN-Vektoren (Van Heeke, G. und S. M. Schuster (1989), J. Biol. Chem. 264: 5503–5509) und dergleichen. Es können auch pGEX-Vektoren (Promega, Madison, Wis.) verwendet werden, um fremde Polypeptide wie Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im Allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können einfach aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von Elution in der Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Proteine, die in solchen Systemen hergestellt werden, können so entwickelt werden, dass sie Heparin-, Thrombin- oder Faktor-XA-Protease Spaltungsorte enthalten, so dass das geklonte Polypeptid von Interesse aus dem GST-Rest nach eigenem Willen freigesetzt werden kann. Bei der Hefe, Saccharomyces cerevisiae, kann eine Anzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie alpha-Faktor, Alkoholoxidase und PGH enthalten, verwendet werden. Für Überblicke siehe Ausubel et al. (supra) und Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516–544.
In Fällen, bei denen Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, die Polypeptide codieren, durch irgendeinen einer Anzahl von Promotoren getrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren, wie die 35S- und 19S-Promotoren von CaMV, allein oder in Kombination mit der Omega-Leader-Sequenz von TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307–311) verwendet werden. Alternativ können Pflanzen-Promotoren, wie die kleine Untereinheit von RUBISCO, oder Hitzeschock-Promotoren verwendet werden (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838–843; und Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85–105). Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen durch direkte DNA-Transformation oder pathogen vermittelte Transfektion eingeführt werden. Solche Techniken werden in einer Anzahl von allgemein erhältlichen Überblicken beschrieben (siehe z. B. Hobbs, S. oder Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N. Y.; S. 191–196).
Es kann auch ein Insektensystem verwendet werden, um ein Polypeptid von Interesse zu exprimieren. In einem solchen System wird z. B. Autographa californica nukleäres Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Die Sequenzen, die die Polypeptide codieren, können in eine nicht essentielle Region des Virus, wie das Polyhedrin-Gen, kloniert und unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt werden. Die erfolgreiche Insertion der Polypeptid codierenden Sequenz wird das Polyhedrin-Gen inaktiv machen und rekombinanten Virus, dem an Hüllprotein fehlt, produzieren. Die rekombinanten Viren können dann verwendet werden, um z. B. S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in denen das Polypeptid von Interesse exprimiert werden kann (Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3224–3227).
Bei Säuger-Wirtszellen ist allgemein eine Anzahl von viral basierten Expressionssystemen erhältlich. In Fällen, bei denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, können z. B. Sequenzen, die ein Polypeptid von Interesse kodieren, in einen Adenovirus-Transkriptions-/Translationskomplex, der aus dem späten Promotor und der dreiteiligen Leadersequenz besteht, ligiert werden. Insertion in eine nicht essentielle E1- oder E3-Region des Virusgenoms kann verwendet werden, um ein lebensfähiges Virus zu erhalten, das in der Lage ist, das Polypeptid in infizierten Wirtszellen zu exprimieren (Logan, J. und Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Set 81: 3655–3659). Zusätzlich können Transkriptionsverstärker, wie der Rous-Sarcom-Virus(RSV)-Verstärker, verwendet werden, um die Expression in Säuger-Wirtszellen zu steigern.
Es können auch spezifische Startsignale verwendet werden, um eine effizientere Translation von Sequenzen, die ein Polypeptid von Interesse codieren, zu erreichen. Solche Signale beinhalten das ATG-Startkodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, in denen Sequenzen, die das Polypeptid, sein Startkodon und Stromaufwärts-Sequenzen codieren, in den geeigneten Expressionsvektor inseriert werden, könnten keine zusätzlichen Transkriptions- oder Translations-Kontrollsignale benötigt werden. In den Fällen jedoch, in denen nur die Codierungssequenz oder ein Teil davon inseriert wird, sollten exogene Translations-Kontrollsignale, einschließlich dem ATG-Startkodon, bereitgestellt werden. Darüber hinaus sollte das Startkodon in dem korrekten Leserahmen vorliegen, um die Translation des gesamten Inserts zu sichern. Exogene Translationselemente und Startkodons können aus verschiedenen Ursprüngen, sowohl natürlich wie auch synthetisch, stammen. Die Effizienz der Expression kann durch Einschluss von Verstärkern, die für das spezielle Zellsystem, das verwendet wird, geeignet sind, wie diejenigen, die in der Literatur beschrieben werden (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125–162), gesteigert werden.
Zusätzlich kann ein Wirtszell-Stamm wegen seiner Fähigkeit, die Expression der inserierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein auf die erwünschte Weise weiter zu verarbeiten, ausgewählt werden. Solche Modifikationen des Polypeptids beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Acetylierung, Carboxylierung, Glycosilierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Posttranslationelle Weiterverarbeitung, die eine „Präpro"-Form des Proteins spaltet, kann auch verwendet werden, um die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion zu erleichtern. Verschiedene Wirtszellen, wie CHO, HeLa, MDCK, HEK293 und WI38, die eine spezifische zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche posttranslationellen Aktivitäten aufweisen, können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Weiterverarbeitung des fremden Proteins zu sichern.
Für lang dauernde, ertragreiche Produktion von rekombinanten Proteinen wird stabile Expression im Allgemeinen bevorzugt. Zum Beispiel können Zelllinien, die ein Polynucleotid von Interesse stabil exprimieren, unter Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge und/oder endogene Expressionselemente enthalten können, und eines selektierbaren Markergens auf dem gleichen oder einem anderen Vektor transformiert werden. Nach der Einführung des Vektors lässt man die Zellen für ein bis zwei Tage in einem angereicherten Medium wachsen, bevor sie auf selektives Medium übertragen werden. Der Zweck des selektierbaren Markers ist es, Resistenz gegenüber Selektion zu verleihen und seine Gegenwart erlaubt das Wachstum und die Erholung von Zellen, die die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klone von stabil transformierten Zellen können unter Verwendung von Gewebekulturtechniken, die für den Zelltyp geeignet sind, vermehrt werden.
Jede Anzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, um transformierte Zelllinien zu gewinnen. Diese beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223–32) und Adeninphosphoribosyltransferase(Lowy, I. et al. (1990) Cell 22: 817–23)-Gene, die in tk.sup.- bzw. aprt.sup.-Zellen verwendet werden können. Auch kann Antimetabolit-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz als die Basis für die Selektion verwendet werden; zum Beispiel dhfr, das Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler, M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Set 77: 3567–70); npt, das Resistenz gegenüber Aminoglysosiden, Neomycin und G-418 verleiht (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1–14) und als oder pat, die Resistenz gegenüber Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricinacetyltransferase verleihen (Murry, supra). Es wurden zusätzlich selektierbare Gene beschrieben, z. B. trpB, welches Zellen ermöglicht, Indol anstelle von Tryptophan zu verwerten, oder hisD, welches Zellen ermöglicht, Histinol anstelle von Histidin zu verwerten (Hartman, S. C. und R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047–51). In letzter Zeit hat die Verwendung von sichtbaren Markern Popularität mit solchen Markern wie Anthocyaninen, beta-Glucuronidase und seinem Substrat GUS und Luciferase und seinem Substrat Luciferin gewonnen, welche breit angewendet werden, nicht nur um Transformanden zu identifizieren, sondern auch, um die Menge an transienter oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zuzuschreiben ist, zu quantifizieren (Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121–131).
Obwohl die Gegenwart/Abwesenheit von Markergenexpression nahelegt, dass das Gen von Interesse auch vorliegt, könnte es nötig sein, seine Gegenwart und Expression zu bestätigen.
Wenn die Sequenz, die ein Polypeptid codiert, in eine Markergensequenz inseriert wird, können z. B. rekombinante Zellen, die Sequenzen enthalten, durch die Abwesenheit von Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen in Tandem mit einer Polypeptid-codierenden Sequenz unter die Kontrolle eines einzelnen Promotors gestellt werden. Die Expression des Markergens in Antwort auf die Induktion oder Selektion weist normalerweise auch auf die Expression des Tandemgens hin.
Alternativ können Wirtszellen, die eine erwünschte Polynucleotidsequenz enthalten und exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren, die demjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, identifiziert werden. Diese Verfahren beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierungen und Protein-Bioassay- oder Immunassay-Techniken, die Membran, Lösungs- oder Chipbasierte Technologien für den Nachweis und/oder die Quantifizierung von Nucleinsäure oder Protein beinhalten.
Es sind eine Vielzahl von Protokollen für den Nachweis und die Messung der Expression von Polynucleotid-codierten Produkten unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Produkt spezifisch sind, auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele beinhalten Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Ein zweiseitiger, monoklonal basierter Immunoassay, der monoklonale Antikörper verwendet, die gegen zwei nicht interferierende Epitope auf einem gegebenen Polypeptid reagieren, kann für einige Anwendungen bevorzugt werden, aber ein kompetitiver Bindungsassay kann auch verwendet werden. Diese und andere Assays werden unter anderen in Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul. Minn.) und Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158: 1211–1216) beschrieben.
Eine große Bandbreite an Markern und Konjugationstechniken sind denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt und können in verschiedenen Nucleinsäure- und Amionsäure-Assays verwendet werden. Mittel zur Herstellung von markierten Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Nachweis von Sequenzen, die mit Polynucleotiden verwandt sind, beinhalten Oligolabeling, Nicktranslation und Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids. Alternativ können die Sequenzen oder irgendwelche Teile davon in einen Vektor für die Produktion einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, sind kommerziell erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und markierten Nucleotiden zu synthetisieren. Diese Verfahren können unter Verwendung einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits durchgeführt werden. Geeignete Reportermoleküle oder Marker, die verwendet werden können, beinhalten Radionuclide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszente oder chromogene Wirkstoffe, wie auch Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dergleichen.
Wirtszellen, die mit einer Polynucleotidsequenz von Interesse transformiert werden, können unter Bedingungen, die für die Expression und Gewinnung des Proteins aus der Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das Protein, das durch eine rekombinante Zelle hergestellt wird, kann sezerniert oder intrazellulär behalten werden, abhängig von der Sequenz und/oder dem Vektor, die/der verwendet wird. Wie von denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet verstanden werden wird, können Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, so entwickelt werden, dass sie Signalsequenzen enthalten, die die Sezernierung des codierten Polypeptids durch eine prokaryote oder eukaryote Zellmembran steuern. Andere rekombinante Konstruktionen können verwendet werden, um Sequenzen, die ein Polypeptid von Interesse kodieren, mit Nucleotidsequenzen, die eine Polypeptiddomäne codieren, die die Reinigung von löslichen Proteinen erleichtern wird, zu verbinden. Solche die Reinigung erleichternden Domänen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Metallchelat-bildende Peptide, wie Histidme-Tryptophan-Module, die die Reinigung auf immobilisierten Metallen ermöglichen, Protein-A-Domänen, die die Reinigung auf immobilisierten Immunglobulin ermöglichen und die Domäne, die in dem FLAGS Extensions-/Affinitätsreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, Wash.) verwendet wird. Der Einschluss von spaltbaren Linkersequenzen, wie diejenigen, die für Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, Calif.) spezifisch sind, zwischen der Reinigungsdomäne und dem codierten Polypeptid kann verwendet werden, um die Reinigung zu erleichtern. Ein solcher Expressionsvektor sorgt für die Expression eines Fusionsproteins, das ein Polypeptid von Interesse und eine Nucleinsäure, die 6 Histidinreste, die einem Thioredoxin oder einem Enterokinase-Spaltungsort vorangehen, codiert, enthält. Die Histidinreste erleichtern die Reinigung auf IMIAC (immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie), wie in Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3: 263–281) beschrieben wird, während der Enterokinase-Spaltungsort ein Mittel zur Reinigung des erwünschten Polypeptids aus dem Fusionsprotein bereitstellt. Eine Diskussion der Vektoren, die Fusionsproteine enthalten, wird in Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12: 441–453) bereitgestellt.
Zusätzlich zu den rekombinanten Produktionsverfahren können Polypeptide und Fragemente davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasetechniken (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154) hergestellt werden. Proteinsynthese kann unter Verwendung von manuellen Techniken oder durch Automatisierung durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung eines Applied Biosystems 431A Peptid-Synthetisierers (Perkin Elmer) erreicht werden. Alternativ können verschiedene Fragmente chemisch getrennt und zusammen unter Verwendung von chemischen Verfahren, um ein Molekül vollständiger Länge herzustellen, synthetisiert werden.
Ortsgerichtete Mutagenese
Ortsgerichtete Mutagenese ist eine Technik, die bei der Herstellung von individuellen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Polypeptiden durch spezifische Mutagenese der darunter liegenden Polynucleotide, die sie codieren, nützlich ist. Die Technik, denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt, stellt weiter eine einfache Möglichkeit bereit, Sequenzvarianten, z. B. solche, die ein oder mehrere der vorangehenden Überlegungen beinhalten, durch Einführung von ein oder mehreren Nucleotidsequenzänderungen in die DNA herzustellen und zu testen. Ortsgerichtete Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Mutanten durch die Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation codieren, wie auch eine ausreichende Anzahl von benachbarten Nucleotiden, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Doppelstrang auf beiden Seiten der Deletionsverbindung, die überbrückt wird, zu bilden. Mutationen können in einer ausgewählten Polynucleotidsequenz angewendet werden, um die Eigenschaften des Polynucleotids selbst und/oder die Eigenschaften, die Aktivität, die Zusammensetzung, Stabilität oder primäre Sequenz des codierten Polypeptids zu verbessern, zu ändern, zu verringern, zu modifizieren oder anderweitig zu verändern.
Die Techniken der ortsgerichteten Mutagenese sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden breit angewendet, um Varianten von sowohl Polypeptiden wie auch Polynucleotiden zu erzeugen. Zum Beispiel wird ortsgerichtete Mutagenese oft verwendet, um einen spezifischen Anteil eines DNA-Moleküls zu verändern. Es wird ein Primer, der typischerweise ungefähr 14 bis ungefähr 25 Nucleotide oder so ähnlich in der Länge umfasst, verwendet, wobei ungefähr 5 bis ungefähr 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindungsstelle der Sequenz verändert werden.
Wie es demjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet bewusst sein wird, haben ortsgerichtete Mutagenesetechniken oft einen Phagenvektor verwendet, der sowohl in einer einzelsträngigen wie auch doppelsträngigen Form vorliegt. Typische Vektoren, die bei ortsgerichteter Mutagenese nützlich sind, beinhalten Vektoren, wie den M13 Phagen. Diese Phagen sind einfach kommerziell erhältlich und ihre Verwendung ist allgemein denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden auch routinemäßig bei der ortsgerichteten Mutagenese, die den Schritt des Transfers des Gens von Interesse von einem Plasmid auf einen Phagen eliminiert, verwendet.
Im Allgemeinen wird die ortsgerichtete Mutagenese, die sich hiermit in Übereinstimmung befindet, durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten oder zwei Stränge eines doppelsträngigen Vektors, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz, die das erwünschte Peptid codiert, beinhaltet, außereinander geschmolzen werden. Ein Oligonucleotidprimer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, im Allgemeinen synthetisch. Dieser Primer wird dann mit dem einsträngigen Vektor verbunden und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie E. coli-Polymerase I Klenow Fragment, ausgesetzt, um die Synthese des Mutations-tragenden Stranges zu vervollständigen. So wird ein Hetero-Doppelstrang gebildet, worin ein Strang die ursprüngliche nicht mutierte Sequenz codiert und der zweite Strang die erwünschte Mutation trägt. Dieser Hetero-Doppelstrang-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen, wie E. coli-Zellen, zu transformieren und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren beinhalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Die Herstellung von Sequenzvarianten der selektiertes Peptid-codierenden DNA-Segmente unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese stellt ein Mittel zur Herstellung von potentiell nützlichen Arten dar und soll nicht limitierend gemeint sein, da es andere Wege gibt, auf denen Sequenzvarianten von Peptiden und der DNA-Sequenzen, die sie codieren, erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, die die erwünschte Peptidsequenz codieren, mit mutagenen Wirkstoffen, wie Hydroxylamin, behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten. Spezifische Details bezüglich dieser Verfahren und Protokolle werden in den Lehren von Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop und Bajpai, 1991; Kuby, 1994; und Maniatis et al., 1982, gefunden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Oligonucleotid gerichtetes Mutageneseverfahren" auf Matrizen-abhängige Prozesse und Vektor-vermittelte Vermehrung, die zu einer Steigerung in der Konzentration eines spezifischen Nucleinsäuremoleküls relativ zu seiner anfänglichen Konzentration oder zu einer Steigerung in der Konzentration eines nachweisbaren Signals, wie Amplifikation, führen. Wie hier verwendet, soll der Begriff „Oligonucleotid gerichtetes Mutageneseverfahren" sich auf einen Prozess beziehen, der die matrizenabhängige Extension eines Primermoleküls involviert. Der Begriff matrizenabhängiger Prozess bezieht sich auf Nucleinsäuresynthese eines RNA- oder DNA-Moleküls, worin die Sequenz des neu synthetisierten Stranges von Nucleinsäure durch die gut bekannten Regeln der komplementären Basenpaarung diktiert wird (siehe z. B. Watson, 1987). Typischerweise involvieren Vektor-vermittelte Methodiken die Einführung des Nucleinsäurefragments in einen DNA- oder RNA-Vektor, die klonale Amplifikation des Vektors und die Gewinnung des amplizierten Nucleinsäurefragments. Beispiele für solche Methodiken werden durch U.S. Patent Nr. 4,237,224 bereitgestellt.
Polynucleotid-Amplifikationstechniken
Eine Anzahl von Matrizen-abhängigen Prozessen sind erhältlich, um die Zielsequenzen von Interesse, die in einer Probe vorliegen, zu amplifizieren. Eines der am Besten bekannten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR^TM), die detailliert in den U.S. Patenten Nr. 4,683,195 , 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben wird. Kurz gefasst werden bei der PCR^TM zwei Primersequenzen hergestellt, die komplementär zu Regionen auf gegenüberliegenden komplementären Strängen der Zielsequenz sind. Es wird ein Überschuss an Desoxynucleotidtriphosphaten zu der Reaktionsmischung zusammen mit einer DNA-Polymerase (z. B. Taq-Polymerase) zugegeben. Wenn die Zielsequenz in einer Probe vorliegt, werden die Primer an das Ziel binden, und die Polymerase wird die Primer dazu veranlassen, entlang der Zielsequenz durch Addition von Nucleotiden verlängert zu werden. Durch Erhöhung und Senkung der Temperatur der Reaktionsmischung werden die verlängerten Primer von dem Ziel dissoziiert, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssige Primer werden an das Ziel und an das Reaktionsprodukt binden und der Prozess wird wiederholt. Vorzugsweise wird Reverse Transkription und PCR^TM-Amplifikations-Verfahren durchgeführt, um die Menge an mRNA, die amplifiziert wurde, zu quantifizieren. Polymerase-Kettenreaktions-Methodiken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Ein anderes Verfahren für die Amplifikation ist die Ligase-Kettenreaktion (bezeichnet als LCR), offenbart in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 320,308 . Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt und in der Gegenwart der Zielsequenz wird jedes Paar an die gegenüberliegenden komplementären Stränge des Ziel binden, so dass sie aneinander stoßen. In der Gegenwart eine Ligase werden die zwei Sondenpaare sich verbinden, um eine einzelne Einheit zu bilden. Durch Temperaturzyklen, wie in PCR^TM, dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen als „Zielsequenzen" für die Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. U.S. Patent Nr. 4,883,750 beschreibt ein alternatives Verfahren der Amplifikation für die Bindung von Sondenpaaren an eine Zielsequenz, die der LCR ähnlich ist.
Qbeta-Replikase, beschrieben in PCT Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. PCT/US87/00880 kann als noch ein anderes Amplifikationsverfahren bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative Sequenz von RNA, die eine Region aufweist, die zu der eines Ziels komplementär ist, zu einer Probe in der Gegenwart einer RNA-Polymerase zugegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, die dann nachgewiesen werden kann.
Ein isothermales Amplifikationsverfahren, bei dem Restriktionsendonucleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen, die Nucleotid 5'[α-thio]Triphosphate in einem Strang eines Restriktionsortes (Walker et al., 1992) enthalten, zu erreichen, kann auch bei der Amplifikation von Nucleinsäuren nützlich sein.
Strand Displacement Amplification (SDA) ist ein anderes Verfahren der Durchführung von isothermaler Amplifikation von Nucleinsäuren, die multiple Runden von Strangverdrängung und Synthese, sprich Nick-Translation, involviert. Ein ähnliches Verfahren, genannt Reparatur-Kettenreaktion (RCR), ist ein anderes Verfahren der Amplifikation, das nützlich sein könnte, und es involviert Annealing von verschiedenen Sonden durch eine Region hindurch, auf die mit der Amplifikation gezielt wird, gefolgt von einer Reparaturreaktion, bei der nur zwei der vier Basen vorliegen. Die anderen zwei Basen können als biotinylierte Derivate zum einfachen Nachweis zugefügt werden. Ein ähnlicher Ansatz wird in SDA verwendet.
Sequenzen können auch unter Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR werden eine Sonde mit einer 3'- und einer 5'-Sequenz von Nicht-Ziel-DNA und eine innere oder „mittlere" Sequenz der Zielprotein-spezifischen RNA mit DNA hybridisiert, die in einer Probe vorliegt. Bei der Hybridisierung wird die Reaktion mit RNaseH behandelt und die Produkte der Sonde werden als unterschiedliche Produkte durch Erzeugung eines Signals, das nach dem Verdau freigesetzt wird, identifiziert. Die ursprüngliche Matrize wird mit einer anderen zu zyklierenden Sonde verbunden und die Reaktion wird wiederholt. So involviert CPR die Amplifikation eines Signals, das durch Hybridisierung einer Sonde mit einer Zielgen-spezifischen exprimierten Nucleinsäure erzeugt wird.
Noch andere Amplifikationsverfahren, die in der Großbritannien Patent-Veröffentlichungs-Nr. 2 202 328 und in PCT Internationale Patentanmeldungs-Veröffentlichungs-Nr. PCT/US89/01025 beschrieben werden, können verwendet werden. Bei der ersteren Anmeldung werden „modifizierte" Primer in einer PCR-ähnlichen, Matrizen- und Enzym-abhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch Markierung mit einem Capture-Rest (z. B. Biotin) und/oder einen Nachweisrest (z. B. Enzym) modifiziert werden. Bei der letzteren Anmeldung wird ein Überschuss an markierten Sonden zu einer Probe zugegeben. In der Gegenwart der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt, um durch einen Überschuss Sonde gebunden zu werden. Die Spaltung der markierten Sonde signalisiert die Gegenwart der Zielsequenz.
Andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren beinhalten Transkriptions-basierte Amplifikationssysteme (TAS) (Kwoh et al., 1989; PCT Internationale Patent-Veröffentlichungs-Nr. WO 88/10315 ), einschließlich Nucleinsäuresequenz-basierter Amplifikation (NASBA) und 3SR. Bei der NASBA können die Nucleinsäuren für die Amplifikation durch Standard- Phenol/Chloroform-Extraktion, Hitzedenaturierung einer Probe, Behandlung mit Lysepuffer und Minisein-Säulen für die Isolierung von DNA und RNA oder Guanidinum-Chloridextraktion von RNA hergestellt werden. Diese Amplifikationstechniken involvieren Annealing eines Primers, der Sequenzen aufweist, die für die Zielsequenz spezifisch sind. Nach der Polymerisation werden DNA/RNA-Hybride mit RNaseH verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle erneut Hitze-denaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA durch Zugabe von sekundärem, zielspezifischem Primer, gefolgt von Polymerisation vollständig doppelsträngig gemacht. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann multipel durch eine Polyermase, wie T7 oder SP6, transkribiert. Bei einer isothermalen zyklischen Reaktion werden die RNAs revers zur DNA transkribiert und erneut mit einer Polymerase, wie T7 oder SP6 transkribiert. Die resultierenden Produkte, ob gekürzt oder vollständig, weisen auf zielspezifische Sequenzen hin.
Die Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nummer 329,822 offenbart einen Nucleinsäure-Amplifikationsprozess, der die zyklische Synthetisierung von Einzelstrang-RNA („ssRNA"), ssDNA und doppelsträngiger DNA (dsDNA) involviert, der verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine erste Matrize für ein erstes Primer-Oligonucleotid, das durch reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann von dem resultierenden DNA:RNA-Doppelstrang durch die Wirkung von Ribonuclease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Doppelstrang mit entweder DNA oder RNA spezifisch ist) entfernt. Die resultierende ssDNA ist eine zweite Matrize für einen zweiten Primer, die auch die Sequenzen eines RNA-Polymerasepromotors (veranschaulicht durch T7-RNA-Polymerase) 5' zu seiner Homologie zu seiner Matrize beinhaltet. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase (veranschaulicht durch das große „Klenow"-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I) verlängert, was zu einem doppelsträngigen DNA(„dsDNA")-Molekül führt, welches eine Sequenz, die identisch zu derjenigen der ursprünglichen RNA ist, zwischen den Primern und zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann durch die passende RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann erneut in den Zyklus eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifikation führt. Bei geeigneter Auswahl von Enzymen kann diese Amplifikation isothermal ohne Zugabe von Enzymen bei jedem Zyklus durchgeführt werden. Wegen der zyklischen Natur dieses Prozesses kann die Ausgangssequenz so ausgewählt werden, dass sie in der Form von entweder DNA oder RNA vorliegt.
PCT Internationale Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nummer WO 89/06700 offenbart ein Nucleinsäuresequenz-Amplifikations-Schema, basierend auf der Hybridisierung einer Promotor-/Primer-Sequenz mit einer Ziel-Einzelstrang-DNA („ssDNA"), gefolgt von der Transkription von vielen RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch; sprich neue Matrizen werden nicht aus den resultierenden RNA-Transkripten hergestellt. Andere Amplifikationsverfahren beinhalten „RACE" (Frohman, 1990) und „einseitige PCR” (Ohara, 1989), die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Verfahren, die auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonucleotiden in der Gegenwart von Nucleinsäure mit der Sequenz des resultierenden „Di-Oligonucleotids" basieren, wodurch das Di-Oligonucleotid amplifiziert wird (Wu und Dean, 1996), können auch bei der Amplifikation von DNA-Sequenzen verwendet werden.
Biologisch funktionelle Äquivalente
Modifikation und Änderungen können in der Struktur der Polynucleotide und Polypeptide durchgeführt werden und man kann dennoch ein funktionelles Molekül erhalten, das ein Polypeptid mit erwünschten Eigenschaften codiert. Wie oben erwähnt, ist es oft erwünscht, ein oder mehrere Mutationen in eine spezifische Polynucleotidsequenz einzuführen. Unter bestimmten Umständen wird die resultierende codierte Polypeptidsequenz durch diese Mutation verändert oder in anderen Fällen bleibt die Sequenz des Polypeptids durch ein oder mehrere Mutationen in dem codierenden Polynucleotid unverändert.
Wenn es erwünscht ist, die Aminosäuresequenz eines Polypeptids zu verändern, um ein Äquivalent oder sogar ein verbessertes, zweite Generationsmolekül zu erzeugen, können die Aminosäureänderungen durch Änderung von einem oder mehreren der Codons der codierenden DNA-Sequenz gemäß der Tabelle 1 erreicht werden.
Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur substituiert werden, ohne dass ein merklicher Verlust an interaktiver Bindungskapazität mit Strukturen, wie zum Beispiel Antigen-Bindungsregionen von Antikörpern oder Bindungsorten auf Substratmolekülen auftritt. Da es die interaktive Kapazität und Natur eines Proteins ist, die die biologische funktionelle Aktivität des Proteins definieren, können bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen in einer Proteinsequenz und natürlich ihrer zugrunde liegenden DNA-Codierungssequenz durchgeführt werden, und man erhält dennoch ein Protein mit ähnlichen Eigenschaften. Es wird daher durch die Erfinder überlegt, dass verschiedene Änderungen in den Peptidsequenzen der offenbarten Zusammensetzungen oder korrespondierenden DNA-Sequenzen, die die Peptide codieren, durchgeführt werden können, ohne dass ein merklicher Verlust in ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität auftritt. Tabelle 1
Wenn man solche Änderungen durchführt, muss der hydropathische Index von Aminosäuren berücksichtigt werden. Die Wichtigkeit des hydropathischen Aminosäureindex bei der Verleihung von interaktiver biologischer Funktion an ein Protein wird allgemein auf dem Fachgebiet verstanden (Kyte und Doolittle, 1982). Es ist akzeptiert, dass der relative hydropathische Charakter der Aminosäure zu der sekundären Struktur des resultierenden Proteins beiträgt, was wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, z. B. Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und dergleichen definiert. Jede Aminosäure wurde auf der Basis ihrer Hydrophobien und Ladungscharakteristiken ein hydropathischer Index zugeschrieben (Kyte und Doolittle, 1982). Diese Werte sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit einem ähnlichen hydropathischen Index oder Score substituiert werden können und dennoch zu einem Protein mit einer ähnlichen biologischen Aktivität führen, sprich man erhält dennoch ein biologisch funktionell äquivalentes Protein. Bei der Durchführung solcher Änderungen ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, diejenigen innerhalb von ±1 werden besonders bevorzugt und diejenigen innerhalb +0,5 werden sogar noch mehr speziell bevorzugt. Es wird auf dem Fachgebiet auch verstanden, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis von Hydrophilie durchgeführt werden kann. U.S. Patent 4,554,101 stellt fest, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren bestimmt wird, mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins korreliert.
Wie in U.S. Patent 4,554,101 ausführlich dargestellt wird, wurden die folgenden Hydrophilie-Werte den Aminosäureresten zugewiesen: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 +1); Glutamat (+3,0 ±1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–04); Prolin (–0,5 ±1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4). Es wird verstanden, dass eine Aminosäure durch eine andere mit ähnlichen Hydrophiliewert substituiert werden kann und man dennoch ein biologisches Äquivalent, und insbesondere ein immunologisch äquivalentes Protein erhält. Bei solchen Änderungen wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophiliewerte innerhalb von +2 liegen, bevorzugt, diejenigen innerhalb von ±1 werden besonders bevorzugt und diejenigen innerhalb von ±0,5 werden noch mehr besonders bevorzugt.
Wie unten umrissen wird, basiert man daher Aminosäuresubstitutionen allgemein auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenketten-Substituenten, z. B. ihre Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und dergleichen. Beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der vorangehenden Charakteristiken berücksichtigen, sind denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt und beinhalten: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin und Valin, Leucin und Isoleucin.
Zusätzlich kann jedes Polynucleotid weiter modifiziert werden, um die Stabilität in vivo zu steigern. Mögliche Modifikationen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf die Addition von Flankierungssequenzen an den 5'- und/oder 3'-Enden; die Verwendung von Phosphorothioat oder 2' O-Methyl anstelle von Phosphodiesterase-Verbindungen in dem Gerüst und/oder den Einschluss von nicht traditionellen Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin, wie auch Acetyl-Methyl-, Thio- und andere modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin.
In vivo-Polynucleotid-Abgabetechniken
Genetische Konstrukte, die ein oder mehrere der Polynucleotide umfassen, werden in Zellen in vivo eingeführt. Dies kann unter Verwendung von irgendeinem einer Vielzahl von gut bekannten Ansätzen erreicht werden, von denen mehrere unten zu dem Zweck der Veranschaulichung umrissen werden.
1. Adenovirus
Eines der bevorzugten Verfahren für die in vivo-Abgabe von ein oder mehr Nucleinsäuresequenzen involviert die Verwendung eines Adenovirus-Expressionsvektors. „Adenovirus-Expressionsvektor" soll bedeuten, dass diejenigen Konstrukte mit eingeschlossen sind, die genug Adenovirus-Sequenzen enthalten, um (a) das Packen des Konstruktes zu unterstützen und (b) ein Polynucleotid zu exprimieren, das darin in einer Sinn- oder Gegensinn-Orientierung geklont wurde. In dem Zusammenhang mit einem Gegensinn-Konstrukt erfordert die Expression natürlich nicht, dass das Genprodukt synthetisiert wird.
Der Expressionsvektor umfasst eine gentechnisch behandelte Form eines Adenovirus. Das Wissen um die genetische Organisierung von Adenovirus, eines 36 kb, linearen, doppelsträngigen DNA-Virus, erlaubt die Substitution von großen Stücken von adenoviraler DNA durch fremde Sequenzen bis zu 7 kb (Grunhaus und Horwitz, 1992). Im Gegensatz zu Retrovirus führt die adenovirale Infektion von Wirtszellen nicht zu einer chromosomalen Integration, da die adenovirale DNA auf eine episomale Weise ohne mögliche Genotoxizität replizieren kann. Auch sind Adenoviren strukturell stabil und keine Genomumordnung wurde nach extensiver Amplifikation nachgewiesen. Adenovirus kann nahezu alle Epithelialzellen unabhängig von ihrem Zellzyklus-Stadium infizieren. Soweit scheint adenovirale Infektion nur mit milder Erkrankung, wie akuter Atemwegserkrankung beim Menschen, verbunden zu sein.
Adenovirus ist besonders für die Verwendung als ein Gentransfer-Vektor wegen seines mittelgroßen Genoms, der Leichtigkeit der Manipulation, dem hohen Titer, dem breiten Zielzellbereich und der hohen Infektiosität geeignet. Beide Enden des Virusgenoms enthalten 100–200 Baenpaar-invertierte Wiederholungen (ITRs), die cis-Elemente sind, die für die virale DNA-Replikation und Packung notwendig sind. Die frühen (E) und späten (L)-Regionen des Genoms enthalten verschiedene Transkriptionseinheiten, die durch den Beginn der viralen DNA-Replikation getrennt werden. Die E1-Region (E1A und E1B) codiert Proteine, die für die Regulierung der Transkription des Virusgenoms und einiger zellulärer Gene verantwortlich sind. Die Expression der E2-Region (E2A und E2B) führt zu der Synthese der Proteine für die virale DNA-Replikation. Diese Proteine sind in die DNA-Replikation, späte Gen-Expression und den Wirtszell-Shut-off involviert (Renan, 1990). Die Produkte der späten Gene, einschließlich der Mehrheit der viralen Capsidproteine, werden nur nach signifikanter Verarbeitung eines einzelnen primären Transkriptes, das von dem hauptsächlichen späten Promotor (MLP) stammt, exprimiert. Der MLP (lokalisiert bei 16.8 m. u.) ist während der späten Phase der Infektion besonders effizient und alle mRNAs, die von diesem Promotor stammen, besitzen eine 5' dreiteilige Leader(TPL)-Sequenz, welche sie zu bevorzugten mRNAs für die Translation macht.
In einem laufenden System wird rekombinanter Adenovirus aus homologer Rekombination zwischen Shuttle-Vektor und Provirus-Vektor erzeugt. Aufgrund der möglichen Rekombination zwischen zwei proviralen Vektoren, kann Wildtyp-Adenovirus aus diesem Prozess erzeugt werden. Es ist daher wichtig, einen einzelnen Klon von Virus aus einem individuellen Plaque zu isolieren und seine Genomstruktur zu untersuchen.
Die Erzeugung und Vermehrung der aktuellen Adenovirus-Vektoren, die Replikations-defizient sind, hängen von einer einzelnen Helfer-Zelllinie, bezeichnet 293, ab, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellen durch Ad5-DNA-Fragmente transformiert wurde und konstitutiv E1-Proteine exprimiert (Graham et al., 1977). Da die E3-Region für das Adenovirus-Genom entbehrlich ist (Jones und Shenk, 1978), tragen die aktuellen Adenovirus-Vektoren mit der Hilfe von 293-Zellen fremde DNA entweder in die E1, die D3 oder beide Regionen (Graham und Prevec, 1991). In der Natur kann Adenovirus ungefähr 105% des Wildtyp-Genoms packen (Ghosh-Choudhury et al., 1987), wobei Kapazität für ungefähr 2 extra kb DNA bereitgestellt wird. Verbunden mit den ungefähr 5,5 kb DNA, die in den E1- und E3-Regionen ersetzbar sind, liegt die maximale Kapazität des aktuellen Adenovirus-Vektors unter 7,5 kb oder bei ungefähr 15% der gesamten Länge des Vektors. Mehr als 80% des Adenovirus viralen Genoms verbleibt in dem Vektorgerüst und ist die Quelle der vektorbedingten Cytotoxizität. Auch ist die Replikationsdefizienz des E1 deletierten Virus inkomplett. Zum Beispiel wurde ein Verlust an viraler Genexpression bei den aktuell erhältlichen Vektoren bei hohen Mengen an Infektion (MOI) beobachtet (Mulligan, 1993).
Helfer-Zelllinien können von menschlichen Zellen, wie menschlichen embryonalen Nierenzellen, Muskelzellen, hämatopoetischen Zellen oder anderen menschlichen embryonalen, mesenchymalen oder epithelialen Zellen stammen. Alternativ können die Helferzellen von den Zellen anderer Säugerarten stammen, die menschliches Adenovirus zulassen. Solche Zellen beinhalten z. B. Verozellen oder andere Affenembryonalen, mesenchymalen oder epithelialen Zellen. Wie oben angegeben wurde, ist die aktuell bevorzugte Helfer-Zelllinie 293.
Kürzlich offenbarte Racher et al. (1995) verbesserte Verfahren für die Kultivierung von 293 Zellen und die Vermehrung von Adenovirus. In einem Format werden natürliche Zell-Aggregate durch Impfung von individuellen Zellen in 1 Liter silikonisierte Spinner-Flasks (rechne, Cambridge, UK), die 100–200 ml Medium enthalten, gezüchtet. Nach Rühren mit 40 UpM wird die Zell-Lebensfähigkeit mit Tryptanblau geschätzt. In einem anderen Format werden Fibra-Cel-Mikroträger (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) wie folgt verwendet. Ein Zell-Inokulat, in 5 ml Medium resuspendiert, wird zu dem Träger (50 ml) in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben zugegeben und mit gelegentlicher Bewegung für 1 bis 4 Stunden stehen gelassen. Das Medium wird dann durch 50 ml frisches Medium ersetzt und Schütteln begonnen. Für die Virusproduktion lässt man Zellen bis zu ungefähr 8%iger Konfluenz wachsen, nach dieser Zeit wird das Medium ersetzt (auf 25% des endgültigen Volumens) und Adenovirus mit einer MOI von 0,05 zugegeben. Die Kulturen werden über Nacht stehen gelassen, wonach das Volumen auf 100% gesteigert und Schütteln für 72 Stunden wiederaufgenommen wird.
Abgesehen von der Anforderung, dass der Adenovirus-Vektor replikationsdefizient, oder zumindest bedingt defizient sein soll, glaubt man nicht, dass die Natur des Adenovirus-Vektors für die erfolgreiche Ausübung der Erfindung essentiell ist. Das Adenovirus kann irgendeiner der 42 verschiedenen bekannten Serotypen oder Untergruppen A–F sein. Adenovirus Typ 5 der Untergruppe C ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um einen bedingt replikationsdefizienten Adenovirus-Vektor für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zu erhalten, da Adenovirus Typ 5 ein menschliches Adenovirus ist, über das eine große Menge an biochemischer und genetischer Information bekannt ist und es wurde historisch für die meisten Konstruktionen, die Adenovirus als einen Vektor verwenden, verwendet.
Wie oben angegeben wurde, ist der typische Vektor replikationsdefizient und wird keine Adenovirus-E1-Region aufweisen. So wird es am bequemsten sein, das Polynucleotid, das das Gen von Interesse kodiert, an der Position einzuführen, von der die D1-codierenden Sequenzen entfernt wurden. Die Position der Insertion des Konstruktes innerhalb der Adenovirus-Sequenzen ist jedoch für die Erfindung nicht entscheidend. Das Polynucleotid, das das Gen von Interesse codiert, kann auch anstelle der deletierten E3-Region in E3-Ersatzvektoren inseriert werden, wie durch Karlsson et al. (1986) beschrieben wird, oder in der E4-Region, wo eine Helfer-Zelllinie oder Helfervirus den E4-Defekt ergänzt.
Adenovirus ist einfach zu züchten und zu manipulieren und zeigt in vitro und in vivo eine große Wirtsbandbreite. Diese Gruppe von Viren kann in hohen Titern, z. B. 10⁹–10¹¹ Plaque bildenden Einheiten pro ml erhalten werden, und sie sind hoch infektiös. Der Lebenslauf des Adenovirus macht nicht die Integration in das Wirtszellgenom erforderlich. Die fremden Gene, die von den Adenovirus-Vektoren geliefert werden, sind episomal und weisen daher eine niedrige Genotoxizität gegenüber Wirtszellen auf. Es wurde über keine Nebenwirkungen in Studien der Impfung mit Wildtyp-Adenovirus berichtet (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), was ihre Sicherheit und ihr therapeutisches Potential als in vivo-Gentransfer-Vektoren zeigt.
Adenovirus-Vektoren wurden in eukaryoter Genexpression (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) und Impfstoffentwicklung (Grunhaus und Horwitz, 1992; Graham und Prevec, 1992) verwendet. Kürzlich legten Tierstudien nahe, dass rekombinantes Adenovirus für die Gentherapie verwendet werden können (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Studien zur Verabreichung von rekombinantem Adenovirus an verschiedene Gewebe beinhalten Trachea-Instillierung (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), Muskelinjektion (Ragot et al., 1993), periphere intravenöse Injektion (Herz und Gerard, 1993) und sterntaktische Impfung in das Gehirn (Le Gal La Salle et al., 1993).
2. Retroviren
Die Retroviren sind eine Gruppe von einsträngigen RNA-Viren, die durch ihre Fähigkeit charakterisiert werden, ihre RNA zu doppelsträngiger DNA in infizierten Zellen durch einen Prozess der reversen Transkription zu konvertieren (Coffin, 1990). Die resultierende DNA integriert sich dann stabil in zelluläre Chromosome als ein Provirus und lenkt die Synthese von viralen Proteinen. Die Integration führt zu der Retention der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene, gag, pol und env, die die Capsidproteine, Polymeraseenzym bzw. Hüllkomponenten codieren. Eine Sequenz, die stromaufwärts von dem gag-Gen gefunden wird, enthält ein Signal für die Verpackung des Genoms in Virione. Zwei lange terminale Wiederholungs(LTR)-Sequenzen liegen an den 5'- und 3'-Enden des viralen Genoms vor. Diese enthalten starke Promotor- und Verstärkersequenzen und sie sind auch für die Integration in das Wirtszellgenom erforderlich (Coffin, 1990).
Um einen retroviralen Vektor herzustellen, wird eine Nucleinsäure, die ein oder mehrere Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen von Interesse codiert, in das virale Genom anstelle von bestimmten viralen Sequenzen inseriert, um ein Virus herzustellen, das replikationsdefizient ist. Um Virione herzustellen, wird eine Verpackungs-Zelllinie, die die gag-, pol- und env-Gene enthält, aber ohne die LTR und Verpackungskomponenten, konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine cDNA zusammen mit den retroviralen LTR und Verpackungssequenzen enthält, in diese Zelllinie (z. B. durch Calciumphosphatpräzipitation) eingeführt wird, ermöglicht es die Verpackungssequenz dem RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in viralen Partikel verpackt zu werden, die dann in das Kulturmedium sezerniert werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann gesammelt, optional konzentriert und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine große Bandbreite an Zelltypen zu infizieren. Die Integration und stabile Expression erfordert jedoch die Teilung von Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Ein neuer Ansatz, entwickelt um spezifische Zielrichtung von Retrovirus-Vektoren zu ermöglichen, wurde kürzlich basierend auf der chemischen Modifikation eines Retrovirus durch die chemische Addition von Lactoseresten zu der viralen Hülle entwickelt. Diese Modifikation könnte die spezifische Infektion von Hepatozyten über Sialoglycoproteinrezeptoren erlauben.
Ein unterschiedlicher Ansatz für die Zielrichtung von rekombinanten Retroviren wurde entwickelt, bei dem biotinylierte Antikörper gegen retrovirales Hüllprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet wurden. Die Antikörper wurden über die Biotinkomponenten unter Verwendung von Streptavidin (Roux et al., 1989) gekoppelt. Unter Verwendung von Antikörpern gegen Haupt-Histokompatibilitätskomplexe-Klasse-I- und Klasse-II-Antigene zeigten sie die Infektion einer Vielzahl von menschlichen Zellen, die diese Oberflächen-Antigene mit einem ecotropen Virus in vitro trugen (Roux et al., 1989).
3. Adeno-assoziierte Viren
AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat und Muzycska, 1984) ist ein Parovirus, entdeckt als eine Kontamination von adenoviralen Vorräten. Es ist ein ubiquitäres Virus (Antikörper liegen in 85% der menschlichen U.S.-Bevölkerung vor), das nicht mit irgendeiner Erkrankung in Verbindung gebracht wurde. Es wird auch als ein Dependovirus klassifiziert, da seine Replikation von der Gegenwart eines Helfervirus, wie eines Adenovirus, abhängig ist. Es wurden fünf Serotypen isoliert, von denen AAV-2 der am besten Charakterisierte ist. AAV besitzt eine einsträngige lineare DNA, die in Capsidproteine VP1, VP2 und VP3 eingekapselt ist, um ein icosahedrales Virion von 20 bis 24 nm im Durchmesser zu bilden (Muzyczka und McLaughlin, 1988).
Die AAV-DNA ist ungefähr 4,7 Kilobasen lang. Sie enthält zwei offene Leserahmen und wird durch zwei ITRs flankiert. Es gibt zwei Hauptgene in dem AAV-Genom: rep und cap. Das rep-Gen codiert Proteine, die für die viralen Replikationen verantwortlich sind, währen cap Capsidprotein VP 1–3 kodiert. Jedes ITR bildet eine T-förmige Haarnadelstruktur. Diese terminalen Wiederholungen sind die einzigen essentiellen cis-Komponenten des AAV für chromosomale Integration. Daher kann der AAV als ein Vektor verwendet werden, wenn alle viralen Codierungssequenzen entfernt und durch die Kassette von Genen für die Abgabe ersetzt wurden. Es wurden drei virale Promotoren identifiziert und p5, p19 und p40, gemäß ihrer Kartenposition genannt. Die Transkription von p5 und p19 führt zu der Produktion von rep-Proteinen und die Transkription von p40 stellt die Capsidproteine her (Hermonat und Muzyczka, 1984).
Es gibt verschiedene Faktoren, die Forscher dazu veranlassten, die Möglichkeit der Verwendung von rAAV als ein Expressionsvektor zu studieren, eine davon ist, dass die Erfordernisse für die Abgabe eines Gens, um in das Wirtschromosom integriert zu werden, erstaunlich gering sind. Es ist notwendig, die 145 bp ITRs zu haben, die nur 6% des AAV-Genoms ausmachen. Dies lässt Raum in dem Vektor, um eine 4,5 kb DNA-Insertion zusammenzufügen. Während diese Tragekapazität das AAV davon abhalten kann, große Gene abzugeben, ist sie reichlich für die Abgabe der Gegensinn-Konstrukte geeignet.
AAV ist auch eine gute Wahl als Abgabevehikel aufgrund seiner Sicherheit. Es gibt einen relativ komplizierten Rettungsmechanismus: nicht nur vom Wildtyp-Adenovirus, sondern auch von AAV-Genen wird gefordert, dass sie rAAV mobilisieren. Entsprechend ist AAV nicht pathogen und nicht mit irgendeiner Erkrankung assoziiert. Die Entfernung von viralen Codierungssequenzen minimiert Immunreaktionen gegen virale Genexpression und daher ruft rAAV keine inflammatorische Reaktion hervor.
4. Andere virale Vektoren als Expressionskonstrukte
Andere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Erfindung für die Abgabe von Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen an eine Wirtszelle verwendet werden. Vektoren, die von Viren wie dem Vaccinia-Virus (Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988), Lentiviren, Polioviren und Herpesviren stammen, können verwendet werden. Sie bieten verschiedene attraktive Merkmale für verschiedene Säugerzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Mit der kürzlichen Erkennung von defizienten Hepatitis B-Viren wurde neue Einsicht in das Struktur-Funktionsverhältnis von verschiedenen viralen Sequenzen gewonnen. In vitro-Studien zeigten, dass das Virus die Fähigkeit zur Helfer-abhängigen Verpackung und reversen Transkription trotz der Deletion von bis zu 80% seines Genoms behielt (Horwich et al., 1990). Dies legte nahe, dass große Teile des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnten. Der Hepatotropismus und die Persistenz (Integration) waren besonders attraktive Eigenschaften für auf die Leber gerichteten Gentransfer. Chang et al. (1991) führte das Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)-Gen in Enten-Hepatitis B-Virusgenom anstelle der Polymerase-, Oberflächen-, und Präoberflächen-Codierungssequenzen ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in einer Geflügelhepatom-Zelllinie cotransfiziert. Es wurden Kulturmedien, die hohe Titer des rekombinanten Virus enthielten, verwendet, um primäre Entenküken-Hepatocyten zu infizieren. Stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach der Transfektion nachgewiesen (Chang et al., 1991).
5. Nicht-virale Vektoren
Um die Expression von Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen hervorzurufen, muss das Expressionskonstrukt in eine Zelle abgegeben werden. Diese Abgabe kann in vitro erreicht werden, wie in Laborverfahren für die Transformierung von Zelllinien, oder in vivo oder ex vivo, wie bei der Behandlung von bestimmten Erkrankungszuständen. Wie oben beschrieben wurde, ist ein bevorzugter Mechanismus für die Abgabe über virale Infektion, wo das Expressionskonstrukt in einen infektiösen viralen Partikel verkapselt wird.
Nachdem das Expressionskonstrukt einmal in die Zelle abgegeben wurde, kann die Nucleinsäure, die die erwünschten Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen codiert, positioniert und an verschiedenen Orten exprimiert werden. Die Nucleinsäure, die das Konstrukt codiert, kann stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann an dem spezifischen Ort und der spezifischen Orientierung über homologe Rekombination (Genersatz) erfolgen oder es kann in einer zufälligen, unspezifischen Lokalisierung integriert werden (Genzuwachs). Die Nucleinsäure kann in der Zelle als ein getrenntes, episomales Segment von DNA stabil erhalten werden. Solche Nucleinsäuresegmente oder „Episome" codieren ausreichend Sequenzen, um den Erhalt und die Replikation unabhängig von oder in Synchronisierung mit dem Wirtszellzyklus zu erlauben. Wie das Expressionskonstrukt an einer Zelle abgegeben wird und wo in der Zelle die Nucleinsäure verbleibt, hängt von dem Typ des Expressionskonstruktes, das verwendet wird, ab.
Das Expressionskonstrukt, das ein oder mehrere Oligonucleotid- oder Polynucleotidsequenzen umfasst, kann einfach aus nackter rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstruktes kann durch irgendeines der Verfahren, die oben erwähnt wurden, die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchlässig machen, durchgeführt werden. Dies ist besonders anwendbar für den Transfer in vitro, aber kann für in vivo-Gebrauch ebenfalls angewendet werden. Dubensky et al. (1984) injizierten erfolgreich Polyomavirus-DNA in der Form von Calciumphosphat-Präzipitaten in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen, wobei die aktive virale Replikation und akute Infektion gezeigt wurde. Benvenisty und Reshef (1986) zeigten auch, dass direkte intraperitoneale Injektion von Calciumphosphat-präzipierten Plasmiden zu der Expression der transfizierten Gene führt. Man stellt sich vor, dass DNA, die ein Gen von Interesse codiert, auch auf eine ähnliche Weise in vivo transferiert werden und das Genprodukt exprimieren kann.
Ein anderes Verfahren des Transfers eines nackten DNA-Expressionskonstruktes in Zellen kann Partikelbeschuss involvieren. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, was es ihnen erlaubt, die Zellmembranen zu durchdringen und in die Zellen einzutreten, ohne sie zu töten (Klein et al., 1987). Es wurden verschiedene Geräte für die Beschleunigung kleiner Partikel entwickelt. Ein solches Gerät hängt von einer Hochspannungsentladung ab, um einen elektrischen Strom zu erzeugen, welcher wiederum die Motivkraft bereitstellt (Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen, wie Wolfram oder Goldkügelchen.
Ausgewählte Organe, einschließlich dem Leber-, Haut- und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen, wurden in vivo beschossen (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dies kann die operative Freilegung des Gewebes oder der Zellen erforderlich machen, um irgendwelches störende Gewebe zwischen der Kanone und dem Zielorgan zu eliminieren, sprich ex vivo-Behandlung. Wieder kann DNA, die ein bestimmtes Gen codiert, über dieses Verfahren abgegeben werden und dennoch inkorporiert werden.
Polypeptidzusammensetzungen und Verwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt in anderen Aspekten Polypeptidzusammensetzungen für die Verwendung bei der Diagnose, Behandlung oder Prävention von Chlamydiainfektion bereit. Allgemein wird ein Polypeptid ein isoliertes Polypeptid (oder ein Epitop, eine Variante oder ein aktiviertes Fragment davon) sein, das von einer Säugerart stammt. Entsprechend wird eine Polypeptidzusammensetzung der vorliegenden Erfindung so verstanden, dass sie ein oder mehrere Polypeptide umfasst, die in der Lage sind, Antikörper hervorzurufen, die immunologisch reaktiv mit einem Polypeptid sind, umfassend:

(i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist.

Wie hier verwendet, beinhaltet ein aktives Fragment eines Polypeptids die Gesamtheit oder einen Teil eines Polypeptids, das durch konventionelle Techniken, z. B. Mutagenese, oder durch Addition, Deletion oder Substition modifiziert wurde, wobei aber das aktive Fragment im Wesentlichen dieselbe Strukturfunktion, Antigenität etc. wie ein Polypeptid, das hier beschrieben wird, zeigt.
In bestimmten veranschaulichenden Ausführungsarten werden die Polypeptide von Nutzen in der Erfindung mindestens einen immunogenen Teil eines Chlamydiaproteins oder eine Variante davon umfassen, wie hier beschrieben wird. Proteine, die Chlamydia-Proteine sind, reagieren im Allgemeinen nachweisbar in einem Immunassay (wie einem ELISA) mit Antiseren von einem Patienten mit einer Chlamydiainfektion. Polypeptide, wie hier beschrieben wird, sind mindestens 15 Aminosäuren lang. Zusätzliche Sequenzen, die von dem nativen Protein stammen, und/oder heterologe Sequenzen können vorliegen und solche Sequenzen können (aber müssen nicht) weitere immunogene oder antigene Eigenschaften besitzen.
Ein „immunogener Anteil", wie er hier verwendet wird, ist ein Anteil eines Proteins, der durch einen B-Zell- und/oder T-Zell-Oberflächen-Antigenrezeptor erkannt wird (sprich spezifisch gebunden wird). Solche immunogenen Anteile umfassen vorzugsweise mindestens 20 Aminosäurereste eines Chlamydia-Proteins oder einer Variante davon. Bestimmte bevorzugte immunogene Anteile beinhalten Peptide, in denen eine N-terminale Leadersequenz und/oder Transmembrandomäne deletiert wurden. Andere bevorzugte immunogene Anteile können eine kleine N- und/oder C-terminale Deletion (z. B. 1–30 Aminosäuren, vorzugsweise 5–15 Aminosäuren), relativ zu dem reifen Protein enthalten.
Immunogene Anteile können allgemein unter Verwendung von gut bekannten Techniken, wie denjenigen, die in Paul, Fundamental Immunology, 3. Ausg., 243–247 (Rauen Press, 1993) und Quellenangaben, die darin zitiert werden, zusammengefasst werden, identifiziert werden. Solche Techniken beinhalten das Screening von Polypeptiden auf die Fähigkeit, mit einigen spezifischen Antikörpern, Antiseren und/oder T-Zelllinien oder Klonen zu reagieren. Wie hier verwendet, sind Antiseren und Antikörper „Antigen-spezifisch", wenn sie spezifisch an ein Antigen binden (sprich sie reagieren mit dem Protein in einem ELISA oder einem anderen Immunassay und sie reagieren nicht nachweisbar mit nicht verwandten Proteinen). Solche Antiseren und Antikörper können wie hier beschrieben und unter Verwendung von gut bekannten Techniken hergestellt werden. Ein immunogener Anteil eines nativen Chlamydia-Proteins ist ein Anteil, der mit solchen Antiseren und/oder T-Zellen mit einem Spiegel reagiert, der nicht wesentlich geringer ist als die Reaktivität des Polypeptids in vollständiger Länge (z. B. in einem ELISA und/oder T-Zell-Reaktivitäts-Assay). Solche immunogenen Anteile können mit solchen Assays mit einem Spiegel reagieren, der ähnlich oder größer ist als die Reaktivität des Polypeptids vollständiger Länge. Solche Screenings können im Allgemeinen unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, durchgeführt werden, so wie diejenigen, die in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, beschrieben werden. Zum Beispiel kann ein Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert und mit Patientenseren in Kontakt gebracht werden, um die Bindung von Antikörpern innerhalb der Seren an das immobilisierte Peptid zu ermöglichen. Ungebundene Seren können dann entfernt und gebundene Antikörper unter Verwendung von z. B. ¹²⁵I-markierten Protein A nachgewiesen werden.
Wie oben bemerkt wurde, kann eine Zusammensetzung eine Variante eines nativen Chlamydia-Proteins umfassen. Eine Polypeptid-„Variante", wie hier verwendet, ist ein Polypeptid, das sich von einem nativen Chlamydia-Protein in einer oder mehreren Substitutionen, Deletionen, Additionen und/oder Insertionen so unterscheidet, dass die Immunogenität des Polypeptids im Wesentlichen nicht verringert wird. In anderen Worten kann die Fähigkeit einer Variante, mit Antigen-spezifischen Antiseren zu reagieren, gesteigert oder unverändert relativ zu dem nativen Protein sein, oder sie kann um weniger als 50%, und vorzugsweise weniger als 20% relativ zu dem nativen Protein verringert sein. Solche Varianten können im Allgemeinen durch Modifizierung von einer der obigen Polypeptidsequenzen und Evaluierung der Reaktivität des modifizierten Polypeptids mit Antigenspezifischen Antikörpern oder Antiseren, wie hier beschrieben wird, identifiziert werden. Bevorzugte Varianten beinhalten diejenigen, in denen ein oder mehrere Anteile, wie eine N-terminale Leadersequenz oder Transmembrandomäne, entfernt wurden. Andere bevorzugte Varianten beinhalten Varianten, in denen ein kleiner Anteil (z. B. 1–30 Aminosäuren, vorzugsweise 5–15 Aminosäuren) von dem N- und/oder C-terminalen Ende des reifen Proteins entfernt wurde.
Polypeptidvarianten, die durch die vorliegende Erfindung mit eingeschlossen werden, beinhalten diejenigen, die mindestens 90%ige, 91%ige, 92%ige, 93%ige, 94%ige, 95%ige, 96%ige, 97%ige, 98%ige oder 99%ige oder mehr Identität (bestimmt wie oben beschrieben) zu der Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 der SEQ ID Nr. 139 zeigen.
Vorzugsweise enthält eine Variante konservative Substitutionen. Eine „konservative Substitution" ist eine, bei der eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure substituiert wird, die ähnliche Eigenschaften aufweist, so dass ein Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie erwarten wird, dass die sekundäre Struktur und die hydropathische Natur des Polypeptids im Wesentlichen unverändert bleibt. Aminosäuresubstitutionen können allgemein auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden. Zum Beispiel beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparagin- und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten beinhalten Leucin, Isoleucin und Valin; Glycin und Alanin; Asparagin und Glutamin und Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin. Andere Gruppen von Aminosäuren, die konservative Änderungen darstellen können, beinhalten: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ilc, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his. Eine Variante kann auch oder alternativ nicht konservative Änderungen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsart unterscheiden sich variante Polypeptide von einer nativen Sequenz durch Substition, Deletion oder Addition von fünf Aminosäuren oder weniger. Varianten können auch (oder alternativ) durch z. B. Deletion oder Addition von Aminosäuren, die minimalen Einfluss auf die Immunogenität, sekundäre Struktur und hydropathische Natur des Polypeptids aufweisen, modifiziert werden.
Wie oben angemerkt wurde, können Polypeptide eine Signal(oder Leader)-Sequenz an dem N-terminalen Ende des Proteins umfassen, die cotranslational oder posttranslational den Transfer des Proteins lenkt. Das Polypeptid kann auch mit einem Linker oder einer anderen Sequenz zur Erleichterung der Synthese, Reinigung oder Identifizierung des Polypeptids (z. B. Poly-His) oder um die Bindung des Polypeptids an einen festen Träger zu steigern, konjugiert sein. Zum Beispiel kann ein Polypeptid an eine Immunglobulin-Fc-Region konjugiert sein.
Polypeptide können unter Verwendung von irgendeiner einer Vielfalt von gut bekannten Techniken hergestellt werden. Rekombinante Polypeptide, die durch DNA-Sequenzen codiert werden, wie oben beschrieben wurde, können einfach aus den DNA-Sequenzen unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielfalt von Expressionsvektoren, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Die Expression kann in irgendeiner geeigneten Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül enthält, das ein rekombinantes Polypeptid codiert, transformiert oder transfiziert wurde, erreicht werden. Geeignete Wirtszellen beinhalten Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryote Zellen, wie Säugerzellen und Pflanzenzellen. Vorzugsweise sind die verwendeten Wirtszellen E. coli, Hefe oder eine Säugerzelllinie, wie COS oder CHO. Überstände von geeigneten Wirt-/Vektorsystemen, die rekombinantes Protein oder Polypeptid in die Kulturmedien sezernieren, können zuerst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Filters konzentriert werden. Nach der Konzentration kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix, wie eine Affinitätsmatrix oder ein Ionenaustauschharz, aufgebracht werden. Schließlich können ein oder mehrere Reverse-Phase HPLC-Schritte durchgeführt werden, um ein rekombinantes Polypeptid weiter zu reinigen.
Anteile und andere Varianten mit weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und im Allgemeinen weniger als ungefähr 50 Aminosäuren können auch durch synthetische Mittel, unter Verwendung von Techniken, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, erzeugt werden. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung von irgendeiner der kommerziell erhältlichen Festphasen-Techniken, wie dem Merrifield Festphasen-Syntheseverfahren, wo Aminosäuren sequentiell zu einer wachsenden Aminosäurekette zugegeben werden, synthetisiert werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2146, 1963. Die Ausrüstung für automatisierte Synthese von Polypeptiden ist kommerziell von Lieferanten wie Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) erhältlich und kann gemäß den Anweisungen des Herstellers bedient werden.
Innerhalb bestimmter spezifischer Ausführungsarten kann ein Polypeptid ein Fusionsprotein sein, das multiple Polypeptide umfasst, wie hier beschrieben wird, oder dass mindestens ein Polypeptid, wie hier beschrieben wird, und eine nicht verwandte Sequenz, wie ein bekanntes Chlamydia-Protein, umfasst. Ein Fusionspartner kann z. B. dabei helfen, T-Helfer-Epitope (einen immunologischen Fusionspartner) bereitzustellen, vorzugsweise T-Helfer-Epitope, die durch Menschen erkannt werden, oder kann dabei helfen, das Protein in höheren Erträgen als das native rekombinante Protein zu exprimieren (ein Expressionsverstärker). Bestimmte bevorzugte Fusionspartner sind sowohl immunologische wie auch Expressions-steigernde Fusionspartner. Andere Fusionspartner können so ausgewählt werden, dass sie die Löslichkeit des Proteins steigern oder es dem Protein ermöglichen, auf gewünschte intrazelluläre Kompartimente gerichtet zu werden. Noch weitere Fusionspartner beinhalten Affinitätsmarker, die die Reinigung des Proteins erleichtern.
Fusionsproteine können im Allgemeinen unter Verwendung von Standardtechniken, einschließlich chemischer Konjugation, hergestellt werden. Vorzugsweise wird ein Fusionsprotein als ein rekombinantes Protein exprimiert, was die Herstellung von gesteigerten Spiegeln relativ zu einem nicht fusionierten Protein in einem Expressionssystem ermöglicht. Kurz gefasst können DNA-Sequenzen, die die Polypeptidkomponenten codieren, getrennt zusammengefügt und in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Das 3'-Ende der DNA-Sequenz, die eine Polypeptidkomponente codiert, wird mit oder ohne einen Peptidlinker an das 5'-Ende einer DNA-Sequenz, die eine zweite Polypeptidkomponente codiert, ligiert, so dass die Leserahmen der Sequenzen sich in Phase befinden. Dies erlaubt die Translation in ein einziges Fusionsprotein, das die biologische Aktivität beider Bestandteil-Polypeptide behält.
Es kann eine Peptidlinker-Sequenz verwendet werden, um die erste und zweite Polypeptidkomponente durch eine Distanz zu trennen, die ausreicht, um sicherzustellen, dass sich jedes Polypeptid in seine sekundären und tertiären Strukturen faltet. Solch eine Peptidlinker-Sequenz wird in das Fusionsprotein unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, inkorporiert. Geeignete Peptidlinker-Sequenzen können basierend auf den folgenden Faktoren ausgewählt werden: (1) ihrer Fähigkeit, eine flexible ausgedehnte Konformation anzunehmen; (2) ihrer Fähigkeit, eine sekundäre Struktur anzunehmen, die mit funktionellen Epitopen auf den ersten und zweiten Polypeptiden in Wechselwirkung treten könnte, und (3) dem Mangel an hydrophoben oder geladenen Resten, die mit Polypeptid-funktionellen Epitopen reagieren könnten. Bevorzugte Peptidlinker-Sequenzen enthalten Gly-, Asn- und Ser-Reste. Andere fast neutrale Aminosäuren, wie Thr und Ala, können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die nützlich als Linker verwendet werden können, beinhalten diejenigen, die in Maratea et al., Gene 40: 39–46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Set USA 83: 8258–8262, 1986; U.S. Patent Nr. 4,935,233 und U.S. Patent Nr. 4,751,180 offenbart werden. Die Linkersequenz kann im Allgemeinen von 1 bis ungefähr 50 Aminosäuren lang sein. Linkersequenzen sind nicht erforderlich, wenn die ersten und zweiten Polypeptide nicht essentielle N-terminale Aminosäureregionen aufweisen, die verwendet werden können, um die funktionellen Domänen voneinander zu trennen und sterische Hinderung zu verhindern.
Die ligierten DNA-Sequenzen sind operabel mit transkriptionellen oder translationalen Regulationselementen verbunden. Die Regulationselemente, die für die Expression von DNA verantwortlich sind, sind nur 5' zu der DNA-Sequenz, die die ersten Polypeptide codiert, lokalisiert. Ähnlich sind Stopkodons, die erforderlich sind, um die Translation und Transkriptions-Terminations-Signale zu beenden, nur 3' zu der DNA-Sequenz, die das zweite Polypeptid codiert, vorhanden.
Es werden auch Zusammensetzungen, die Fusionsproteine umfassen, für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Solche Proteine umfassen ein Polypeptid, umfassend:

(i) Die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, wie durch den Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 bestimmt wird; oder
(ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; zusammen mit einem nicht verwandten immunogenen Protein. Vorzugsweise ist das immunogene Protein in der Lage, eine Gedächtnisreaktion hervorzurufen. Beispiele für solche Proteine beinhalten Tetanus, Tuberkulose und Hepatitis-Proteine (siehe z. B. Stoute et al., New Engl. J. Med., 336: 86–91, 1997).

In bevorzugten Ausführungsarten stammt ein immunologischer Fusionspartner von Protein D, einem Oberflächenprotein des Gram-negativen Bakteriums Haemophilus influenza B ( WO 91/18926 ). Vorzugsweise umfasst ein Protein-D-Derivat ungefähr das erste Drittel des Proteins (z. B. die ersten N-terminalen 100–110 Aminosäuren) und ein Protein-D-Derivat kann lipidiert sein. Innerhalb bestimmter bevorzugter Ausführungsarten werden die ersten 109 Reste eines Lipoprotein-D-Fusionspartners auf dem N-Terminus mit eingeschlossen, um das Polypeptid mit zusätzlichen exogenen T-Zell-Epitopen bereitzustellen und den Expressionsspiegel in E. coli zu steigern (daher als ein Expressions-Steigerer wirkend). Der Lipidschwanz stellt die optimale Präsentation des Antigens für Antigen-präsentierende Zellen sicher. Andere Fusionspartner beinhalten das nicht strukturelle Protein von Influenza-Virus, NS1 (Hämagglutinin). Typischerweise werden die N-terminalen 81 Aminosäuren verwendet, obwohl unterschiedliche Fragmente, die T-Helferepitopte beinhalten, verwendet werden können.
In einer anderen Ausführungsart ist der immunologische Fusionspartner das Protein, das als LYTA bekannt ist, oder ein Teil davon (vorzugsweise ein C-terminaler Teil). LYTA stammt von Streptococcus pneumoniae, welches eine N-Acetyl-N-alaninamidase synthetisiert, die als Amidase-LYTA bekannt ist (codiert durch das LytA-Gen; Gene 43: 265–292, 1986). LYTA ist ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen in dem Peptidoglycan-Gerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LYTA-Proteins ist für die Affinität zu dem Cholin oder zu einigen Cholin-Analoga, wie DEAE, verantwortlich. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli-C-LYTA exprimierenden Plasmiden, die für die Expression von Fusionsproteinen nützlich sind, ausgenutzt. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LYTA-Fragment an dem Aminoende enthalten, wurde beschrieben (siehe Biotechnology 10: 795–798, 1992). In einer bevorzugten Ausführungsart kann ein Wiederholungsanteil von LYTA in ein Fusionsprotein mit eingeschlossen werden. Ein Wiederholungsanteil wird in der C-terminalen Region, beginnend am Rest 178, gefunden. Ein besonders bevorzugter Wiederholungsanteil beinhaltet die Reste 188–305.
Im Allgemeinen sind Polypeptide (einschließlich Fusionsproteinen) und Polynucleotide, wie hier beschrieben wird, isoliert. Ein „isoliertes" Polypeptid oder Polynucleotid ist eines, das aus seiner ursprünglichen Umgebung entfernt wurde. Zum Beispiel ist ein natürlich auftretendes Protein isoliert, wenn es von einigen oder allen der zusammen auftretenden Materialien in dem natürlichen System getrennt ist. Vorzugsweise sind solche Polypeptide mindestens ungefähr 90% rein, mehr vorzuziehen ungefähr 95% rein und am Besten mindestens ungefähr 99% rein. Ein Polypeptid wird als isoliert betrachtet, wenn es z. B. in einen Vektor kloniert ist, der nicht ein Teil der natürlichen Umgebung ist.
Veranschaulichende therapeutische Zusammensetzungen und Verwendungen
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein oder mehrere der obigen Polypeptide oder Fusionsproteine (oder Polynucleotide, die solche Polypeptide oder Fusionsproteine codieren) für die Verwendung bei der Induktion von schützender Immunität gegen Chlamydiainfektion in einem Patienten bereit. Wie hier verwendet, bezieht sich ein „Patient" auf jedes warmblütige Tier, vorzugsweise einen Menschen. Ein Patient kann von einer Erkrankung betroffen sein, oder er kann von nachweisbarer Erkrankung und/oder Infektion frei sein. In anderen Worten kann die schützende Immunität induziert werden, um Chlamydiainfektion zu verhindern oder zu behandeln. Bei diesem Aspekt liegt das Polypeptid, Fusionsprotein oder Polynucleotidmolekül im Allgemeinen innerhalb einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einem Impfstoff vor. Pharmazeutische Zusammensetzungen können ein oder mehrere Polypeptide umfassen, von denen jedes ein oder mehrere der Sequenzen (i) der Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenz über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139 bestimmt wird; oder (ii) eines immunogenen Anteils der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist, und einen physiologisch akzeptablen Träger enthalten. Impfstoffe können ein oder mehrere der Polypeptide umfassen, umfassend (i) die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenz über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139 bestimmt wird; oder (ii) einen immunogenen Anteil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; und ein Immunstimulans, wie ein Adjuvans oder ein Ribosom (in welches das Polypeptid eingeschlossen ist). Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe können andere Chlamydiaantigene enthalten, entweder in ein Kombinationspolypeptid eingeschlossen oder in einem getrennten Polypeptid vorliegend.
Alternativ kann ein Impfstoff Polynucleotide enthalten, die ein oder mehrere Polypeptide oder Fusionsproteine codieren, wie oben beschrieben wurde, so dass das Polypeptid in situ erzeugt wird. Bei solchen Impfstoffen können die Polynucleotide in irgendeinem einer Vielfalt von Ausgabesystemen, die demjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Gebiet bekannt sind, vorliegen, einschließlich Nucleinsäure-Expressionssystemen, bakteriellen und viralen Expressionssystemen. Geeignete Nucleinsäure-Expressionssysteme enthalten die notwendigen Polynucleotidsequenzen für die Expression in dem Patienten (wie ein geeignetes Promotor- und Terminierungssignal). Bakterielle Abgabesysteme involvieren die Verabreichung eines Bakteriums (wie Bacillus-Calmette-Guerrin), das einen immunogenen Anteil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsart können die Polynucleotide unter Verwendung eines viralen Expressionssystemes (z. B. Vaccinia oder ein anderes Pockenvirus, Retrovirus oder Adenovirus) eingeführt werden, was die Verwendung eines nicht pathogenen (defekten) Virus involviert. Techniken für den Einschluss von Polynucleotiden in solche Expressionssysteme sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Polynucleotide können als „nackte" Plasmidvektoren verabreicht werden, wie z. B. in Ulmer et al., Science 259: 1745–1749, 1993 beschrieben und im Überblick durch Cohen, Science 259: 1691–1692, 1993, dargestellt wird. Techniken für den Einschluss von DNA in solche Vektoren sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein retroviraler Vektor kann zusätzlich ein Gen für einen selektierbaren Marker (um bei der Identifikation oder Selektion von transduzierten Zellen zu helfen) und/oder ein zielgebendes Teil, wie ein Gen, das einen Liganden für einen Rezeptor auf der spezifischen Zielzelle codiert, transferieren, um den Vektor zielspezifisch zu machen. Zielrichtung kann auch unter Verwendung eines Antikörpers unter Verwendung von Verfahren, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden.
Andere Formulierungen für therapeutische Zwecke beinhalten colloidale Dispersionssysteme, wie Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und auf Lipid basierende Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Micellen, gemischten Micellen und Liposomen. Ein bevorzugtes kolloidales System für die Verwendung als ein Abgabevehikel in vitro und in vivo ist ein Liposom (sprich ein künstlicher Membranvesikel). Die Aufnahme von nackten Polynucleotiden kann durch Einschluss der Polynucleotide in und/oder auf bioabbaubare Kügelchen, die effizient in die Zellen transportiert werden, gesteigert werden. Die Herstellung und Verwendung solcher Systeme ist auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Bei einem verwandten Aspekt kann ein Polynucleotid-Impfstoff, wie oben beschrieben, simultan mit oder sequenziell zu entweder einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem bekannten Chlamydia-Antigen verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung von Polynucleotiden, die ein Polypeptid codieren, entweder „nackt" oder in einem Abgabesystem, wie oben beschrieben, von der Verabreichung eines Antigens gefolgt werden, um den schützenden Immuneffekt des Impfstoffes zu steigern.
Ein Immunstimulans kann irgendeine Substanz sein, die eine Immunreaktion auf ein exogenes Antigen steigert oder vervielfacht. Beispiele für Immunstimulanzien beinhalten Adjuvanzien, bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polylactidgalactid) und Liposome (in die die Verbindung eingeschlossen ist; siehe z. B. Fullerton, U.S. Patent Nr. 4,235,877 ). Die Impfstoffherstellung wird allgemein in z. B. M. F. Powell und M. J. Newman, Hrsg., „Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995) beschrieben. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung können auch andere Verbindungen enthalten, die biologisch aktiv oder inaktiv sein können. Zum Beispiel können ein oder mehrere immunogene Anteile von anderen Chlamydia-Antigenen vorliegen, entweder in ein Fusionspolypeptid eingeschlossen oder als eine separate Verbindung innerhalb der Zusammensetzung oder dem Impfstoff.
Eine pharmazeutische Zusammsensetzung oder ein Impfstoff kann DNA enthalten, die ein oder mehrere der Polypeptide codiert, wie oben beschrieben wurde, so dass das Polypeptid in situ erzeugt wird. Wie oben bemerkt wurde, kann die DNA innerhalb irgendeines von einer Vielzahl von Abgabesystemen, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, vorliegen, einschließlich Nucleinsäure-Expressionssystemen, bakteriellen und viralen Expressionssystemen. Zahlreiche Genabgabetechniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie diejenigen, die durch Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143–198, 1998, und Quellen, die darin zitiert werden, beschrieben werden. Geeignete Nucleinsäure-Expressionssysteme enthalten die notwendigen DNA-Sequenzen für die Expression in dem Patienten (wie ein geeignetes Promotor- und Terminierungssignal). Bakterielle Abgabesysteme involvieren die Verabreichung eines Bakteriums (wie eines Bacillus-Calmette-Guerrin), welches einen immunogenen Anteil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert oder ein solches Epitop sezerniert.
In einer bevorzugten Ausführungsart kann die DNA unter Verwendung eines viralen Expressionssystemes (z. B. Vaccinia oder ein andere Pockenvirus, Retrovirus, Adenovirus, Baculovirus, Togavirus, Bacteriophage und dergleichen) eingeführt werden, was häufig die Verwendung eines nicht pathogenen (defekten), Replikations-kompetenten Virus involviert.
Viele virale Expressionsvektoren stammen z. B. von Viren der Retroviridae-Familie. Diese Familie beinhaltet die Maus-Leukämieviren, die Maus-Brustkrebsviren, die menschlichen Foamy-Viren, Rous-Sarkomvirus und die Immundefizienzviren, einschließlich menschlichen, von Affen und Katzen stammenden. Überlegungen, wenn retrovirale Expressionsvektoren designed werden, werden in Comstock et al. (1997) diskutiert.
Es wurden ausgezeichnete, auf Maus-Leukämievirus (MLV) basierende virale Expressionsvektoren durch Kim et al. (1998) entwickelt. Bei der Erzeugung der MLV-Vektoren fanden Kim et al. heraus, dass die gesamte gag-Sequenz zusammen mit der direkt stromaufwärts liegenden Region ohne signifikante Beeinflussung der viralen Verpackung oder Genexpression deletiert werden konnte. Weiter wurde herausgefunden, dass fast die gesamte U3-Region durch den unmittelbar frühen Promotor von menschlichen Cytomegalievirus ohne schädliche Effekte ersetzt werden konnte. Zusätzlich konnten MCR und innere Ribosomen-Eintrittsorte (IRES) ohne Nebenwirkungen zugefügt werden. Basierend auf ihren Beobachtungen entwarfen Kim et al. eine Reihe von MLV-basierten Expressionsvektoren, die ein oder mehrere der Merkmale, die oben beschrieben werden, umfassen.
Als mehr über das menschliche Foamy-Virus (HFV) gelernt wurde, wurden Eigenschaften von HFV, die für seine Verwendung als ein Expressionsvektor günstig sind, entdeckt. Diese Eigenschaften beinhalten die Expression von pol durch Splicing und Beginn der Translation an einem definierten Startkodon. Andere Aspekte von HFV-viralen Expressionsvektoren werden in Bodem et al. (1997) im Überblick dargestellt.
Murakami et al. (1997) beschreibt auf Rous-Sarcomvirus (RSV) basierende replikationskompetente Vogel-Retrovirus-Vektoren, IR1 und IR2, um ein heterologes Gen in einem hohen Spiegel zu exprimieren. In diesen Vektoren wurde der IRES, stammend von Encephalomyocarditis-Virus (EMCV), zwischen das env-Gen und das heterologe Gen inseriert. Der IR1-Vektor behält den Splice-Akzeptorort, der stromabwärts des env-Gens vorliegt, während es dem IR2-Vektor daran mangelt. Murakami et al. haben eine hochgradige Expression von verschiedenen unterschiedlichen heterologen Genen durch diese Vektoren gezeigt.
Kürzlich wurde eine Anzahl von auf Lentivirus basierenden retroviralen Expressionsvektoren entwickelt. Kafri et al. (1997) zeigten anhaltende Expression von Genen, die direkt in die Leber und die Muskulatur durch einen menschlichen Immundefizienz-Virus(HIV)-basierten Expressionsvektor abgegeben wurden. Ein Vorteil des Systems ist die innewohnende Fähigkeit von HIV, nicht teilende Zellen zu transduzieren. Da die Viren von Kafri et al. pseudotypisiert mit vesikulärem Stomatitis Virus G Glycoprotein (VSVG) sind, können sie einen breiten Bereich von Gewebe und Zelltypen transduzieren.
Es wurde eine große Zahl von Adenovirus-basierten Expressionsvektoren entwickelt, vorrangig aufgrund der Vorteile, die durch diese Vektoren bei Gentherapie-Anwendungen angeboten werden. Adenovirus-Expressionsvektoren und Verfahren der Verwendung solcher Vektoren sind das Thema einer Anzahl von Patenten in den Vereinigten Staaten, einschließlich United States Patent Nr. 5,698,202 , United States Patent Nr. 5,616,326 , United States Patent Nr. 5,585,362 und United States Patent Nr. 5,518,913 .
Zusätzliche adenovirale Konstrukte werden in Kathri et al. (1997) und Tomanin et al. (1997) beschrieben. Kathri et al. beschreibt neue Rinder-Adenovirus-Expressionsvektoren und ihre Fähigkeit, nasale turbinale Zellen vom Rind und Kaninchen-Nierenzellen wie auch eine Bandbreite von menschlichem Zelltyp, einschließlich Lungen und Vorhaut-Fibroblasten, wie auch Leber, Prostata, Brust, Kolon und retinale Linien, zu infizieren. Tomanin et al. beschreiben adenovirale Expressionsvektoren, die das T7-RNA-Polymerasegen enthalten. Wenn sie in Zellen eingeführt wurden, die ein heterologes Gen, operabel gebunden an einen T7-Promotor, enthalten, waren die Vektoren in der Lage, die Genexpression von dem T7-Promotor anzutreiben. Die Autoren schlagen vor, dass dieses System nützlich für die Klonierung und Expression von Genen, die zytotoxische Proteine codieren, sein könnte.
Pockenviren werden breit für die Expression von heterologen Genen in Säugerzellen verwendet. Über die Jahre wurden die Vektoren verbessert, um eine hohe Expression des heterologen Gens zu ermöglichen und die Integration von multiplen heterologen Genen in ein einzelnes Molekül zu vereinfachen. In einer Anstrengung, zytopathische Effekte zu verringern und die Sicherheit zu steigern, erfahren Vaccinia-Virusmutanten und andere Pockenviren, die abortive Infektion in Säugerzellen durchlaufen, besondere Aufmerksamkeit (Oertli et al., 1997). Die Verwendung von Pockenviren als Expressionsvektoren wird in Carroll und Moss (1997) im Überblick dargestellt.
Togavirale Expressionsvektoren, die alphavirale Expressionsvektoren beinhalten, wurden verwendet, um die Struktur und Funktion von Proteinen zu studieren und für Proteinherstellungszwecke. Attraktive Merkmale von togaviralen Expressionsvektoren sind schnelle und effiziente Genexpression, ein breiter Wirtsbereich und RNA-Genome (Huang, 1996). Auch wurde von rekombinanten Impfstoffen, basierend auf alphaviralen Expressionsvektoren, gezeigt, dass sie eine starke humorale und zelluläre Immunantwort mit gutem immunologischem Gedächtnis und schützenden Effekten induzieren (Tubulekas et al., 1997). Alphavirale Expressionsvektoren und ihre Verwendung werden z. B. in Lundstrom (1997) diskutiert.
In einer Studie verwendeten Li und Garoff (1996) Semliki-Forest-Virus(SFV)-Expressionsvektoren, um retrovirale Gene zu exprimieren und retrovirale Partikel in BHK-21-Zellen zu produzieren. Die Partikel, die durch dieses Verfahren hergestellt wurden, besaßen Protease- und Reverse-Transkriptase-Aktivität und waren infektiös. Darüber hinaus konnte kein Helfervirus in den Virusvorräten nachgewiesen werden. Daher besitzt dieses System Merkmale, die attraktiv für seine Verwendung in Gentherapieprotokollen sind.
Baculovirale Expressionsvektoren wurden traditionell verwendet, um heterologe Proteine in Insektenzellen zu exprimieren. Beispiele für Proteine beinhalten Säuger-Chemokin-Rezeptoren (Wang et al., 1997), Reporterproteine, wie grün fluoreszierendes Protein (Wu et al., 1997) und FLAG Fusionsproteine (Wu et al., 1997; Koh et al., 1997). Kürzliche Fortschritte in der baculoviralen Expressionsvektor-Technologie, einschließlich ihrer Verwendung in Virion-Display-Vektoren und Expression in Säugerzellen, werden durch Possee (1997) im Überblick dargestellt. Andere Überblicke zu baculoviralen Expressionsvektoren beinhalten Jones und Morikawa (1996) und O'Reilly (1997).
Andere geeignete virale Expressionssysteme werden z. B. in Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317–321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86–103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8 : 17–21 ; 1990 ; U.S. Patent Nr. 4,603,112 , 4,769,330 und 5,017,487 ; WO 89/01973 ; U.S. Patent Nr. 4,777,127 ; GB 2,200,651 ; EP 0,345,242 ; WO 91/02805 ; Berkner, Biotechniques 6: 616–627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431–434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215–219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498–11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838–2848, 1993; und Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202–1207, 1993 offenbart. Techniken für den Einschluss von DNA in solche Expressionssysteme sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt. In anderen Systemen kann die DNA als „nackte" DNA eingeführt werden, wie z. B. in Ulmer et al., Science 259: 1745–1749, 1993 und durch Cohen, Science 259: 1691–1692, 1993 im Überblick dargestellt wird. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Beschichtung der DNA auf bioabbaubare Kügelchen, die effizient in die Zellen transportiert werden, gesteigert werden.
Es wird offensichtlich sein, dass ein Impfstoff eine Polynucleotid- und/oder eine Polypeptidkomponente, wie erwünscht, umfassen kann. Es wird auch offensichtlich sein, dass ein Impfstoff pharmazeutisch akzeptable Salze der Polynucleotide und/oder Polypeptide, die hier bereitgestellt werden, enthalten kann. Solche Salze können aus pharmazeutisch akzeptablen, nicht-toxischen Basen hergestellt werden, einschließlich organischen Basen (z. B. Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen und basischen Aminosäuren) und anorganischen Basen (z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Alcium und Magnesiumsalze). Während jeder geeignete Träger, der demjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird der Typ des Trägers abhängig von dem Modus der Verabreichung variieren. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für jede geeignete Weise der Verabreichung formuliert sein, einschließlich z. B. topische, orale, nasale, intravenöse, intracraniale, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung. Für parenterale Verabreichung, wie subkutane Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann jeder der obigen Träger oder ein fester Träger, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glucose, Saccharose und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polylactat, Polyglycolat) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären werden z. B. in U.S. Patent Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
Solche Zusammensetzungen können auch Puffer (z. B. neutral gepufferte Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), Kohlenhydrate (z. B. Glucose, Mannose, Saccharose oder Dextrane), Mannitol, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren, wie Glycin, Antioxidantien, Bakteriostatika, Chelatbildner, wie EDTA oder Gluthation, Adjuvantien (z. B. Aluminiumhydroxid), gelöste Stoffe, die die Formulierung isoton, hypoton oder schwach hyperton mit dem Blut eines Empfängers machen, Suspensionsmittel, Verdickungsmittel und/oder Konservierungsstoffe umfassen. Alternativ können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als ein Lyophilisat formuliert sein. Verbindungen können auch in Liposome unter Verwendung bekannter Technologie eingeschlossen werden.
Irgendeines einer Vielfalt von Immunstimulantien kann bei den Impfstoffen dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Adjuvans mit eingeschlossen werden. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die entworfen wurde, um das Antigen vor schnellem Katabolismus zu schützen, wie Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen Stimulator, der Immunreaktion, wie Lipid A, Bortadella Pertussis oder Mycobacterium tuberculosis abgeleitete Proteine. Geeignete Adjuvantien sind z. B. als Freund's inkomplettes Adjuvans und komplettes Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); Aluminiumsalze, wie Aluminiumhydroxidgel (Alum) oder Aluminiumphosphat; Salze von Calcium, Eisen oder Zink; eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin, acylierte Zucker; kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide; Polyphosphazene; bioabbaubare Mikrosphären; Monophosphoryl-Lipid A und Quil A erhältlich. Cytokine, wie GM-CSF oder Interleukin-2, -7 oder -12, können auch als Adjuvantien verwendet werden.
Innerhalb der Impfstoffe, die hier bereitgestellt werden, unter ausgewählten Umständen, kann die Adjuvans- Zusammensetzung entwickelt werden, um eine Immunantwort vorrangig des Th1-Typs oder Th2-Typs zu induzieren. Hohe Spiegel an Th1-Typ-Cytokinen (z. B. IFN-γ, TFNα, IL-2 und IL-12) tendieren dazu, die Induktion von Zell-vermittelten Immunantworten auf ein verabreichtes Antigen zu favorisieren. Im Gegensatz dazu tendieren hohe Spiegel an Th2-Typ-Cytokinen (z. B. IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10) dazu, die Induktion von humoralen Immunantworten zu favorisieren. Nach der Anwendung eines Impfstoffes, wie er hier bereitgestellt wird, wird ein Patient eine Immunreaktion unterstützen, die Th1- und Th2-Typ-Antworten beinhaltet. In einer bevorzugten Ausführungsart, in der eine Reaktion vorrangig vom Th1-Typ ist, wird der Spiegel an Th1-Cytokinen in einem größeren Ausmaß ansteigen als der Spiegel von Th2-Typ-Cytokinen. Die Spiegel dieser Cytokine können einfach unter Verwendung von Standard-Assays beurteilt werden. Für einen Überblick über die Familien der Cytokine, siehe Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145–173, 1989.
Bevorzugte Adjuvantien für die Verwendung bei der Hervorrufung einer hauptsächlich Th1-Typ-Antwort beinhalten z. B. eine Kombination aus Monophosphoryl-Lipid A, vorzugsweise 3-de-O-acyliertem Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz. MPL-Adjuvantien sind von Corixa Corporation (Seattle, WA; siehe U.S. Patent Nr. 4,436,727 ; 4,877,611 ; 4,866,034 und 4,912,094 ) erhältlich. CpG-enthaltende Oligonucleotide (in denen das CpG-Dinucleotid unmethyliert ist) induzieren vorrangig auch eine Th1-Antwort. Solche Oligonucleotide sind bekannt und werden z. B. in WO 96/02555 und WO 99/33488 beschrieben. Immunstimulierende DNA-Sequenzen werden auch z. B. durch Sato et al., Science 273: 352, 1996, beschrieben. Ein anderes bevorzugtes Adjuvans ist Saponin, vorzugsweise QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), das allein oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verwendet werden kann. Zum Beispiel involviert ein verbessertes System die Kombination eines Monophosphoryl-Lipid A und Saponin- Derivats, wie die Kombination von QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 beschrieben wird, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, worin das QS21 mit Cholesterin gequencht wird, wie in WO 96/33739 beschrieben wird. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocoferol. Eine besonders stark wirkende Adjuvans-Formulierung involviert QS21, 3D-MPL und Tocoferol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion, wie in WO 95/17210 beschrieben wird. Andere bevorzugte Adjuvantien beinhalten Montanid ISA 720 (Seppic, Frankreich), SAF (Chiron, Californien, USA), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), die SBAS-Reihe von Adjuvantien (z. B. SBAS-2 oder SBAS-4, erhältlich von SmithKline Beecham, Rixensart, Belgien), Detox (Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529 (Corixa Corporation; Seattle, WA) und andere Aminoalkylglucosaminid-4-phosphate (AGPs), wie diejenigen, die in den anhängigen U.S. Patentanmeldungen Seriennummern 08/853,826 und 09/074,720 beschrieben werden.
Jeder Impfstoff, der hier bereitgestellt wird, kann unter Verwendung von gut bekannten Verfahren hergestellt werden, die zu einer Kombination aus Antigen, Immunstimulans und einem geeigneten Träger oder Arzneiträger führen. Die Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, können als Teil einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden (sprich einer Formulierung wie einer Kapsel, Schwamm oder Gel (z. B. bestehend aus Polysacchariden), was eine langsame Freisetzung der Verbindung nach der Verabreichung bewirkt). Solche Formulierungen können allgemein unter Verwendung von gut bekannten Technologien hergestellt werden (siehe z. B. Coombes et al., Vaccine 14: 1429–1438, 1996) und z. B. durch orale, rektale oder subkutane Implantation oder durch Implantation an dem erwünschten Zielort verabreicht werden. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ein Polypeptid, Polynucleotid oder Antikörper enthalten, der in einer Trägermatrix dispergiert und/oder in einem Reservoir enthalten ist, der von einer Geschwindigkeits-kontrollierenden Membran umgeben ist.
Träger für die Verwendung in solchen Formulierungen sind biokompatibel und können auch bioabbaubar sein; vorzugsweise stellt die Formulierung einen relativ konstanten Spiegel an aktiver Bestandteilfreisetzung bereit. Solche Träger beinhalten Mikropartikel von Poly (Lactid-co-glycolid), wie auch Polyacrylat, Latex, Stärke, Zellulose und Dextran. Andere Träger mit verzögerter Freisetzung beinhalten supramolekulare Biovektoren, die einen nicht flüssigen hydrophilen Kern (sprich ein quervernetztes Polysaccharid oder Oligosaccharid) und wahlweise eine externe Schicht, umfassend eine amphiphile Verbindung, wie ein Phospholipid, umfassen (siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,151,254 und PCT Anmeldungen WO 94/20078 , WO 94/23701 und WO 96/06638 ). Die Menge an aktiver Verbindung, die in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung enthalten ist, hängt von dem Ort der Implantation, der Geschwindigkeit und erwarteten Dauer der Freisetzung und der Natur des Zustandes, der behandelt oder verhindert werden soll, ab.
Jeder aus einer Vielfalt von Abgabevehikeln kann innerhalb der pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe verwendet werden, um die Produktion einer Antigen-spezifischen Immunreaktion, die auf Chlamydia-infizierte Zellen zielt, zu erleichtern.
Wege und Frequenz der Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffen, wie auch die Dosierung, wird von Individuum zu Individuum variieren. Im Allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (sprich intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden. Zwischen 1 und 3 Dosen können für einen Zeitraum von 1–36 Wochen verabreicht werden. Vorzugsweise werden 3 Dosen in Abständen von 3–4 Monaten verabreicht und Booster-Impfungen können danach periodisch gegeben werden. Alternative Protokolle können für einzelne Patienten geeignet sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge an Polypeptid oder DNA, die, wenn sie wie oben beschrieben verabreicht wird, in der Lage ist, eine Immunreaktion in einem immunisierten Patienten hervorzurufen, die ausreicht, um den Patienten vor Chlamydia-Infektion für mindestens 1–2 Jahre zu schützen. Im Allgemeinen liegt die Menge an Polypeptid, die in einer Dosis vorliegt (oder in situ durch die DNA in einer Dosis hergestellt wird) in einem Bereich von 1 pg bis ungefähr 100 mg pro kg Wirt, typischerweise von ungefähr 10 pg bis ungefähr 1 mg und vorzugsweise von ungefähr 100 pg bis ungefähr 1 μg. Geeignete Dosierungsgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, aber werden typischerweise in dem Bereich von ungefähr 0,1 ml bis ungefähr 5 ml liegen.
Während irgendein geeigneter Träger, der denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird der Typ des Trägers, abhängig von dem Modus der Verabreichung, variieren. Für die parenterale Verabreichung, wie subkutane Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann jeder der obigen Träger oder ein fester Träger, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glucose, Saccharose und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polylactidgalactid) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären werden z. B. in den U.S. Patenten Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
Im Allgemeinen stellt ein geeignetes Dosierungs- und Behandlungsregime die aktive Verbindung/die aktiven Verbindungen in einer Menge bereit, die ausreicht, um einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen bereitzustellen. Eine solche Antwort kann durch Feststellung eines verbesserten klinischen Outcomes bei behandelten Patienten im Vergleich zu unbehandelten Patienten überwacht werden. Steigerungen bei zuvor existierenden Immunantworten gegen ein Chlamydia-Protein korrelieren im Allgemeinen mit einem verbesserten klinischen Outcome. Solche Immunantworten können im Allgemeinen unter Verwendung von Standard-Proliferationen, Cytotoxizität oder Cytokin-Assays evaluiert werden, die unter Verwendung von Proben, die von einem Patienten vor und nach der Behandlung erhalten werden, durchgeführt werden.
Nachweis und Diagnose
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Verwendung der Polypeptide, die oben beschrieben werden, für die Diagnose von Chlamydia-Infektion bereit. Bei diesem Aspekt werden Verfahren zum Nachweis von Chlamydia-Infektion in einer biologischen Probe bereitgestellt, wobei eines oder mehrere der obigen Polypeptide entweder allein oder in Kombination verwendet werden. Zur Klärung wird der Begriff „Polypeptid" verwendet, wenn spezifische Ausführungsarten der erfinderischen diagnostischen Verfahren beschrieben werden. Es wird jedoch für jemanden mit Bewanderung auf dem Fachgebiet klar sein, dass die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung auch in solchen Verfahren verwendet werden können.
Wie hier verwendet, ist eine „biologische Probe" eine Antikörper enthaltende Probe, die von einem Patienten erhalten wurde. Vorzugsweise ist die Probe Vollblut, Sputum, Serum, Plasma, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin. Mehr vorzuziehen ist die Probe Blut, Serum oder Plasmaprobe, die von einem Patienten erhalten werden. Die Polypeptide werden in einem Assay verwendet, wie unten beschrieben wird, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern gegen das Polypeptid/die Polypeptide in der Probe zu bestimmen, relativ zu einem vorbestimmten Cut-off-Wert. Die Gegenwart solcher Antikörper weist auf die vorangehende Sensibilisierung gegen Chlamydia-Antigene hin, was hinweisend auf Chlamydia-Infektionen sein könnte.
In Ausführungsarten, in denen mehr als ein Polypeptid verwendet wird, sind die Polypeptide, die verwendet werden, vorzugsweise komplementär (sprich ein Bestandteil-Polypeptid wird die Infektion in Proben nachweisen, wo die Infektion durch ein anderes Bestandteil-Polypeptid nicht nachgewiesen würde). Komplementäre Polypeptide können im Allgemeinen unter Verwendung von jedem Polypeptid einzeln identifziert werden, um Serumproben, die von einer Reihe von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie mit Chlamydia infiziert sind, erhalten wurden, zu beurteilen. Nach der Bestimmung, welche Proben Test-positiv (wie unten beschrieben) mit jedem Polypeptid sind, können Kombinationen aus zwei oder mehr Polypeptiden formuliert werden, die in der Lage sind, Infektionen in den meisten oder allen der gestesteten Proben nachzuweisen.
Eine Vielzahl von Assay-Formaten sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet für die Verwendung von ein oder mehr Polypeptiden, um Antikörper in einer Probe nachzuweisen, bekannt. Siehe z. B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer bevorzugten Ausführungsart involviert der Assay die Verwendung von Polypeptid, das auf einem festen Träger immobilisiert wurde, um an den Antikörper aus der Probe zu binden und ihn zu entfernen. Der gebundene Antikörper kann dann unter Verwendung eines Nachweisreagens, das eine Reportergruppe enthält, nachgewiesen werden. Geeignete Nachweisreagentien beinhalten Antikörper, die an den Antikörper-/Polypeptidkomplex und freies Polypeptid, das mit einer Reportergruppe markiert ist, binden (z. B. in einem semi-kompetitiven Assay). Alternativ kann ein kompetitiver Assay verwendet werden, in dem ein Antikörper, der an das Polypeptid bindet, mit einer Reportergruppe markiert wird und man es ihm ermöglicht, an das immobilisierte Antigen nach Inkubation des Antigens der Probe zu binden. Das Ausmaß, in dem Bestandteile der Probe die Bindung des markierten Antikörpers an das Polypeptid inhibieren, weist auf die Reaktivität der Probe in dem immobilisierten Polypeptid hin.
Der feste Träger kann irgendein festes Material sein, das denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, an das das Antigen angebracht werden kann. Zum Beispiel kann der feste Träger eine Testvertiefung in einer Mikrotiterplatte oder eine Nitrozellulose oder eine andere geeignete Membran sein. Alternativ kann der Träger ein Kügelchen oder eine Scheibe sein, so wie Glas, Fieberglas, Latex oder ein Kunststoffmaterial, wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid. Der Träger kann auch ein magnetisches Teilchen oder ein fieberoptischer Sensor sein, wie diejenigen, die z. B. in U.S. Patent Nr. 5,359,681 offenbart werden.
Die Polypeptide können an den festen Träger unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken, die demjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, gebunden werden. In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „gebunden" die sowohl nicht kovalente Assoziierung, wie Adsorption, wie auch die kovalente Anbringung (die eine direkte Verbindung zwischen dem Antigen und den funktionellen Gruppen auf dem Träger sein kann oder eine Verbindung durch einen quervernetzenden Wirkstoff sein kann). Die Bindung durch Adsorption an eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder an eine Membran wird bevorzugt. In solchen Fällen kann die Adsorption durch In-Kontakt-Bringen des Polypetides in einem geeigneten Puffer mit dem festen Träger für eine geeignete Zeitdauer sein. Die Kontaktzeit variiert mit der Temperatur, aber liegt typischerweise zwischen ungefähr 1 Stunde und 1 Tag. Im Allgemeinen reicht das In-Kontakt-Bringen einer Vertiefung von einer Kunststoffmikrotiterplatte (wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid) mit einer Menge von Polypeptid in dem Bereich von 10 ng bis ungefähr 1 μg, und vorzugsweise ungefähr 100 ng, aus, um eine adäquate Menge an Antigen zu binden.
Kovalentes Anbringen von Polypeptid an einen festen Träger kann im Allgemeinen durch zuerst Reaktion des Trägers mit einem bifunktionellen Reagens, der mit sowohl dem Träger wie auch einer funktionellen Gruppe, wie einer Hydroxyl- oder Aminogruppe, auf dem Polypeptid reagieren wird, erreicht. Zum Beispiel kann das Polypeptid an Träger mit einer geeigneten Polymerbeschichtung unter Verwendung von Benzochinon oder durch Kondensation einer Aldehydgruppe auf den Träger mit einem Amin und einem aktiven Wasserstoff auf dem Polypeptid gebunden werden (siehe z. B. Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, bei A12–A13).
Im bestimmten Ausführungsarten ist der Assay ein Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA). Dieser Assay kann durchgeführt werden, indem zuerst ein Polypeptid-Antigen, das auf einem festen Träger, gewöhnlich der Vertiefung einer Mikrotiterplatte, immobilisiert wurde, mit der Probe in Kontakt gebracht wird, so dass die Antikörper gegen das Polypeptid innerhalb der Probe in der Lage sind, an das immobilisierte Polypeptid zu binden. Ungebundene Probe wird dann von dem immobilisierten Polypeptid entfernt und ein Nachweisreagens, das in der Lage ist, an den immobilisierten Antikörper-Polypeptidkomplex zu binden, wird zugegeben. Die Menge an Nachweisreagens, die auf dem festen Träger gebunden bleibt, wird dann unter Verwendung eines Verfahrens, das für das spezifische Nachweisreagens geeignet ist, bestimmt.
Konkreter werden, soweit das Polypeptid auf dem Träger immobilisiert wurde, wie oben beschrieben wird, die verbleibendenen Proteinbindungsorte auf dem Träger typischerweise blockiert. Jedes geeignete Blockierungsmittel, das demjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Tween 20^TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kann verwendet werden. Das immobilisierte Polypeptid wird dann mit der Probe inkubiert und man lässt den Antikörper an das Antigen binden. Die Probe kann mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor der Inkubation verdünnt werden. Im Allgemeinen ist eine geeignete Kontaktzeit (sprich Inkubationszeit) der Zeitraum, der ausreicht, um die Gegenwart von Antikörpern in einer HGE-infizierten Probe nachzuweisen. Vorzugsweise reicht die Kontaktzeit aus, um einen Grad an Bindung zu erreichen, der mindestens 95% von demjenigen beträgt, der im Gleichgewicht zwischen gebundenem und ungebundenem Antikörper erreicht wird, zu erreichen. Diejenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet werden erkennen, dass die Zeit, die notwendig ist, um ein Gleichgewicht zu erreichen, einfach durch Assay des Grades an Bindung, die über einen Zeitraum auftritt, bestimmt werden kann. Bei Raumtemperatur ist im Allgemeinen eine Inkubationszeit von ungefähr 30 Minuten ausreichend.
Ungebundene Probe kann dann durch Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Puffer, wie PBS, enthaltend 0,1% Tween 20^TM, entfernt werden. Nachweisreagens kann dann zu dem festen Träger zugegeben werden. Ein geeignetes Nachweisreagens ist jede Verbindung, die an den immobilisierten Antikörper-Polypeptidkomplex bindet, und die dann durch irgendeines einer Vielzahl von Mitteln, die denjenigen in dem Fachgebiet bekannt sind, nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise enthält das Nachweisreagens ein Bindemittel (wie z. B. Protein A, Protein G, Immunglobulin, Lectin oder freies Antigen), konjugiert an eine Reportergruppe. Bevorzugte Reportergruppen beinhalten Enzyme (wie Meerrettichperoxidase), Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuclide, lumineszierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen und Biotin. Die Konjugation von Bindemittel an Reportergruppe kann unter Verwendung von Standardverfahren, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden. Häufige Bindungsmittel können auch konjugiert an eine Vielzahl von Reportergruppen von vielen kommerziellen Quellen erworben werden (z. B. Zymed Laboratories, San Francisco, CA, und Pierce, Rockford, IL).
Das Nachweisreagens wird dann mit dem immobilisierten Antikörper-Polypeptidkomplex für eine Zeitdauer, die ausreicht, um den gebundenen Antikörper nachzuweisen, inkubiert. Eine geeignete Zeitdauer kann im Allgemeinen aus den Anweisungen des Herstellers oder Assay des Grades an Bindung, der über einen Zeitraum auftritt, bestimmt werden. Ungebundenes Nachweisreagens wird dann entfernt und gebundenes Nachweisreagens wird unter Verwendung der Reportergruppe nachgewiesen. Das Verfahren, das für den Nachweis der Reportergruppe verwendet wird, hängt von der Natur der Reportergruppe ab. Für radioaktive Gruppen sind im Allgemeinen Szintillations-zählende oder autoradiographische Verfahren geeignet. Spektroskopische Verfahren können verwendet werden, um Farbstoffe, lumineszierende Gruppen und fluoreszierende Gruppen nachzuweisen. Biotin kann unter Verwendung von Avidin, gekoppelt an eine verschiedene Reportergruppe (gewöhnlich eine radioaktive oder fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym) nachgewiesen werden. Enzymreportergruppen können im Allgemeinen durch die Zugabe von Substrat (im Allgemeinen für einen spezifischen Zeitraum), gefolgt von spektroskopischer oder anderer Analyse der Reaktionsprodukte, nachgewiesen werden.
Um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antichlamydia-Antikörpern in der Probe zu bestimmen, wird im Allgemeinen das Signal, das von der Reportergruppe, die auf dem festen Träger gebunden bleibt, nachgewiesen wird, mit einem Signal, das zu einem vorbestimmten Cut-off-Wert korrespondiert, verglichen. In einer bevorzugten Ausführungsart ist der Cut-off-Wert das durchschnittliche mittlere Signal, das erhalten wird, wenn das immobilisierte Antigen mit Proben von einem nicht infizierten Patienten inkubiert wird. Im Allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das drei Standardabweichungen oberhalb des vorbestimmten Cut-off-Wertes liegt, als positiv für Chlamydia-Infektion betrachtet. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsart wird der Cut-off-Wert unter Verwendung einer Receive-Operator-Kurve, gemäß dem Verfahren von Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, S. 106–107, bestimmt. Kurz gefasst, kann in dieser Ausführungsart der Cut-off-Wert aus einer Aufzeichnung von Paaren von wahren positiven Raten (sprich Sensitivät) und falsch positiven Raten (100% Spezifität), die zu jedem möglichen Cut-off-Wert für das diagnostische Testergebnis korrespondieren, bestimmt werden. Der Cut-off-Wert auf dem Diagramm, der am nächsten zu der oberen linksseitigen Ecke ist (sprich der Wert, der das größte Gebiet umfasst), ist der genaueste Cut-off-Wert und eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher ist als der Cut-off-Wert, der durch dieses Verfahren bestimmt wird, kann als positiv betrachtet werden. Alternativ kann der Cut-off-Wert entlang dem Diagramm nach links verschoben werden, um die flasch positiven Raten zu minimieren, oder nach rechts, um die falsch negativen Raten zu minimieren. Im Allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher ist als der Cut-off-Wert, der durch dieses Verfahren bestimmt wird, als positiv für Chlamydia-Infektion betrachtet.
Bei einer verwandten Ausführungsart wird der Assay in einem schnellen Durchfluss oder Striptest-Format durchgeführt, worin das Antigen auf eine Membran, wie Nitrozellulose, immobilisiert wird. In dem Durchflusstest binden die Antikörper in der Probe an immobilisierte Polypeptide, während die Probe durch die Membran passiert. Ein Nachweisreagens (sprich Protein-A kolloidales Gold) bindet dann an den Antikörper-Polypeptidkomplex, während die Lösung, die das Nachweisreagens enthält, durch die Membran fließt. Der Nachweis von gebundenem Nachweisreagens kann dann durchgeführt werden, wie oben beschrieben wurde. In dem Striptest-Format wird ein Ende der Membran, an die Polypeptid gebunden ist, in eine Lösung getaucht, die die Probe enthält. Die Probe wandert entlang der Membran durch eine Region, die Nachweisreagens enthält, und zu dem Gebiet des immobilisiertes Peptids. Die Konzentration an Nachweisreagens an dem Polypeptid weist auf die Gegenwart von Anti-Chlamydia-Antikörpern in der Probe hin. Typischerweise erzeugt die Konzentration von Nachweisreagens an diesem Ort ein Muster, wie eine Linie, das einfach visuell gelesen werden kann. Die Abwesenheit eines solchen Mustern weist auf ein negatives Ergebnis hin. Im Allgemeinen wird die Menge an Polypeptid, die auf der Membran immobilisiert wird, ausgewählt, um ein visuell erkennbares Muster zu erzeugen, wenn die biologische Probe einen Spiegel an Antikörpern enthält, der ausreichen würde, um ein positives Signal in einem ELISA, wie oben diskutiert wurde, zu erzeugen. Vorzugsweise liegt die Menge an Polypeptid, das auf der Membran immobilisiert ist, in dem Bereich von ungefähr 25 ng bis ungefähr 1 μg und mehr vorzuziehen von ungefähr 50 ng bis ungefähr 500 ng. Solche Tests können typischerweise mit einer sehr kleinen Menge (z. B. einem Tropfen) Patientenserum oder Blut durchgeführt werden.
Natürlich gibt es zahlreiche andere Assay-Protokolle, die für die Verwendung mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die obigen Beschreibungen sollen nur exemplarisch sein. Ein Beispiel für ein alternatives Assay-Protokoll, das nützlich bei solchen Verfahren verwendet werden kann, ist ein Western-Blot, worin die Proteine, die in einer biologischen Probe vorliegen, auf einem Gel vor der Ausssetzung gegenüber einem Bindemittel getrennt werden. Solche Techniken sind denjenigen mit Bewanderung auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Diagnostische Reagentien der vorliegenden Erfindung können auch DNA-Sequenzen umfassen, die ein oder mehrere der obigen Polypetide oder einen oder mehrere Anteile davon kodieren. Zum Beispiel können mindestens zwei Oligonucleotidprimer in einem auf einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierendem Assay, um Chlamydia-spezifische cDNA, die aus einer biologischen Probe stammt, zu amplifizieren, verwendet werden, worin mindestens einer der Oligonucleotidprimer für ein DNA-Molekül spezifisch ist, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Die Gegenwart der amplifizierten cDNA wird dann unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie Gel-Elektrophorese, nachgewiesen. Ähnlich können Oligonucleotidsonden, die spezifisch für ein DNA-Molekül, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, sind, in einem Hybridisierungs-Assay verwendet werden, um die Gegenwart eines erfinderischen Polypeptids in einer biologischen Probe nachzuweisen.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration und keinesweges zur Limitierung angeboten.
Beispiel 1
CD4 T-Zell-Expressionsklonierung für die Identifikation von T-Zell-stimulierenden Antigenen von Chlamydia trachomatis Serovar E
In diesem Beispiel wurde eine CD4+ T-Zell-Expressions-Klonierungsstrategie verwendet, um Chlamydia trachomatis-Antigene, erkannt durch Patienten, die im Corixa Corporation's Blutspendeprogramm aufgenommen sind, zu identifizieren. Eine genomische Bibliothek von Chlamydia trachomatis Serovar E wurde konstruiert und mit Chlamydia-spezifischen T-Zell-Linien, die durch Stimulierung von PBMCs aus diesen Spendern erzeugt wurden, gescreent. Spender CT1 ist ein 27 Jahre alter Mann, dessen klinische Manifestation eine Non-Gonokokken-Urethritis war und dessen Urin positiv auf Chlamydia durch Ligase-Kettenreaktion getestet wurde. Spender CT3 ist ein 43-jähriger alter Mann, der asymptomatisch und mit Serovar J infiziert ist. Spender CT10 ist eine 24 Jahre alte Frau, die asymptomatisch ist und gegenüber Chlamydia durch ihren Partner exponiert war, aber keine Erkrankung entwickelte. Spender CT11 ist eine 24 Jahre alte Frau mit multiplen Infektionen (Serovar J, F und E).
Chlamydien-spezifische T-Zell-Linien wurden von Spendern mit Chlamydia-Genitaltrakt-Infektion oder Spendern, die gegenüber Chlamydia exponiert waren, die keine Erkrankung entwickelten, erzeugt. T-Zell-Linien von den Spendern CT-1, CT-3 und CT-10 wurden durch Stimulierung von PBMCs mit retikulären Körpern von C. trachomatis Serovar E erzeugt. T-Zell-Linien von Spender CT-11 wurden durch Stimulation von PBMCs mit entweder retikulären Körpern oder Elementarkörpern von C. trachomatis Serovar E erzeugt. Eine zufällig gescherte Genombibliothek von C. trachomatis Serovar E wurde in lambda Zap II-Vektor konstruiert und eine amplifizierte Bibliothek in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Dichte von 25 Klonen pro Vertiefung ausplattiert. Die Bakterien wurden induziert, um das rekombinante Protein in der Gegenwart von 2 mM IPTG für 2 Stunden zu exprimieren, dann pelletiert und in 200 μl RMPI/10% FBS erneut suspendiert. 10 μl der induzierten bakteriellen Suspension wurde auf Platten mit 96 Vertiefungen, die autologe Monozyten abgeleitete dendritische Zellen enthielten, transferiert. Nach einer zweistündigen Inkubation wurden die dendritischen Zellen gewaschen, um E. coli zu entfernen, und die T-Zellen wurden zugegeben. Positive E. coli-Pools wurden durch Bestimmung der IFN-gamma-Produktion und Proliferation von T-Zellen in den Pools identifiziert. Die Anzahl von Pools, die durch jede T-Zell-Linie identifiziert wurden, ist wie folgt: CT1-Linie: 30/480 Pools; CT3-Linie: 91/960 Pools; CT10-Linie: 40/480 Pools; CT11-Linie: 51/480 Pools. Die unter Verwendung dieses Ansatzes identifizierten Klone werden in SEQ ID Nr. 1–14 dargelegt.
In einem anderen Beispiel unter Verwendung von im Wesentlichen dem gleichen Ansatz, der oben beschrieben wurde, identifizierten wir 12 zusätzliche T-Zell-reaktive Klone aus Chlamydia trachomatis Serovar E Expressions-Screening. Klon E5-E9-3 (CT1 positiv) enthält ein 636 bp Insert, das partiell den OLR für dnaK-ähnliches Gen codiert. Ein Teil dieser Sequenz wurde auch in Klon E1-A5-53 identifiziert. Klon E4-H3-56 (CTI positiv, 463 bp Insert) enthält einen partiellen OLR für das TSA-Gen (CT603) auf dem komplementären Strang. Das Insert für Klon E2-G12-52 (1.265 bp) wurde in der CT11-Linie identifiziert. Es enthält einen partiellen OLR für cipB, eine Protease-ATPase. Ein anderer Klon, der mit der CT11-Linie identifiziert wurde, E1-F9-79 (167 bp), enthält einen partiellen OLR für das Gen CT133 auf dem komplementären Strang. CT133 ist eine vorhergesagte rRNA-Methylase. Klon E4-D2-79 (CT3 positiv) enthält ein 1.181 pb Insert, das ein partieller OLR für nrdA-Gen ist. Der OLR für dieses Gen wurde auch in Klon E2-B10-52 (CT10 positiv) identifiziert. Klon E6-C8-95 enthält ein 731 pb Insert, das unter Verwendung der Spenderlinien CT3, CT1 und CT12 identifiziert wurde. Dieses Insert weist eine Carboxy-terminale Hälfte für das Gen für den 60 kDA OLR auf. Klon E7-H11-61 (Ct3 positiv – 1.135 bp) besitzt partielle Inserts für fliA (CT061), tyrS (CT062), TSA (CT603) und ein hypothetisches Protein (CT602). Das Insert für Klon E5-A11-8 (CT10 positiv – 1.736 pb) enthält den kompletten OLR für groES (CT111) und einen Hauptanteil für den OLR für groEL (CT110). Klon E3-F2-37 (CT10, CT3, CT11 und CT12 positiv – 1.377 bp Insert) enthält einen partiellen OLR für Gen tRNA-Trp (CT322) und einen vollständigen OLR für das Gen secE (CT321). E4-G9-75 ist ein anderer CT10-Klon, der einen partiellen OLR (723 pb Insert) für die Amino-terminale Region des pmpH-Gens (CT872) enthält. Klon E2-D5-89 (516 pb) ist auch ein CT10-positiver Klon, der einen partiellen OLR für pmpD-Gen (12) enthält. Das Insert für Klon ES-E2-10 (CT10 positiv) ist 427 pb und enthält einen partiellen OLR für das Haupt-äußere-Membran-Protein omp1.
Beispiel 2
Zusätzliche CD4 T-Zell-Expressionsklonierung für die Identifikation von T-Zell-stimulierenden Antigenen von Chlamydia trachomatis Serovar E
Es wurden 20 Sequenzen aus einzelnen Klonen unter Verwendung eines Chlamydia trachomatis Serovar E (Ct E) Bibliotheks-Expression-Screening-Verfahrens isoliert. Beschreibungen, wie die Klone und Linien erzeugt wurden, werden in Beispiel 1 bereitgestellt.
Von Klon E5-A8-85 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) wurde herausgefunden, dass er ein 1.433 bp Insert enthält. Dieses Insert enthält eine große Region der C-terminalen Hälfte des CT875, eines Chlamydia trachomatis hypothetisch spezifischen Gens, das in SEQ ID Nr. 34 offenbart wird. Ebenfalls in diesem Klon liegt ein partiell offener Leserahmen (OLR) eines hypothetischen Proteins CT001 vor, das auf dem komplementären Strang ist.
Von dem Klon E9-G2-93 (identifiziert unter Verwendung der C10-Patientenlinie) wurde gezeigt, dass er 554 pb Insert enthält, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 33 offenbart wird. Diese Sequenz codiert einen partiellen OLR für CT178, ein hypothetisches CT-Protein.
Klon E7-B1-16 (identifiziert unter Verwendung der Patientenlinien CT10, CT3, CT5, CT11, CT13 und CHH037) besitzt ein 2.577 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 32 offenbart wird. Von diesem Klon wurde herausgefunden, dass er 3 OLRs enthält. Der erste OLR enthält fast den gesamten OLR für CT694, ein Chlamydia trachomatis(CT)-spezifisches hyptothetisches Protein. Der zweite OLR ist ein OLR in voller Länge für CT695, ein anderes hyptothetisches CT-Protein. Der dritte OLR ist der N-terminale Anteil von CT696.
Klon E9-D5-8 (identifiziert unter Verwendung der Patientenlinien CT10, CT1, CT4 und CT11) enthält ein 393 bp Insert, das in SEQ ID Nr. 31 offenbart wird. Es wurde herausgefunden, dass es einen partiellen OLR für CT680, das S2 ribosomale Protein, codiert.
Klon E9-E10-51 (identifiziert unter Verwendung der Patientenlinie CT10) enthält ein 883 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 30 offenbart wird. Dieser Klon enthält zwei partielle OLRs. Der erste von diesen ist die C-terminale Hälfte von CT680, die einige Überlappung mit dem Insert zeigen kann, das in Klon E9-D5-8 vorliegt. Der zweite OLR ist der N-terminale partielle OLR für CT679, welches der Verlängerungsfaktor TS ist.
Klon E3-B4-18 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) enthält 1.224 pb Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 29 offenbart wird. Dieser Klon enthält vier OLRs. An dem N-terminalen Ende des Klons befindet sich der komplette OLR für CT772, codierend für anorganische Pyrophosphatase. Der zweite OLR ist ein kleiner Teil des C-terminalen Endes von CT771 auf dem komplementären Rahmen. Der dritte ist ein OLR des hypothetischen Proteins, CT191, und der vierte ist ein partieller OLR für CT190, DNA-Gyrase-B.
Klon E10-B2-57 (identifiziert unter Verwendung der CT10-Patientenlinie) enthält ein 822 pb Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 42 offenbart wird. Dieser Klon enthält den kompletten OLR für CT066, ein hypothetisches Protein auf dem komplementären Strang.
Klon E3-F3-18 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) enthält 1.141 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 41 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für pmpG (CT871) im Rahmen mit dem β-gal-Gen.
Klon E4-D6-21 (identifiziert unter Verwendung der CT3-Patientenlinie) enthält ein 1.297 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 40 offenbart wird. Dieser Klon enthält einen sehr kleinen Teil von xseA (CT329), den gesamten OLR für tpiS (CT328) auf dem komplementären Strang und einen partiellen Amino-terminalen OLR für trpC (CT327) auf dem oberen Rahmen.
Klon E1-G9-23 (identifiziert unter Verwendung der CT3-Patientenlinie) enthält ein 1.180 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 39 offenbart wird. Dieses Klon enthält fast den gesamtn OLR für Glycogensynthase (CT798).
Klon E3-A3-31 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) enthält ein 1.834 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 38 offenbart wird. Dieser Klon enthält eine große Region des hypothetischen Gens CT622.
Klon E2-F7-11 (identifiziert unter Verwendung sowohl der CT3- wie auch der CT10-Patientenlinien) enthält ein 2.093 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 37 offenbart wird. Dieser Klon enthält eine große Region des rpoN-Gens (CT609) im Rahmen mit β-gal und den kompletten ORL für das hyptothetische Gen CT610 auf dem komplementären Strang. Zusätzlich enthält er auch das carboxyterminale Ende von CT611, einem anderen hypothetischen Gen.
Klon E7-H11-10 (identifiziert unter Verwendung der CT3-Patientenlinie) enthält ein 1.990 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 36 offenbart wird. Dieser Klon enthält den Amino-terminalen partiellen ORL für CT610, einen vollständigen OLR für CT611, einen anderen vollständigen OLR für CT612 und einen Carboxy-terminalen Teil von CT613. Alle diese Gene sind hypothetisch und alle liegen auf dem komplementären Strang vor.
Klon E10-C6-45 (identifiziert unter Verwendung der CT3-Patientenlinie) enthält ein 196 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 35 offenbart wird. Dieser Klon enthält einen partiellen OLR für nrdA (CT827) im Rahmen mit β-gal. Dieser Klon enthält ein relativ kleines Insert und hat besonderen Nutzen bei der Bestimmung des Epitops dieses Gens, das zu der Immunogenität von Serovar E beiträgt.
Klon E3-H6-10 (identifiziert unter Verwendung der CT12-Patientenlinie) enthält ein 3.734 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 48 offenbart wird. Dieser Klon enthält OLRs für eine Reihe von hypothetischen Proteinen. Er enthält die partiellen OLRs für CT223 und CT229 und die kompletten OLRs für CT224, CT225, CT226, CT227 und CT228.
Klon E4-C3-40 (identifiziert unter Verwendung der CT10-Patientenlinie) enthält ein 2.044 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 47 offenbart wird. Dieser Klon enthält einen partiellen OLR für nrdA (CT827) und den kompletten OLR für nrdB (CT828).
Klon E2-D8-19 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) enthält ein 2.010 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 46 offenbart wird. Dieser Klon enthält sowohl den OLR für das Chlamydia trachomatis-Plasmid wie auch partielle OLRs für OLR3 und OLR6 und vollständige OLRs für OLR4 und OLR5.
Klon E3-D10-46 (identifiziert unter Verwendung der Patientenlinien CT1, CT3, CT4, CT11 und CT12) enthält ein 1.666 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 45 offenbart wird. Dieser Klon enthält einen partiellen OLR für CT770 (fab F), einen vollständigen OLR für CT771 (Hydrolase/Phosphatasehomolog), einen vollständigen OLR für CT772 (ppa, anorganische Phosphatase) und einen partiellen OLR für CT773 (ldh, Leucin-Dehydrogenase).
Klon E10-H8-1 (identifiziert unter Verwendung sowohl der CT3- wie auch CT10-Patientenlinien) enthält ein 1.862 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 44 offenbart wird. Es enthält die partiellen OLRs für CT871 (pmpG) wie auch CT872 (pmpH).
Klon E3-F3-7 (identifiziert unter Verwendung der CT1-Patientenlinie) enthält ein 1.643 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 43 offenbart wird. Es enhält die partiellen OLRs für sowohl CT869 (pmpE) wie auch CT870 (pmpF).
Beispiel 3
Zusätzliche CD4 T-Zell-Exprssionsklonierung für die Identifikation von T-Zell-stimulierenden Antigenen von Chlamydia trachomatis Serovar E
Die T-Zell-Linie CHH037 wurde aus einer 22 Jahre alten gesunden Frau, die für Chlamydia sero-negativ war, erzeugt. Diese Linie wurde verwendet, um die Chlamydia trachomatis Serovar E Bibliothek zu screenen. 19 Klone wurden auf diesem Screening identifiziert, wie unten beschrieben wird.
Klon E7-B12-65 enthält ein 1.179 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 114 offenbart wird. Es enthält den vollständigen OLR des Gens für Malatdehydrogenase (CT376) auf dem komplementären Strang.
Klon E4-H9-83 enthält ein 772 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 115 identifziert wird. Es enthält den partiellen OLR für das Hitzeschock-Protein GroEL (CT110).
Klon E9-B10-52 enthält ein 487 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 116 identifziert wird. Es enthält einen partiellen OLR für das Gen yscC (CT674), einem allgemeinen Sekretionsweg-Protein.
Klon E7-A7-79 enthält ein 1.014 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 117 offenbart wird. Es enthält den kompletten OLR für das Histon-ähnliche Entwicklungsgen, hctA (CT743) und einen partiellen ORL für das rRNA-Methyltransferasegen ygcA (CT742).
Klon E2-D11-18 enthält ein 287 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 118 offenbart wird. Es enthält den partiellen OLR für hctA (CT743).
Klon E9-H6-15, identifiziert unter Verwendung der CT3-Linie, enthält ein 713 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 125 offenbart wird. Es enthält den partiellen OLR für das pmpB-Gen (CT 413).
Klon E3-D10-87, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 780 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 126 offenbart wird. Es enthält den partiellen OLR für CT388, ein hypothetisches Gen, auf dem komplementären Strang und einen partiellen OLR für CT389, ein anderes hypothetisches Protein.
Klon E9-D6-43, identifiziert unter Verwendung der CT3-Linie, enthält ein 433 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 127 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für CT858.
Klon E3-D10-4, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 803 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 128 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für pGP3-D, einen OLR, der auf dem Plasmid pCHL1 codiert wird.
Klon E3-G8-7, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 842 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 129 offenbart wird. Es enthält partielle OLRs für CT557 (Leda) und CT558 (LipA).
Klon E3-F11-32, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 813 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 130 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für pmpD (CT812).
Klon E2-F8-5, identifiziert unter Verwendung der CT12-Linie, enthält ein 1.947 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 131 offenbart wird. Es enthält einen kompletten OLR für den 15 kDa OLR (CT442) und einen partiellen OLR für den 60 kDa OLR (CT443).
Klon E2-G4-39, identifiziert unter Verwendung der CT12-Linie, enthält ein 1.278 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 132 offenbart wird. Es enthält den partiellen OLR für den 60 kDa OLR (CT443).
Klon E9-D1-16, identifiziert unter Verwendung der CT10-Linie, enthält ein 916 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 133 enthüllt wird. Es enthält den partiellen OLR für das pmpH (CT872).
Klon E3-F3-6, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 751 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 134 enthüllt wird. Es enthält die partiellen OLRs, alle auf dem komplementären Strang, für die Gene accB (CT123), L13 ribosomal (CT125) und S9 ribosomal (CT126).
Klon E2-D4-70, identifiziert unter Verwendung der CT12-Linie, enthält ein 410 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 135 offenbart wird. Es enthält den partiellen OLR für das pmpC-Gen (CT414).
Klon E5-A1-79, identifiziert unter Verwendung der CT1-Linie, enthält ein 2.719 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 136 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für ydhO (CT127), einen vollständigen OLR für S9 ribosomales Gen (CT126 auf dem komplementären Strang), einen vollständigen OLR für das L13 ribosomale Gen (CT125 auf dem komplementären Strang) und einen partiellen OLR für accC (CT124 auf dem komplementären Strang).
Klon E1-F7-16, identifiziert unter Verwendung der Linien CT12, CT3 und CT11, enthält ein 2.354 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 137 offenbart wird. Es enthält einen partiellen OLR für das ftsH-Gen (CT841) und den gesamten OLR für das pnp-Gen (CT842) auf dem komplementären Strang.
Klon E1-D8-62, identifiziert unter Verwendung der CT12-Linie, enthält ein 898 bp Insert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 138 offenbart wird. Es enthält partielle OLRs für das ftsH-Gen (CT841) und für das pnp-Gen (CT842).
Beispiel 4
Expression von Chlamydia trachomatis rekombinanten Proteinen
Verschiedene Chlamydia trachomatis Serovar E spezifische Gene wurden in pET17b kloniert. Dieses Plasmid schließt einen 6X Histidinmarker an dem N-Ende ein, um die Expression und Reinigung von rekombinanten Proteinen zu ermöglichen.
Die zwei rekombinanten Proteine voller Länge, CT622 und CT875, wurden in E. coli exprimiert. Diese beiden Gene wurden unter Verwendung von CtLGVII-Expressions-Screening identifiziert, aber die Serovar E-Homologe wurden exprimiert. Die Primer, die verwendet wurden, um diese Gene zu amplifizieren, basierten auf Serovar D-Sequenzen. Die Gene wurden unter Verwendung von Serovar E genomischer DNA als der Matrize amplifziert. Einmal amplifiziert, wurden die Fragmente in pET-17b mit einem N-terminalen 6X-His-Marker kloniert. Nach der Transformation des rekombinanten Plasmids in XL-I-Blau-Zellen, wurde die DNA präpariert und die Klone vollständig sequenziert. Die DNA wurde dann in die Expressionswirt BL21-pLysS-Zellen (Novagen) für die Herstellung der rekombinanten Proteine transformiert. Die Proteine wurden mit IPTG induziert und auf Ni-NTA-Agarose unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt. Die DNA-Sequenzen für CTE622 und CTE875 werden in SEQ ID Nr. 28 bzw. 27 offenbart und ihre Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID Nr. 139 bzw. 140 offenbart.
Fünf zusätzliche Chlamydia trachomatis-Gene wurden geklont. Das Chlamydia trachomatis-spezifische Protein CT694, das Protein CT695 und das L1-ribosomale Protein, deren DNA-Sequenzen in SEQ ID Nr. 119, 120 bzw. 121 offenbart werden.
Die Proteinsequenzen dieser 6X Histidin-rekombinanten Proteine werden in SEQ ID Nr. 122 (CT694), 123 (CT695) und 124 (L1-ribosomales Protein) offenbart. Die Gene CT875 und CT622 von Serovar E wurden ebenfalls unter Verwendung von pET17b als 6X-His-Fusionsproteine geklont. Diese rekombinanten Proteine wurden exprimiert und gereinigt und ihre Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID Nr. 140 bzw. 139 offenbart.
Beispiel 5
Rekombinante Chlamydia-Antigene, die durch T-Zell-Linien erkannt werden.

Patienten-T-Zell-Linien wurden aus den folgenden Spendern erzeugt:
CT1, CT2, CT3, CT4, CT5, CT6, CT7, CT8, CT9, CT10, CT11, CT12, CT13, CT14, CT15 und CT16. Eine Zusammenfassung ihrer Details wird in Tabelle II eingschlossen.

Tabelle II: C. trachomatis-Patienten
Patienten	Geschlecht	Alter	Klinische Manifestation	Serovar	IgG-Titer	Multiple Infektionen
CT1	M	27	NGU	LCR	Negativ	Nein
CT2	M	24	NGU	D	Negativ	E
CT3	M	43	Asymptomatisch Abgabe Eb Dx war HPV	J	Ct 1:512 Cp 1:1024 Cps 1:256	Nein
CT4	W	25	Asymptomatisch Abgabe Eb	J	Ct 1:1024	Y
CT5	W	27	BV	LCR	Ct 1:256 Cp 1:256	F/F
CT6	M	26	Perinealer Ausschlag, Ausfluss, Dysurie	G	Cp 1:1024	N
CT7	W	29	BV Genitalulcus	E	Ct 1:512 Cp 1:1024	N
CT8	W	24	Nicht bekannt	LCR	Nicht getestet	NA
CT9	M	24	Asymptomatisch	LCR	Ct 1:128 Cp 1:128	N
CT10	W	20	Milder Juckreiz vulvär	Negativ	Negativ	12/1/98
CT11	W	21	BV abnormaler pap	J	Ct 1:512	F/F/J/E/E PID 6/96
CT12	M	20	Asymptomatisch	LCR	Cp 1:512	N
CT13	W	18	BV, Gonorrhoe, Ct vaginal	G	Ct 1:1024	N
CT14	M	24	NGU	LCR	Ct 1:256 Cp 1:256	N
CT15	W	21	Muco-purulente Zervicitis	Kultur	Ct 1:256 Ct IgM	N
CT16	M	26	Asymptomatisch/Kontakt	LCR	NA	N
CT8	M	38	Keine klinische Anamnese für Erkrankung	Negativ	Negativ	Nein
NGU = Non-Gonokokken-Urethritis; BV = Bakterielle Vaginose; CT = Chlamydiatrachomatis; Cp = Chlamydia pneumoniae; Eb = Chlamydia Elementarkörper; HPV = menschliches Papillomvirus; Dx = Diagnose; PID = Pelvic Inflammatory Disease; LCR = Ligase-Kettenreaktion.

PBMC wurden aus einer zweiten Reihe von Spendern gesammelt und T-Zell-Linien wurden von einer Untergruppe von diesen erzeugt. Eine Zusammenfassung der Details für drei solcher T-Zell-Linien wird in der Tabelle unten aufgeführt.

Tabelle III: Normale Spender

Spender Geschlecht Alter CT-IgG-Titer CP-IgG-Titer

CHH011 W 49 1:64 1:16

CHH037 W 22 0 0

CHH042 W 25 0 1:16
Spender CHH011 ist eine gesunde 49 Jahre alte weibliche Spenderin, die für C. trachomatis seronegativ ist. PBMC produzierten höhere Mengen an IFN-gamma in Reaktion auf C. trachomatis-Elementarkörper im Vergleich zu C. pneumoniae-Elementarkörpern, was auf eine C. trachomatis-spezifische Reaktion hinweist. Spender CHH037 ist eine 22 Jahre gesunde weibliche Spenderin, die für C. trachomatis seronegativ ist.
PBMC produzierten höhere Mengen an IFN-gamma in Reaktion auf C. trachomatis-Elementarkörper im Vergleich zu C. pneumoniae-Elementarkörpern, was auf eine C. trachomatis-spezifische Reaktion hinweist. CHH042 ist eine 25 Jahre alte gesunde weibliche Spenderin mit einem IgG-Titer von 1:16 für C. pneumoniae. PBMC produzierten höhere Mengen an IFN-gamma in Reaktion auf C. trachomatis-Elementarkörper im Vergleich zu C. pneumoniae-Elementarkörpern, was auf eine C. trachomatis-spezifische Reaktion hinweist.
Rekombinante Proteine für verschiedene Chlamydia-trachomatis-Gene wurden wie oben beschrieben erzeugt. Sequenzen für MOMP wurden von Serovar F abgeleitet. Die Gene CT875, CT622, pmp-B-2, pmpA und CT529 wurden von Serovar E und die Sequenzen für die Gene gro-EL, Swib, pmpD, pmpG, TSA, CT610, pmpC, pmpE, S13, IpdA, pmpl und pmpH-C wurden von LII abgeleitet.

Verschiedene der Patienten- und Spenderlinien, die oben beschrieben wurden, wurden gegen die rekombinanten Chlamydia-Proteine getestet. Tabelle IV fasst die Ergebnisse der T-Zell-Reaktionen auf die rekombinanten Chlamydia-Proteine zusammen.

Tabelle IV: Rekombinante Chlamydia-Antigene, die durch T-Zell-Linien erkannt werden
Antigen	Serovar	Anzahl von Treffern	CL 8 L2	CT 10 E	CT 1 E	CT 3 E	CT 4 L2	CT 5 E	CT 11 E	CT 12 E	CT 13 E	CHH-011 E	CHH-037 E
gro-EL (CT110)	L2	10	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
MompF (CT681)	F	10	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
CT875	E	8	-	+	+	-	+	+	+	+	+	-	+
SWIB (CT460)	L2	8	+	+	-	+	-	+	-	+	+	+	+
pmpD (CT812)	L2	5	-	+	+	+	+	-	-	+	+	-	-
pmpG (CT871)	L2	6	-	+	+	-	+	+	nt	-	+	+	-
TSA (CT603)	L2	6	-	-	+	+	+	+	-	-	+	-	+
CT622	E	3	-	-	+	-	+	-	-	-	+	-	-
CT610	L2	3	-	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-
pmpB-2 (CT413)	E	3	-	-	+	+	+	-	-	-	-	-	-
pmpC (CT414)	L2	4	-	-	-	+	-	+	-	+	-	-	+
pmpE (CT869)	L2	3	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-	-
S13 (CT509)	L2	2	+	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-
IpdA (CT557)	L2	3	-	-	+	+	-	-	-	-	-	+	-
pmpl (CT874)	L2	2	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+	-
pmpH-C (CT872)	L2	1	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-
pmpA (CT412)	E	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
CT529	E	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Obwohl die vorliegende Erfindung in einiger Ausführlichkeit mit Hilfe von Veranschaulichung und Beispiel für die Zwecke der Klarheit des Verständnisses beschrieben wurde, können Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden, ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen, der nur durch den Umfang der anhängigen Ansprüche limiert werden soll. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, umfassend: (a) ein Polypeptid, umfassend: (i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder (b) ein Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß (a); zur Verwendung bei der Diagnose, Behandlung oder Prävention einer Chlamydiainfektion.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Polypeptid umfasst, umfassend: (i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, die ein Polypeptid umfasst, bestehend aus: (i) der Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder einer Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einem immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon umfasst, mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfester der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon umfasst, mit einer mindestens 95%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfester der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 139 umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Polypeptid einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139 umfasst, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei der immunogene Teil mindestens 20 Aminosäuren lang ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Polynukleotid umfasst, codierend ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz mit Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon umfasst, mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10, die ein Polynukleotid mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 28 umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Polynukleotid umfasst, codierend ein Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid von (a) ein Fusionsprotein ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Vakzin, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 und ein Immunstimulans.
Vakzin gemäß Anspruch 15, wobei das Immunstimulans ein Adjuvans ist.
Verwendung von (a) einem Polypeptid, umfassend: (i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder (b) einem Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß (a); zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention einer Chlamydiainfektion.
Verwendung von (a) einem Polypeptid, umfassend: (i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder (b) einem Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß (a); zum Nachweis einer Chlamydiainfektion in einem Patienten.
Verwendung von (a) einem Polypeptid, umfassend: (i) die Aminosäuresequenz mit den Resten 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139 oder eine Variante davon mit einer mindestens 90%igen Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der Reste 8 bis 660 von SEQ ID Nr. 139; oder (ii) einen immunogenen Teil der Aminosäurereste 8 bis 660 der Sequenz von SEQ ID Nr. 139, der mindestens 15 Aminosäuren lang ist; oder (b) einem Polynukleotid, codierend das Polypeptid gemäß (a); zur Herstellung eines diagnostischen Kits zum Nachweis einer Chlamydiainfektion in einem Patienten.