DE60130468T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von chlamydia-infektionen - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Nachweis und die Behandlung von Chlamydia-Infektion. Insbesondere betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, die Polypeptid umfassen, die ein Chlamydia-Antigen umfassen, und die Verwendung solcher Polypeptide für die Serodiagnose und Behandlung von Chlamydia-Infektion.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Chlamydiae sind intrazelluläre, bakterielle Pathogene, die für eine große Bandbreite von wichtigen menschlichen und tierischen Infektionen verantwortlich sind. Chlamydia trachomatis ist einer der häufigsten Gründe für sexuell übertragbare Erkrankungen und kann zu pelvic inflammatory disease (PID) führen, was zu Eileiterobstruktion und Infertilität führen kann. Chlamydia trachomatis kann auch eine Rolle bei männlicher Infertilität spielen. 1990 wurden die Kosten für die Behandlung von PID in den USA auf 4 Milliarden Dollar geschätzt. Trachom aufgrund okulärer Infektion mit Chlamydia trachomatis ist der Hauptgrund für verhinderbare Erblindung weltweit. Chlamydia pneumonia ist eine Hauptursache für akute Atemwegsinfektionen bei Menschen und man glaubt auch, dass es eine Rolle bei der Pathogenese der Atherosklerose und insbesondere bei koronarer Herzerkrankung spielt. Von Individuen mit einem hohen Antikörpertiter gegen Chlamydia pneumonia wurde gezeigt, dass sie mindest doppelt so wahrscheinlich an einer koronaren Herzerkrankung leiden wie seronegative Individuen. Chlamydien-Infektionen stellen daher ein signifikantes Gesundheitsproblem sowohl in den USA wie auch weltweit dar.
  • Chlamydien-Infektion ist oft asymptomatisch. Zum Beispiel kann zu dem Zeitpunkt, an dem eine Frau medizinische Beachtung wegen PID sucht, bereits ein irreversibler Schaden aufgetreten sein, der zur Infertilität führt. Es bleibt daher ein Bedarf auf dem Fachgebiet für verbesserte Impfstoffe und pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verhinderung und Behandlung von Chlamydia-Infektionen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Notwendigkeit und stellt weiter andere verwandte Vorteile bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen für die Therapie von Chlamydia-Infektion bereit. Bei einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die Polypeptide umfassen, die ein Chlamydia-Antigen mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 431 aufgelistet wird, oder eine Variante eines solchen Antigens mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge von SEQ ID Nr. 431 bestimmt wird, für die Verwendung bei der Stimulation einer Immunreaktion bei einem Patienten und für die Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Chlamydia-Infektion umfassen. Bestimmte Varianten sind immunogen, so dass die Fähigkeit der Variante, mit antigenspezifischen Antiseren zu reagieren, nicht wesentlich vermindert wird. Bei bestimmten Ausführungsarten umfasst das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die durch die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NR. 407 codiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter Zusammensetzungen bereit, die Polynukleotide umfassen, die ein Polypeptid codieren, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, für die Verwendung bei der Stimulation einer Immunreaktion bei einem Patienten und für die Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Chlamydia-Infektion, z.B. umfasst die Zusammensetzung ein Polynukleotid, das die Sequenz von SEQ ID NR. 407 umfasst oder daraus besteht.
  • Bei einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine bereit, die ein Polypeptid umfassen, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, oder alternativ ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, und ein bekanntes Chlamydia-Antigen umfasst, wie auch Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren, in Kombination mit einem physiologisch akzeptablen Träger oder Immunstimulanz für die Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfungen davon.
  • Bei anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein oder mehrere Chlamydia-Polypeptide, wie die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon, mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu umfassen, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, z.B. ein Polypeptid gemäß SEQ ID NR. 431 oder ein Polynukleotidmolekül, das ein solches Polypeptid codiert, wie ein Polynukleotid gemäß SEQ ID NR. 407 und die einen physiologisch akzeptablen Träger umfassen. Die Erfindung stellt auch Impfstoffe für prophylaktische und therapeutische Zwecke bereit, umfassend ein oder mehrere Polypeptide, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, und ein Immunstimulanz, wie hier definiert wird, zusammen mit Impfstoffen, umfassend ein oder mehrere Polynukleotidsequenzen, die solche Polypeptide codieren, und ein Immunstimulanz.
  • Auch bereitgestellt wird die Verwendung eines (a) Polypeptids, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der SEQ ID NR. 431 bestimmt wird; oder (b) eines Polynukleotids, das das Polypeptid (a) codiert; bei der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder Prävention von Chlamydia-Infektion.
  • Weiter bereitgestellt wird die Verwendung eines (a) Polypeptids, umfassend die Sequenz der SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird; oder (b) ein Polynukleotid, das das Polypeptid von (a) codiert; für den Nachweis von Chlamydia-Infektion bei einem Patienten.
  • Zusätzlich bereitgestellt wird die Verwendung eines (a) Polypeptids, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird; oder (b) eines Polynukleotids, das das Polypeptid von (a) codiert; bei der Herstellung eines diagnostischen Kits für den Nachweis von Chlamydia-Infektion bei einem Patienten.
  • Sequenzidentifikationen
    • SEQ ID NR. 1 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis Klon 1-B1-66.
    • SEQ ID NR. 4 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis Klon 10-C10-31.
    • SEQ ID NR. 5 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz für 1-B1-66.
    • SEQ ID NR. 12 ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz für 10-C10-31.
    • SEQ ID NR. 31 ist die Aminosäuresequenz für ein 10meres Konsensuspeptid von CtC7.8-12 und CtC7.8-13.
    • SEQ ID NR. 39 ist die Aminosäuresequenz für CtSwib 52-67 Peptid von C. trachomatis LGV II.
    • SEQ ID NR. 56 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 14-H1-4, das mit dem thiolspezifischen Antioxidanzgen CT603 Homologie teilt.
    • SEQ ID NR. 57 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 12-G3-83, das mit dem hypothetischen Protein CT622 Homologie teilt.
    • SEQ ID NR. 59 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 11-H4-28, das mit dem dnaK Gen CT396 Homologie teilt.
    • SEQ ID NR. 60 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 11-H3-68, das teilweise Homologie mit dem PGP6-D-Virulenzprotein und L1 ribosomalem Gen CT318 teilt.
    • SEQ ID NR. 62 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 11-G10-46, das mit dem hypothetischen Protein CT610 Homologie teilt.
    • SEQ ID NR. 87 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 15-H2-76, das teilweise Homologie mit den pmpD- und SycE-Genen und dem CT089 ORF teilt.
    • SEQ ID NR. 110 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 21-G12-60, das teilweise offene Leserahmen für die hypothetischen Proteine CT875, CT229 und CT228 enthält.
    • SEQ ID NR. 111 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 22-B3-53, das mit dem CT110 ORF von GroEL Homologie teilt.
    • SEQ ID NR. 114 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 17-C10-31, das teilweise Homologie mit dem CT858 ORF teilt.
    • SEQ ID NR. 115 ist die bestimmte DNA-Sequenz für das C. trachomatis LGV II Klon 21-C7-8, das Homologie mit dem dnaK-ähnlichen Gen teilt.
    • SEQ ID NR. 407 stellt die Serovar-D-DNA-Sequenz von dem Chlamydia trachomatis-Gen CT858 in voller Länge dar.
    • SEQ ID NR. 431 stellt die Serovar-D-Aminosäuresequenz des Chlamydia trachomatis-Gens CT858 in voller Länge dar.
  • Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt Antikörper-Isotyptiter bei C57B1/6-Mäusen, die mit C. trachomatis SWIB-Protein immunisiert wurden.
  • 2 zeigt Chlamydia-spezifische T-Zell-proliferative Reaktionen bei Splenozyten von C3H-Mäusen, die mit C. trachomatis SWIB-Protein immunisiert wurden.
  • 3 zeigt die C. trachomatis-spezifischen SWIB-proliferativen Reaktionen auf eine primäre T-Zelllinie (TCT-10 EB) von einem asymptomatischen Spender.
  • 4 veranschaulicht die Identifikation des T-Zell-Epitops in C. trachomatis SWIB mit einer antigenspezifischen T-Zelllinie (TCL-10 EB).
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Wie oben angemerkt wurde, richtet sich die vorliegende Erfindung allgemein auf Zusammensetzungen für die Behandlung von Chlamydia-Infektion. Bei einem Aspekt beinhalten die Zusammensetzungen der betreffenden Erfindung Polypeptide, die das Chlamydia-Antigen von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 gezeigt wurde, umfassen.
  • Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Polypeptid" Aminosäureketten von jeder Länge, einschließlich Proteine vollständiger Länge (sprich Antigene), worin die Aminosäurereste über covalente Peptidbindungen verbunden sind. So kann ein Polypeptid, das einen immunogenen Anteil eines Antigens umfasst, vollständig aus dem immunogenen Anteil bestehen oder kann zusätzliche Sequenzen enthalten. Die zusätzlichen Sequenzen können von dem nativen Chlamydia-Antigen stammen oder sie können heterolog sein und solche Sequenzen können (aber müssen nicht) immunogen sein.
  • Der Begriff "Polynukleotid(e)", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer von Desoxyribonukleotid oder Ribonukleotidbasen und beinhaltet DNA und korrespondierende RNA-Moleküle, einschließlich HnRNA- und mRNA-Moleküle, sowohl Sinn- wie auch Gegensinnstränge, und umfasst cDNA, genomische DNA und rekombinante DNA, wie auch vollständig oder teilweise synthetisierte Polynukleotide. Ein HnRNA-Molekül enthält Introns und korrespondiert zu einem DNA-Molekül auf eine im allge meinen 1:1-Weise. Ein mRNA-Molekül korrespondiert zu einem HnRNA- und DNA-Molekül, von dem die Introns exzidiert wurden. Ein Polynukleotid kann aus einem gesamten Gen oder irgendeinem Anteil davon bestehen. Operable Gegensinn-Polynukleotide können ein Fragment des korrespondierenden Polynukleotids umfassen und die Definition von "Polynukleotid" beinhaltet daher alle solchen operablen Gegensinn-Fragmente.
  • Polypeptide, die die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, umfassen, können allgemein allein oder in Kombination verwendet werden, um Chlamydia-Infektion bei einem Patienten nachzuweisen.
  • Die Zusammensetzungen und Verwendungen der vorliegenden Erfindung umfassen auch Varianten von Polypeptiden, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, und Polynukleotide, die solche Polypeptidmoleküle codieren. Solche Varianten können natürlich auftretende allele Varianten der Erfindungssequenzen beinhalten, sind aber nicht darauf begrenzt. Insbesondere können Varianten andere Chlamydiae-Serovare, wie die Serovare D, E und F, wie auch die verschiedenen LGV-Serovare, die Homologie mit den Polypeptid- und Polynukleotidmolekülen, die hier beschrieben werden, teilen, beinhalten. Vorzugsweise zeigen die Serovar-Homologe 95 bis 99%ige Homologie zu der korrespondierenden Polypeptidsequenz (den Sequenzen), die hier beschrieben werden.
  • Eine Polypeptid-"Variante", wie sie hier verwendet wird, ist ein Polypeptid, das sich von dem angegebenen Polypeptid nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet, so dass die antigenen Eigenschaften des Polypeptids erhalten bleiben. Bei einer bevorzugten Ausführungsart unterscheiden sich die Variant-Polypeptide von einer identifizierten Sequenz durch Substitution, Deletion oder Addition von fünf Aminosäuren oder weniger. Solche Varianten können allgemein durch Modifizierung der Referenz-Polypeptidsequenz und Evaluierung der antigenen Eigenschaften des modifizierten Polypeptids unter Verwendung von z.B. den repräsentativen Verfahrensweisen, die hier beschrieben werden, identifiziert werden. In anderen Worten kann die Fähigkeit einer Variante, mit antigenspezifischen Antiseren zu reagieren, gesteigert oder unverändert belassen werden, relativ zu dem nativen Protein, oder sie kann um weniger als 50% und vorzugsweise weniger als 20%, relativ zu dem nativen Protein, vermindert werden. Solche Varianten können im allgemeinen durch Modifikation der Referenz-Polypeptidsequenz und Evaluation der Reaktivität des modifizierten Polypeptids mit Antigen-spezifischen Antikörpern oder Antiseren, wie hier beschrieben wird, identifiziert werden. Bevorzugte Varianten beinhalten diejenigen, in denen eine oder mehrere Anteile, wie eine N-terminale Leadersequenz oder Transmembrandomäne, entfernt wurden. Andere bevorzugte Varianten beinhalten Varianten, bei denen ein kleiner Teil (z.B. 1 bis 30 Aminosäuren, vorzugsweise 5 bis 15 Aminosäuren) von dem N- und/oder C-Ende des reifen Proteins entfernt wurde.
  • Wie hier verwendet, ist eine "konservative Substitution" eine, bei der eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften aufweist, substituiert wird, so dass ein Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie erwarten würde, dass die sekundäre Struktur und hydropathische Natur des Polypeptids im wesentlichen unverändert ist. Aminosäuresubstitutionen können im allgemeinen auf der Basis von Ähnlichkeit in Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden. Zum Beispiel beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophiliewerten beinhalten Leucin, Isoleucin und Valin; Glycin und Alanin; Asparagin und Glutamin und Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin. Andere Gruppen der Aminosäuren, die konservative Änderungen darstellen können, beinhalten: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his und (5) phe, tyr, trp, his. Eine Variante kann auch oder alternativ nicht-konservative Änderungen enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsart unterscheiden sich Variant-Polypeptide von einer nativen Sequenz durch Substitution, Deletion oder Addition von fünf Aminosäuren oder weniger. Varianten können auch (oder alternativ) durch z.B. die Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluss auf die Immunogenität, sekundäre Struktur und hydropathische Natur des Polypeptids aufweisen, modifiziert werden. Varianten können auch oder alternativ andere Modifikationen enthalten, einschließlich der Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluss auf die antigenen Eigenschaften, sekundäre Struktur und hydropathische Natur des Polypeptids aufweisen. Zum Beispiel kann ein Polypeptid mit einer Signal- (oder Leader-)Sequenz an dem N-terminalen Ende des Proteins, die co-translational oder post-translational den Transfer des Proteins lenkt, konjugiert sein. Das Polypeptid kann auch an einen Linker oder eine andere Sequenz für die Vereinfachung der Synthese, Reinigung oder Identifikation des Polypeptids (z.B. poly-His) oder um die Bindung des Polypeptids an einen festen Träger zu steigern, konjugiert sein. Zum Beispiel kann ein Polypeptid an eine Immunglobulin-Fc-Region konjugiert sein.
  • Eine Polynukleotid-"Variante" ist eine Sequenz, die sich von der angegebenen Nukleotidsequenz dadurch unterscheidet, dass sie eine oder mehrere Nukleotiddeletionen, Substitutionen oder Additionen aufweist, so dass die Immunogenität des codierten Polypeptids relativ zu dem nativen Protein nicht vermindert wird. Der Effekt auf die Immunogenität des codierten Polypeptids kann im allgemeinen, wie hier beschrieben wird, beurteilt werden. Solche Modifikationen können einfach unter Verwendung von Standard-Mutagenese-Techniken, wie Oligonukleotid-gerichteter ortsspezifischer Mutagenese, wie z.B. durch Adelman et al. (DNA, 2:183, 1983) gelehrt wird, eingeführt werden. Nukleotid-Varianten können natürlich auftretende allele Varianten, wie unten diskutiert wird, oder nicht-natürlich auftretende Varianten sein.
  • Von zwei Nukleotid- oder Polypeptidsequenzen wird gesagt, dass sie "identisch" sind, wenn die Sequenz der Nukleotide oder Aminosäurereste in den zwei Sequenzen die gleiche ist, wenn sie für maximale Übereinstimmung angeordnet werden, wie unten beschrieben wird. Vergleiche zwischen zwei Sequenzen werden typischerweise durch Vergleich der Sequenzen über ein Vergleichsfenster durchgeführt, um lokale Regionen auf Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Ein "Vergleichsfenster", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Segment von mindestens ungefähr 20 aufeinanderfolgenden Positionen, normalerweise 30 bis ungefähr 75, 40 bis ungefähr 50, in dem eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl von aufeinanderfolgenden Positionen verglichen werden kann, nachdem die zwei Sequenzen optimal angeordnet wurden.
  • Die optimale Anordnung von Sequenzen für den Vergleich kann unter Verwendung des Megalign-Programms in der Lasergene suite of bioinformatics software (DNASTAR, Inc., Madison, WI) unter Verwendung von voreingestellten Parametern durchgeführt werden. Dieses Programm verkörpert verschiedene Anordnungspläne, die in den folgenden Zitaten beschrieben werden: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in Proteins – Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (Hrsg.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Band 5, Suppl. 3, Seiten 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, Seiten 626-645 Methods in Enzymology Band 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. und Sharp, P. M. (1989) Fast and sensitive multiple sequence alignments an a microcomputer CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. und Muller W. (1988) Optimal alignments in linear space CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) The neighbor joining method. A new method for reconstructing phylogenetic trees Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. und Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. und Lipman, D. J. (1983) Rapid similarity searches of nucleic acid and Protein data banks Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.
  • Alternativ kann die optimale Anordnung von Sequenzen für den Vergleich durch den lokalen Identitätsalgorithmus von Smith und Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, durch den Identitäts-Anordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durch die Suche nach Ähnlichkeitsverfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444, durch computerisierte Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion durchgeführt werden.
  • Ein Beispiel zur Veranschaulichung von Algorithmen, die für die Bestimmung von Prozent Sequenzidentität und Sequenzähnlichkeit geeignet sind, sind die BLAST- und BLAST 2.0-Algorithmen, die in Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 bzw. Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 beschrieben werden. BLAST und BLAST 2.0 können z.B. mit den Parametern, die hier beschrieben werden, verwendet werden, um das Prozent Sequenzidentität für die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung zu bestimmen. Die Software für die Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhältlich. Bei einem Beispiel zur Veranschaulichung können kumulative Punktwerte unter Verwendung der Parameter M (Belohnungspunktzahl für ein Paar übereinstimmender Reste; immer > 0) und N (Strafpunktzahl für nicht übereinstimmende Reste; immer < 0) für Nukleotidsequenzen berechnet werden. Für Aminosäuresequenzen kann eine Scoring-Matrix verwendet werden, um die kumulative Punktzahl zu berechnen. Die Ausdehnung der Worttreffer in jede Richtung wird angehalten, wenn: die kumulative Anordnungspunktzahl um die Quantität X von ihrem maximalen erreichten Wert abfällt; die kumulative Punktzahl aufgrund der Anhäufung von einem oder mehreren negativ angerechneten Restanordnungen auf null oder darunter fällt; oder das Ende von einer der Sequenzen erreicht wird. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und Geschwindigkeit der Anordnung. Das BLASTN-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet als Voreinstellung eine Wortlänge (W) von 11 und Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Scoring-Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)-Anordnungen, (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4 und einen Vergleich beider Stränge.
  • Vorzugsweise wird das "Prozent Sequenzidentität" durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster von mindestens 20 Positionen bestimmt, wobei der Teil der Polynukleotid- oder Aminosäuresequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (sprich Lücken) von 20 Prozent oder weniger, normalerweise 5 bis 15 Prozent oder 10 bis 12 Prozent, im Vergleich mit den Referenzsequenzen (die keine Additionen oder Deletionen umfassen) für die optimale Anordnung der zwei Sequenzen umfassen können. Das Prozent wird durch Bestimmung der Anzahl von Positionen, an denen die identischen Nukleinsäurebasen oder Aminosäurereste in beiden Sequenzen auftreten, um die Anzahl der übereinstimmenden Positionen zu ergeben, Teilung der Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtanzahl von Positionen in der Referenzsequenz (sprich die Fenstergröße) und Multiplikation der Ergebnisse mit 100, um das Prozent Sequenzidentität zu ergeben, berechnet.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verwendungen bereit, die Polypeptidsequenzen (und Polynukleotidsequenzen, die die Polypeptide codieren) involvieren, die eine substanzielle Identität zu den Sequenzen, die hier offenbart werden, aufweisen, z.B. diejenigen, die mindestens eine 95%ige, 96%ige, 97%ige, 98%ige oder 99%ige oder höhere Sequenzidentität im Vergleich mit der gesamten Länge der Referenzsequenz unter Verwendung der Verfahren, die hier beschrieben werden (z.B. BLAST-Analyse unter Verwendung von Standardparametern, wie unten beschrieben wird) umfassen. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass diese Werte geeignet angepasst werden können, um die korrespondierende Identität von Proteinen, die durch zwei Polynukleotidsequenzen codiert werden, durch Beachtung der Kodon-Degeneration, Aminosäureähnlichkeit, Leserahmenpositionierung und dergleichen zu bestimmen.
  • Die Polynukleotide zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können, unabhängig von der Länge der Codierungssequenz selbst, mit anderen DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymorten, multiplen Klonierungsorten, anderen Codierungssegmenten und dergleichen, kombiniert werden, so dass ihre Gesamtlänge beträchtlich variieren kann. Es wird daher überlegt, dass ein Nukleinsäurefragment von fast jeder Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Herstellung und Verwendung bei dem beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokoll begrenzt wird. Zum Beispiel werden zur Veranschaulichung DNA-Segmente mit Gesamtlängen von ungefähr 10.000, ungefähr 5.000, ungefähr 3.000, ungefähr 2.000 Basenpaaren in Länge und dergleichen (einschließlich allen dazwischenliegenden Längen) als nützlich bei vielen Anwendungen dieser Erfindung überlegt.
  • Polynukleotidvarianten beinhalten Allele der Gene, die die Nukleotidsequenz, die hier angegeben wird, codieren. Wie hier verwendet, ist ein "Allel" oder eine "allele Sequenz" eine alternative Form des Gens, die aus mindestens einer Mutation in der Nukleinsäuresequenz resultieren kann. Allele können zu veränderten mRNAs oder Polypeptiden führen, deren Struktur oder Funktion verändert oder nicht verändert sein kann. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele allele Formen aufweisen. Häufige mutationsbedingte Änderungen, die zu Allelen führen, werden im allgemeinen natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nukleotiden zugeschrieben. Jede dieser Arten von Änderungen kann allein oder in Kombination mit anderen, ein- oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz auftreten.
  • Im allgemeinen können Chlamydia-Antigene und Polynukleotidsequenzen, die solche Antigene codieren, unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Polynukleotidmoleküle, die Chlamydia-Antigene codieren, aus einer Chlamydia-Genom- oder cDNA-Expressionsbibliothek durch Screening mit einer Chlamydia-spezifischen T-Zelllinie, wie unten beschrieben wird, isoliert und unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, sequenziert werden. Zusätzlich kann ein Polynukleotid, wie unten ausführlicher beschrieben wird, durch Screening eines Mikroarrays von cDNAs auf Chlamydia-assoziierte Expression (sprich Expression, die mindestens zweifach größer bei Chlamydia-infizierten Zellen ist als bei Kontrollen, wie unter Verwendung eines repräsentativen Assays, der hier bereitgestellt wird, bestimmt wird) identifiziert werden. Solche Screenings können unter Verwendung eines Synteni-Mikroarrays (Palo Alto, CA) gemäß den Anleitungen des Herstellers (und im wesentlichen wie durch Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 und Heller et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997 beschrieben wird) durchgeführt werden. Alternativ können Polypeptide aus cDNA, die aus Zellen hergestellt wird, die die Proteine, die hier beschrieben werden, exprimieren, amplifiziert werden. Solche Polynukleotide können über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Für diesen Ansatz können sequenzspezifische Primer entwickelt werden, basierend auf den Sequenzen, die hier bereitgestellt werden, und sie können gekauft oder synthetisiert werden.
  • Antigene können rekombinant, wie hier unten beschrieben wird, durch Insertion einer Polynukleotidsequenz, die das Antigen codiert, in einen Expressionsvektor und Expression des Antigens in einem geeigneten Wirt hergestellt werden. Antigene können auf eine erwünschte Eigenschaft, wie die Fähigkeit, mit Seren zu reagieren, die von einem mit Chlamydien infizierten Individuum stammen, wie hier beschrieben wird, ausgewertet und unter Verwendung von z.B. traditioneller Edman-Chemie sequenziert werden. Siehe Edman und Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967.
  • Polynukleotidsequenzen, die Antigene codieren, können auch durch Screening einer geeigneten Chlamydia-cDNA oder genomischen DNA-Bibliothek auf Polynukleotidsequenzen, die hybridisieren, um Oligonukleotide, die von partiellen Aminosäuresequenzen von isolierten Antigenen stammen, zu degenerieren, erhalten werden. Degenerierte Oligonukleotidsequenzen für die Verwendung bei einem solchen Screening können entwickelt und synthetisiert werden und das Screening kann durchgeführt werden, wie in (z.B.) Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (und Quellen, die hier zitiert werden) beschrieben wird. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann auch unter Verwendung der obigen Oligonukleotide bei Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, verwendet werden, um eine Nukleinsäurensonde aus einer cDNA oder Genom-Bibliothek zu isolieren. Das Bibliothek-Screening kann dann unter Verwendung der isolierten Sonde durchgeführt werden.
  • Ein amplifizierter Anteil kann verwendet werden, um ein Gen vollständiger Länge aus einer geeigneten Bibliothek (z.B. einer Chlamydia-cDNA-Bibliothek) unter Verwendung von gut bekannten Techniken zu isolieren. Bei solchen Techniken wird eine Bibliothek (cDNA oder genomisch) unter Verwendung von einer oder mehreren Polynukleotidsonden oder Primern, die für die Amplifikation geeignet sind, gescreent. Vorzugsweise ist eine Bibliothek größenselektiert, um größere Moleküle mit einzuschließen. Random primed Bibliotheken können auch für die Identifizierung von 5'- und Strom aufwärtsregionen von Genen bevorzugt werden. Genombibliotheken werden für das Erhalten von Introns und Verlängern von 5'-Sequenzen bevorzugt.
  • Für Hybridisierungstechniken kann eine partielle Sequenz unter Verwendung von gut bekannten Techniken (z.B. durch Nick-Translation oder Endmarkierung mit 32P) markiert werden. Eine bakterielle oder Bakteriophagen-Bibliothek wird dann gescreent, indem man Filter, die denaturierte Bakterienkolonien (oder Rasens, die Phagenplaques enthalten) enthalten, mit der markierten Sonde hybridisiert (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridisierende Kolonien oder Plaques werden ausgewählt und expandiert und die DNA wird für die weitere Analyse isoliert. cDNA-Klone können analysiert werden, um die Menge von zusätzlicher Sequenz durch z.B. PCR unter Verwendung eines Primers aus der partiellen Sequenz und eines Primers aus dem Vektor, zu bestimmen. Restriktionskarten und partielle Sequenzen können erzeugt werden, um einen oder mehrere überlappende Klone zu identifizieren. Die vollständige Sequenz kann dann unter Verwendung von Standardtechniken, die die Erzeugung einer Serie von Deletionsklonen involvieren können, bestimmt werden. Die daraus hervorgehenden überlappenden Sequenzen werden dann zu einer einzelnen, fortlaufenden Sequenz angeordnet. Ein cDNA-Molekül vollständiger Länge kann dann durch Verbindung geeigneter Fragmente unter Verwendung gut bekannter Techniken erzeugt werden.
  • Alternativ gibt es zahlreiche Amplifikationstechniken für das Erhalten einer Codierungssequenz vollständiger Länge aus einer partiellen cDNA-Sequenz. Bei solchen Techniken wird die Amplifikation im allgemeinen über PCR durchgeführt. Irgendeines einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Kits kann verwendet werden, um den Amplifikationsschritt durchzuführen. Primer können unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (siehe z.B. Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich Hrsg., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) entwickelt werden und Software, die auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, kann auch verwendet werden. Primer weisen vorzugsweise eine Länge von 22 bis 30 Nukleotiden auf, besitzen einen GC-Gehalt von mindestens 50% und binden an die Zielsequenz bei Temperaturen von ungefähr 68°C bis 72°C. Die amplifizierte Region kann, wie oben beschrieben, sequenziert und überlappende Sequenzen zu einer fortlaufenden Sequenz angeordnet werden.
  • Eine solche Amplifikationstechnik ist inverse PCR (siehe Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), die Restriktionsenzyme verwendet, um ein Fragment in der bekannten Region des Gens zu erzeugen. Das Fragment wird dann durch intramolekulare Ligation zirkularisiert und als eine Matrize für PCR mit divergenten Primern, die aus der bekannten Region stammen, verwendet. Bei einem alternativen Ansatz können Sequenzen, die einer partiellen Sequenz benachbart sind, durch Amplifikation mit einem Primer für eine Linkersequenz und einem Primer, der für eine bekannte Region spezifisch ist, gewonnen werden. Die amplifizierten Sequenzen werden typischerweise einer zweiten Amplifikationsrunde mit demselben Linkerprimer und einem zweiten Primer, der für die bekannte Region spezifisch ist, unterworfen. Eine Variation dieser Vorgehensweise, die zwei Primer verwendet, die die Extension in entgegengesetzte Richtungen von der bekannten Sequenz initiieren, wird in WO 96/38591 beschrieben. Zusätzliche Techniken beinhalten Capture-PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) und Walking-PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991). Transkriptions-vermittelte Amplifikation oder TMA ist ein anderes Verfahren, das für die Amplifikation von DNA, rRNA oder mRNA verwendet werden kann, wie in Patent Nr. PCT/US91/03184 beschrieben wird. Diese autokatalytischen und isothermen non-PCR-basierten Verfahren verwenden zwei Primer und zwei Enzyme: RNA-Polymerase und Reverse Transkriptase. Ein Primer enthält eine Promotorsequenz für RNA-Polymerase. Bei der ersten Amplifikation hybridisiert der Promotorprimer an die Ziel-rRNA an einem definierten Ort. Reverse Transkriptase erzeugt eine DNA-Kopie der Ziel-rRNA durch Verlängerung von dem 3'-Ende des Promotorprimers. Die RNA in dem resultierenden Komplex wird abgebaut und ein zweiter Primer bindet an die DNA-Kopie. Ein neuer Strang DNA wird von dem Ende des Primers durch Reverse Transkriptase synthetisiert, was doppelsträngige DNA erzeugt. RNA-Polymerase erkennt die Promotorsequenz in der DNA-Matrize und startet die Transkription. Jedes der neu synthetisierten RNA-Amplicons tritt erneut in den TMA-Prozess ein und dient als eine Matrize für eine neue Runde der Replikation, was zu der exponentiellen Expansion der RNA-Amplicons führt. Andere Verfahren, die Amplifikation verwenden, können auch verwendet werden, um eine cDNA-Sequenz voller Länge zu erhalten.
  • Unter bestimmten Voraussetzungen ist es möglich, eine cDNA-Sequenz voller Länge durch Analyse von Sequenzen, die in einer Expressed Sequenz Tag-(EST)-Datenbank bereitgestellt werden, wie diejenigen, die von GenBank erhältlich sind, zu erhalten. Die Suche nach überlappenden ESTs kann im allgemeinen unter Verwendung von gut bekannten Programmen (z.B. NCBI BLAST-Suche) durchgeführt werden und solche ESTs können verwendet werden, um eine fortlaufende Sequenz voller Länge zu erzeugen. cDNA-Sequenzen voller Länge können auch durch Analyse von Genomfragmenten erhalten werden.
  • Polynukleotidvarianten können im allgemeinen durch irgendein Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, einschließlich chemischer Synthese durch z.B. Festphasen-Phosphoramidit-chemische Synthese, hergestellt werden. Modifikationen können auch in einer Polynukleotidsequenz unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken, wie Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese (siehe Adelman et al., DNA 2:183, 1983) eingeführt werden. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vitro- oder in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die ein Chlamydia-Protein oder einen Teil davon codieren, erzeugt werden, vorausgesetzt, dass die DNA in einen Vektor mit einem geeigneten RNA-Polymerasepromoter (wie T7 oder SP6) inkorporiert ist. Bestimmte Anteile können verwendet werden, um ein codiertes Polypeptid herzustellen, wie hier beschrieben wird. Zusätzlich oder alternativ kann ein Teil an einen Patienten verabreicht werden, so dass das codierte Polypeptid in vivo erzeugt wird (z.B. durch Transfektion von Antigen-präsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen, mit einem cDNA-Konstrukt, das ein Chlamydia-Polypeptid codiert und Verabreichung der transfizierten Zellen an den Patienten).
  • Es kann auch ein Teil einer Sequenz, die zu einer Codierungssequenz komplementär ist (sprich ein Gegensinn-Polynukleotid), als eine Sonde oder zur Modulation von Genexpression verwendet werden. cDNA-Konstrukte, die in Gegensinn-RNA transkribiert werden können, können auch in Zellen von Geweben eingeführt werden, um die Herstellung von Gegensinn-RNA zu erleichtern. Ein Gegensinn-Polynukleotid kann verwendet werden, wie hier beschrieben wird, um die Expression eines Chlamydia-Proteins zu inhibieren. Gegensinn-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Tripel-Helix-Bildung zu kontrollieren, was die Fähigkeit der Doppel-Helix umfasst, sich ausreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder Regulationsmolekülen zu öffnen (siehe Gee et al., In Huber und Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994)). Alternativ kann ein Gegensinn-Molekül entwickelt werden, um mit einer Kontrollregion eines Gens (z.B. einem Promotor, Verstärker oder Transkriptionsstartort) zu hybridisieren und die Transkription des Gens zu blockieren; oder um die Translation durch Inhibition der Bindung eines Transkriptes an Ribosomen zu blockieren.
  • Es kann auch ein Teil einer Codierungssequenz oder einer komplementären Sequenz als eine Sonde oder ein Primer entwickelt werden, um Genexpres sion nachzuweisen. Sonden können mit einer Vielzahl von Reportergruppen, wie Radionukliden und Enzymen, markiert werden und weisen vorzugsweise eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden, mehr vorzuziehen mindestens 20 Nukleotiden und noch mehr vorzuziehen mindestens 30 Nukleotiden auf. Primer sind, wie oben angemerkt wurde, vorzugsweise 22 bis 30 Nukleotide lang.
  • Jedes Polynukleotid kann weiter modifiziert werden, um die Stabilität in vivo zu steigern. Mögliche Modifikationen beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, die Zugabe von Flankierungssequenzen an den 5'- und/oder 3'-Enden; die Verwendung von Phosphorthioat oder 2'-O-Methyl anstelle von Phosphodiesterase-Verbindungen in dem Gerüst und/oder der Einschluss von nicht-traditionellen Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin, wie auch Acetyl-, Methyl-, Thio- und andere modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin.
  • Nukleotidsequenzen, wie sie hier beschrieben werden, können mit einer Vielzahl anderer Nukleotidsequenzen unter Verwendung von etablierten rekombinanten DNA-Techniken verbunden werden. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid in irgendeinen einer Vielzahl von Klonierungsvektoren, einschließlich Plasmiden, Phagemiden, λ-Phagen-Derivaten und Cosmiden geklont werden. Vektoren von besonderem Interesse beinhalten Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, Sondenerzeugungsvektoren und Sequenzierungsvektoren. Im allgemeinen wird ein Vektor einen Replikationsursprung, der zumindest in einem Organismus funktioniert, günstige Restriktionsendonukleasenorte und einen oder mehrere selektierbare Markierer enthalten. Andere Elemente werden von der erwünschten Verwendung abhängen und werden demjenigen, der normales Fachwissen auf dem Gebiet besitzt, offensichtlich sein.
  • Synthetische Polypeptide, die weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als ungefähr 50 Aminosäuren aufweisen, können unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, erzeugt werden. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung von irgendeiner der kommerziell erhältlichen Festphasentechniken, wie dem Merrifield-Festphasen-Syntheseverfahren, wo Aminosäuren sequenziell zu einer wachsenden Aminosäurekette zugegeben werden, erzeugt werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Die Ausrüstung für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist kommerziell von Lieferanten, wie Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, erhältlich und kann gemäß den Anleitungen des Herstellers bedient werden.
  • Immunogene Anteile von Chlamydia-Antigenen können unter Verwendung von gut bekannten Techniken, wie denjenigen, die in Paul, Fundamental Immunology, 3. Ausgabe, Raven Press, 1993, S. 243-247 und Quellen, die hierin zitiert werden, zusammengefasst werden, hergestellt und identifiziert werden. Solche Techniken beinhalten das Screening von Polypeptidanteilen des nativen Antigens auf immunogene Eigenschaften. Die repräsentativen ELISAs, die hier beschrieben werden, können im allgemeinen bei diesen Screenings angewendet werden. Ein immunogener Anteil eines Polypeptids ist ein Anteil, der innerhalb solcher repräsentativer Assays ein Signal in solchen Assays erzeugt, das im wesentlichen demjenigen ähnlich ist, das durch das Antigen vollständiger Länge erzeugt wird. In anderen Worten erzeugt ein immunogener Anteil eines Chlamydia-Antigens mindestens ungefähr 20% und vorzugsweise ungefähr 100% des Signals, das durch das Antigen voller Länge in einem Modell-ELISA, wie hier beschrieben wird, induziert wird.
  • Anteile und andere Varianten der Chlamydia-Antigene können durch synthetische oder rekombinante Mittel erzeugt werden. Varianten eines nativen Antigens können im allgemeinen unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken, wie Oligonukleotid-gerichteter ortsspezifischer Mutagenese, hergestellt werden. Abschnitte der Polynukleotidsequenz können auch unter Verwendung von Standardtechniken entfernt werden, um die Herstellung von gekürzten Polypeptiden zu erlauben.
  • Rekombinante Polypeptide, die Anteile und/oder Varianten eines nativen Antigens enthalten, können einfach aus einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid codiert, unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, gut bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel können Überstände aus geeigneten Wirt/Vektorsystemen, die rekombinantes Protein in Kulturmedien sezernieren, zuerst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Filters konzentriert werden. Nach der Konzentration kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix, wie eine Affinitätsmatrix oder ein Ionenaustauschharz, aufgebracht werden. Schließlich kann ein oder mehrere Reverse-Phase-HPLC-Schritte durchgeführt werden, um ein rekombinantes Protein weiter zu reinigen.
  • Irgendeiner einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, bekannt sind, kann verwendet werden, um rekombinante Polypeptide, wie hier beschrieben wird, zu exprimieren. Die Expression kann in irgendeiner geeigneten Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, der ein Polynukleotidmolekül enthält, das ein rekombinantes Polypeptid codiert, transfiziert oder transformiert wurde, erreicht werden. Geeignete Wirtszellen beinhalten Prokaryoten, Hefe und höhere Eukaryontenzellen. Vorzugsweise sind die verwendeten Wirtszellen E. coli, Hefe oder eine Säugerzelllinie, wie COS oder CHO. Die DNA-Sequenzen, die auf diese Weise exprimiert werden, können natürlich auftretende Antigene, Teile von natürlich auftretenden Antigenen oder andere Varianten davon codieren.
  • Allgemein werden die Polypeptide, die hier offenbart werden, unabhängig von dem Herstellungsverfahren auf eine isolierte, im wesentlichen reine, Form hergestellt. Vorzugsweise sind die Polypeptide mindestens zu ungefähr 80% rein, mehr vorzuziehen zu mindestens ungefähr 90% rein und am besten zu mindestens ungefähr 99% rein.
  • Bei bestimmten spezifischen Ausführungsarten kann ein Polypeptid ein Fusionsprotein sein, das multiple Polypeptide umfasst, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, oder das mindestens ein Polypeptid umfasst, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, und eine nicht verwandte Sequenz, wie ein bekanntes Chlamydien-Protein. Ein Fusionspartner kann z.B. dabei helfen, T-Helferepitope (einen immunologischen Fusionspartner) bereitzustellen, vorzugsweise T-Helferepitope, die durch Menschen erkannt werden, oder kann dabei helfen, das Protein in höheren Erträgen als das native rekombinante Protein zu exprimieren (ein Expressionsverstärker). Bestimmte bevorzugte Fusionspartner sind sowohl immunologische wie auch expressionsverstärkende Fusionspartner. Andere Fusionspartner können so ausgewählt werden, dass sie die Löslichkeit des Proteins steigern oder das Protein in die Lage versetzen, auf erwünschte intrazelluläre Kompartimente zu zielen. Noch weitere Fusionspartner beinhalten Affinitätsmarkierungen, die die Reinigung des Proteins erleichtern. Eine DNA-Sequenz, die ein Fusionsprotein für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung codiert, kann unter Verwendung von bekannten rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden, um getrennte DNA-Sequenzen, die z.B. die ersten und zweiten Polypeptide codieren, zu einem geeigneten Expressionsvektor anzuordnen. Das 3'-Ende einer DNA-Sequenz, die das erste Polypeptid codiert, wird mit oder ohne einen Peptidlinker an das 5'-Ende einer DNA-Sequenz, die das zweite Polypeptid codiert, gebunden, so dass die Leserahmen der Sequenzen in Phase sind, um eine mRNA-Translation der zwei DNA-Sequenzen in ein einzelnes Fusions protein, das die biologische Aktivität von sowohl den ersten wie auch den zweiten Polypeptiden behält, zu erlauben.
  • Eine Peptidlinkersequenz kann verwendet werden, um die ersten und die zweiten Polypeptide auf eine Distanz zu trennen, die ausreicht, um sicherzustellen, dass sich jedes Polypeptid in seine sekundären und tertiären Strukturen faltet. Solch eine Peptidlinkersequenz wird in das Fusionsprotein unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, eingeschlossen. Geeignete Peptidlinkersequenzen können basierend auf den folgenden Faktoren ausgewählt werden: (1) ihre Fähigkeit, eine flexible, ausgedehnte Konformation anzunehmen; (2) ihre Unfähigkeit, eine sekundäre Struktur anzunehmen, die mit funktionellen Epitopen auf den ersten und zweiten Polypeptiden interagieren könnte und (3) den Mangel an hydrophoben oder geladenen Resten, die mit den funktionellen Polypeptidepitopen reagieren könnten. Bevorzugte Peptidlinkersequenzen enthalten Gly-, Asn- und Ser-Reste. Andere fast neutrale Aminosäuren, wie Thr und Ala, können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die nützlich als Linker verwendet werden können, beinhalten diejenigen, die in Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562, 1986; US-Patent Nr. 4,935,233 und US-Patent Nr. 4,751,180 offenbart werden. Die Linkersequenz kann von 1 bis ungefähr 50 Aminosäuren lang sein. Als eine Alternative zu der Verwendung einer Peptidlinkersequenz (wenn erwünscht), kann man nicht-essentielle N-terminale Aminosäureregionen (wenn sie vorliegen) auf den ersten und zweiten Polypeptiden nutzen, um die funktionellen Domänen zu trennen und sterische Hinderung zu verhindern.
  • Die ligierten DNA-Sequenzen sind operabel an geeignete Transkriptions- oder Translations-regulierende Elemente gebunden. Die Regulationselemente, die für die Expression von DNA verantwortlich sind, sind nur 5' zu der DNA-Sequenz, die die ersten Polypeptide codiert, lokalisiert. Ähnlich sind Stop-Kodons, die erforderlich sind, um die Translation zu beenden, und Transkriptions-Terminierungssignale nur 3' zu der DNA-Sequenz, die das zweite Polypeptid codiert, vorhanden.
  • Es werden auch Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend Fusionsproteine, die ein Polypeptid umfassen, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, zusammen mit einem nicht verwandten immunogenen Protein. Vor zugsweise ist das immunogene Protein dazu in der Lage, eine Erinnerungsantwort hervorzurufen. Beispiele für solche Proteine beinhalten Tetanus-, Tuberkulose- und Hepatitis-Proteine (siehe z.B. Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).
  • Bei bevorzugten Ausführungsarten stammt ein immunologischer Fusionspartner von Protein D, einem Oberflächenprotein des gram-negativen Bakteriums Haemophilus influenza B ( WO 91/18926 ). Vorzugsweise umfasst ein Protein D-Derivat ungefähr das erste Drittel des Proteins (z.B. die ersten N-terminalen 100 bis 110 Aminosäuren) und ein Protein D-Derivat kann mit Lipiden versehen sein. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsarten sind die ersten 109 Reste eines Lipoprotein-D-Fusionspartners auf dem N-Terminus mit eingeschlossen, um das Polypeptid mit zusätzlichen exogenen T-Zell-Epitopen zu versehen und den Expressionslevel in E. coli zu steigern (so als ein Expressionsverstärker funktionierend). Der Lipidschwanz sichert die optimale Präsentation des Antigens für Antigen präsentierende Zellen. Andere Fusionspartner beinhalten das nicht-strukturelle Protein von Influenzavirus, NS1 (Hämagglutinin). Typischerweise werden die N-terminalen 81 Aminosäuren verwendet, obwohl verschiedene Fragmente, die T-Helferepitope umfassen, verwendet werden können.
  • Bei einer anderen Ausführungsart ist der immunologische Fusionspartner das Protein, das als LYTA bekannt ist, oder ein Teil davon (vorzugsweise ein C-terminaler Teil). LYTA stammt von Streptococcus pneumoniae, das eine N-Acetyl-L-alanin-amidase synthetisiert, die als Amidase LYTA bekannt ist (codiert durch das LytA-Gen; Gene 43:265-292, 1986). LYTA ist ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen in dem Peptidoglycangerüst zersetzt. Die C-terminale Domäne des LYTA-Proteins ist für die Affinität zu dem Cholin oder zu einigen Cholinanalogen, wie DEAE, verantwortlich. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli C-LYTA-Expressionsplasmiden, die für die Expression von Fusionsproteinen nützlich sind, ausgenutzt. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LYTA-Fragment an dem Aminoende enthalten, wurde beschrieben (siehe Biotechnology 10:795-798, 1992). Bei einer bevorzugten Ausführungsart kann ein Wiederholungsteil von LYTA in ein Fusionsprotein mit eingeschlossen werden. Ein Wiederholungsteil wird in der C-terminalen Region, ausgehend von Rest 178, gefunden. Ein besonders bevorzugter Wiederholungsteil schließt die Reste 188 bis 305 mit ein.
  • Ein von Mycobacterium tuberculosis stammendes Ra12-Polynukleotid kann mit einem Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon, mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, gebunden werden. Ra12-Zusammensetzungen und Verfahren für ihre Verwendung bei der Verstärkung von Expression von heterologen Polynukleotidsequenzen werden in US-Patentanmeldung 60/158,585 beschrieben. Kurz gefasst bezieht sich Ra12 auf eine Polynukleotidregion, die eine Untersequenz einer Mycobacterium tuberculosis MTB32A-Nukleinsäure ist. MTB32A ist eine Serinprotease von 32 KD Molekulargewicht, die durch ein Gen in virulenten und avirulenten Stämmen von M. tuberculosis codiert wird. Die Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz von MTB32A wurden beschrieben ( US-Patentanmeldung 60/158,585 ; siehe auch Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007. Bei einer Ausführungsart umfasst das Ra12-Polypeptid, das bei der Produktion von Fusionspolypeptiden verwendet wird, ein C-terminales Fragment der MTB32A-Codierungssequenz, das effektiv bei der Verstärkung der Expression und/oder Immunogenität von heterologen Chlamydiaantigenem Polypeptiden, womit es fusioniert ist, ist. Das Ra12-Polypeptid kann auch zu einem ungefähr 14 kD C-terminalen Fragment von MTB32A korrespondieren, umfassend einige oder alle der Aminosäurereste 192 bis 323 von MTB32A.
  • Rekombinante Nukleinsäuren, die ein Fusionspolypeptid codieren, umfassend ein Ra12-Polypeptid und ein heterologes Chlamydia-Polypeptid, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, können einfach durch konventionelle gentechnische Techniken konstruiert werden. Rekombinante Nukleinsäuren werden so konstruiert, dass vorzugsweise eine Ra12-Polynukleotidsequenz 5' zu einer ausgewählten heterologen Chlamydia-Polynukleotidsequenz lokalisiert ist. Es kann auch günstig sein, eine Ra12-Polynukleotidsequenz 3' zu einer ausgewählten heterologen Polynukleotidsequenz zu platzieren oder eine heterologe Polynukleotidsequenz in einen Ort innerhalb einer Ra12-Polynukleotidsequenz zu inserieren.
  • Zusätzlich kann jedes geeignete Polynukleotid, das ein Ra12 oder einen Teil oder eine andere Variante davon codiert, bei der Konstruktion rekombinanter Fusionspolynukleotide, umfassend Ra12 und ein oder mehrere Chlamydia-Polynukleotide, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, die durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, verwendet werden. Bevorzugte Ra12-Polynukleotide umfassen im allgemeinen mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgende Nukleotide, mindestens ungefähr 30 Nukleotide, mindestens ungefähr 60 Nukleotide, mindestens ungefähr 100 Nukleotide, mindestens ungefähr 200 Nukleotide oder mindestens ungefähr 300 Nukleotide, die einen Teil eines Ra12-Polypeptids codieren.
  • Ra12-Polynukleotide können eine native Sequenz (sprich eine endogene Sequenz, die ein Ra12-Polypeptid oder einen Teil davon codiert) umfassen oder können eine Variante einer solchen Sequenz umfassen. Ra12-Polynukleotidvarianten können ein oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen und/oder Insertionen enthalten, so dass die biologische Aktivität des codierten Fusionspolypeptids im wesentlichen nicht verringert wird, relativ zu einem Fusionspolypeptid, das ein natives Ra12-Polypeptid umfasst. Varianten zeigen vorzugsweise eine mindestens ungefähr 70%ige Identität, mehr vorzuziehen eine mindestens ungefähr 80%ige Identität und am besten eine mindestens ungefähr 90%ige Identität zu einer Polynukleotidsequenz, die ein natives Ra12-Polypeptid oder einen Teil davon codiert.
  • Bei einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend ein oder mehrere der obigen Polypeptide oder Fusionsproteine (oder Polynukleotide, die solche Polypeptide oder Fusionsproteine codieren), um eine protektive Immunität gegen Chlamydia-Infektion bei einem Patienten hervorzurufen. Wie hier verwendet, bezieht sich ein "Patient" auf irgendein warmblütiges Tier, vorzugsweise einen Menschen. Ein Patient kann von einer Erkrankung betroffen sein oder kann frei von nachweisbarer Erkrankung und/oder Infektion sein. In anderen Worten kann protektive Immunität induziert werden, um Chlamydia-Infektion zu verhindern oder zu behandeln.
  • Bei diesem Aspekt liegt das Polypeptid, Fusionsprotein oder Polynukleotidmolekül im allgemeinen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einem Impfstoff vor. Pharmazeutische Zusammensetzungen können ein oder mehrere Polypeptide, von denen jedes ein oder mehrere der obigen Sequenzen (oder Varianten davon) enthalten kann, und einen physiologisch akzeptablen Träger umfassen. Impfstoffe können ein oder mehrere der obigen Polypeptide und ein Immunstimulanz, wie ein Adjuvans oder ein Liposom (in das das Polypeptid eingeschlossen ist) umfassen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe können auch andere Chlamydia-Antigene enthal ten, entweder in ein Kombinationspolypeptid eingeschlossen oder innerhalb eines separaten Polypeptids vorliegend.
  • Alternativ kann ein Impfstoff Polynukleotide enthalten, die ein oder mehrere Polypeptide oder Fusionsproteine, wie oben beschrieben, codieren, so dass das Polypeptid in situ erzeugt wird. Bei solchen Impfstoffen können die Polynukleotide innerhalb einer Vielzahl von Abgabesystemen, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, bekannt sind, vorliegen, einschließlich Nukleinsäure-Expressionssysteme, bakterielle und virale Expressionssysteme. Geeignete Nukleinsäure-Expressionssysteme enthalten die notwendigen Polynukleotidsequenzen zur Expression in dem Patienten (wie einen geeigneten Promotor und ein Terminierungssignal). Bakterielle Abgabesysteme involvieren die Verabreichung eines Bakteriums (wie Bacillus-Calmette-Guerin), das das Polypeptid auf seiner Zelloberfläche exprimiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsart können die Polynukleotide unter Verwendung eines viralen Expressionssystems (z.B. Vaccinia oder anderer Pockenvirus, Retrovirus oder Adenovirus) eingeführt werden, was die Verwendung eines nicht-pathogenen (defekten) Virus involvieren kann. Techniken für den Einschluss von Polynukleotiden in solche Expressionssysteme sind denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, gut bekannt. Die Polynukleotide können auch als "nackte" Plasmidvektoren verabreicht werden, wie z.B. in Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 und im Überblick durch Cohen, Science 259:1691-1692, 1993 beschrieben wird. Techniken zum Einschluss von DNA in solche Vektoren sind denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, gut bekannt. Ein retroviraler Vektor kann zusätzlich ein Gen für einen selektierbaren Marker (um bei der Identifikation oder Selektion von transduzierten Zellen zu helfen) und/oder einen Zielanteil transferieren oder inkorporieren, wie ein Gen, das einen Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, um den Vektor zielspezifisch zu machen. Targeting kann auch unter Verwendung eines Antikörpers durch Verfahren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, bekannt sind, erreicht werden.
  • Andere Formulierungen für therapeutische Zwecke beinhalten kolloidale Dispersionssysteme, wie Makromolekülkomplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und lipidbasierte Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposome. Ein bevorzugtes kolloidales System für die Verwendung als ein Abgabevehikel in vitro und in vivo ist ein Liposom (sprich ein künstlicher Membranvesikel). Die Aufnahme von nackten Polynukleotiden kann durch Inkorporierung der Polynukleotide in und/oder auf bioabbaubare Kügelchen, die effizient in die Zellen transportiert werden, gesteigert werden. Die Herstellung und Verwendung solcher Systeme ist auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Bei einem verwandten Aspekt kann ein Polynukleotidimpfstoff, wie oben beschrieben, simultan mit oder sequenziell nach entweder einem Polypeptid, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, oder einem bekannten Chlamydia-Antigen, verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung von Polynukleotiden, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codieren, entweder "nackt" oder in einem Abgabesystem, wie oben beschrieben wurde, von einer Verabreichung eines Antigens gefolgt werden, um den protektiven Immuneffekt des Impfstoffes zu verstärken.
  • Bei bestimmten Aspekten können Polypeptide und/oder Polynukleotide in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder immunogene Zusammensetzungen (sprich Impfstoffe) inkorporiert werden. Pharmazeutisch Zusammensetzungen umfassen eine oder mehrere solcher Verbindungen und einen physiologisch akzeptablen Träger. Impfstoffe können eine oder mehrere solcher Verbindungen und ein Immunstimulanz umfassen. Ein Immunstimulanz kann irgendeine Substanz sein, die eine Immunreaktion auf ein exogenes Antigen verstärkt oder potenziert. Beispiele für Immunstimulanzien beinhalten Adjuvantien, bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polylactid-Galactid) und Liposome (in die die Verbindung eingeschlossen wird; siehe z.B. Fullerton, US-Patent Nr. 4,235,877 ). Impfstoffherstellung wird allgemein in z.B. M. F. Powell und M. J. Newman, Hrsg., "Impfstoff Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995) beschreiben. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe innerhalb des Umfanges der Erfindung können auch andere Verbindungen enthalten, die biologisch aktiv oder inaktiv sein können. Zum Beispiel können ein oder mehrere immunogene Anteile von anderen Chlamydia-Antigenen vorliegen, entweder in ein Fusionspolypeptid inkorporiert oder als eine getrennte Verbindung innerhalb der Zusammensetzung oder dem Impfstoff.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Impfstoff kann DNA enthalten, die ein oder mehrere der Polypeptide codiert, wie oben beschrieben wurde, so dass das Polypeptid in situ erzeugt wird. Wie oben angemerkt wurde, kann die DNA innerhalb irgendeinem einer Vielzahl von Abgabesystemen, die demjenigen, der auf dem Fachgebiet normal bewandert ist, bekannt sind, vorliegen, einschließlich Nukleinsäureexpressionsystemen, bakteriellen und viralen Expressionssystemen. Zahlreiche Genabgabetechniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt, so wie diejenigen, die durch Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 und Quellen, die darin zitiert werden, beschrieben werden. Geeignete Nukleinsäure-Expressionssysteme enthalten die notwendigen DNA-Sequenzen für die Expression in den Patienten (wie einen geeigneten Promotor und ein Terminierungssignal). Bakterielle Abgabesysteme involvieren die Verabreichung eines Bakteriums (wie Bacillus-Calmette-Guerin), das einen immunogenen Anteil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert oder ein solches Epitop sezerniert.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsart kann die DNA unter Verwendung eines viralen Expressionssystems (z.B. Vaccinia oder anderes Pockenvirus, Retrovirus, Adenovirus, Bakulovirus, Togavirus, Bakteriophage und dergleichen) eingeführt werden, was oft die Verwendung eines nicht-pathogenen (defekten), zur Replikation fähigen Virus involviert.
  • Zum Beispiel stammen viele virale Expressionsvektoren von Viren der Retroviridae-Familie. Diese Familie beinhaltet die Maus-Leukämieviren, die Maus-Brustkrebsviren, die menschlichen Foamy-Viren, Rous-Sarkom-Viren und die Immundefizienzviren, einschließlich denen von Menschen, Affen und Katzen. Überlegungen, wenn retrovirale Expressionsvektoren entwickelt werden, werden in Comstock et al. (1997) diskutiert.
  • Ausgezeichnete Maus-Leukämie-Virus-(MLV)-basierende virale Expressionsvektoren wurden durch Kim et al. (1998) entwickelt. Bei der Erzeugung der MLV-Vektoren fanden Kim et al. heraus, dass die gesamte gag-Sequenz, zusammen mit der unmittelbaren Stromaufwärtsregion, ohne signifikante Beeinflussung der Virusverpackung oder Genexpression deletiert werden konnte. Weiter wurde herausgefunden, dass nahezu die gesamte U3-Region durch den unmittelbar frühen Promotor des menschlichen Zytomegalievirus ohne schädigende Wirkungen ersetzt werden konnte. Zusätzlich konnten MCR und interne Ribosomen-Eintrittsorte (IRES) ohne Nebenwirkungen zugefügt werden. Basierend auf ihren Beobachtungen entwickelten Kim et al. eine Reihe von MLV-basierten Expressionsvektoren, die ein oder mehrere der Eigenschaften, die oben beschrieben wurden, umfassen.
  • Als mehr über menschliches Foamy-Virus (HFV) gelernt wurde, wurden Eigenschaften von HFV, die für seine Verwendung als ein Expressionsvektor günstig sind, entdeckt. Diese Eigenschaften beinhalten die Expression von pol durch Splicing und Start der Translation an einem definierten Startco don. Über andere Aspekte von HFV-viralen Expressionsvektoren wird in Bodem et al. (1997) ein Überblick gegeben.
  • Murakami et al (1997) beschreibt auf einem Rous-Sarkom-Virus-(RSY)-basierende replikationsfähige Vogel-Retrovirus-Vektoren, IR1 und IR2, die ein heterologes Gen in einem hohen Spiegel exprimieren. In diesen Vektoren wurde das IRES, das vom Encephalomyocarditisvirus (EMCV) stammte, zwischen dem env-Gen und dem heterologen Gen inseriert. Der IR1-Vektor behält den Splice-Akzeptorort, der stromabwärts von dem env-Gen vorliegt, während es dem IR2-Vektor daran mangelt. Murakami et al. zeigen Expression von hohen Spiegeln von verschiedenen heterologenen Genen durch diese Vektoren.
  • Kürzlich wurde eine Anzahl von Lentivirus-basierenden retroviralen Expressionsvektoren entwickelt. Kafri et al. (1997) zeigten länger andauernde Expression von Genen, die direkt in die Leber und den Muskel durch einen auf menschlichem Immundeffizienzvirus (HIV)-basierenden Expressionsvektor abgegeben wurden. Ein Vorteil des Systems ist die ihm innewohnende Fähigkeit von HIV, nicht teilende Zellen zu transduzieren. Da die Viren von Kafri et al. mit vesikulärem Stomatitis-Virus-G-Glycoprotein (VSVG) pseudotypisiert sind, können sie eine große Bandbreite von Geweben und Zelltypen transduzieren.
  • Eine große Anzahl Adenovirus-basierte Expressionsvektoren wurden entwickelt, vornehmlich aufgrund der Vorteile, die durch diese Vektoren bei Gentherapieanwendungen angeboten werden. Adenovirus-Expressionsvektoren und Verfahren zur Verwendung solcher Vektoren sind das Thema einer Anzahl von United States Patenten, einschließlich United States Patent Nr. 5,698,202 , United States Patent Nr. 5,616,326 , United States Patent Nr. 5,585,362 und United States Patent Nr. 5,518,913 .
  • Zusätzliche adenovirale Konstrukte werden in Khatri et al. (1997) und Tomanin et al. (1997) beschrieben. Khatri et al. beschreiben neuartige Schafs-Adenovirus-Expressionsvektoren und ihre Fähigkeit, Nasenmuscheln von Rindern und Kaninchennierenzellen, wie auch eine Reihe von menschlichen Zelltypen, einschließlich Lungen- und Vorhaut-Fibroblasten, wie auch Leber-, Prostata-, Brust-, Kolon- und Retinallinien zu infizieren. Tomanin et al. beschreiben adenovirale Expressionsvektoren, die das T7-RNA-Polymerasegen enthalten. Wenn sie in Zellen eingeführt werden, die ein an einen T7-Promotor operabel gebundenes Gen enthalten, sind die Vektoren in der Lage, die Genexpression von dem T7-Promotor anzutreiben. Die Autoren schlagen vor, dass dieses System für die Klonierung und Expression von Genen, die zytotoxische Proteine codieren, nützlich sein könnte.
  • Pockenviren werden breit für die Expression von heterologen Genen in Säugerzellen verwendet. Über die Jahre wurden die Vektoren verbessert, um eine hohe Expression des heterologen Gens zu ermöglichen und die Integration von multiplen heterologen Genen in ein einzelnes Molekül zu vereinfachen. Bei einer Anstrengung, die cytopathischen Effekte zu verringern und die Sicherheit zu erhöhen, erhalten Vakziniavirusmutanten und andere Pockenviren, die abortive Infektion in Säugerzellen erfahren, besondere Aufmerksamkeit (Oertli et al., 1997). Über die Verwendung von Pockenviren als Expressionsvektoren wird in Carroll und Moss (1997) ein Überblick gegeben.
  • Togavirale Expressionsvektoren, die alphavirale Expressionsvektoren mit einschließen, wurden verwendet, um die Struktur und Funktion von Proteinen zu studieren und wegen Proteinproduktionszwecken. Attraktive Eigenschaften von togaviralen Expressionsvektoren sind schnelle und effiziente Genexpression, breite Wirtsbereiche und RNA-Genome (Huang, 1996). Es wurde auch von rekombinanten Impfstoffen, die auf alphaviralen Expressionsvektoren basierten, gezeigt, dass sie eine starke humorale und zelluläre Immunantwort mit gutem immunologischem Gedächtnis und Schutzeffekten induzieren (Tubulekas et al., 1997). Alphavirale Expressionsvektoren und ihre Verwendung werden z.B. in Lundstrom (1997) diskutiert.
  • In einer Studie verwendeten Li und Garoff (1996) Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionsvektoren, um retrovirale Gene zu exprimieren und retrovirale Partikel in BHK-21-Zellen herzustellen. Die durch dieses Verfahren hergestellten Partikel besaßen Protease- und Reverse Transkriptaseaktivität und waren infektiös. Darüber hinaus konnte kein Helfervirus in diesen Virusstämmen nachgewiesen werden. Daher weist dieses System Eigenschaften auf, die für seine Verwendung bei Gentherapieprotokollen attraktiv sind.
  • Bakulovirale Expressionsvektoren wurden traditionell verwendet, um heterologe Proteine in Insektenzellen zu exprimieren. Beispiele für Proteine beinhalten Säuger-Chemokin-Rezeptoren (Wang et al., 1997), Reporterproteine, wie grünes fluoreszierendes Protein (Wu et al., 1997) und FLAG-Fusionsproteine (Wu et al., 1997; Koh et al., 1997). Kürzliche Fortschritte in der bakuloviralen Expressionsvektor-Technologie, einschließlich ihrer Verwendung bei Virion-Display-Vektoren und Expression in Säugerzellen wird durch Possee (1997) im Überblick dargestellt. Andere Überblicke über bakulovirale Expressionsvektoren beinhalten Jones und Morikawa (1996) und O'Reilly (1997).
  • Andere geeignete virale Expressionssysteme werden z.B. in Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; US-Patente Nrn. 4,603,112 , 4,769,330 und 5,017,487 ; WO 89/01973 ; US-Patent Nr. 4,777,127 ; GB 2,200,651 ; EP 0,345,242 ; WO 91/02805 ; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; und Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993 offenbart. Techniken für den Einschluss von DNA in solche Expressionssysteme sind denjenigen, die auf dem Fachgebiet normal bewandert sind, gut bekannt. In anderen Systemen kann die DNA als "nackte" DNA eingeführt werden, wie z.B. in Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 beschrieben und durch Cohen, Science 259:1691-1692, 1993 im Überblick dargestellt wird. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Beschichten der DNA auf bioabbaubare Kügelchen, die effizient in die Zellen transportiert werden, gesteigert werden.
  • Es wird offensichtlich sein, dass ein Impfstoff ein Polynukleotid und/oder einen Polypeptidbestandteil umfassen kann, wie erwünscht. Es wird auch offensichtlich sein, dass ein Impfstoff pharmazeutisch akzeptable Salze der Polynukleotide und/oder Polypeptide enthalten kann. Solche Salze können aus pharmazeutisch akzeptablen nicht-toxischen Basen, einschließlich organischen Basen (z.B. Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen und basischen Aminosäuren) und anorganischen Basen (z.B. Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Calcium- und Magnesiumsalze) hergestellt werden. Während jeder geeignete Träger, der demjenigen, der auf dem Fachgebiet normal bewandert ist, bekannt ist, in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird die Art des Trägers abhängig von der Art der Verabreichung variieren. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können für jede geeignete Weise der Verabreichung formuliert sein, einschließlich z.B. topische, orale, nasale, intravenöse, intrakraniale, intraperitoneale, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung. Für die parenterale Verabreichung, wie subkutane Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann jeder der obigen Träger oder ein fester Träger, wie Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z.B. Polylactatpolyglycolat) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären werden z.B. in den US-Patenten Nrn. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
  • Solche Zusammensetzungen können auch Puffer (z.B. neutral gepufferte Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung), Kohlenhydrate (z.B. Glucose, Mannose, Saccharose oder Dextrane), Mannitol, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren, wie Glycin, Antioxidantien, Bakteriostatika, Chelatbildner, wie EDTA oder Glutathion, Adjuvantien (z.B. Aluminiumhydroxid), gelöste Stoffe, die die Formulierung isoton, hypoton oder schwach hyperton zu dem Blut eines Empfängers machen, Suspensionsmittel, Verdickungsmittel und/oder Konservierungsstoffe umfassen. Alternativ können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als ein Lyophilisat formuliert sein. Verbindungen können auch in Liposome unter Verwendung gut bekannter Technologie verkapselt werden.
  • Irgendeines einer Vielzahl von Immunstimulantien kann in den Impfstoffen dieser Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Adjuvans mit eingeschlossen werden. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die dafür vorgesehen ist, das Antigen vor schnellem Katabolismus zu schützen, wie Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen Stimulator von Immunantworten, wie Lipid A, Bortadella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis abgeleitete Proteine. Geeignete Adjuvantien sind kommerziell erhältlich als z.B. Freund's inkomplettes Adjuvans und vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc., Rahway, NJ); ALS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); Aluminiumsalze, wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat; Salze von Calcium, Eisen oder Zink; eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin; acylierte Zucker; kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide; Polyphosphazene; bioabbaubare Mikrosphären; Monophosphoryllipid A und Quil A. Zytokine, wie GM-CSF oder Interleukin-2, -7 oder -12, können auch als Adjuvantien verwendet werden.
  • Bei den Impfstoffen, die hier bereitgestellt werden, kann unter ausgewählten Umständen die Adjuvanszusammensetzung entwickelt werden, um eine Immunantwort hauptsächlich vom Th1-Typ oder Th2-Typ zu induzieren. Hohe Spiegel an Th1-Typ Zytokinen (z.B. IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-12) tendieren dazu, die Induktion von zellvermittelten Immunantworten auf ein verabreichtes Antigen zu favorisieren. Im Gegensatz dazu tendieren hohe Spiegel an Th2-Typ Zytokinen (z.B. IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10) dazu, die Induktion von humoralen Immunantworten zu favorisieren. Nach der Anwendung eines Impfstoffes, wie er hier bereitgestellt wird, wird ein Patient Immunantworten unterstützen, die Th1- und Th2-Typ-Antworten beinhalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsart, bei der eine Antwort hauptsächlich Th1-Typ ist, wird der Spiegel der Th1-Typ-Zytokine in einem größeren Ausmaß ansteigen als der Spiegel der Th2-Typ-Zytokine. Die Spiegel dieser Zytokine können einfach unter Verwendung von Standardassays beurteilt werden. Für einen Überblick über die Familien der Zytokine siehe Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
  • Bevorzugte Adjuvantien für die Verwendung zur Hervorrufung einer hauptsächlich Th1-Typ-Antwort beinhalten z.B. eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, vorzugsweise 3-de-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz. MPL-Adjuvantien sind von Corixa Corporation (Seattle, WA; siehe US-Patente Nrn. 4,436,727 ; 4,877,611 ; 4,866,034 und 4,912,094 ) erhältlich. CpG-enthaltende Oligonukleotide (in denen das CpG-Dinukleotid nicht methyliert ist) induzieren auch hauptsächlich eine Th1-Antwort. Solche Oligonukleotide sind gut bekannt und werden z.B. in WO 96/02555 und WO 99/33488 beschrieben. Immunstimulierende DNA-Sequenzen werden auch beschrieben, z.B. durch Sato et al., Science 273:352, 1996. Ein anderes bevorzugtes Adjuvans ist ein Saponin, vorzugsweise QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), das allein oder in Kombination mit anderen Adjuvantien verwendet werden kann. Ein verstärktes System involviert z.B. die Kombination eines Monophosphoryllipid A und Saponinderivats, wie die Kombination von QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 beschrieben wird, oder eine weniger reaktive Zusammensetzung, wo das QS21 mit Cholesterin gelöscht wird, wie in WO 96/33739 beschrieben wird. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Eine besonders wirksame Adjuvansformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
  • Andere bevorzugte Adjuvantien beinhalten Montanid ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), die SBAS-Serie von Adjuvantien (z.B. SBAS-2 oder SBAS-4, erhältlich von SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (Corixa Corporation; Seattle, WA), RC-529 (Corixa Corporation; Seattle, WA) und andere Aminoalkylglucosaminid-4-phosphate (AGPs), wie diejenigen, die in der anhängigen US-Patentanmeldung Serien Nrn. 08/853,826 und 09/074,720 beschrieben werden.
  • Jeder Impfstoff, der hier bereitgestellt wird, kann unter Verwendung von gut bekannten Verfahren hergestellt werden, die zu einer Kombination aus Antigen, Immunstimulanz und einem geeigneten Träger oder Arzneiträger führen. Die Zusammensetzungen, die hier beschrieben werden, können als Teil einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (sprich einer Formulierung, wie einer Kapsel, einem Schwamm oder Gel (bestehend z.B. aus Polysacchariden), die eine langsame Freisetzung von Verbindung nach der Verabreichung bewirkt) verabreicht werden. Solche Formulierungen können allgemein unter Verwendung gut bekannter Technologie (siehe z.B. Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438, 1996) hergestellt und z.B. oral, rektal oder durch subkutane Implantation oder durch Implantation an dem gewünschten Zielort verabreicht werden. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ein Polypeptid, Polynukleotid oder Antikörper enthalten, der in einer Trägermatrix verteilt und/oder in einem Reservoir enthalten ist, das von einer Geschwindigkeit kontrollierenden Membran umgeben ist.
  • Träger für die Verwendung in solchen Formulierungen sind biokompatibel und können auch bioabbaubar sein; vorzugsweise stellt die Formulierung einen relativ konstanten Spiegel an aktiver Bestandteilfreisetzung bereit. Solche Träger beinhalten Mikropartikel von Poly(lactid-co-glycolid), wie auch Polyacrylat, Latex, Stärke, Cellulose und Dextran. Andere Träger mit verzögerter Freisetzung beinhalten supramolekulare Biovektoren, die einen nicht-flüssigen hydrophilen Kern (z.B. ein quervernetztes Polysaccharid oder Oligosaccharid) und wahlweise eine externe Schicht, die eine amphiphile Verbindung, wie ein Phospholipid umfasst (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,151,254 und PCT-Anmeldungen WO 94/20078 , WO/94/23701 und WO 96/06638 ) umfassen. Die Menge an aktiver Verbindung, die in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung enthalten ist, hängt von dem Ort der Implantation, der Geschwindigkeit und der erwarteten Dauer der Freisetzung und der Natur des Zustandes, der behandelt oder verhindert werden soll, ab.
  • Es kann irgendeiner einer Vielzahl von Abgabeträgerstoffen innerhalb der pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe verwendet werden, um das Hervorrufen einer antigenspezifischen Immunantwort, die auf Chlamydia-infizierte Zellen zielt, zu erleichtern.
  • Wege und Frequenz der Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffen, wie auch die Dosierung, wird von Individuum zu Individuum variieren. Im allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (z.B. intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z.B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden. Es können zwischen 1 und 3 Dosen für einen 1- bis 36-Wochenzeitraum verabreicht werden. Vorzugsweise werden 3 Dosen in Intervallen von 3 bis 4 Monaten verabreicht und Booster-Impfungen können periodisch danach gegeben werden. Alternative Protokolle können für individuelle Patienten geeignet sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge an Polypeptid oder DNA die, wenn sie wie oben beschrieben verabreicht wird, in der Lage ist, eine Immunantwort bei einem immunisierten Patienten hervorzurufen, die ausreicht, um den Patienten vor Chlamydia-Infektion für mindestens 1 bis 2 Jahre zu schützen. Im allgemeinen liegt die Menge an Polypeptid, die in einer Dosis vorliegt (oder in situ durch die DNA in einer Dosis hervorgerufen wird) in einem Bereich von ungefähr 1 pg bis ungefähr 100 mg pro kg Wirt, typischerweise bei ungefähr 10 pg bis ungefähr 1 mg und vorzugsweise bei ungefähr 100 pg bis ungefähr 1 ⌷ g. Geeignete Dosisgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, aber werden typischerweise in dem Bereich von ungefähr 0,1 ml bis ungefähr 5 ml liegen.
  • Während irgendein geeigneter Träger, der denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, in dem pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird die Art des Trägers abhängig von dem Verabreichungsmodus variieren. Für die parenterale Verabreichung, wie subkutane Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann irgendeiner der obigen Träger oder ein fester Träger, wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z.B. Polylactidgalactid) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären werden z.B. in US-Patenten Nrn. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
  • Im allgemeinen stellt ein geeignetes Dosierungs- und Behandlungsregime die aktive Verbindung/die aktiven Verbindungen in einer Menge bereit, die ausreicht, um einen therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen bereitzustellen. Solch eine Antwort kann durch Ermittlung eines verbesserten klinischen Ergebnisses bei behandelten Patienten im Vergleich mit nicht behandelten Patienten überprüft werden. Steigerungen bei vorherbestehenden Immunantworten auf ein Chlamydia-Protein korrelieren im allgemeinen mit einem verbesserten klinischen Ergebnis. Solche Immunantworten können im allgemeinen unter Verwendung von Standard-Proliferations-, Zytotoxizitäts- oder Zytokinassays, die unter Verwendung von Proben, die von einem Patien ten vor und nach der Behandlung erhalten wurden, durchgeführt werden, evaluiert werden.
  • Chlamydien-Infektion kann in einer biologischen Probe unter Verwendung von einem oder mehreren Polypeptiden, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon, mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, entweder allein oder in Kombination, nachgewiesen werden. Zur Klarstellung wird der Begriff "Polypeptid" verwendet, wenn diagnostische Verfahren beschrieben werden. Es wird jedoch dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass Fusionsproteine bei solchen Verfahren auch verwendet werden können.
  • Wie hier verwendet, ist eine "biologische Probe" irgendeine Antikörper enthaltende Probe, die von einem Patienten abgenommen wird. Vorzugsweise ist die Probe Vollblut, Sputum, Serum, Plasma, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin. Mehr vorzuziehen ist die Probe eine Blut-, Serum- oder Plasmaprobe, die von einem Patienten abgenommen wird. Die Polypeptide werden in einem Assay verwendet, wie unten beschrieben wird, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern gegen das Polypeptid/die Polypeptide in der Proben, relativ zu einem vorbestimmten Cut-Off-Wert, zu bestimmen. Die Gegenwart solcher Antikörper weist auf eine vorherige Sensibilisierung gegenüber Chlamydia-Antigenen hin, was auf Chlamydia-Infektion hinweisen kann.
  • Eine Vielzahl von Assayformaten für die Verwendung von einem oder mehreren Polypeptiden, um Antikörper in einer Probe nachzuweisen, sind denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Bei einer bevorzugten Ausführungsart involviert der Assay die Verwendung von Polypeptid, das auf einem festen Träger immobilisiert wurde, um den Antikörper zu binden und ihn aus der Probe zu entfernen. Der gebundene Antikörper kann dann unter Verwendung eines Nachweisreagenzes, das eine Reportergruppe enthält, nachgewiesen werden. Geeignete Nachweisreagenzien beinhalten Antikörper, die an den Antikörper/Polypeptidkomplex binden, und freies Polypeptid, das mit einer Reportergruppe markiert wird (z.B. in einem semi-kompetitiven Assay). Alternativ kann ein kompetitiver Assay verwendet werden, bei dem ein Antikörper, der an das Polypeptid bindet, mit einer Reportergruppe markiert wird, und man es ihm erlaubt, an das immobilisierte Antigen nach Inkubation des Antigens mit der Probe zu binden. Das Ausmaß, in dem Bestandteile der Probe die Bindung des markierten Antikörpers an das Polypeptid inhibieren, ist hinweisend für die Reaktivität der Probe mit dem immobilisierten Polypeptid.
  • Der feste Träger kann ein festes Material sein, das denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, an das das Antigen angebracht werden kann. Zum Beispiel kann der feste Träger eine Testvertiefung in einer Mikrotiterplatte oder eine Nitrocellulose oder eine andere geeignete Membran sein. Alternativ kann der Träger ein Kügelchen oder eine Scheibe, wie Glas, Fiberglas, Latex oder ein Plastikmaterial, wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid, sein. Der Träger kann auch ein magnetisches Partikel oder ein glasfaseroptischer Sensor sein, wie diejenigen, die z.B. in US-Patent Nr. 5,359,681 offenbart werden.
  • Die Polypeptide können auch an den festen Träger unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, gebunden werden. In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "gebunden" sowohl auf nicht-kovalente Assoziation, wie Adsorption, und kovalente Bindung (die eine direkte Bindung zwischen dem Antigen und funktionellen Gruppen auf dem Träger sein kann oder eine Verbindung mit Hilfe eines Vernetzungsmittels sein kann). Die Bindung durch Adsorption an eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder an eine Membran wird bevorzugt. In solchen Fällen kann die Adsorption durch Inkontaktbringen des Polypeptids in einen geeigneten Puffer mit dem festen Träger für eine passende Zeitdauer erreicht werden. Die Kontaktzeit variiert mit der Temperatur, aber liegt typischerweise zwischen ungefähr 1 Stunde und 1 Tag. Im allgemeinen reicht das Inkontaktbringen einer Vertiefung einer Kunststoff-Mikrotiterplatte (wie Polystyrol oder Polyvinylchlorid) mit einer Menge von Polypeptid, die in dem Bereich von ungefähr 10 ng bis ungefähr 1 μg liegt, und vorzugsweise bei ungefähr 100 ng, aus, um eine adäquate Menge an Antigen zu binden.
  • Die kovalente Bindung von Polypeptid an einen festen Träger kann allgemein durch zuerst Umsetzung des Trägers mit einem bifunktionellen Reagenz, das sowohl mit dem Träger, wie auch einer funktionellen Gruppe, wie einer Hydroxyl- oder Aminogruppe, auf dem Polypeptid reagieren wird, erreicht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an Träger mit einer geeigneten Polymerbeschichtung unter Verwendung von Benzochinon oder durch Kondensation einer Aldehydgruppe auf dem Träger mit einem Amin und einem aktiven Wasserstoff auf dem Polypeptid gebunden werden (siehe z.B. Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, bei A12-A13).
  • Der diagnostische Assay kann ein Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) sein. Dieser Assay kann durch zuerst Inkontaktbringen eines Polypeptidantigens, das auf einem festen Träger, gebräuchlich der Vertiefung einer Mikrotiterplatte, immobilisiert wurde, mit der Probe durchgeführt werden, so dass es Antikörpern gegen das Polypeptid innerhalb der Probe möglich ist, an das immobilisierte Polypeptid zu binden. Ungebundene Probe wird dann von dem immobilisierten Polypeptid entfernt und ein Nachweismittel, das in der Lage ist, an den immobilisierten Antikörper-Polypeptid-Komplex zu binden, wird zugefügt. Die Menge des Nachweisreagenzes, die an den festen Träger gebunden bleibt, wird dann unter Verwendung eines Verfahrens, das für das spezifische Nachweisreagenz geeignet ist, bestimmt.
  • Genauer werden die verbleibenden Protein-Bindungsstellen, wenn das Polypeptid auf dem Träger immobilisiert ist, wie oben beschrieben wurde, auf dem Träger typischerweise blockiert. Es kann jedes geeignete Blockierungsmittel, das denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt ist, wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Tween 20TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verwendet werden. Das immobilisierte Polypeptid wird dann mit der Probe inkubiert und man läßt den Antikörper an das Antigen binden. Die Probe kann mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), vor der Inkubation verdünnt werden. Im allgemeinen ist eine geeignete Kontaktzeit (sprich Inkubationszeit) der Zeitraum, der ausreicht, um die Gegenwart eines Antikörpers in einer HGE-infizierten Probe nachzuweisen. Vorzugsweise ist die Kontaktzeit ausreichend, um einen Bindungsgrad zu erreichen, der mindestens 95% von demjenigen beträgt, der bei Gleichgewicht zwischen gebundenem und ungebundenem Antikörper erreicht wird. Diejenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet werden erkennen, dass die Zeit, die notwendig ist, um ein Gleichgewicht zu erreichen, einfach durch Assay des Grades der Bindung, die über einen Zeitraum auftritt, bestimmt werden kann. Bei Raumtemperatur ist im allgemeinen eine Inkubationszeit von ungefähr 30 Minuten ausreichend.
  • Ungebundene Probe kann dann durch Waschen des festen Trägers mit einem geeigneten Puffer, wie PBS, das 0,1% Tween 20TM enthält, entfernt werden. Das Nachweisreagenz kann dann zu dem festen Träger zugegeben werden. Ein geeignetes Nachweisreagenz ist jede Verbindung, die an den immobilisierten Antikörper-Polypeptid-Komplex bindet und die durch irgendeines einer Anzahl von Mitteln, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise enthält das Nachweisreagenz ein Bindemittel (wie z.B. Protein A, Protein G, Immunoglobulin, Lectin oder freies Antigen), konjugiert an eine Reportergruppe. Bevorzugte Reportergruppen beinhalten Enzyme (wie Meerrettichperoxidase), Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Färbemittel, Radionuklide, lumineszierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen und Biotin. Die Konjugation des Bindemittels an die Reportergruppe kann unter Verwendung von Standardverfahren, die denjenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden. Häufige Bindemittel können auch konjugiert an eine Vielzahl von Reportergruppen von vielen kommerziellen Quellen erworben werden (z.B. Zymed Laboratories, San Francisco, CA, und Pierce, Rockford, IL).
  • Das Nachweisreagenz wird dann mit dem immobilisierten Antikörper-Polypeptid-Komplex für einen Zeitraum, der ausreicht, um den gebundenen Antikörper nachzuweisen, inkubiert. Ein geeigneter Zeitraum kann im allgemeinen aus den Anleitungen des Herstellers oder durch Assay des Grades an Bindung, die über einen Zeitraum auftritt, bestimmt werden. Ungebundenes Nachweisreagenz wird dann entfernt und gebundenes Nachweisreagenz wird unter Verwendung der Reportergruppe nachgewiesen. Das Verfahren, das für den Nachweis der Reportergruppe verwendet wird, hängt von der Natur der Reportergruppe ab. Für radioaktive Gruppen sind im allgemeinen Szintillationszählung oder autoradiographische Verfahren geeignet. Spektroskopische Verfahren können verwendet werden, um Färbemittel, lumineszierende Gruppen und fluoreszierende Gruppen nachzuweisen. Biotin kann unter Verwendung von Avidin, gekoppelt an eine andere Reportergruppe (gewöhnlich eine radioaktive oder fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym), nachgewiesen werden. Enzymreportergruppen können im allgemeinen durch die Addition von Substrat (im allgemeinen für einen bestimmten Zeitraum), gefolgt von spektroskopischer oder anderer Analyse der Reaktionsprodukte, nachgewiesen werden.
  • Um die Gegenwart oder Abwesenheit von Anti-Chlamydia-Antikörpern in der Probe zu bestimmen, wird das Signal, das von der Reportergruppe, die an den festen Träger gebunden bleibt, nachgewiesen wird, im allgemeinen mit einem Signal verglichen, das zu einem vorherbestimmten Cut-Off-Wert korrespondiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsart ist der Cut-Off-Wert das durchschnittliche mittlere Signal, das erhalten wird, wenn das immobilisierte Antigen mit Proben von einem nicht-infizierten Patienten inkubiert wird. Im allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das drei Standardabweichungen über dem vorherbestimmten Cut-Off-Wert liegt, als positiv für Chlamydia-Infektion betrachtet. Bei einer alternativen bevorzugten Ausführungsart wird der Cut-Off-Wert unter Verwendung einer Receiver-Operator-Kurve, gemäß dem Verfahren von Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, S. 106-107, bestimmt. Kurz gefasst kann bei dieser Ausführungsart der Cut-Off-Wert aus einer grafischen Darstellung von Paaren aus wahren positiven Häufigkeiten (sprich Sensitivität) und falschen positiven Häufigkeiten (100% Spezifität), die zu jedem möglichen Cut-Off-Wert für das diagnostische Testergebnis korrespondieren, bestimmt werden. Der Cut-Off-Wert in der grafischen Darstellung, der der oberen linken Ecke am nächsten liegt (sprich der Wert, der den größten Bereich umfasst), ist der genaueste Cut-Off-Wert und eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher ist als der durch dieses Verfahren bestimmte Cut-Off-Wert, kann als positiv betrachtet werden. Alternativ kann der Cut-Off-Wert entlang der grafischen Darstellung nach links, um die falsch positive Rate zu minimieren, oder nach rechts, um die falsch negative Rate zu minimieren, verlagert werden. Im allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher liegt als der durch dieses Verfahren bestimmte Cut-Off-Wert, als positiv für Chlamydia-Infektion betrachtet.
  • Andere diagnostische Assays können in einem schnellen Durchfluss- oder Streifentestformat durchgeführt werden, wobei das Antigen auf einer Membran, wie Nitrocellulose, immobilisiert wird. Bei dem Durchflusstest binden die Antikörper in der Probe an das immobilisierte Polypeptid, während die Probe die Membran passiert. Ein Nachweisreagenz (z.B. Protein A-kolloidales Gold) bindet dann an den Antikörper-Polypeptid-Komplex, während die Lösung, die das Nachweisreagenz enthält, durch die Membran fließt. Der Nachweis von gebundenem Nachweisreagenz kann dann, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Bei dem Streifentestformat wird ein Ende der Membran, an das Polypeptid gebunden ist, in eine Lösung, die die Probe enthält, eingetaucht. Die Probe wandert entlang der Membran durch eine Region, die Nachweisreagenz enthält, und zu dem Gebiet des immobilisierten Polypeptids. Die Konzentration von Nachweisreagenz an dem Polypeptid weist auf die Gegenwart von Anti-Chlamydia-Antikörpern in der Probe hin. Typischerweise erzeugt die Konzentration des Nachweisreagenzes an dieser Stelle ein Muster, wie eine Linie, die visuell abgelesen werden kann. Die Abwesenheit eines solchen Musters weist auf ein negatives Ergebnis hin. Im allgemeinen wird die Menge von Polypeptid, das auf der Membran immobilisiert ist, ausgewählt, um ein visuell erkennbares Muster zu erzeugen, wenn die biologische Probe einen Spiegel von Antikörpern enthält, der ausreichen würde, um ein positives Signal in einem ELISA zu erzeugen, wie oben diskutiert wurde. Vorzugsweise liegt die Menge an Polypeptid, das auf der Mem bran immobilisiert ist, in dem Bereich von ungefähr 25 ng bis ungefähr 1 μg und mehr vorzuziehen von ungefähr 50 ng bis ungefähr 500 ng. Solche Tests können typischerweise mit einer sehr kleinen Menge (z.B. einem Tropfen) Patientenserum oder Blut durchgeführt werden.
  • Natürlich gibt es zahlreiche andere Assay-Protokolle, die für die Verwendung mit Polypeptiden, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder einer Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, geeignet sind. Die obigen Beschreibungen sollen nur beispielhaft sein. Ein Beispiel für ein alternatives Assay-Protokoll, das nützlich bei solchen Verfahren verwendet werden kann, ist ein Western-Blot, worin die Proteine. die in einer biologischen Probe vorliegen, auf einem Gel vor der Aussetzung gegenüber einem Bindemittel, getrennt werden. Solche Techniken sind den Fachleuten gut bekannt.
  • Diagnostische Reagenzien können auch DNA-Sequenzen umfassen, die ein oder mehrere Polypeptide, umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90%iger Sequenzidentität dazu, wie durch Vergleich der zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge von der Sequenz der SEQ ID NR. 431 bestimmt wird, umfassen.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung angeboten.
  • Verfahrensbeispiel 1
  • Induktion der T-Zell-Proliferation und Interferon-γ-Produktion durch Chlamydia trachomatis-Antigene
  • Die Fähigkeit von rekombinanten Chlamydia trachomatis-Antigenen, die T-Zell-Proliferation und Interferon-γ-Produktion zu induzieren, wird wie folgt bestimmt.
  • Proteine werden durch IPTG induziert und durch Ni-NTA-Agarose-Affinitätschromatograph gereinigt (Webb et al., J. Immunology 157:5034-5041, 1996). Die gereinigten Polypeptide werden dann auf ihre Fähigkeit, T-Zell-Proliferation in PBMC-Präparaten zu induzieren, gescreent. Die PBMCs von C. trachomatis-Patienten wie auch von normalen Spendern, von deren T-Zellen bekannt ist, dass sie in Antwort auf Chlamydia-Antigene proliferieren, werden in Medium, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% gepooltem menschlichem Serum und 50 μg/ml Gentamicin umfasst, kultiviert. Gereinigte Polypeptide werden in doppelter Ausführung bei Konzentrationen von 0,5 bis 10 μg/ml zugegeben. Nach sechs Tagen Kultivierung in Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 200 μl, werden 50 μl Medium von jeder Vertiefung zur Bestimmung der IFNγ-Spiegel entfernt, wie unten beschrieben wird. Die Platten werden dann mit 1 μCi/Vertiefung titriertem Thymidin für weitere 18 Stunden gepulst, geerntet und die Tritiumaufnahme wird unter Verwendung eines Gas-Szintillationszählers bestimmt. Fraktionen, die zu einer Proliferation bei beiden Wiederholungen führen, die dreifach größer ist als die Proliferation, die bei Zellen, die in Medium alleine kultiviert wurden, beobachtet wird, werden als positiv betrachtet.
  • IFNγ wird unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA) gemessen. ELISA-Platten werden mit einem Maus-monoklonalen Antikörper, der gegen menschliches IFNγ (PharMingen, San Diego, CA) gerichtet ist, in PBS für vier Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Die Vertiefungen werden dann mit PBS, das 5% (W/V) fettfreie getrocknete Milch enthält, für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten werden sechsmal in PBS/0,2% TWEEN-20 gewaschen und die Proben, verdünnt 1:2 in Kulturmedium, in den ELISA-Platten, werden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden wieder gewaschen und ein polyklonales Kaninchen-anti-Mensch-IFNγ-Serum, verdünnt 1:3.000 in PBS/10% normalem Ziegenserum, wird zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten werden dann für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und es wir Meerrettichperoxidase-gekoppeltes Anti-Kaninchen-IgG (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) in einer 1:2.000-Verdünnung in PBS/5% fettfreier getrockneter Milch zugegeben. Nach weiteren zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur werden die Platten gewaschen und TMB-Substrat zugegeben. Die Reaktion wird nach 20 Minuten mit 1N Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wird bei 450 nm unter Verwendung von 570 nm als Referenzwellenlänge bestimmt. Fraktionen, die bei beiden Wiederholungen dazu führen, dass sich ein zweifach größerer OD als der mittlere OD von Zellen, die im Medium allein kultiviert werden, plus 3 Standarddeviationen ergibt, werden als positiv betrachtet.
  • Bei der Verwendung der obigen Methodik wurde herausgefunden, dass rekombinantes 1B1-66-Protein (SEQ ID NR. 5) eine proliferative Antwort und IFNγ-Produktion in einer Chlamydia-spezifischen T-Zelllinie, die verwendet wird, um eine Genom-Bibliothek von C. trachomatis LGVII zu screenen, induziert.
  • Verfahrensbeispiel 2
  • Erzeugung von Antikörper und T-Zellantworten bei Mäusen, die mit Chlamydia-Antigenen immunisiert wurden.
  • Es wurden Immugenitätsstudien durchgeführt, um die Antikörper und CD4+-T-Zell-Antworten bei Mäusen zu bestimmen, die entweder mit gereinigten SWIB- oder S13-Proteinen, formuliert mit Montanid-Adjuvans, oder durch DNA-basierte Immunisierungen mit pcDNA-3-Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen für SWIB oder S13 enthielten, immunisiert werden. SWIB wird auch als Klon 1-B1-66 (SEQ ID NR. 1, wobei die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 5 bereitgestellt wird) bezeichnet und S13-ribosomales Protein wird auch als Klon 10-C10-31 (SEQ ID NR. 4, wobe die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 12 bereitgestellt wird) bezeichnet. Bei dem ersten Experiment wurden Gruppen von drei C57BL/6-Mäusen zweimal immunisiert und auf Antikörper und CD4+-T-Zell-Antworten beobachtet. DNA-Immunisierungen wurden intradermal an der Basis des Schwanzes und Polypeptid-Immunisierungen auf subkutanem Wege verabreicht. Die Ergebnisse aus Standard-3H-Inkorporations-Assays von Milzzellen von immunisierten Mäusen zeigten eine starke proliferative Antwort aus der Gruppe, die mit gereinigtem rekombinantem SWIB-Polypeptid immunisiert wurde (SEQ ID NR. 5). Die weitere Analyse durch Zytokin-Induktionsassays, wie zuvor beschrieben, zeigte, dass die Gruppe, die mit SWIB-Polypeptid immunisiert wurde, eine messbare IFNγ- und IL-4-Antwort produzierte. Darauffolgende ELISA-basierte Assays, um die vorherrschende Antikörper-Isotyp-Antwort in der experimentellen Gruppe, die mit dem SWIB-Polypeptid immunisiert wurde, zu bestimmen, wurden durchgeführt. 1 zeigt, dass die SWIB-immunisierte Gruppe eine humorale Antwort gab, die hauptsächlich IgG1 war.
  • Bei einem zweiten Experiment wurden C3H-Mäuse dreimal mit 10 μg gereinigtem SWIB-Protein (auch bezeichnet als Klon 1-B1-66, SEQ ID NR. 5), formuliert in entweder PBS oder Montanid, in dreiwöchigen Intervallen immunisiert und zwei Wochen nach der dritten Immunisierung geerntet. Es wurden die Antikörpertiter, die gegen das SWIB-Protein gerichtet waren, durch Standard-ELISA-basierte Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, bestimmt, wobei gezeigt wurde, dass das SWIB-Protein, formuliert mit Montanid-Adjuvans, eine starke humorale Immunantwort induzierte. T-Zell-proliferative Antworten wurden durch einen XTT-basierten Assay (Scudiero, et al., Cancer Research, 1988, 48:4827) bestimmt. Wie in 2 gezeigt wird, rufen Splenozyten von Mäusen, die mit dem SWIB-Polypeptid plus Montanid immunisiert wurden, eine Antigen-spezifische proliferative Antwort hervor. Zusätzlich wurde die Kapazität von Splenozyten von immunisierten Tieren, IFNγ in Antwort auf lösliches rekombinantes SWIB-Polypeptid zu sezernieren, unter Verwendung des Zytokin-Induktionsassays, das zuvor beschrieben wurde, bestimmt. Die Splenzoyten von allen Tieren in der Gruppe, die mit SWIB-Polypeptid, formuliert mit Montanid-Adjuvans, immunisiert wurde, sezernierten IFNγ in Antwort auf Exposition gegenüber dem SWIB-Chlamydia-Antigen, was eine Chlamydia-spezifische Immunantwort zeigt.
  • Bei einem weiteren Experiment wurden C3H-Mäuse zu drei verschiedenen Zeitpunkten an der Basis des Schwanzes mit 10 μg gereinigtem SWIB- oder S13-Protein (C. trachomatis, SWIB-Protein, Klon 1-B1-66, SEQ ID NR. 5, und S13-Protein, Klon 10-C10-31, SEQ ID NR. 4), formuliert mit dem SBAS2-Adjuvans (SmithKline Beecham, London, England) immunisiert. Die Antigen-spezifischen Antikörpertiter wurden durch ELISA gemessen, wobei beide Polypeptide eine starke IgG-Antwort induzierten, die Titer im Bereich von 1 × 10-4 bis 1 × 10-5 hatten. Die IgG1- und IgG2a-Komponenten dieser Antwort lagen in ziemlich gleichen Mengen vor. Die Antigen-spezifischen T-Zell-proliferativen Antworten, bestimmt durch Standard-3H-Inkorporationsassays auf Milzzellen, isoliert von immunisierten Mäusen, waren ziemlich stark für SWIB (50.000 cpm über der negativen Kontrolle) und sogar noch stärker für s13 (100.000 cpm über der negativen Kontrolle). Die IFNγ-Produktion wurde durch Standard-ELISA-Techniken aus Überstand von der proliferierenden Kultur untersucht. In vitro-Restimulation der Kultur mit S13-Protein induzierte hohe Spiegel von IFNγ-Produktion, ungefähr 25 ng/ml gegen 2 ng/ml für die negative Kontrolle. Die Restimulation mit dem SWIB-Protein induzierte IFNγ auch, obwohl in einem geringeren Ausmaß.
  • In einem ähnlichen Experiment wurden C3H-Mäuse zu drei verschiedenen Zeitpunkten mit 10 μg gereinigtem SWIB- oder S13-Protein (C. trachomatis, SWIB-Protein, Klon 1-B1-66, SEQ ID NR. 5 und S13-Protein, Klon 10-C10-31, SEQ ID NR. 4), gemischt mit 10 μg Cholera-Toxin, immunisiert. Mukosale Immunisierung entstand durch intranasale Impfung. Antigenspezifische Antikörperantworten wurden durch Standard-ELISA-Techniken bestimmt. Antigenspezifische IgG-Antikörper lagen in dem Blut von SWIB-immunisierten Mäusen mit Titern im Bereich von 1 × 10-3 bis 1 × 10-4 vor, aber waren in den S13-immunisierten Tieren nicht nachweisbar. Die Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten von isolierten Splenozyten, wie durch IFNγ-Produktion gemessen wurden, ergaben ähnliche Ergebnisse wie diejenigen, die direkt oberhalb für systemische Immunisierung beschrieben wurden.
  • Es wurde eine Tierstudie durchgeführt, um die Immunogenität des CT529-Serovar-LGVII CTL-Epitops, definiert durch das CT529 10mere Konsensuspeptid (CSFIGGITYL – SEQ ID NR. 31), das als ein H2-Kd-beschränktes CTL-Epitop identifiziert wurde, zu bestimmen. BALB/c-Mäuse (3 Mäuse pro Gruppe) wurden dreimal mit 25 μg Peptid, verbundenen mit verschiedenen Adjuvantien, immunisiert. Das Peptid wurde systemisch an der Basis des Schwanzes in entweder SKB-Adjuvans-System SBAS-2'', SBAS-7 (SmithKline Beecham, London, England) oder Montanid verabreicht. Das Peptid wurde auch intranasal, gemischt mit 10 μg Cholera Toxin (CT), verabreicht. Naive Mäuse wurden als eine Kontrolle verwendet. Vier Wochen nach der dritten Immunisierung wurden Milzzellen erneut mit LPS-Blasten, gepulst mit 10 μg/ml CT529 10merem Konsensuspeptid, in drei verschiedenen Effektor-zu-LPS-Blasten-Verhältnissen: 6, 1,5 und 0,4 mit 1 × 106 Zellen/ml stimuliert. Nach 2 erneuten Stimulationen wurden die Effektorzellen unter Verwendung eines Standard-Chrom Freisetzungs-Assays auf ihre Fähigkeit, Peptide, die mit P815-Zellen gepulst wurden, zu lysieren, getestet. Ein nicht relevantes Peptid aus Hühnerei-Ovalbumin wurde als eine negative Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass eine signifikante Immunantwort gegenüber dem CT529 10meren Konsensuspeptid hervorgerufen wurde und dass Antigen-spezifische T-Zellen, die in der Lage sind, peptidgepulste Ziele zu lysieren, in Antwort auf Immunisierung mit dem Peptid hervorgerufen werden. Spezifisch wurden Antigen-spezifische lytische Aktivitäten bei der Gruppe mit SBAS-7- und CT-Adjuvans gefunden, während Montanid und SBAS-2'' es nicht schafften, die CTL-Epitop-Immunisierung zu verstärken.
  • Beispiel 3
  • Immunantworten auf menschliche PBMC- und T-Zelllinien gegen Chlamydia-Antigene
  • Die Beispiele, die hier bereitgestellt werden, lassen darauf schließen, dass es eine Population von gesunden Spendern in der allgemeinen Population gibt, die mit C. trachomatis infiziert wurde und eine schützende Immunantwort, die die C. trachomatis-Infektion kontrolliert, erzeugten. Diese Spender blieben klinisch asymptomatisch und seronegativ für C. trachomatis. Um die Immunantworten von normalen Spendern gegen Chlamydia-Antigene, die durch CD4-Expressionsklonierung identifiziert wurden, zu charakterisieren, wurde PBMC, das von 12 gesunden Spendern erhalten wurde, gegen eine Tafel aus rekombinanten Chlamydia-Antigenen, einschließlich C. trachomatis, C. pneumoniae-SWIB und C. trachomatis, C. pneumoniae-S13, getestet. Die Daten werden in Tabelle I unten zusammengefasst. Alle Spender waren seronegativ für C. trachomatis, während 6 von 12 einen positiven C. pneumoniae-Titer aufwiesen. Unter Verwendung eines Stimulationsindex von > 4 als eine positive Antwort, reagierten 11 von 12 der Versuchspersonen auf C. trachomatis-Elementarkörperchen und 12 von 12 reagierten auf C. pneumoniae-Elementarkörperchen. Ein Spender, AD104, reagierte auf rekombinantes C. pneumoniae-S13-Protein, aber nicht auf rekombinantes C. trachomatis-S13-Protein, was auf eine C. pneumoniae-spezifische Antwort hinweist. Drei aus 12 Spendern hatten eine C. trachomatis-SWIB, aber nicht eine C. pneumoniae-SWIB-spezifische Antwort, was eine C. trachomatis-Infektion bestätigte. C. trachomatis und C. pneumoniae-S13 riefen eine Antwort bei 8 von 12 Spendern hervor, was auf eine Chlamydia-Infektion schließen läßt. Diese Daten zeigen die Fähigkeit von SWIB und S13, eine T-Zell-Antwort in PBMC von normalen Studien-Testpersonen hervorzurufen. Tabelle I
    Immunantwort von normalen Studien-Versuchspersonen gegen Chlamydia
    Spender Geschlecht Chlamydia-IgG-Titer CT EB CP EB CT Swib CP Swib CT S13 CP S13 CT IpdA CT TSA
    AD100 männlich negativ ++ +++ + - ++ ++ - n.t.
    AD104 weiblich negativ +++ ++ - - - ++ - n.t.
    AD108 männlich CP1:256 ++ ++ + +/- + + + n.t.
    AD112 weiblich negativ ++ ++ + - + - +/- n.t.
    AD120 männlich negativ - + - - - - - n.t.
    AD124 weiblich CP1:128 ++ ++ - - - - - n.t.
    AD128 männlich CP1:512 + ++ - - ++ + ++ -
    AD132 weiblich negativ ++ ++ - - + + - -
    AD136 weiblich CP1:128 + ++ - - +/- - - -
    AD140 männlich CP1:256 ++ ++ - - + + - -
    AD142 weiblich CP1:512 ++ ++ - - + + + -
    AD146 weiblich negativ ++ ++ - - ++ + + -
    • CT = Chlamydia trachomatis; CP = Chlamydia pneumoniae; EB = Chlamydia Elementarkörperchen; Swib = rekombinantes Chlamydia Swib-Protein; S13 = rekombinantes Chlamydia S13-Protein; lpdA = rekombinantes Chlamydia lpdA-Protein; TSA = rekombinantes Chlamydia TSA-Protein. Werte stellen die Ergebnisse aus Standard-Proliferationsassays dar. Proliferative Antworten wurden durch Stimulierung von 3 × 105 PBMC mit 1 × 104 von Monozyten stammenden Dendritenzellen, die mit den jeweiligen rekombinanten Antigenen oder Elementarkörperchen (EB) vorinkubiert wurden, bestimmt. Die Assays wurden nach 6 Tagen mit einem 3H-Thymidinpuls für die letzten 18 Stunden geerntet.
    • SI: Stimulationsindex
    • +/-: SI ~ 4
    • +: SI > 4
    • ++: SI 10-30
    • +++: SI > 30
  • Bei einer ersten Reihe von Experimenten wurden T-Zelllinien von einem gesunden weiblichen Individuum (CT-10) mit einer Anamnese für genitale Exposition gegenüber C. trachomatis durch Stimulation von T-Zellen mit C. trachomatis LGV II Elementarkörperchen, wie zuvor beschrieben wurde, erzeugt. Obwohl die Studien-Versuchsperson gegenüber C. trachomatis ausgesetzt war, serokonvertierte sie nicht und entwickelte keine klinischen Symptome, was darauf schließen läßt, dass Donor CT-10 eine schützende Immunantwort gegen C. trachomatis entwickelt haben könnte. Wie in 3 gezeigt wird, reagierte eine primäre Chlamydia-spezifische T-Zelllinie, die von Spender CT-10 stammte, auf C. trachomatis-SWIB, aber nicht auf C. pneumoniae-SWIB rekombinante Proteine, was die Exposition von CT-10 gegenüber C. trachomatis bestätigt. Die Epitopkartierung der T-Zellreaktion auf C. trachomatis-SWIB zeigte, dass dieser Spender auf dasselbe Epitop Ct-SWIB 52-67 (SEQ ID NR. 39) wie die T-Zelllinie TCL-8 reagierte, wie in 4 gezeigt wird.
  • Zusätzliche T-Zelllinien wurden für verschiedene C. trachomatis-Patienten erzeugt, wie oben beschrieben wurde. Eine Zusammenfassung des klinischen Profils und der proliferativen Antworten der Patienten auf verschiedene C. trachomatis- und C. pneumoniae-Elementarkörperchen und rekombinanten Proteine werden in Tabelle II, wie folgt, zusammengefasst: Tabelle II
    Proliferative Antworten von C. trachomatis-Patienten
    Patienten Klinische Mannifestation IgG-Titer CT Eb CP EB CT Swib CP Swib CT S13 CP S13 CT IpdA CT TSA
    CT-1 NGU negativ + + - - ++ ++ ++ +
    CT-2 NGU negativ ++ ++ - - + +/- - -
    CT-3 asymptomatisch abgestoßener Eb Dx war HPV Ct1:512 Cp1:1024 Cps1:256 + + - - + - + -
    CT-4 asymptomatisch abgestoßener Eb Ct1:1024 + + - - - - - -
    CT-5 BV Ct1:256 Cp1:256 ++ ++ - - + - - -
    CT-6 perinealer Ausschlag Ausfluss Cp1:1024 + + - - - - - -
    CT-7 BV Genitalulcus Ct:512 Cp1:1024 + + - - + + + -
    CT-8 Nicht bekannt Nicht getestet ++ ++ - - - - - -
    CT-9 asymptomatisch Ct:1:128 Cp1:128 +++ ++ - - ++ + + -
    CT-10 Juckreiz mild vulvär negativ ++ ++ - - - - - -
    CT-11 BV, anormaler pap Ct1:512 +++ +++ - - +++ +/- ++ +
    CT-12 asymptomatisch Cp1:512 ++ ++ - - ++ + + -
    • NGU = Non-Gonokokken Urethritis; BV = bakterielle Vaginose; CT = Chlamydia trachomatis; CP = Chlamydia pneumoniae; EB = Chlamydia Elementarkörperchen; Swib = rekombinantes Chlamydia Swib-Protein; S13 = rekombinantes Chlamydia S13-Protein; lpdA = rekombinantes Chlamydia lpdA-Protein; TSA = rekombinantes Chlamydia TSA-Protein
    • Werte stellen die Ergebnisse aus Standard-Proliferationsassays dar. Proliferative Antworten wurden durch Stimulation von 3 × 105 PBMC mit den jeweiligen rekombinanten Antigenen oder Elementarkörperchen (EB) bestimmt. Die Assays wurden nach 6 Tagen mit einem 3H-Thymidinpuls für die letzten 18 Stunden geerntet.
    • SI: Stimulationsindex
    • +/-: SI ~ 4
    • +: SI > 4
    • ++: SI 10-30
    • +++: SI > 30
  • Unter Verwendung der Tafel von asymptomatischen (wie oben definiert) Studienversuchspersonen und C. trachomatis-Patienten, wie in den Tabellen I und II zusammengefasst wurde, wurde eine umfassende Studie der Immunantworten auf PBMC, die von den zwei Gruppen stammten, durchgeführt. Kurz gefasst wurden PBMCs von C. pneumoniae-Patienten wie auch von normalen Spendern in Medium kultiviert, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% gepooltem menschlichem Serum, und 50 μg/ml Gentamicin umfasste. Gereinigte Polypeptide, eine Gruppe von rekombinanten Chlamydia-Antigenen, einschließlich C. trachomatis-, C. pneumoniae-SWIB und S13, wie auch C. trachomatis lpdA und TSA wurden in doppelter Ausführung in Konzentrationen von 0,5 bis 10 μg/ml zugegeben. Nach sechs Tagen Kultivierung in Rundbodenplatten mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 200 μl, wurden 50 μl Medium von jeder Vertiefung für die Bestimmung der IFNγ-Spiegel entfernt, wie unten beschrieben wird. Die Platten wurden dann mit 1 μCi/Vertiefung titriertem Thymidin für weitere 18 Stunden gepulst, geerntet und die Tritiumaufnahme wurde unter Verwendung eines Gas-Szintillationszählers bestimmt. Fraktionen, die zu einer Proliferation bei beiden Wiederholungen führten, die dreifach größer war als die Proliferation, die in Zellen beobachtet wurde, die in Medium alleine kultiviert wurden, werden als positiv betrachtet.
  • Proliferative Antworten auf die rekombinanten Chlamydia-Antigene zeigten, dass die Mehrzahl von asymptomatischen Spender und C. trachomatis-Patienten das C. trachomatis S13-Antigen (8/12) erkannten und eine Mehrzahl der C. trachomatis-Patienten das C. pneumonia S13-Antigen (8/12) erkannten, wobei 4/12 asymptomatischen Spendern auch das C. pneumonia S13-Antigen erkannten. Auch gaben sechs von zwölf der C. trachomatis-Patienten und vier von zwölf der asymptomatischen Spender eine proliferative Antwort auf das lpdA-Antigen von C. trachomatis. Diese Ergebnisse zeigen, dass das C. trachomatis- und C. pneumonia-S13-Antigen, C. trachomatis-Swib-Antigen und das C. trachomatis-lpdA-Antigen durch die asymptomatischen Spender erkannt wird, was darauf hinweist, dass diese Antigene während der Exposition gegenüber Chlamydia erkannt werden und eine Immunantwort gegen sie hervorgerufen wird. Dies läßt darauf schließen, dass diese Antigene eine Rolle bei der Verleihung von protektiver Immunität bei einem menschlichen Wirt spielen könnten. Zusätzlich wird das C. trachomatis- und C. pneumonia S13-Antigen ähnlich gut unter den C. trachomatis-Patienten erkannt, was deshalb darauf hinweist, dass es Epitope geben könnte, die sich C. trachomatis und C. pneumonia in dem S13-Protein teilen. Tabelle III fasst die Ergebnisse dieser Studien zusammen. Tabelle III
    Antigen Normale Spender C.t.-Patienten
    C.t.-Swib 3/12 0/12
    C.p.-Swib 0/12 0/12
    C.t.-S13 8/12 8/12
    C.p.-S13 4/12 8/12
    lpdA 4/12 6/12
    TSA 0/12 2/12
  • Es wurde eine Reihe von Studien begonnen, um die zelluläre Immunantwort auf kurzzeitige T-Zelllinien, die von asymptomatischen Spendern und C. trachomatis-Patienten erzeugt wurden, zu bestimmen. Zelluläre Immunantworten wurden durch Standard-Proliferations-Assays und IFNγ gemessen. Genauer lag die Mehrheit der Antigene in der Form von einzelnen E. coli-Klonen, die Chlamydia-Antigene exprimierten, vor, obwohl einige rekombinante Proteine auch in den Assays verwendet wurden. Die einzelnen E. coli-Klone wurden auf 1 × 104 von Monozyten stammende Dendritenzellen titriert und nach zwei Stunden wurde die Kultur gewaschen und 2,5 × 104 T-Zellen wurden zugegeben. Der Assay, der die rekombinanten Proteine verwendete, wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Die Proliferation wurde nach vier Tagen mit einem Standard-3H-Thymidinpuls für die letzten 18 Stunden bestimmt. Die Induktion von IFNγ wurde aus Kulturüberständen, die nach vier Tagen geerntet wurden, unter Verwendung von Standard-ELISA-Assays, wie oben beschrieben wurde, bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass alle C. trachomatis-Antigene, die getestet wurden, außer C.T. Swib, eine proliferative Antwort von einer oder mehr verschiedenen T-Zelllinien, die von C. trachomatis-Patienten stammten, hervorrief. Zusätzlich wurden proliferative Antworten von sowohl den C. trachomatis-Patienten und asymptomatischen Spendern für die folgenden Chlamydia-Gene hervorgerufen, CT622, groEL, pmpD, CT610 und rS13.
  • Das 12G3-83-Klon enthält auch Sequenzen zu CT734 und CT764 zusätzlich zu CT622 und deshalb könnten diese Gensequenzen auch immunreaktive Epitope aufweisen. Ähnlich enthält Klon 21G12-60 Sequenzen zu den hypothetischen Proteingenen CT229 und CT228 zusätzlich zu CT875; und 15H2-76 enthält auch Sequenzen von CT812 und CT088, wie auch eine geteilte Homologie zu dem sycE-Gen. Klon 11H3-61 enthält auch Sequenzen, die sich Homologie mit dem PGP6-D-Virulenzprotein teilen. Tabelle IV
    Klon C.t. Antigen (mutmaßlich*) TCL von asymptomatischen Spendern TCL von C.t.-Patienten SEQ ID NR.
    1B1-66 (E.coli) Swib 2/2 0/4 5
    1B1-66 (Protein) Swib 2/2 0/4 5
    12G3-83 (E.coli) CT622* 2/2 4/4 57
    22B3-53 (E.coli) groEL 1/2 4/4 111
    22B3-53 (Protein) groEL 1/2 4/4 111
    15H2-76 (E.coli) PmpD* 1/2 3/4 87
    11H3-61 (E.coli) rL1* 0/2 3/4 60
    14H1-4 (E.coli) TSA 0/2 3/4 56
    14H1-4 (Protein) TSA 0/2 3/4 56
    11G10-46 (E.coli) CT610 1/2 1/4 62
    10C10-17 (E.coli) rS13 1/2 1/4 62
    10C10-17 (Protein) rS13 1/2 1/4 62
    21G12-60 (E.coli) CT875* 0/2 2/4 110
    11H4-32 (E.coli) dnaK 0/2 2/4 59
    21C7-8 (E.coli) dnaK 0/2 2/4 115
    17C10-31 (E.coli) CT858 0/2 2/4 114
  • Verfahrensbeispiel 4
  • Schutzstudien unter Verwendung von Chlamydia-Antigenen
  • 1. Swib
  • Schutzstudien wurden in Mäusen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Immunisierung mit Chlamydia-Antigenen Einfluss auf die Genitaltrakterkrankung, die aus Chlamydia-Aufnahme resultiert, nehmen kann. Es wurden zwei Modelle verwendet; ein Modell der intravaginalen Aufnahme, das ein menschliches Isolat verwendet, das einen Stamm von Chlamydia psittaci (MTW447) enthält, und ein Modell der intrauterinen Aufnahme, das ein menschliches Isolat involviert, das als Chlamydia trachomatis, Serovar F (Stamm NI1) identifiziert wurde. Beide Stämme induzieren Entzündung in dem oberen Genitaltrakt, welche Endometritis und Salpingitis ähnelt, die durch Chlamydia trachomatis bei Frauen hervorgerufen wird. Bei dem ersten Experiment wurden C3H-Mäuse (4 Mäuse pro Gruppe) dreimal mit 100 μg pcDNA-3-Expressionsvektor, der C. trachomatis SWIB DNA (SEQ ID NR. 1, wobei die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 5 bereitgestellt wird) enthielt, immunisiert. Die Beimpfungen fanden an der Basis des Schwanzes für systemische Immunisierung statt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere mit Progesteron behandelt und infiziert, entweder durch die Vagina oder durch Injektion des Impfmaterials in den Uterus. Zwei Wochen nach der Infektion wurden die Mäuse geopfert und die Genitaltrakte seziert, gefärbt und histopathologisch untersucht. Der Entzündungsgrad wurde beurteilt (von + für sehr mild, bis +++++ für sehr schwer). Werte, die jedem einzelnen Ovidukt/Ovar zugeordnet wurden, wurden summiert und durch die Anzahl von Organen, die untersucht wurden, geteilt, um eine mittlere Bewertung der Entzündung für die Gruppe zu erhalten. Bei dem Modell der uterinen Beimpfung zeigten negative kontrollimmunisierte Tiere, die leeren Vektor erhielten, eine einheitliche Entzündung mit einer Ovar/Ovidukt-mittleren Entzündungsbewertung von 6,12, im Gegensatz zu 2,62 für die DNA-immunisierte Gruppe. Bei dem Modell der vaginalen Beimpfung und aufsteigenden Infektion hatten negative kontrollimmunisierte Mäuse eine Ovar/Ovidukt mittlere Entzündungsbewertung von 8,37, gegenüber 5,00 für die DNA-immunisierte Gruppe. Auch zeigten in dem späteren Modell geimpfte Mäuse keine Zeichen eines tubalen Verschlusses, während Negativkontroll-geimpfte Gruppen entzündliche Zellen in dem Lumen des Eileiters aufwiesen.
  • Bei einem zweiten Experiment wurden C3H-Mäuse (4 Mäuse pro Gruppe) dreimal mit 50 μg pcDNA-3-Expressionsvektor, der C. trachomatis SWIB DNA (SEQ ID NR. 1, wobei die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 5 bereitgestellt wird), eingekapselt in Poly-Lactid-co-Glycolid-Mikrosphären (PLG) enthielt, immunisiert; Immunisierungen wurden intraperitoneal durchgeführt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere mit Progesteron behandelt und durch Impfung von C. psittaci in die Vagina infiziert. Zwei Wochen nach der Infektion wurden die Mäuse geopfert und die Genitaltrakte seziert, gefärbt und histopathologisch untersucht. Der Entzündungsgrad wurde, wie zuvor beschrieben, bewertet. Bewertungen, die jedem einzelnen Ovidukt/Ovar zugeordnet wurden, wurden summiert und durch die Anzahl von untersuchten Organen geteilt, um ein Mittel der Entzündung für die Gruppe zu erhalten. Negative, kontrollimmunisierte Tiere, die PLG-verkapselten leeren Vektor erhielten, zeigten einheitliche Entzündung mit einer Ovar/Ovidukt-mittleren Entzündungsbewertung von 7,28 gegenüber 5,71 für die PLG-verkapselte DNA-immunisierte Gruppe, Entzündung in dem Peritoneum betrug 1,75 für die geimpfte Gruppe gegenüber 3,75 für die Kontrolle.
  • Bei einem dritten Experiment wurden C3H-Mäuse (4 pro Gruppe) dreimal mit 10 μg gereinigtem rekombinantem Protein, entweder SWIB (SEQ ID NR. 1, wobei die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 5 bereitgestellt wird), oder S13 (SEQ ID NR. 4, wobei die korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NR. 12 bereitgestellt wird), gemischt mit Cholera Toxin (CT) immunisiert; das Präparat wurde intranasal unter Anästhesie in einem 20 μl Volumen verabreicht. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere mit Progesteron behandelt und infiziert, entweder durch vaginale Beimpfung von C. psittaci oder durch Injektion von C. trachomatis Serovar F in den Uterus. Zwei Wochen nach der Infektion wurden die Mäuse geopfert und die Genitaltrakte seziert, gefärbt und histopathologisch untersucht. Der Grad an Entzündung wurde, wie oben beschrieben, bewertet. Bewertungen, die jedem einzelnen Ovidukt/Ovar zugeordnet wurden, wurden summiert und durch die Anzahl von untersuchten Organen geteilt, um die mittlere Bewertung der Entzündung für die Gruppe zu erhalten. Bei dem Modell der uterinen Beimpfung zeigten negative Kontroll-immunisierte Tiere, die Choleratoxin allein erhielten, eine Ovar/Ovidukt-mittlere Entzündungsbewertung von 4,25 (nur 2-Mäuse analysiert; 2 andere starben) gegenüber 5,00 für die s13 plus Choleratoxin-immunisierte Gruppe und 1,00 für das SWIB plus Choleratoxin. Unbehandelte infizierte Tiere wiesen eine Ovar/Ovidukt-mittlere Entzündungsbewertung von 7 auf. Bei dem Modell der vaginalen Beimpfung und absteigenden Infektion hatten negative Kontroll-immunisierte Mäuse eine Ovar/Ovidukt-mittlere Entzündungsbewertung von 7,37 gegenüber 6,75 für die s13 plus Choleratoxin-immunisierte Gruppe und 5,37 für die SWIB plus Choleratoxin-immunisierte Gruppe. Unbehandelte infizierte Tiere wiesen eine Ovar/Ovidukt-mittlere Entzündungsbewertung von 8 auf.
  • Die drei oben beschriebenen Experimente legen nahe, dass SWIB-spezifischer Schutz erhältlich ist. Dieser schützende Effekt ist in dem Modell der homologen Infektion deutlicher, aber liegt bei einer heterologen Provokationsinfektion mit C. psittaci immer noch vor.
  • 2. CT529/Cap1
  • CT529/Cap1 wurde früher als ein Produkt von Chlamydia identifiziert, das CD8+ CTL stimuliert. In diesem Beispiel versuchten wir zu bestätigen, dass die Immunisierung mit Cap1 in einem Tiermodell der Chlamydia-Infektion schützend sein würde.
  • Um ein rekombinantes Vaccina-Virus für die Abgabe eines Cap1-immunogenen Fragmentes zu erzeugen, wurde ein DNA-Fragment, das eine modifizierte Kozak-Sequenz und Basenpaare 319-530 des cap1-Gens (CT529) enthielt, von C. trachomatis L2 Genom-DNA unter Verwendung von PCRTM amplifiziert und in pSC11ss (Earl PL, Koenig S, Moss B (1991) Biological and immunological properties of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein: analysis of Proteins with truncations and deletions expressed by recombinant vaccinia viruses. J. Virol. 65:31-41) ligiert. DNA, verdaut mit SalI und StuI. Der Teil des cap1-Gens, der in pSC11ss gebunden ist, codiert Aminosäuren 107-176 des Cap1-Proteins, enthaltend das zuvor identifizierte CTL-Epitop von Aminosäuren 139-147. Das resultierende Plasmid wurde verwendet, um CV-1-Zellen zu transfizieren (ATCC# CCL-70; Jensen FC et al. (1964) Infektion of human and simian tissue cultures with Rous Sarcoma Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52: 53-59.), die darauffolgend mit Wildtyp-Vacciniavirus infiziert wurden. Homologe Rekombination zwischen dem Wildtyp-Virus und Plasmid-DNA erzeugte rekombinante Vaccinia-Viren, die auf der Basis von sowohl β-Galactosidase-Expression und der Inaktivierung von Thymidinkinase ausgewählt wurden, wie zuvor beschrieben (Chakrabarti et al., Mol Cell Biol. 1985, 5(12):3403-9). Rekombinantes Virus wurde dreimal Plaque-gereinigt und nach Wachstum in menschlichen TK-143B-Zellen titriert. Viruspräparate wurden mit gleichen Volumen von 0,25 mg/ml Trypsin für 30 Minuten bei 37°C behandelt und in PBS vor der Immunisierung von Mäusen verdünnt. Es wurden Gruppen von fünf Mäusen für alle experimentelle und Kontrollgruppen verwendet. Die Daten, die unten dargestellt werden, sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ.
  • Eine Gruppe von Mäusen wurde mit 106 der rekombinanten Vaccinia i.p. immunisiert und man ließ sie sich für 3 Wochen erholen. Negative Kontrollgruppen wurden mit entweder Puffer allein oder Wildtyp-Vaccinia immunisiert. Als eine positive Kontrolle wurde eine Gruppe von Mäusen i.v. mit 106 i.f.u. C. trachomatis infiziert. Von der Anzahl von Organismen, die der positiven Kontrollgruppe verabreicht wurde, wurde zuvor gezeigt, dass sie innerhalb von 2 Wochen geklärt ist. Nach 3 Wochen wurden die Tiere in jeder der Gruppen i.v. mit 106 i.f.u. von C. trachomatis provoziert. Drei Tage nach der Provokation wurden die Mäuse geopfert und die Anzahl von i.f.u. pro Milz wurde bestimmt.
  • Die mittlere Anzahl von Organismen, die in den Milzen der Tiere, die mit dem Vaccinia-Virus, der Cap1 exprimierte, immunisiert wurden, gefunden wurde (7,1 × 104) war 2,6-fach geringer (p < 0,01; Wilcoxon's-Rang-Summen-Analyse) als bei Tieren in den Kontrollgruppen, die entweder mit Puffer (1,8 × 105) oder Wildtyp-Vaccinia (1,9 × 105) immunisiert wurden. Tiere in der positiven Gruppe wiesen 77-fach weniger Organismen (2,4 × 103) pro Milz auf als Tiere in den negativen Kontrollgruppen (p < 0,01; Wilcoxon's-Rang-Summen-Analyse). Diese Daten zeigen, dass Immunisierung mit einem immunogenen Fragment von Cap1 einen statistisch signifikanten Grad an Schutz gegen C. trachomatis-Infektion gewähren kann.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 00600001
  • Figure 00610001

Claims (13)

  1. Zusammensetzung, umfassend: (a) ein Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID NR. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431, oder (b) ein Polynukleotid, kodierend das Polypeptid von (a); zur Verwendung bei der Stimulation einer Immunantwort bei einem Patienten.
  2. Zusammensetzung, umfassend: (a) ein Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431, oder (b) ein Polynukleotid, kodierend das Polypeptid von (a); zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Chlamydia-Infektion.
  3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431.
  4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, umfassend ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ ID NR. 431 umfasst.
  5. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend ein Polypeptid, das ein Fusionspolypeptid ist.
  6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend ein Polypeptid, das aus der Sequenz von SEQ ID NR. 431 besteht oder einer Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der gesamten Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431.
  7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Polynukleotid, das die Sequenz von SEQ ID NR. 407 umfasst.
  8. Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, umfassend ein Polynukleotid, das aus der Sequenz von SEQ ID NR. 407 besteht.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen physiologisch annehmbaren Träger.
  10. Impfstoff, umfassend eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und ein Immunstimulans.
  11. Verwendung von (a) einem Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431, oder (b) einem Polynukleotid, kodierend das Polypeptid von (a); für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung einer Chlamydia-Infektion.
  12. Verwendung von (a) einem Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431, oder (b) einem Polynukleotid, kodierend das Polypeptid von (a); für den Nachweis einer Chlamydia-Infektion bei einem Patienten.
  13. Verwendung von (a) einem Polypeptid umfassend die Sequenz von SEQ ID Nr. 431 oder eine Variante davon mit mindestens 90% Sequenzidentität dazu, bestimmt durch Vergleich der zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster der ganzen Länge der Sequenz von SEQ ID NR. 431, oder (b) einem Polynukleotid, kodierend das Polypeptid von (a); bei der Herstellung eines Diagnosekits für den Nachweis einer Chlamydia-Infektion bei einem Patienten.
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