MXPA01006663A - Antigenos de chlamydia y fragmentos de acido desoxirribonucleico correspondientes y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee un metodo de acido nucleico que incluye ADN, inmunizacion de un hospedero, incluyendo humanos, contra enfermedades provocadas por infeccion por una cepa de Chlamydia, especificamente C. Pneumoniae, que emplea un vector que contiene una secuencia nucleotidica que codifica una translocasa ATP/ADP de una cepa de Chammydia pneumoniae y un promotor para efectuar la expresion del gen transtocasa ATP/ADP en el hospedero; las modificaciones son posibles dentro del alcance de esta invencion.

Description

ANTIGENOS DE CHLAMYDIA Y FRAGMENTOS DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLE1CO CORRESPONDIENTES Y USOS DE LOS MISMOS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/114,060, presentada el 28 de diciembre de 1998, solicitud provisional de E.U.A. No. 60/123,967, presentada el 12 de marzo de 1999, y la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/141 ,271 , presentada el 30 de junio de 1999.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al antígeno de proteína de membrana exterior de 98 Kda de Chlamydia y moléculas de ADN correspondientes, los cuales se pueden usar para prevenir y tratar infección por Chlamydia en mamíferos, como los humanos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los Chlamydiae son procariotes. Exhiben similitudes morfológicas y estructurales con las bacterias Gram-negativas, incluyendo una membrana extema trilaminar que contiene lipopolisacáridos y varías proteínas de membrana que son estructuralmente y funcionalmente análogas a las proteínas encontradas en E coli. Son parásitos intracelulares obligados con un ciclo de vida bifásico único que consiste en una etapa extracelular metabólicamente inactiva pero infecciosa y una etapa intracelular de replicación pero no infecciosa. La etapa de repiicación del ciclo de vida toma lugar dentro de una inclusión unida a la membrana que lleva las bacterias fuera del citoplasma de la célula hospedera infectada. C. pneumoniae es un patógeno humano común, descrito originalmente como la cepa TWAR de Chlamydia psittaci, pero posteriormente fue reconocida como una nueva especie. C. pneumoniae es antigénicamente, genéticamente y morfológicamente distinta a otras especies de Chlamydia (C. trachomatis, C. pecorum y C. psittaci). Muestra 10% o menos de homología de secuencia de ADN, ya sea con C. trachomatis o C. psittaci. C. pneumoniae es una causa común de neumonía adquirida colectiva, solamente menos frecuente que Streptococcus pneumoniae y Micoplasma pneumoniae (Grayston y otros (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231; Campos y otros (1995), Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36:1477). También puede causar síntomas y enfermedades del sistema respiratorio superior, incluyendo bronquitis y sinusitis (Grayston y otros (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231 ; Grayston y otros (1990) Journal of Infectious Diseases 161 :618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases 18:501 ; Wang y otros (1986) "Chlamydial Infections", Cambridge University Press, Cambridge, p. 329. La gran mayoría de la población adulta (más del 60%) tiene anticuerpos para C. pneumoniae (Wang y otros (1986) "Chlamydial Infections" Cambridge University Press, Cambridge, p. 329), que indican una infección pasada que no fue reconocida o que fue asintomática. La infección por C. pneumoniae usualmente se presenta como una enfermedad respiratoria aguda (esto es, tos, dolor de garganta, afonía y fiebre; sonidos anormales de pecho durante auscultación). En la mayoría de los pacientes, la tos persiste de 2 a 6 semanas, y la recuperación es lenta. Aproximadamente en el 10% de estos casos, la infección del tracto respiratorio superior es seguida por bronquitis o neumonía. Además, durante una epidemia de C. pneumoniae, se ha notado una coinfección posterior con pneumococos en cerca de la mitad de estos pacientes con neumonía, particularmente en los débiles y los ancianos. Como se explicó anteriormente, cada vez hay más evidencia de que la infección por C. pneumoniae también está ligada a enfermedades diferentes a las infecciones respiratorias. Se presume que el depósito del organismo son las personas. A diferencia de las infecciones por C. psrt' taci, no existe ningún ave o animal conocido como depósito. La transmisión no se ha definido claramente. Puede derivar del contacto directo con secreciones, de partículas contaminadas o de la propagación en el aire. Existe un largo período de incubación, que puede durar muchos meses. Basándose en los análisis de las epidemias, C. pneumoniae parece propagarse lentamente en una población (con un intervalo promedio de 30 dias entre caso y caso) porque las personas infectadas son transmisores ineficientes del organismo. La susceptibilidad a C. pneumoniae es universal. Después de la infección primaría durante la infancia, ocurren reinfecciones durante la edad adulta. C. pneumoniae parece ser una enfermedad endémica en todo el mundo, notable por intervalos superpuestos de incidencia incrementada (epidemia) que persisten durante 2 a 3 años. La infección por C. trachomatis no confiere inmunidad cruzada para C. pneumoniae. Las infecciones se tratan fácilmente con antibióticos orales, tetraciclina o eritromicina (2 g/d durante por lo menos 10 a 14 días). La azitromicina, un fármaco recientemente desarrollado, es altamente efectivo como una terapia de una sola dosis contra las infecciones por Chlamydia. En la mayoría de los casos, la infección por C. pneumoniae es frecuentemente ligera y sin complicaciones y hasta el 90% de las infecciones son subagudas o no reconocidas. Entre los niños de países industrializados, se ha pensado que las infecciones son raras hasta la edad de 5 años, aunque un estudio reciente (E. Norman y otros "Chlamydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections", Acta Paediatrica, 1998, Vol 87 iss 1, pp 23-27) han reportado que muchos niños de este grupo de edad muestran evidencia PCR de infección a pesar de ser seronegativos, y estiman una frecuencia de 17-19% en edades de 2 a 4. En países en vías de desarrollo, la seroprevalencia de anticuerpos de C. pneumoniae entre niños jóvenes es elevada, y se sospecha que C. pneumoniae puede ser una causa importante de enfermedad aguda del tracto respiratorio inferior y de mortalidad para infantes y niños en las regiones tropicales del mundo. Según estudios de seroprevalencia y estudios de epidemias locales, la infección inicial por C. pneumoniae generalmente sucede entre las edades de 5 y 20. En E.U.A., por ejemplo, se estima que hay 30,000 casos de neumonía infantil cada año causados por C. pneumoniae. Las infecciones pueden agruparse entre grupos de niños o adultos jóvenes (esto es, niños en edad escolar o conscriptos militares). C. pneumoniae causa de 10 al 25% de las infecciones del tracto respiratorio inferior adquiridas por la comunidad (según reportes de Suecia, Italia, Finlandia, y los E.U.A.). Durante una epidemia, la infección por C. pneumonía puede ser la responsable de 50 al 60% de los casos de neumonía.

Durante estos períodos, también se han reportado más episodios de infecciones mixtas con S. pneumoniae. En la edad adulta, la reinfección es común; la presentación clínica tiende a ser más ligera. Con base en estudios de población con seroprevalencia, parece incrementarse la exposición con la edad, lo que es particularmente evidente entre los hombres. Algunos investigadores han especulado que es común un estado de infección por C. pneumoniae persistente y asintomático. En adultos de mediana edad o mayores, la infección por C. pneumoniae puede convertirse en bronquitis crónica y sinusitis. Un estudio en los E.U.A. reveló que la incidencia de neumonía causada por C. pneumoniae en personas menores de 60 años, es de 1 caso por cada 1000 personas al año; pero en los ancianos, la incidencia de la enfermedad se elevó tres veces. La infección por C. pneumoniae rara vez lleva a la hospitalización, excepto en pacientes con una enfermedad subyacente, La asociación de arterieesclerosis e infección por C. pneumoniae, es de considerable importancia. Hay varios estudios epidemiológicos que muestran una correlación de infecciones previas con C. pneumoniae y ataques al corazón, enfermedades de la arteria coronaría y la arteria carótida (Saikku y otros (1988) Lancet; ii:983; Thom y otros (1992) JAMA 268:68; Linnanmaki y otros (1993), Circulation 87:1030; Saikku y otros (1992) Annals Infernal Medicine 116:273; Melnick y otros (1993) American Journal of Medicine 95:499). Además, los organismos se han detectado en ateromas y secciones con grasa de las arterias coronaria, carótida, arterias periféricas y aorta (Shor y otros (1992) South African. Medical Journal 82:158; Kuo y otros (1993) Journal oflnfectious Diseases 167:841 ; Kuo y otros (1993) Arteriesclerosis and Thrombosis 13:1500; Campbell y otros (1995) Journal of Infectious Deseases 172:585; Chiu y otros, Circulation, 1997 (en prensa). Se ha recuperado C. pneumoniae viable de la arteria coronaria y carótida (Ramírez y otros (1996) Annals of Interna! Medicine 125:979; Jackson y otros, resumen, K121, p272, 36° ICAAC, 15-18 sep. 1996, New Orieans). Además, se ha demostrado que C. pneumoniae puede inducir cambios de arterieesclerosis en un modelo de conejo (Fong y otros (1997) Journal of Clinical Microbiology 35:48). En conjunto, estos resultados indican que es altamente posible que C. pneumoniae pueda causar artenoesclerosis en humanos, aunque aún queda por demostrarse la importancia epidemiológica de la artenoesclerosis por Chlamydia. Varios estudios recientes también han indicado una asociación entre la infección por C. pneumoniae y el asma. Se ha relacionado a la infección con ronquera, bronquitis asmática, asma de aparición en adulto y exacerbaciones agudas del asma en adultos, y estudios en pequeña escala han mostrado que el tratamiento prolongado con antibiótico fueron efectivos para reducir grandemente la severidad de la enfermedad en algunos individuos (Hahn DL, y otros, "Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asthma" Ann Alergy Asthma Immunol., enero 1998; 80 (1):45-49.; Hahn DL y otros, "Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomatic asthma" Epidemiol Infecí., Dic. 1996; 117(3) :513-517; Bjornsson E, y otros, "Serology of chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperrresponsiveness". Scand J Infecí Dis. 1996; 28 (1):63-69; Hahn DL. Tratment of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a before-after trial" J Fam Pract. Oct. 1995; 41 (4) : 345-351 ; Allegra L, y otros, "Acute exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection" Eur Respir J Dic. 1994; 7 (12) : 2165-2168; Hahn DL y otros, "Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis and adult-onset asthma" JAMA Jul. 10, 1991; 266(2): 225-230).

En vista de estos resultados, una vacuna protectora contra la infección por C. pneumoniae sería de considerable importancia. Aún no hay una vacuna efectiva para ninguna infección humana por Chlamydia. Se cree que se puede desarrollar una vacuna efectiva usando Chlamydiae físicamente o químicamente inactivada. Sin embargo, tal vacuna no tiene un margen alto de seguridad. En general, las vacunas más seguras se hacen manipulando genéticamente al organismo con atenuación o con medios recombinantes. Por lo tanto, la falta de información genética sobre Chlamydia, específicamente C. pneumoniae, ha sido un gran obstáculo para la creación de una vacuna segura y efectiva contra la infección humana por Chlamydia. Estudios con £ trachomatis y C. psittaci indican que una vacuna segura y efectiva contra Chlamydia es una meta alcanzable. Por ejemplo, ratones que se han recuperado de infección pulmonar con C. trachomatis quedan protegidos contra la infertilidad inducida por una exposición vaginal posterior (Pal y otros (1996) Infection and Immunlty 64:5341 ). De la misma forma, ovejas inmunizadas con C. psittaci inactivado fueron protegidas contra abortos y partos muertos inducidos posteriormente por Chlamydia (Jones y otros (1995) Vaccine 13:715). La protección contra las infecciones por Chlamydia ha sido asociada con las respuestas inmunes Th1 , particularmente la inducción células CD4+T productoras de INFg (Igietsemes y otros (1993) Immunology 5:317). La transferencia adoptiva de líneas o clonas de células CD4+ a ratones sin pelo o SCID, confinó protección contra exposición o enfermedades crónicas franqueadas (Igietseme y otros (1993 Regional Immunology 5:317; Magee y otros (1993) Regional Immunology 5:305), y la supresión in vivo de células CD4+ T exacerbó la enfermedad después de la exposición (Landers y otros (1991) Infection & Immunity 59:3774; Magee y otros (1995) Infection & Immunity 63:516). Sin embargo, la presencia de títulos suficientemente altos de anticuerpo neutralizante en las superficies de la mucosa también puede ejercer un efecto protector (Cotter y otros (1995) Infection & Immunity 63:4704). La variación antigénica dentro de las especies C. pneumonías no está bien documentada debido a la insuficiencia de información genética, aunque se espera que exista variación en base a C. trachomatis. Los serovaríantes de C. trachomatis son definidos en base a variación antigénica en la proteína de membrana exterior mayor (MOMP), pero las secuencias de gen publicadas de MOMP de C. pneumoniae, no muestran variación entre varios aislados diversos del organismo (Campbell y otros (1990) Infection and Immunology 58:93; McCafferty y otros (1995) Infection and Immunology 63:2387-9; Knudsen y otros (1996) Third Meeting of European Society for Chlamydia Research, Viena). El gen que codifica un antígeno 76 kDa se ha clonado de una cepa individual de C. pneumoniae y la secuencia publicada (Pérez Melgosa y otros, Infecí Immun. 1994. 62:880). Se ha descrito un operón que codifica los genes de proteína de membrana exterior rica en cisteína 9 kDa y 60 kDa (Watson y otros, Nucleic Acids Res (1990) 18: 5299; Watson y otros, Microbiology (1995) 141 :2489). Muchos antígenos reconocidos por suero inmune a C. pneumoniae se conservan a través de todos los Chlamydiae, sin embargo, 98 kDa, 76 kDa y otras muchas proteínas pueden ser específicas de C. pneumoniae (Pérez Melgosa y otros, Infecí Immun. 1994. 62:880; Melgosa y otros, FEMS Microbiol Lett (1993) 12:199;, Campbell y otros, J Clin Microbiol (1990) 28:1261 ; lijima et al., J Clin Microbiol (1994) 32:583). Aún no es posible una evaluación del número y frecuencia relativa de cualquier serotipo de C. pneumoniae y los antígenos definidores. Toda la secuencia del genoma de la cepa CWL-029 de C. pneumoniae es conocida ahora (httD://clamvdia-www.berilev.edu:4231/) y a medida que las secuencias adicionales estén disponibles puede ganarse una mejor comprensión de la variación antigénica. Muchos antígenos reconocidos por suero inmune a C. pneumoniae, se conservan a través de todos los Chlamydiae, pero las proteínas de 98 kDa, 76 kDa y 54 kDa parecen ser específicas de C. pneumoniae (Campos y otros (1995) Investigation of Ophtalmology and Visual Science 36:1477; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases. 18:501 ; Wiedmann-AI Ahmad M, y otros, "Reactions of Polyclonal and Neutralizing Anti-p54 Monoclonal Antibodies with an Isolated, Species-specific 54-Kilodalton Protein of Chlamydia Pneumoniae". Clin Diagn Lab Immunol. Nov de 1997; 4(6):700-704). Un inmunoblot de aislados con suero de pacientes, sí muestra una variación de patrones del blotting entre aislados, indicando que pueden existir serotipos de C. pneumoniae (Grayston y otros, (1995) Journal of Infectious Diseases 168:1231: Ramírez y otros (1996) Annals of Internal Medicine 125:979). Sin embargo, los resultados son potencialmente confusos por el estado de infección de los pacientes, ya que los perfiles de inmunoblot del suero de un paciente cambian con el tiempo después de la infección. Una evaluación del número y la relativa frecuencia de cualquiera de los serotipos y los antf genos definidores, no es posible aún. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar y aislar secuencias de polinucleótido de C. pneumoniae para su uso en la prevención y tratamiento de infección por Chlamydia.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN La presente invención provee moléculas de polinucleótidos purificadas y aisladas que codifican los polipéptidos designados como ATP/ADP translocasa de Chlamydia (SEQ ID No: 1 ) que se pueden usar en métodos para prevenir, tratar y diagnosticar infección por Chlamydia. En una forma de la invención, las moléculas de polinucleótido son ADN que codifica los polipéptidos de la SEQ ID No: 2. Otra forma de la invención provee polipéptidos correspondientes a las moléculas de ADN aisladas. Se muestra la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados correspondientes como SEQ ID No: 2. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que la invención, habiendo provisto las secuencias de polinucleótidos que codifican la proteína ATP/ADP translocasa de Chlamydia, también provee polinucleótidos que codifican fragmentos derivados de dicho polipéptido. Además, se entiende que la invención provee mutantes y derivados de tales polipéptidos y fragmentos derivados de los mismos, que se originan de la adición, eliminación o sustitución de aminoácidos no esenciales como aquí se describe. Los expertos en la técnica también entenderán fácilmente que la invención, habiendo provisto las secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de Chlamydia, provee además anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a tales polipéptidos. La presente invención tiene amplia aplicación e incluye cassettes de expresión, vectores y células transformadas o transfectadas con los polinucleótidos de la invención. Por lo tanto, la presente invención provee además (i) un método para producir un polipéptido de la invención en un sistema hospedero recombinante y cassettes de expresión relacionados, vectores, y células transformadas o transfectadas; (ii) una vacuna o un vector de vacuna vivo, tal como un vector de virus de viruela, de Salmonella typhimurium, o de Vibrio choleraa, que contiene un polinucleótido de la invención; tales vacunas y vectores de vacuna siendo útiles, por ejemplo, para prevenir y tratar infección por Chlamydia, en combinación con un diluyante o vehículo, y composiciones farmacéuticas relacionadas, y métodos terapéuticos y/o profilácticos asociados; (iii) un uso terapéutico y/o profiláctico de una molécula de ARN o ADN de la invención, ya sea en una forma simple o formulada con un vehículo de suministro, un polipéptido o combinación de polipéptidos, o un anticuerpo monoespecífico de la invención, y composiciones farmacéuticas relacionadas; (iv) un método para diagnosticar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica, que puede incluir el uso de una molécula de ADN o ARN, un anticuerpo monoespecífico, o un polipéptido de la invención; y (v) un método para purificar un polipéptido de la invención por medio de cromotografía de afinidad basada en anticuerpos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La presente invención se entenderá mejor con la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los que: La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos del gen ATP/ADP translocasa (SEQ ID No: 1) y la secuencia deducida de aminoácidos de ATP/ADP translocasa de Chlamydia pneumonías (SEQ ID No: 2). La figura 2 muestra el análisis de enzima de restricción del gen ATP/ADP translocasa de C. pneumoniae. La figura 3 muestra la construcción y elementos del plásmido pCAI764. La figura 4 muestra protección contra la infección de C. pneumoniae mediante pCAI764 siguiendo la inmunización del ADN.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Un marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteína ATP/ADP translocasa de Chlamydia se ha identificado del genoma C. pneumoniae. El gen que codifica esta proteína se ha insertado en un plásmido de expresión y se ha mostrado para conferir protección inmune contra la infección por Chlamydia. Asimismo, esta proteína ATP/ADP translocasa y polipéptidos relacionados pueden utilizarse prevenir y tratar la infección por Chlamydia. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proveen polinucleótidos aislados que codifican para polipéptidos de Chlamydia, cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la SEQ ID Nos: 2. El término "polinucleótido aislado" se define como un polinucleótido removido del ambiente en el que ocurre naturalmente. Por ejemplo, una molécula de ADN natural, presente en el genoma de una bacteria viviente o como parte de un banco de genes, no es aislada; pero la misma molécula separada de la parte restante del genoma bacteriano, como resultado de un evento de clonación (ampliación) por ejemplo, sí es aislada. Generalmente, una molécula de ADN aislada está libre de regiones de ADN (por ejemplo, regiones codificadoras) con las cuales es inmediatamente contigua en los extremos 5' ó 3' en el genoma natural. Tales polinucleótidos aislados pueden ser parte de un vector o una composición y aún así definirse como aislados, ya que tal vector o composición no es parte del ambiente natural de tal polinucleótido. El polinucleótido de la invención puede ser ARN o ADN (ADNc, ADN genómico, o ADN sintético), o modificaciones, variantes, homólogos o fragmentos de los mismos. El ADN puede ser de doble cadena o una sola cadena, y, si es de una sola cadena, puede ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora (de antisentido). Cualquiera de las secuencias que codifican los polipéptidos de la invención, como se muestra en SEQ ID No: 1 , es (a) una secuencia codificadora, (b) una secuencia de ríbonucleótido derivada de la trascripción de (a), o (c) una secuencia codificadora que usa la redundancia o degeneración del código genético para codificar los mismos polipéptidos. olipéptido" o "proteína" se refiere a cualquier cadena de aminoácidos sin importar su longitud o modificación posterior a la traducción (por ejemplo, glicosilación o fosforilación). Ambos términos se usan de forma intercambiable en esta solicitud. Consistentemente con el primer aspecto de la invención, se proveen secuencias de aminoácidos que son homólogas a la SEQ ID No: 2. Como se usa aquí, una "secuencia homóloga de aminoácidos", es cualquier polipéptido que es codificado, total o parcialmente, por una secuencia de ácido nucleico que híbrida a 25-35°C debajo de ia temperatura crítica de fusión (Tm), con cualquier porción de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID No: 1. Una secuencia homóloga de aminoácidos es una que difiere de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No: 2, en una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. Una secuencia asi también abarca variantes serotípicas (definidas abajo) así como secuencias que contienen supresiones o inserciones que retienen características inherentes del polipéptido, tales como la inmunogenicidad. De preferencia, tal secuencia es por lo menos 75%, de preferencia 80%, y preferiblemente 90% idéntica a la SEQ ID No: 2.. Las secuencias homólogas de aminoácidos incluyen secuencias que son idénticas o sustancialmente idénticas a SEQ ID No: 2. "Secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica" se refiere a una secuencia que es por lo menos 90%, preferentemente 95%, de preferencia 97% y preferiblemente 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, y que preferentemente difiere de la secuencia de referencia por una mayoría de sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son sustituciones entre aminoácidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo, aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga, tales como asparagina, glutamina, serína, treonina, y tirosina; aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano y cisteína.

La homología se mide usando software de análisis de secuencias, tal como el paquete de software "Sequence Analysis Software Package" de Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, University Avenue 1710, Madison, Wl 53705. Las secuencias de aminoácidos se alinean para maximizar la identidad. Para tener una correcta alineación, se pueden introducir espacios artificialmente en la secuencia. Una vez establecida la alineación óptima, se establece el grado de homología registrando todas las posiciones en las que los aminoácidos de ambas secuencias son idénticos, con respecto al número total de posiciones. Las secuencias homólogas de polinucleótido se definen de forma similar. Preferiblemente, una secuencia homóloga es por lo menos 45%, de preferencia 60% y preferiblemente 85% idéntica a la secuencia codificadora de SEQ ID No: . Consistentemente con el primer aspecto de la invención, los polipéptidos que tienen una secuencia homóloga a SEQ ID No: 2 incluyen las variantes alélicas que ocurren naturalmente, así como también mutantes o cualquier otra variante que no ocurre naturalmente, que retienen las características inherentes del polipéptido de las SEQ ID No: 2. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alterna de un polipéptido que se caracteriza por tener una sustitución, supresión o adición de uno o más aminoácidos, que no altera la función biológica del polipéptido. "Función biológica" se refiere a la función del polipéptido en las células en las que ocurre naturalmente, aunque la función no sea necesaria para el crecimiento o supervivencia de las células. Por ejemplo, la función biológica de una porina es la de permitir la entrada en las células de compuestos presentes en el medio extracelular. La función biológica es distinta de la propiedad antigénica. Un polipéptido puede tener más de una función biológica. Las variantes alélicas son de naturaleza muy común. Por ejemplo, una especie bacteriana tal como C. pneumoniae, usualmente está representada por una variedad de cepas que difieren entre sí por variaciones alélicas menores. Ciertamente, un polipéptido que cumple con la misma función biológica en diferentes cepas, puede tener una secuencia de aminoácidos (y una secuencia de polinucleótidos) que no sea idéntica en cada una de las cepas. A pesar de esta variación, se ha demostrado una respuesta inmune generalmente dirigida contra muchas variantes alélicas. En estudios del antígeno MOMP de Chlamydia, ocurre unión de anticuerpos entre cepas cruzadas, más neutralización de infectividad, a pesar de la variación de las secuencias de aminoácidos de MOMP de cepa a cepa, lo que indica que MOMP, cuando se usa como inmunógeno, es tolerante de variaciones de aminoácidos. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos homólogos o variantes alélicas, se recuperan por ampliación mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ADN bacteriano genómico extraído por métodos convencionales. Esto incluye el uso de oligonucleótidos iniciadores sintéticos que coincidan hacia la parte inicial y hacia la parte final de los extremos 5' y 3' del dominio codificador. Los iniciadores apropiados se diseñan de acuerdo a la información de secuencia de nucleótidos que se provee en SEQ ID No:1. El procedimiento es el siguiente: se selecciona un iniciador que consiste de 10 a 40, preferentemente 15 a 25 nucleótidos. Es conveniente seleccionar iniciadores que contengan nucleótidos C y G en una proporción suficiente para asegurar una hibridación eficiente; esto es, una cantidad de nucleótidos C y G de por lo menos 40%, preferentemente 50% del contenido total de nucleótidos. Una reacción PCR estándar contiene típicamente 0.5 a 5 unidades de Taq ADN polimerasa por 100 µ?, 20 a 200 µ? de desoxinucleótido cada una, preferiblemente a concentraciones equivalentes, 0.5 a 2.5 mM de magnesio sobre la concentración total de desoxinucleótido, 105 a 106 moléculas objetivo, y de alrededor de 20 pmoles de cada iniciador. Aproximadamente, se realizaron 25 a 50 ciclos de PCR, con una temperatura de unión de 15°C a 5°C por debajo de la Tm real de los iniciadores. Una temperatura de unión más estricta mejora la discriminación contra los iniciadores incorrectamente unidos y reduce la incorporación de nucleótidos incorrectos en el extremo 3' de los iniciadores. Una temperatura de desnaturalización de 95°C a 97°C es típica, aunque pueden ser apropiadas temperaturas más elevadas para la desmadurazación de los objetivos ricos en G+C. El número de ciclos realizados depende de la concentración inicial de las moléculas objetivo, aunque típicamente no se recomiendan más de 40 ciclos ya que productos base no específicos tienden a acumularse.

Un método alternativo para recuperar polinucleótidos que codifican polipéptidos homólogos o variantes alélicas, es a través de una prueba de hibridación de una colección de ADN o A N. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica y se describen en Ausubel y otros, (Ausubel y otros, Current Protocois in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994), Silhavy y otros, (Silhavy y otros, Experimente with Gene Fusions, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1984), y Davis y otros, (Davis y otros, A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1980)). Parámetros importantes para optimizar las condiciones de hibridación, están reflejadas en una fórmula usada para obtener la temperatura crítica de fusión, arriba de la cual, dos cadenas complementarias de ADN se separan entre sí (Casey & Davidson, Nucí. Acid Res. (1977) 4:1539). Para polinucleótidos de cerca de 600 nucleótidos o mayores, esta fórmula es la siguiente: Tm = 81.5 + 0.41 x (% G+C) + 16.6 log (concentración iónica de catones) - 0.63 x (% formamida) -600/número de bases. Bajo condiciones de severidad apropiada, la temperatura de hibridación (Th) es de aproximadamente 20 a 40°C, 20 a 25°C, o, preferentemente 30 a 40°C debajo de la Tm calculada. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden determinar fácilmente la temperatura óptima y las condiciones de sal. Para los polinucleótidos de la invención, las condiciones de severidad, tanto para las incubaciones de prehibridación como de hibridación, se alcanzan (i) en 4 - 16 horas a 42°C, en SSC 6x con formamida 50%, o (ii) en 4 - 16 horas a 65°C en una solución acuosa SSC 6x (NaCI 1M, citrato de sodio 0.1 M (pH 7.0)). Típicamente, los experimentos de hibridación se realizan a una temperatura de 60 a 68°C, por ejemplo, 65°C. A dicha temperatura, las condiciones de hibridación estrictas pueden lograrse en SSc 6x, preferiblemente en SSc 2x o SSc x, más preferiblemente en SSc 0.5x, SSc 0.3x o SSc 0.1x (en ausencia de formamida). SSc 1x contiene NaCI 0.15 M y citrato de sodio 0.015 M. Los homólogos útiles y sus fragmentos que no ocurren naturalmente, se diseñan usando métodos conocidos para identificar regiones de un antígeno que probablemente toleren cambios y/o supresiones en la secuencia de aminoácidos. Como ejemplo, se comparan polipéptidos homólogos de diferentes especies y se identifican las secuencias que se conservan. Mientras más divergentes sean las secuencias, es más probable que toleren cambios de secuencia. La homología entre las secuencias puede analizarse utilizando, como un ejemplo el algoritmo de búsqueda de homología BLAST de Altschul y otros, Nucleic Acids Res.; 25:3389-3402 (1997). Alternativamente, las secuencias se modifican de tal forma que se hacen más reactivas a las células T y/o B, basándose en el análisis asistido por computadora de epítopes de células T o B probables. También otra alternativa es mutar un residuo de aminoácido particular o secuencia en el polipéptido in vitro, después probar la capacidad que los polipéptidos mutantes tienen de prevenir y tratar la infección por Chlamydia de acuerdo al método que se describe a continuación.

Una persona con conocimientos en la técnica entenderá fácilmente que, al seguir el procedimiento de prueba de esta invención, se puede determinar sin mayor experimentación si un homólogo en particular de cualquiera de SEQ ID No: 2 puede ser útil en la prevención y tratamiento de infección por Chlamydia. El procedimiento de prueba comprende estos pasos: (i) inmunizar un animal, preferentemente ratón, con el homólogo o fragmento de prueba; (ii) inocular al animal inmunizado con Chlamydia; y (iii) seleccionar aquellos homólogos o fragmentos que confieren protección contra Chlamydia. "Conferir protección" se refiere a que hay una reducción en la severidad de cualquiera de los efectos de la infección por Chlamydia, en comparación con un animal de control que no fue inmunizado con el homólogo o fragmento de prueba. Consistentemente con el primer aspecto de la invención, se proveen derivados de polipéptido que son secuencias parciales de SEQ ID No: 2, secuencias parciales de secuencias de polipéptido homólogas a SEQ ID No: 2, poiipéptidos derivados de polipéptidos de longitud completa por supresión interna, y proteínas de fusión. Es una práctica aceptada en el campo de la inmunología, el hecho de usar fragmentos y variantes de inmunógenos de proteína como vacunas, ya que todo lo que se requiere para inducir una respuesta inmune a una proteína, es una región inmunogénica pequeña de la proteína (por ejemplo, de 8 a 10 aminoácidos). Se ha visto que varios péptidos sintéticos cortos correspondientes a antígenos expuestos en superficie, de patógenos diferentes de Chlamydia, son efectivos como antígenos de vacuna contra sus respectivos patógenos, por ejemplo, un péptido de 11 residuos de virus de tumor mamario murino (Casey & Davidson, Nucí. Acid Res (1997) 4:1539), un péptido de 16 residuos de virus Semliki Forest (Snijders y otros, 1991. J. Gen. Virol. 72:557-565), y dos péptidos traslapantes de 15 residuos cada uno, de parvovirus canino (Langeveld y otros, Vaccine 12 (15): 1473-1480, 1994). Por lo tanto, para el experto en la técnica será fácilmente evidente, habiendo leído la presente descripción, que las secuencias parciales de SEQ ID No: 2, o sus secuencias de aminoácidos homólogas, son inherentes a las secuencias de longitud completa y son enseñadas por la presente invención. Se prefiere que tales fragmentos de polipéptido sean de por lo menos 12 aminoácidos de longitud. Convenientemente, de por lo menos 20 aminoácidos; de preferencia por lo menos de 50 aminoácidos; de preferencia de 75 aminoácidos, y muy preferiblemente de por lo menos 100 aminoácidos de longitud. Se recuperan polinucleótidos de 30 a 600 nucleótidos que codifican secuencias parciales de secuencias homólogas a SÉQ ID No: 2, por medio de ampliación por PCR usando los parámetros descritos arriba y usando iniciadores que coinciden con las secuencias hacia el inicio y hacia el final de los extremos 5' y 3' del fragmento que será ampliado. El polinucleótido usado como molde para tal ampliación puede ser el polinucleótido de longitud completa homólogo a SEQ ID No: 1 , o un polinucleótido contenido en una mezcla de polinucleótidos tal como una colección de ADN o ARN. Como un método altemativo para recuperar las secuencias parciales, se lleva a cabo una hibridación de prueba bajo las condiciones descritas arriba usando la fórmula para calcular Tm. Cuando se espera recuperar los fragmentos de 30 a 600 nücleótidos, la Tm calculada se corrige por sustracción (600/tamaño de polinucleótido en pares de bases) y las condiciones de severidad se definen por una temperatura de hibridación que es 5 a 10°C debajo de Tm. Cuando se espera obtener oiigonucleótidos más cortos a 20-30 bases, la fórmula para calcular la Tm es la siguiente: Tm = 4 x (G+C) + 2 (A+T). Por ejemplo, un fragmento de 18 nücleótidos de 50% de G+C tendría una Tm aproximada de 54°C. Péptidos cortos que son fragmentos de SEQ ID No: 2 o sus secuencias homólogas, se obtienen directamente por síntesis química (E. Gross y H. J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesis, John Wiley & Sons (1981), y M. Bodanzki, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag ( 984)). Los derivados de polipéptidos útiles, por ejemplo, fragmentos de polipéptido, se diseñan usando análisis asistido por computadora de secuencias de aminoácidos. Esto identificaría regiones antigénicas probablemente expuestas en la superficie (Hughes y otros. Infect. Immun. 60(9):3497). Un análisis de las 6 secuencias de aminoácidos contenidas en SEQ ID No: 2, basado en el producto de propensiones de flexibilidad e hidrofobicidad usando el programa SEQSEE (Wishart DS y otros, "SEQSEE: A Comprehensive Program Suite for Protein Sequence Analysis." Compu Appl Biosci. Abril 1994; 10(2): 121 -32), puede revelar un número de epítopes potenciales de células B y T que se pueden usar como base para seleccionar fragmentos y variantes inmunogénicos útiles. Este análisis usa una combinación razonable de características de superficie extema que probablemente pueden ser reconocidas por anticuerpos. Probables epítopes de células T para la subclase HLA-A0201 HC, fueron revelados por un algoritmo, que emula un enfoque desarrollado en el NIH (Parker KC y otros "Peptide binding to MHC class I molecules: implications for antigenic peptide prediction" ImmunoI Res 1995; 14(1): 34-57). Los epítopes que inducen una respuesta protectora inmune dependiente de células T, están presentes en toda la longitud del polipéptido. Sin embargo, algunos epítopes pueden estar enmascarados por estructuras secundarias y terciarias del polipéptido. Para revelar tales epítopes enmascarados, se crean grandes supresiones internas que remueven mucho de la estructura de la proteína original y expone a los epítopes enmascarados. Algunas veces, tales supresiones internas efectúan la ventaja adicional de remover regiones inmunodominantes de alta variabilidad entre cepas. Usando los métodos estándar (Ausubel y otros, Current Protocole in Molecular Bblogy, John Wiley & Sons Inc, 1994) se construyen polinucleótidos que codifican fragmentos de polipéptido y polipéptidos que tienen grandes supresiones internas. Tales métodos incluyen PCR estándar, PCR inversa, tratamiento con enzimas de restricción de moléculas de ADN clonadas, o el método de Kunkel y otros (Kunkel y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1985) 82:448). Los componentes para estos métodos y las instrucciones para su uso están disponibles en varias fuentes comerciales tales como Stratagene. Una vez que se han construido los imitantes de supresión, se prueba su capacidad de prevenir y tratar infección por Chlamydia como se describió arriba. Tal y como se usa aquí, un polipéptido de fusión es aquel que contiene un polipéptido o un derivado de polipéptido de la invención fusionado en el extremo terminal N o C con cualquier otro polipéptido (que en adelante se le denominará cola de péptido). Una forma simple de obtener tal polipéptido de fusión es mediante traducción de una fusión en marco de las secuencias de polinucleótido; esto es, un gen híbrido. El gen híbrido que codifica al polipéptido de fusión, se inserta en un vector de expresión que se usa para transformar o transfectar una célula hospedera. Alternativamente, la secuencia de polinucleótido que codifica al polipéptido o al derivado de polipéptido, se inserta en un vector de expresión en el que el polinucleótido que codifica a la cola de polipéptido ya está presente. Tales vectores e instrucciones para su uso están disponibles comercialmente, por ejemplo, el sistema pMal-c2 o pMal-p2 de New England Biolabs, en el que la cola de péptido es una proteína de unión a maltosa; el sistema glutation-S-transferasa de Pharmacia, o el sistema His-Tag disponible en Novagen. Estos y otros 7 sistemas de expresión proveen medios convenientes para una mayor purificación de los polipéptidos y derivados de la invención. Un ejemplo ventajoso de un polipéptido de fusión es aquel en donde el polipéptido, u homólogo, o fragmento de la invención, se fusiona a un polipéptido que tiene actividad adyuvante, tal como la subunidad B, ya sea de la toxina del cólera o la toxina termolábil de £. col!. Otra fusión ventajosa es aquella en donde el polipéptido, homólogo o fragmento, se fusiona a un epitope fuerte de células T o a un epítope de células B. Un epítope así puede ser uno conocido en la técnica (por ejemplo, el antígeno de núcleo del virus de la Hepatitis B, D.R. Millich y otros, "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a single synthetic T cell site", Natura 1987, 329:547-549), o uno que haya sido identificado en otro polipéptido de la invención (basándose en el análisis asistido por computadora de epítopes probables de células T y B). Consistentemente con este aspecto de la invención, está un polipéptido de fusión que comprende epítopes de células T o B de la SEQ ID No: 2 o su homólogo o fragmento, en donde los epítopes derivan de múltiples variantes de dicho polipéptido u homólogo o fragmento, cada variante diferenciándose de otra en la localización y secuencia de su epítope dentro del polipéptido. Una fusión así es efectiva en la prevención y tratamiento de la infección por Chlamydia, ya que optimiza la respuesta de células T y B hacia todo el polipéptido, homólogo o fragmento. Para efectuar la fusión, el polipéptido de la invención se fusiona con el extremo terminal N, o preferiblemente C, del polipéptido que tiene actividad adyuvante o epítope de células T o B. Alternativamente, se inserta internamente un fragmento de polipéptido de la invención dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene actividad de adyuvante. El epítope de células T o B también se puede insertar internamente dentro de ia secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención. Consistentemente con el primer aspecto, los poiinucleótidos de la invención también codifican polipéptidos precursores híbridos que contienen péptidos de señal heterólogos, que se convierten en polipéptidos maduros de la invención. éptido de señal heterólogo" se refiere a un péptido señal que no se encuentra en los precursores naturales de los polipéptidos de la invención. Moléculas de poiinucleótidos de conformidad con la invención, que incluyen ARN, ADN, o sus modificaciones o combinaciones, tienen varias aplicaciones. Por ejemplo, una molécula de ADN se usa, (i) en un proceso para producir el polipéptido codificado en un sistema hospedero recombinante, (ii) en la construcción de vectores de vacuna tales como los virus de viruela, que se usan además en métodos y composiciones para prevenir y/o tratar la infección por Chlamydia, (iii) como un agente de vacuna (también como una molécula de ARN), en una forma simple o formulada con un vehículo de suministro y , (iv) en la construcción de cepas de Chlamydia atenuadas que puedan sobreexpresar a un polinucieótido de la invención o expresarlo en una forma mutada, no tóxica.

Por lo tanto, un segundo aspecto de la invención comprende (i) un cassette de expresión que contiene una molécula de ADN de la invención colocada bajo el control de elementos requeridos para la expresión, en particular, bajo el control de un promotor apropiado; (ii) un vector de expresión que contiene un cassette de expresión de la invención; (iii) una célula procariótica o eucariótica transformada o transfectada con un cassette de expresión y/o vector de la invención, así como (iv) un proceso para producir un polipéptido o un derivado de polipéptido codificado por un polinucleótido de la invención, que implica cultivar una célula procariótica o eucariótica transformada o transfectada con un cassette de expresión y/o vector de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ADN de la invención, y recuperar del cultivo celular el polipéptido o derivado de polipéptido codificado. Un sistema de expresión recombinante se selecciona de hospederos procaríóticos y eucaríóticos. Los hospederos eucaríóticos incluyen células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris), células de mamífero (por ejemplo, células COS1 , NIH3T3, o JEG3), células de artrópodos (por ejemplo, células Spodoptera frugiperda (SF9)), y células de plantas. Un sistema de expresión preferido es un hospedero procariótico como E. coli. Las células bacterianas y eucarióticas están disponibles de varías fuentes diferentes, que incluyen fuentes comerciales, para los expertos en la técnica, por ejemplo, The American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland). Las fuentes comerciales de células que se usan para la expresión de proteína recombinante, también proveen instrucciones para el uso de las células. La elección del sistema de expresión depende de las características deseadas para el polipéptido expresado. Por ejemplo, puede ser útil producir un polipéptido de la invención en una forma lipídica particular o en cualquier otra forma. El experto en la técnica entenderá fácilmente que no se esperaría que todos los vectores y secuencias de control de expresión y hospederos expresen igualmente bien los polinucleótidos de esta invención. Sin embargo, con la gula descrita abajo, se puede hacer una selección de vectores, secuencias de control de expresión y hospederos sin mayor experimentación y sin salirse del alcance de esta invención. Al seleccionar un vector, debe escogerse un hospedero que sea compatible con el vector que se espera que exista y en el que posiblemente se duplique. Las consideraciones se hacen con respecto al número de copias del vector, la capacidad de controlar el número de copias, la expresión de otras proteínas tales como de resistencia a antibióticos. Al seleccionar una secuencia de control de expresión, se consideran varías variables. Entre las variables importantes están la relativa a la fuerza de la secuencia (por ejemplo, la capacidad para conducir la expresión bajo varias condiciones), la capacidad para controlar la función de la secuencia, la compatibilidad entre el polinucleótido que será expresado y la secuencia de control (por ejemplo, se considera que las estructuras secundarías evitan a las estructuras de horquilla que impiden una transcripción eficiente). Al seleccionar el hospedero, se seleccionan hospederos unicelulares que sean compatibles con el vector seleccionado, tolerantes de cualquier posible efecto tóxico del producto expresado; capaces de secretar eficientemente el producto expresado si esto se desea; que puedan expresar el producto en la conformación deseada; que puedan ser fácilmente escalados, y que faciliten la purificación del producto final. La elección del cassette de expresión depende del sistema hospedero seleccionado así como de las características deseadas para el polipéptido expresado. Generalmente, un cassette de expresión incluye un promotor que es funcional en el sistema hospedero seleccionado y que puede ser constitutivo o inducible; un sitio de unión de ribosoma; un codón de inicio (ATG) si es necesario; una región que codifique un péptido señal, por ejemplo, un péptido de señal de lipidación; una molécula de ADN de la invención; un codón de detención; y opcionalmente una región terminal 3' (un terminador de traducción y/o transcripción). La región que codifica al péptido señal es adyacente al polinucleótido de la invención y se coloca en el marco de lectura apropiado. La región que codifica al péptido señal es homóloga o heteróloga a la molécula de ADN que codifica al polipéptido maduro y es compatible con el aparato de secreción del hospedero usado para la expresión. El marco de lectura abierto constituido por la molécula de ADN de la invención, individualmente o junto con el péptido señal, se coloca bajo el control del promotor para que la transcripción y la traducción ocurran en el sistema hospedero. Los promotores y las regiones que codifican el péptido señal son ampliamente conocidos y están disponibles para los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, al promotor de Salmonella typhimurium (y derivados) que es inducible por arabinosa (promotor araB) y es funcional en bacterias Gram-negativas como E. coli (como se describe en la patente de E.U.A. No: 5,028,530 y en Cagnon y otros, (Cagnon y otros, Protein Engineering (1991 ) 4(7):843)); el promotor del gen del bacteriófago T7 que codifica ARN polimerasa, que es funcional en varias cepas de E. coli que expresan polimerasa T7 (descrita en la patente de E.U.A No: 4,952,496); péptido de señal de lipidación OspA; y péptido de señal de lipidación RIpB (Takase y otros. J. Bact. (1987) 169:5692). El cassette de expresión generalmente es parte de un vector de expresión, que se selecciona por su capacidad para duplicarse en el sistema de expresión escogido. Los vectores de expresión (por ejemplo, plásmidos o vectores virales) pueden escogerse, por ejemplo, de aquellos descritos en Pouwels y otros, (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 985, Supp. 1987). Los vectores de expresión convenientes se pueden comprar en varias fuentes comerciales. Los métodos para transformar/transfectar células hospederas con vectores de expresión, son bien conocidos en la técnica y dependen del sistema hospedero seleccionado, como se describe en Ausubel y otros, (Ausubel y otros, Cürrent Protocols in Molecular Bio gy, John Wiley & Sons Inc. 1994).

Después de la expresión, un polipéptido recombinante de la invención (o un derivado de polipéptido) se produce y permanece en el compartimiento intracelular, se secreta excreta en el medio extracelular o en el espacio períplásmico, o se incrusta en la membrana celular. El polipéptido se recupera en una forma sustancialmente purificada del extracto celular o del sobrenadante después de centrifugación del cultivo de células recombinantes. Generalmente, el polipéptido recombinante se purifica mediante purificación de afinidad basada en anticuerpos o a través de otros métodos bien conocidos que pueden ser adaptados fácilmente por una persona experta en la técnica, tal como la fusión del polinucleótido que codifica al polipéptido o su derivado, a un dominio pequeño de unión de afinidad. Los anticuerpos útiles para purificar los polipéptidos de la invención por inmunoafinidad, se obtienen según se describe más abajo. Un polinucleótido de la invención también puede ser útil como vacuna. Hay dos rutas principales, ya sea usando un hospedero viral o bacteriano como vehículo de suministro de genes (vector de vacuna vivo) o administrando el gen en una forma libre, por ejemplo, insertado en un plásmido. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polinucleótido de la invención se evalúa como se describe enseguida. Por lo tanto, un tercer aspecto de la invención provee (i) un vector de vacuna como el virus de viruela, que contiene una molécula de ADN de la invención, colocada bajo el control de los elementos requeridos para la expresión; (ii) una composición de materia que comprende un vector de vacuna de la invención, junto con un diiuyente o vehículo; específicamente (iii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad, terapéuticamente o profilácticamente efectiva, de un vector de vacuna de la invención; (iv) un método para inducir una respuesta inmune contra Chlamydia en un mamífero (por ejemplo, un humano; alternativamente, el método puede usarse en aplicaciones veterinarias para prevenir o tratar la infección por Chlamydia de animales, por ejemplo, gatos o aves), que implica administrarle al mamífero una cantidad inmunogénicamente efectiva, de un vector de vacuna de la invención para producir una respuesta inmune, protectora o terapéutica, a Chlamydia; y particularmente, (v) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumonía, C. pecorum), lo que implica administrarle a un individuo infectado, una cantidad, profiláctica o terapéutica, de un vector de vacuna de la invención. Adicionalmente, el tercer aspecto de la invención incluye el uso de un vector de vacuna de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección por Chlamydia. Como aquí se usa, un vector de vacuna expresa uno o varios polipéptidos o derivados de la invención. El vector de vacuna puede expresar adicionalmente una citocina, como interleucina 2 (IL-2) o interleucina 12 (IL-12), que incrementa la respuesta inmune (efecto adyuvante). Se entiende que cada uno de ios componentes a expresar, se colocan bajo el control de los elementos requeridos para expresión en una célula de mamífero.

Consistentemente con el tercer aspecto de la invención, está una composición que incluye varios vectores de vacuna, cada uno de ellos, capaz de expresar un polipéptido o derivado de la invención. Una composición podría también incluir un vector de vacuna capaz de expresar un antígeno de Chlamydia adicional, o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante o derivado del mismo; opcionaimente junto con, o una citocina como IL-2 o IL-12. Los métodos de vacunación para tratar o prevenir la infección en un mamífero, incluyen el uso de un vector de vacuna de la invención, para ser administrado por cualquier vía convencional, particularmente a una superficie de mucosa (por ejemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, pulmonar, intestinal, rectal, vaginal, o del tracto urinario) o por la vía parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, o intraperitoneal). Las vías preferidas dependen de la elección del vector de vacuna. El tratamiento puede ser efectuado con una sola dosis o repitiéndola en intervalos. La dosis apropiada depende de varios parámetros conocidos por los técnicos expertos, tales como el mismo vector de vacuna, la vía de administración o la condición del mamífero que se vacunará (peso, edad y otras características). Los vectores de vacuna vivos disponibles en la técnica, incluyen vectores virales como los adenovirus y virus de viruela, así como también vectores bacterianos, por ejemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille bilió de Calmette-Guérin (BCG), y Straptococcus.

Un ejemplo de un vector de adenovirus, así como también un método para construir un vector de adenovirus capaz de expresar una molécula de ADN de la invención, se describen en la patente de E.U.A. No: 4,920,209. Los vectores del virus de la viruela incluyen virus de vaccinia y virus de viruela de canario, descritos en la patente de E.U.A No: 4,722,848 y la patente de E.U.A No: 5,364,773, respectivamente. (Véase también, por ejemplo, Tartaglia y otros, Virology (1992) 188:217) para una descripción de un vector de virus de vaccinia; y Taylor y otros, Vaccine (1995) 13:539 para una referecia de una viruela de canario). Los vectores de virus de viruela capaces de expresar un polinucleótido de la invención, se obtienen por recombinación homóloga, tal como se describe en Kieny y otros, Natura (1984) 312:163, para que el polinucleótido de la invención se inserte en el genoma viral bajo condiciones apropiadas para la expresión en células de mamífero. Generalmente, la dosis del vector viral de vacuna, para uso terapéutico o profiláctico, puede ser de aproximadamente 1x104 a aproximadamente 1x1011, de preferencia aproximadamente de 1x107 a aproximadamente 1x 010, de preferencia de aproximadamente 1x107 a aproximadamente 1x109 unidades formadoras de placa por kilogramo. De preferencia, los vectores virales se administran parenteralmente; por ejemplo, en 3 dosis, separadas en 4 semanas. Se prefiere evitar la adición de un adyuvante químico a una composición que contenga un vector viral de la invención y con ello, reducir la respuesta inmune al vector viral mismo.

Se conocen cepas mutantes no toxicogénicas de Vibrio cholerara que son útiles como vacuna oral viva. Mekalanos y otros, Natura (1983) 306:551 y la patente de E.U.A. No: 4,882,278 describen cepas que tienen una cantidad sustancial de la secuencia codificadora de cada uno de los dos alelos ctxA suprimidos, para que no se produzca ninguna toxina de Cholerae funcional. WO 92/11354 describe una cepa en la que el locus irgA es inactivado por mutación; esta mutación se puede combinar en una sola cepa con mutaciones de ctxA. WO 94/01533 describe un muíante de supresión carente de secuencias funcionales de ADN de ctxA y attRSI. Estas cepas mutantes son construidas por ingeniería genética para que expresen antfgenos heterólogos, tal como se describe en WO 94/19482. Una dosis efectiva de la vacuna de una cepa de Vibrio cholerae, capaz de expresar un polipéptido o un derivado de polipéptido codificado por una molécula de ADN de la invención, contiene aproximadamente 1x105 a aproximadamente 1x109, de preferencia de aproximadamente 1x106 a aproximadamente 1x108, bacterias viables en un volumen apropiado para la vía de administración seleccionada. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vías de mucosas; preferiblemente, estos vectores se administran intranasalmente u oralmente. Se describen cepas atenuadas de Salmonella typhimurium, construidas por ingeniería genética para la expresión recombinante de antígenos heterólogos o no, y su uso como vacunas orales, en Nakayama y otros (Bio Technology (1998) 6:693) y WO 92/11361. Las vías de administración preferidas incluyen todas las vias de mucosas: preferiblemente, estos vectores se administran intranasalmente u oralmente. Otras cepas bacterianas usadas como vectores de vacuna en el contexto de la presente invención, se describen para Shigella fíexnery en High y otros, EMBO (1992) 1 : 1991 y Sizemore y otros, Science (1995) 270:299 para Streptococcus gordonii en Medaglini y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. E.UA. (1995) 92:6868, y para Bacille Calmette Guerín en Flynn J. L, Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (suppl. I): 31 , WO 88/06626, WO 90/00594, WO 91/13157, WO 92/01796, y WO 92/21376. En vectores bacterianos, el polinucleótido de la Invención se inserta en el genoma bacteriano o permanece en un estado libre como parte de un plásmido. La composición que comprende un vector bacteriano de vacuna de la presente invención puede además, contener un adyuvante. Los expertos en la técnica conocen varios adyuvantes. Los adyuvantes que se prefieren se seleccionan como se provee más abajo. Por lo tanto, un cuarto aspecto de la invención provee (i) una composición de material que incluye un polinucleótido de la invención, junto con un diluyente o vehículo; (ii) una composición farmacéutica que incluye una cantidad, terapéuticamente o profilácticamente efectiva, de un polinucleótido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmune contra Chlamydia en un mamífero por administración de una cantidad, inmunogénicamente efectiva, de un polinucleótido de la invención para provocar una respuesta protectora inmune a Chlamydia; y particularmente, (iv) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae, o C. pecorum) mediante la administración de una cantidad, profiláctica o terapéutica, de un polinucieótido de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, el cuarto aspecto de la invención incluye el uso de un polinucieótido de la invención en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar la infección por Chlamydia. Un uso preferido incluye el uso de una molécula de ADN colocada bajo condiciones para la expresión en una célula de mamífero, especialmente en un piásmido que no se puede duplicar en células de mamíferos, y para integrarse sustancialmente en un genoma de mamífero. El uso de los polinucleótidos de la invención incluye su administración a un mamífero como vacuna, para propósitos terapéuticos o profilácticos. Tales polinucleótidos se usan en la forma de ADN como parte de un piásmido que es incapaz de duplicarse en una célula de mamífero y es incapaz de integrarse en un genoma de mamífero. Generalmente, tal molécula de ADN se coloca bajo el control de un promotor apropiado para la expresión en una célula de mamífero. El promotor funciona ya sea de forma ubicua o específica de tejido. Los ejemplos de promotores no específicos de tejido incluyen el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (descrito en la patente de E.U.A. No: 4,168,062) y el promotor del Virus de Sarcoma de Rous (desctiro en Norton & Coffin, Molec. Cell Biol. (1985) 5:281 ). Un ejemplo de un promotor específico de tejido es el promotor de desmina que maneja la expresión en células musculares (Li y otros, Gene (1989) 78:243, Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:6562 y Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268:10403). El uso de los promotores es bien conocido por los expertos en la técnica. Se describen vectores útiles en muchas publicaciones, específicamente WO 94/21797 y Hartíkka y otros, Human Gene Therapy (1996) 7:1205. Los polinucleótidos de la invención que se usan como una vacuna, codifican ya sea un precursor o una forma madura del polipéptido correspondiente. En la forma de precursor, el péptido señal es homólogo o heterólogo. Si es heterólogo, se prefiere una secuencia guía eucaríótica, tal como la secuencia gula del factor de plasminógeno de tipo de tejido (tPA). Como se usa aquí, una composición de la invención contiene uno o vanos polinucleótidos, opcionalmente, por lo menos con un polinucleótido adicional que codifica otro antígeno de Chlamydia como la subunidad de ureasa A, B, o ambas, o un fragmento, derivado, muíante, o su análogo. La composición también puede contener un polinucleótido adicional que codifica una citocina, como interleucina-2 (IL-2) o ¡nterleucina-12 (IL-12) para que se incremente la respuesta inmune. Estos polinucleótidos adicionales se colocan bajo control apropiado para la expresión. Convenientemente, moléculas de ADN de la invención y/o moléculas de ADN adicionales que se incluirán en la misma composición, están presentes en el mismo plásmido.

Las técnicas estándar de biología molecular para preparar y purificar polinucleótidos, se usan en la preparación de los polinucleótidos terapéuticos de la invención. Para usarse como vacuna, un polinucleótido de la invención se formula de acuerdo a varios métodos descritos abajo. Un método utiliza el polinucleótido en una forma simple, libre de cualquier vehículo de suministro. Un polinucleótido así simplemente se diluye en una solución fisiológicamente aceptable, como la salina estéril o la salina estéril amortiguada, con o sin un vehículo. Cuando está presente, el vehículo es preferentemente isotónico, hipotónico, o débilmente hipertónico, y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal y como la provista por una solución de sacarosa, por ejemplo, una solución que contiene 20% de sacarosa. Un método alternativo utiliza el polinucleótido en asociación con agentes que ayudan en la incorporación celular. Ejemplos de tales agentes son (i) agentes químicos que modifican la permeabilidad celular, como la bupivacaina (véase, por ejemplo, WO 94/16737), (¡i) liposomas para encapsulación del polinucleótido, o (iii) lípidos catiónicos o micropartículas de sílice, oro, o tungsteno que se asocian con los polinucleótidos. Los liposomas aniónicos y neutros se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, "Liposomes: A Practical Approach", RPC New Ed, IRL Press (1990), para una descripción detallada de los métodos para hacer liposomas) y son útiles para suministrar una gran variedad de productos, incluyendo polinucleótidos.

Los lípidos catiónicos también se conocen en la técnica y se usan comúnmente para suministro de genes. Tales lípidos incluyen Lipófectin™ también conocido como DOTMA (cloruro de N-[1-(2,3-diole¡lox¡)propil]-N,N,N-trimetilamon¡o), DOTAP (1 ,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano), DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio), DOGS (dioctadecilamidologlicil-espermina) y derivados de colesterol tales como DC-Chol (3 beta-(N-(N',N'-dimetilaminometano)-carbamoil)-colesterol). Se puede encontrar una descripción de estos lípidos catiónicos en EP 187,702, WO 90/11092, la patente de E.U.A No: 5,283,185, WO 91/15501. WO 95/26356, y la patente de E.U.A. No: 5,527,928. Los lípidos catiónicos para suministro de genes, de preferencia de usan en asociación con un lípido neutro como DOPE (dioleil fosfatidiletanolamina), tal como se describe por ejemplo en WO 90/11092. Una formulación que contiene liposomas catiónicos puede, opcionalmente, contener otros compuestos que faciliten la transfección. Varios de ellos se describen en WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608, y WO 95/02397. Incluyen derivados de espermina útiles para facilitar el transporte de ADN a través de la membrana nuclear (véase, por ejemplo, WO 93/18759) y compuestos de permeabilización de membrana tales como GALA, Gramicidina S, y sales biliares catiónicas (véase, por ejemplo, WO 93/19768). Se usan micropartfculas de oro o tungsteno para suministro de genes, tal como se describe en WO 91/00359, WO 93/17706, y Tang y otros, (Nature (1992) 356:152). El polinucleótido cubierto con micropartfculas se inyecta por vía intradérmica o intraepidérmica, usando un dispositivo de inyección sin aguja ("pistola de genes"), como se describe en la patente de E.UA No: 4,945,050, la patente de E.U.A. No: 5,015,580, y WO 94/24263. La cantidad de ADN que se usará en un receptor de vacuna depende, por ejemplo, de la fuerza del promotor usado en la construcción del ADN, la inmunogenicidad del producto de gen expresado, la condición del mamífero destinado para la administración (por ejemplo, el peso, edad, y la salud general del mamífero), el modo de administración, y el tipo de formulación. En general, una dosis, terapéuticamente o profilácticamente efectiva de aproximadamente *\µ3 a aproximadamente 1 mg, de preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 µg y, aún mejor, de aproximadamente 25 µg a aproximadamente 250 µ?, se puede administrar a humanos adultos. La administración se puede lograr en una sola dosis o repetirse a intervalos. La vía de administración es cualquier vía convencional usada en el campo de las vacunas. Como guía general, un poiinucleótido de la invención se administra por medio de una superficie de mucosa, por ejemplo, una superficie ocular, intranasal, pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal y del tracto urinario; o por vía párente ral, por ejemplo, por una vía intravenosa, subcutánea, intraparítoneal, intradérmica, intraepidérmica o intramuscular. La elección de la vía de administración depende de la formulación que se seleccione. Un poiinucleótido formulado en asociación con bupivacaína se administra, convenientemente, en el músculo. Cuando se usa un liposoma neutro o aniónico o un lípido catiónico, como el DOTMA o DC-Chol, la formulación se puede inyectar, convenientemente, por vía intravenosa, intranasal (aerosolización), intramuscular, intradérmica y subcutánea. Un polinucleótido en forma simple se puede administrar de forma conveniente por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Aunque no es absolutamente requerido, tal composición puede también contener un adyuvante. Si es así, se prefiere un adyuvante sistémico que no requiera una administración concomitante para que exhiba un efecto adyuvante, tal como por ejemplo QS21 , que se describe en la patente de E.U.A. No: 5,057,546. La información de secuencia que se provee en la presente solicitud, hace posible el diseño de sondas de nucleótido específicas e iniciadores que se usan para propósitos de diagnóstico. Por lo tanto, un quinto aspecto de la invención provee una sonda de nucleótido o iniciador que tiene una secuencia encontrada en, o derivada por, la degeneración del código genético de una secuencia mostrada en la SEQ ID No: 1. El término "sonda", como se usa en la presente solicitud, se refiere a moléculas de ADN (de preferencia de una sola cadena) o de ARN (o sus modificaciones o combinaciones) que hibrídan bajo las condiciones severas, como se definieron anteriormente, con moléculas de ácido nucleico que tienen SEQ ID No: 1 o con secuencias homólogas a la SEQ ID No: 1 , o con sus secuencias complementarias o de antisentido. Generalmente, las sondas son significantemente más cortas que las secuencias de longitud completa. Tales sondas contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, de preferencia de aproximadamente 10 a cerca de 80 nucleótidos. En particular, las sondas tienen secuencias que son, por lo menos 75%, de preferencia por lo menos 85%, aún mejor 95% homólogas a una porción de cualquiera de la SEQ ID No: 1 o que son complementarías a tales secuencias. Las sondas pueden contener bases modificadas tales como inosina, metil-5-desoxocitidina, desoxiurídina, dimetilamino-5-desoxiuridina, o diamino-2,6-purína. Los residuos de azúcar o fosfato también pueden modificarse o sustituirse. Por ejemplo, un residuo de desoxirribosa puede reemplazarse con una poliamida (Nielsen y otros, Science (1994) 254:1497) y los residuos de fosfato pueden reemplazarse con grupos de éster tales como difosfato, alquilo, arílfosfonato y esteres de fosforotioato. Además, el grupo 2'-hidroxilo en ríbonucleótidos puede modificarse incluyendo tales grupos como los alquilo. Las sondas de la invención se usan en pruebas de diagnóstico, como sondas de captura o detección. Tales sondas de captura se inmovilizan convencionalmente en un soporte sólido, directamente o indirectamente, por medios covalentes o por adsorción pasiva. Una sonda de detección se marca con un marcador de detección seleccionado de: isótopos radioactivos, enzimas como peroxidasa, fosfatasa alcalina, y enzimas capaces de hidrolizar un substrato cromogénico, fluorogénico, o luminiscente; compuestos que son cromogénicos, fluorogénicos, o luminisecentes, análogos de base de nucleótido y biotina.

Las sondas de la invención se usan en cualquier técnica de hibridación convencional, como el dot blot (Maniatis y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982) Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York), Southern blot (Southern, J. Mol. Biol. (1975) 98:503), Northern blot (idéntica a la Southern blot con la excepción de que se usa ARN como objetivo), o la técnica de sandwich (Dunn y otros, Cell (1977) 12:23). La segunda técnica implica el uso de una sonda de captura específica y/o una sonda de detección específica con secuencias de nucleótido que difieren entre sí, por lo menos parcialmente. Un iniciador es una sonda de, usualmente, cerca de 10 hasta 40 nucleótidos aproximadamente, que se usa para iniciar la polimerización enzimática de ADN en un proceso de ampliación (por ejemplo, PCR), en un proceso de alargamiento, o en un método de transcripción inversa. Los iniciadores que se usan en métodos de diagnóstico que implican PCR se marcan mediante los métodos conocidos en la técnica. Tal como se describe en este documento, la invención también incluye (i) un reactivo que comprende una sonda de la invención para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico; (ii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico, en el que (a) se recupera una muestra o se deriva del material biológico, (b) se extrae y se desnaturaliza ADN o ARN del material, y (c) se expone a una sonda de la invención, por ejemplo una sonda de captura, de detección, o ambas, bajo condiciones de hibridación severas, para detectar la hibridación; y (iii) un método para detectar y/o identificar la presencia de Chlamydia en un material biológico, en el que (a) se recupera una muestra o se deriva del material biológico, (b) se extrae ADN del mismo, (c) el ADN extraído se prepara por lo menos con uno, y de preferencia dos, iniciadores de la invención y es ampliado por una reacción en cadena de polimerasa, y (d) se produce el fragmento de ADN ampliado. Es aparente que la descripción de secuencias de polinucleótido de SEQ ID No: 1 , sus secuencias homólogas y parciales, hace posible sus secuencias de aminoácidos correspondientes. Por lo tanto, un sexto aspecto de la invención presenta un polipéptido o derivado de polipéptido sustancialmente purificado que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de la invención. Un "polipéptido sustancialmente purificado" tal como se usa en este documento, se define como un polipéptido que se separa del medio en el que ocurre naturalmente y/o que está libre de la mayoría de los polipéptidos que están presentes en el medio en el que fue sintetizado. Por ejemplo, un polipéptido sustancialmente purificado está libre de polipéptidos citoplásmicos. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que los polipéptidos de la invención pueden ser purificados de una fuente natural, esto es, una cepa de Chlamydia, o pueden ser producidos por medios recombinantes. Consistentemente con el sexto aspecto de la invención, están los polipéptidos, homólogos o fragmentos que son modificados o tratados para incrementar su inmunogenicidad en el animal objetivo, en quien se espera que el polipéptido, homólogo o fragmentos confiera protección contra Chlamydia. Tales modificaciones o tratamientos incluyen: sustituciones de aminoácido con un derivado de aminoácido como la 3-metilhistidina, 4-hidroxipolina, 5-hidroxilisina, etc., modificaciones o supresiones que se llevan a cabo después de la preparación del polipéptido, homólogo o fragmento, tales como la modificación de grupos de laterales amino, carboxilo o hidroxilo de los aminoácidos. La identificación de polipéptidos homólogos o derivados de polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención que tienen antigenicidad específica, se logra probando la reactividad cruzada con un antisuero desarrollado contra el polipéptido de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 1. El procedimiento es el siguiente: se desarrolla un antisuero monoespecífico hiperinmune contra un polipéptido de referencia purificado, un polipéptido de fusión (por ejemplo, un producto de expresión de MBP, GST, o sistemas His-tag, cuya descripción e instrucciones de uso se encuentran en los manuales de productos de Invitrogen para pcADN3.1/Myc-His (+) A, B, y C y para Sistema de Purificación de Proteína Xpress™) o un péptido sintético que se predice como antigénico), Cuando un antisuero se desarrolla contra un polipéptido de fusión, se emplean dos sistemas de fusión diferentes. La antigenicidad específica se puede determinar de acuerdo con varios métodos, incluyendo Western blot (Towbin y otros, Pmc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. (1979) 76:4350), dot blot, y ELISA, descritas a continuación.

En una prueba Western blot, el producto que será probado, ya sea como una preparación purificada o un extracto total de E. col¡, se somete a una electroforesis SDS-Page, tal como lo describe Laemmli {Natura (1970) 227:680). Después de transferirse a una membrana de nitrocelulosa, el material se incuba con el antisuero hiperinmune monoespecífico diluido en la escala de diluciones de cerca de 1:5 hasta cerca de 1 :5000, de preferencia de aproximadamente 1 :100 a cerca de 1 :500. La antigenicidad específica se muestra una vez que una banda correspondiente al producto exhiba reactividad en cualquiera de las diluciones de la escala antes mencionada. En una prueba ELISA, el producto que será probado se usa preferentemente como el antígeno de recubrimiento. Se prefiere una preparación purificada, aunque también se puede utilizar un extracto de células completas. Brevemente, se distribuyen aproximadamente 100 µ? de una preparación de cerca de 10 de proteína/ml, en pozos de una placa de policarbonato ELISA de 96 pozos. La placa se incuba por dos horas a 37° C y durante la noche a 4° C. Se lava la placa con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) conteniendo 0.05% de Tween 20 (amortiguador PBS/Tween). Los pozos se saturan con 250 µ? de PBS conteniendo 1 % de seroalbúmina de bovino (BSA) para impedir la unión de anticuerpos no específica. Después de una hora de incubación a 37°C, se lava la placa con amortiguador PBS/Tween. El antisuero se diluye en forma senada en amortiguador PBS/Tween que contiene 0.5 % de BSA. Se agregan 100 µ? de diluciones por pozo. Se incuba la placa durante 90 minutos a 37° C, se lava y se evalúa de acuerdo a los procedimientos estándar. Por ejemplo, se agrega un conjugado de peroxidasa anti-conejo de cabra a los pozos cuando los anticuerpos específicos se desarrollaron en conejos. La incubación se lleva a cabo durante 90 minutos a 37°C y se lava la placa. Se desarrolla la reacción con el substrato apropiado y se mide la reacción por colorimetría (absorbencia medida espectrofotométrícamente). Bajo las condiciones experimentales anteriores, una reacción positiva se hace evidente por valores de D.O. mayores que un suero de control no inmune. En una prueba dot blot, se prefiere un producto purificado, aunque también se puede usar un extracto de células completas. Brevemente, una solución del producto aproximadamente a 100 µg/ml se diluye dos veces en serie en Tris-HC1 50 mM (pH 7.5). Se aplican 100 µ? de cada dilución a una membrana de nitrocelulosa de 0.45 µp? puesta en un aparato de dot blot de 96 pozos (Biorad). Se remueve el amortiguador aplicándole vacío al sistema. Los pozos se lavan con la adición de Tris- HCI 50 mM (pH 7.5) y la membrana se seca con aire. La membrana se satura en amortiguador de bloqueo (Trís-HC1 50 mM (pH 7.5) NaCI 0.15 M, 10 g/l de leche descremada) y se incuba con una dilución de antisuero de aproximadamente 1 :50 a cerca de 1:5000, de preferencia aproximadamente :500. La reacción se revela de acuerdo a los procedimientos estándar. Por ejemplo, se agrega un conjugado de peroxidasa anti-conejo de cabra a los pozos cuando se usan anticuerpos de conejo. La incubación se lleva a cabo durante 90 minutos a 37°C y se lava el blot. La reacción se desarrolla con el substrato apropiado y se detiene. La reacción se mide visualmente por la aparición de una mancha de color, por ejemplo, mediante colorimetría. Bajo las condiciones experimentales anteriores, una reacción positiva se pone de manifiesto una vez que una mancha de color es asociada con una dilución de por lo menos cerca de 1 :5, de preferencia por lo menos cerca de 1 :500. La eficacia terapéutica o profiláctica de un polipéptido o derivado de la invención se puede evaluar tal y como se describe enseguida. Un séptimo aspecto de la invención provee (i) una composición de material que contiene un polipéptido de la invención junto con un diluyente o vehículo; específicamente (ii) una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un polipéptido de la invención; (iii) un método para inducir una respuesta inmune contra Chlamydia en un mamífero, administrándole al mamífero una cantidad inmunogénicamente efectiva de un polipéptido de la invención para provocar una respuesta protectora inmune a Chlamydia; y particularmente, (iv) un método para prevenir y/o tratar una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae o C. pecorum), administrándole una cantidad, profiláctica o terapéutica, de un polipéptido de la invención, a un individuo infectado. Adicionalmente, el séptimo aspecto de la invención incluye el uso de un polipéptido de la invención para la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar infección por Chlamydia. Tal y como se usa aquí, las composiciones inmunogénicas de la invención se administran por las vías convencionales conocidas en el campo de las vacunas, en particular a una superficie de mucosa (por ejemplo, ocular, intranasal, pulmonar, oral, gástrica, intestinal, rectal, vaginal, o tracto urinario) o por vfa parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal). La selección de la vía de administración depende de varios parámetros, tales como el adyuvante asociado con el polipéptido. Si se usa un adyuvante de mucosa, se prefiere la vía intranasal u oral. Si se usa una formulación de lípido o un compuesto de aluminio, se prefiere la vía parenteral, siendo preferida la vía subcutánea o intramuscular. La selección también depende de la naturaleza del agente de vacuna. Por ejemplo, un polipéptido de la invención fusionado a CTB o LTB, se administra mejor en una superficie mucosa. Tal como se usa aquí, la composición de la invención contiene uno o varios poiipéptidos o derivados de la invención. Opcionalmente, la composición contiene por lo menos un antígeno de Chlamydia adicional, o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante o su derivado. Para usarse en una composición de la invención, un polipéptido, o su derivado, se formula en, o con, liposomas, preferentemente iiposomas neutros o aniónicos, microesferas, ISCOMS, o partículas tipo virus (VLPs) para facilitar el suministro y/o incrementar la respuesta inmune. Estos compuestos están disponibles con facilidad para los expertos en la técnica; por ejemplo, véase Liposomes: A Practical Approach, RCP nueva edición IRL press (1990).

Otros adyuvantes diferentes a los liposomas y materiales similares, son también conocidos y usados en la técnica. Los adyuvantes pueden proteger al antígeno de dispersión rápida al secuestrarlo en un depósito local, o podrían contener sustancias que estimulan al hospedero para que secrete factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Una selección apropiada puede ser realizada convencionalmente por los expertos en la técnica, por ejemplo, de entre los que se describen más abajo (bajo el decimoprimer aspecto de la invención). El tratamiento se logra en una sola dosis, o en dosis repetidas a intervalos conforme sea necesario, tal como lo puede determinar un experto en la técnica. Por ejemplo, a una dosis iniciadora le siguen tres dosis de refuerzo a intervalos semanales o mensuales. Una dosis apropiada depende de varios parámetros incluyendo el receptor (por ejemplo, adulto o infante), el antígeno de vacuna particular, la vía y frecuencia de administración, la presencia/ausencia o tipo de adyuvante, y el efecto deseado (por ejemplo, protección y/o tratamiento), tal como lo puede determinar un experto en la técnica. En general, un antígeno de vacuna de la invención se administra por una vía a través de las mucosas en una cantidad de aproximadamente 10 µ9 hasta cerca de 500 mg, de preferencia de aproximadamente 1 mg hasta cerca de 200 mg. Para la vía parenteral de administración, por lo general la dosis no excede aproximadamente 1 mg, preferentemente cerca de 100 µ?.

Cuando se usan como agentes de vacuna, ios polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden usar en forma de secuencias como parte de un proceso de inmunización de pasos múltiples. Por ejemplo, inicialmente se ceba un mamífero con un vector de vacuna de la invención, tal como un virus de viruela, por ejemplo, por vía parenteral, y después se le refuerza dos veces con el polipéptido codificado por el vector de vacuna, por ejemplo, por la vía de la mucosa. En otro ejemplo, los liposomas asociados con un polipéptido o derivado de la invención, también se usan para cebar, llevando a cabo reforzamiento a través de las mucosas usando un polipéptido o derivado soluble de la invención en combinación con un adyuvante de mucosa (por ejemplo, LT). Un derivado de polipéptido de la invención también se usa de acuerdo al séptimo aspecto de la invención como un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos anW-Chlamydia, por ejemplo, en una muestra de sangre. Tales polipéptidos tienen aproximadamente 5 hasta cerca de 80, de preferencia de aproximadamente 10 a cerca de 50 aminoácidos de longitud. Pueden ser marcados o no marcados, dependiendo del método de diagnóstico. Los métodos de diagnóstico que incluyen tal reactivo, se describen más abajo. En la expresión de una molécula de ADN de la invención, un polipéptido o derivado de polipéptido se produce y se purifica usando técnicas de laboratorio conocidas. Tal como se describió anteriormente, el polipéptido o derivado de polipéptido se puede producir como una proteína de fusión que contiene una cola fusionada que facilita la purificación. El producto de fusión se usa para inmunizar un mamífero pequeño, por ejemplo, un ratón o un conejo, para desarrollar anticuerpos contra el polipéptido o derivado de polipéptido (anticuerpos monoespecíficos). Por lo tanto, un octavo aspecto de la invención provee un anticuerpo monoespecífico que se une a un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención. "Anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que puede reaccionar con un polipéptido de Chlamydia único que ocurre naturalmente. Un anticuerpo de la invención puede ser policlonal o monodonal. Los anticuerpos monoespecíficos pueden ser recombinantes, por ejemplo, quiméricos (por ejemplo, constituidos por una región variable de origen murino asociado con una región constante de humano), humanizados (un esqueleto constante de inmunoglobulina humana junto con una región hipervariable de animal, por ejemplo, de origen murino), y/o de una sola cadena. Tanto los anticuerpos policlonales como los monoespecíficos, también pueden estar en la forma de fragmentos de inmunoglobulina, por ejemplo, fragmentos F(ab)'2 o Fab. Los anticuerpos de la invención son de cualquier isotipo, por ejemplo, IgG o IgA, y los anticuerpos policlonales son de un solo isotipo o una mezcla de isotipos. Los anticuerpos contra los polipéptidos, homólogos o fragmentos de la presente invención, se generan por inmunización de un mamífero con una composición que comprende dicho polipéptido, homólogo o fragmento. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los métodos para producir anticuerpos policlonaies o monoclonales se conocen bien en la técnica. Para una revisión, véase "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Eds. E. Harlow y D. Lane (1988), y D. E. Yelton y otros, 1981. Ann. Rev. Biochem. 50:657-680. Para anticuerpos monoclonales, véase Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497. Los anticuerpos de la invención, que se desarrollan para un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención, se producen e identifican usando pruebas inmunológicos estándar, por ejemplo, análisis Western blot, prueba dot blot, o ELISA (véase, por ejemplo, Coligan y otros, Current Protocole in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc, New York, NY). Los anticuerpos se usan en métodos de diagnóstico para detectar la presencia de un antígeno de Chlamydia en una muestra, como una muestra biológica. Los anticuerpos también se usan en cromatografía de afinidad para purificar un polipéptido o derivado de polipéptido de la invención. Tal como se describe más adelante, tales anticuerpos se pueden usar en métodos profiláctiicos y terapéuticos de inmunización pasiva. Por lo tanto, un noveno aspecto de la invención provee (i) un reactivo para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica que contiene un anticuerpo, polipéptido, o derivado de polipéptido de la invención; y (ii) un método diagnóstico para detectar la presencia de Chlamydia en una muestra biológica, poniendo en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, un polipéptido, o un derivado de polipéptido de la invención, para que se forme un complejo inmune, y detectando tal complejo para indicar la presencia de Chlamydia en la muestra o el organismo del que se deriva la muestra. Los expertos en la técnica entenderán fácilmente que el complejo inmune se forma entre un componente de la muestra y el anticuerpo, polipéptido, o derivado de polipéptido, cualquiera que se use, y que cualquier material no unido se remueve antes de detectar el complejo. Se entiende que un reactivo de polipéptido es útil para detectar la presencia de anticuerpos an\\-Chlamydia en una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre, mientras que un anticuerpo de la invención se usa para probar una muestra, tal como un extracto gástrico o biopsia, y detectar la presencia de polipéptidos de Chlamydia. Para aplicaciones diagnósticas, el reactivo (es decir, el anticuerpo, polipéptido, o derivado de polipéptido de la invención) está, ya sea en un estado libre o inmovilizado en un soporte sólido, como un tubo, un glóbulo o cualquier otro soporte convencional usado en este campo. La inmovilización se logra usando medios directos o indirectos. Los medios directos incluyen adsorción pasiva (unión no covalente) o unión covalente entre el soporte y el reactivo. "Medios indirectos" se refiere a que un compuesto anti-reactivo que interacciona con un reactivo, se une primero ai soporte sólido. Por ejemplo, si se usa un reactivo de polipéptido, un anticuerpo que se le une puede servir como un anti-reactivo, siempre que se una a un epítope que no esté implicado en el reconocimiento de anticuerpos en muestras biológicas. Los medios indirectos también pueden emplear un sistema ligando-receptor, por ejemplo, en donde una molécula, como una vitamina, se injerta en el reactivo de polipéptido y el receptor correspondiente se inmoviliza en la fase de sólida. Esto lo ilustra el sistema biotina-estreptavidina. Alternativamente, se agrega químicamente o por ingeniería genética una cola de péptido en el reactivo, y el producto injertado o fusionado se inmoviliza por adsorción pasiva o enlace covalente de la cola de péptido. Tales agentes de diagnóstico pueden estar incluidos en un equipo que también tenga instrucciones de uso. El reactivo se marca con un medio de detección que permite la detección, del reactivo cuando éste se une a su objetivo. Los medios de detección pueden ser un agente fluorescente tal como ísocianato de fluoresceína o isotiocianato de fluoresceína, o una enzima, como peroxidasa de rábano o luciferasa o fosfatasa alcalina, o un elemento radiactivo como 125l ó 51 Cr. Por lo tanto, un décimo aspecto de la invención provee un proceso para purificar, de una muestra biológica, un polipéptido o un derivado de polipéptido de la invención, que incluye el llevar a cabo una cromatografía de afinidad basada en anticuerpos con la muestra biológica, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoespecífico de la invención. Para usarse en un procedimiento de purificación de la invención, el anticuerpo es policlonal o monoespecífico, y de preferencia es del tipo IgG. Se preparan IgGs purificados de un antisuero usando métodos estándar (véase, por ejemplo, Coligan y otros, Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Los soportes de cromatografía convencionales, así como métodos estándar para injertar anticuerpos, se describen por ejemplo en Antibodies: A Laborator Manua", D. Lañe, E. Harlow, Eds. (1988) y se describen más abajo. Brevemente, una muestra biológica, como un extracto de C. pneumoniae, preferentemente en una solución de amortiguador, se aplica a un material de cromatografía, preferiblemente equilibrado con el amortiguador usado para diluir la muestra biológica para que el poiipéptido o derivado de polipéptido de la invención (esto es, el antígeno), se pueda adsorber en el material. El material de cromatografía, como un gel o una resina acoplada a un anticuerpo de la invención, está en forma de cargas o en una columna. Los componentes no unidos se lavan y el antígeno se eluye entonces con un amortiguador apropiado de elución, como un amortiguador de glicina o un amortiguador que contenga un agente caotrópico, por ejemplo, guanidina HCI, o alta concentración de sal (por ejemplo, MgCI2 3M). Las fracciones eluidas se recuperan y la presencia del antígeno se detecta, por ejemplo, midiendo la absorbencia a 280 nm. Un decimoprimer aspecto de la invención provee (i) una composición de material que comprende un anticuerpo monoespecífico de la invención, junto con un diiuyente o vehículo; (ii) una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo monoespecífico de la invención, y (iii) un método para tratar o prevenir una infección por Chlamydia (por ejemplo, C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae o C. pecorum), administrándole una cantidad terapéutica o profiláctica de un anticuerpo monoespecífico de la invención a un individuo infectado. Adicionalmente, el decimoprimer aspecto de la invención incluye el uso de un anticuerpo monoespecífico de la invención en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por Chlamydia. El anticuerpo monoespecífico puede ser policlonal o monoclonal, de preferencia del isotipo IgA (predominantemente). En la inmunización pasiva, el anticuerpo se administra a una superficie mucosa del mamífero, por ejemplo, la mucosa gástrica, por ejemplo, oralmente o intragástrícamente, convenientemente, en presencia de un amortiguador de bicarbonato. Alternativamente, se lleva a cabo una administración sistémica, sin requerir un amortiguador de bicarbonato. Un anticuerpo monoespecífico de la invención se administra como un solo componente activo o como una mezcla con por lo menos un anticuerpo monoespecífico específico para un polipéptido de Chlamydia diferente. La cantidad de anticuerpo y el régimen particular que se use, son determinados fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, la administración diaria de aproximadamente 100 a 1 ,000 mg de anticuerpos por una semana, o tres dosis por día de aproximadamente 100 a 1,000 mg de anticuerpos por dos o tres días, son regímenes efectivos para la mayoría de los propósitos. La eficacia terapéutica o profiláctica se evalúa usando métodos estándar de la técnica, por ejemplo, midiendo la inducción de una respuesta inmune en la mucosa o la inducción de inmunidad protectora y/o terapéutica, usando, por ejemplo, el modelo de ratón de C. pneumoniae. Los expertos en la técnica fácilmente reconocerán que la cepa de C. pneumoniae del modelo se puede reemplazar con otra cepa de Chlamydia. Por ejemplo, la eficacia de moléculas de ADN y polipéptidos de C. pneumoniae, se evalúa, preferiblemente, en un modelo de ratón usando una cepa de C. pneumoniae. La protección se determina comparando el grado de infección por Chlamydia con la de un grupo de control. La protección se hace evidente cuando la infección es reducida en comparación con el grupo de control. Tal evaluación se hace para polinucleótidos, vectores de vacuna, polipéptidos y sus derivados, y anticuerpos de la invención. Los adyuvantes útiles en cualquiera de las composiciones de vacuna descritos anteriormente, son como sigue. Los adyuvantes para administración parenteral incluyen compuestos de aluminio, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, e hidroxifosfato de aluminio. El antígeno se precipita o adsorbe sobre el compuesto de aluminio de acuerdo a protocolos estándar. Se usan otros adyuvantes, tales como RIBI (ImmunoChem, Hamilton, T), en administración parenteral. Los adyuvantes para administración en mucosa incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo, la toxina del cólera (CT), la toxina termolábil de E. coli (LT), la toxina A de Clostridium difficile y la toxina de pertussis (PT), o sus combinaciones, subunidades, toxoides, o mutantes, tales como una preparación purificada de la subunidad B de toxina de cólera nativa (CTB). También son convenientes fragmentos, homólogos, derivados, y fusiones para cualquiera de estas toxinas, siempre que retengan la actividad de adyuvante. De preferencia, se usa un mutante que tiene toxicidad reducida. Los imitantes convenientes se describen, por ejemplo, en WO 95/17211 (mutante Arg-7Lys de CT), WO 96/06627 (mutante Arg-192-Gly de LT), y WO 95/34323 (mutante Arg-9-Lys y Glu-129-Gly de PT). Mulantes de LT adicionales que se usan en los métodos y composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, los mutantes Ser-63-Lys, Ala-69-Gly, Glu-110-Asp, y Glu-112-Asp. Otros adyuvantes, tales como un Ifpido A de monofosforilo bacteriano (MPLA), por ejemplo de E. cotí, Salmonella mm' nesota, Salmonella typhimuríum, o Shigella fíexnerí; saponinas, o microesf ras de glicólido poliláctido (PLGA), también se usan en la administración a mucosas. Los adyuvantes útiles tanto para administración en mucosas como parenterales, incluyen polifosfazeno (WO 95/02415), DC-chol (3b-(N-(N',N'-dimetilaminometano)-carbamoil)colesteiOl; patente de E.U.A No. 5,283.185 y WO 96/14831 ), y QS-21 (WO 88/9336). Cualquier composición farmacéutica de la invención que contiene un polinucleótido, un polipéptido, un derivado de polipéptido, o un anticuerpo de la invención, se fabrica de la manera convencional. En particular, se formula con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, agua o una solución salina, como la solución salina de amortiguador de fosfato. En general, se selecciona un diluyente o vehículo en base al modo y la vía de administración, y la práctica farmacéutica estándar.

Los vehículos o diluyentes farmacéuticos convenientes, y las necesidades farmacéuticas para su uso en formulaciones farmacéuticas, se describen en " Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto estándar de referencia en este campo y en la USP/NF. La invención también incluye métodos en los que la infección por Chlamydia se trata por administración oral de un polipéptido de Chlamydia de la invención y un adyuvante de mucosa, en combinación con un antibiótico, un antiácido, sucralfato, o una combinación de los mismos. Ejemplos de tales compuestos que se pueden administrar con el antígeno de vacuna y el adyuvante son los antibióticos, incluyendo, por ejemplo, macrólidos, tetraciclinas, y sus derivados (ejemplos específicos de antibióticos que se pueden usar, incluyen azitromicina o doxicidina, o inmunomoduladores tales como citocinas o esferoides). Además, se usan compuestos que contienen más de uno de los componentes enlistados anteriormente, juntos. La invención también incluye composiciones para llevar a cabo estos métodos, esto es, composiciones que contienen un antígeno (o antígenos) de Chlamydia de la invención, un adyuvante, y uno o más compuestos de los anteriormente enlistados, en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se ha mostrado recientemente que la proteína de membrana rica en cisteína de 60 kDa contiene una secuencia que reacciona en forma cruzada con epítope de cadena pesada de la miosina alfa de murinos M7A-alfa de, un epítope conservado en humanos (Bachmaier y otros, Science (1990) 283:1335). Se propone esta reacción en forma cruzada para contribuir al desarrollo de la enfermedad cardiovascular, de manera que pueda ser benéfica para remover este epítope y cualesquiera otros epitopes que reaccionan en forma cruzada con antígenos humanos, a partir de la proteína si se tiene que utilizar como una vacuna. Asimismo, una modalidad adicional de la presente invención incluye la modificación de la secuencia de codificación, por ejemplo, mediante supresión o sustitución de los nucleótidos que codifican el epítope de polinucleótidos que codifican la proteína, para mejorar la eficacia y seguridad de la proteína como una vacuna. Un enfoque similar puede ser apropiado para cualquier antígeno protector que tenga homologías no deseadas o reacciones cruzadas con antígenos humanos. Las cantidades de los compuestos antes enlistados usadas en los métodos y composiciones de la invención son determinadas fácilmente por un experto en la técnica. También el experto sabe y diseña fácilmente los programas de tratamiento/inmunización. Por ejemplo, los componentes no de vacuna se pueden administrar en los días 1-14, y el antígeno de vacuna + adyuvante se puede administrar en los días 7, 14, 21 y 28.

EJEMPLOS La descripción anterior detalla de manera general la presente invención. Se puede obtener un entendimiento más completo con referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen exclusivamente para efectos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios de forma y sustitución de equivalentes según lo recomienden o juzguen conveniente las circunstancias. Aunque se han empleado términos específicos en la presente, tales términos están considerados en un sentido descriptivo y no para efectos de limitación.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la preparación de un vector de expresión de plásmido pCAI764 que contiene el gen ATP/ADP translocasa. El gen ATP/ADP translocasa se amplificó a partir de ADN genómico de Chlamydia pneumoniae mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un iniciador de extremo 5' (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGACAAAAACCGAAGAAAAACC 3') (SEQ ID No: 3) y un inciador de extremo 3' (5' GCGCCGGATCCCTGAAGAAGCAGGAGCTG 3') (SEQ ID No: 4). El iniciador de extremo 5' contiene un sitio de restricción Not I, un sitio de unión a ribosoma, un codón de iniciación y una secuencia en el extremo 5' de la secuencia de codificación de ATP/ADP translocasa. El iniciador de extremo 3' incluye la secuencia que codifica para la secuencia C-terminal de ATP/ADP translocasa y un sitio de restricción Bam Hl. Se excluyó el oodón de detención y se insertó un nudeótido adidonal para obtener una fusión en marco con la marca de Histidina. Después de la amplificadón, el fragmento de PCR se purificó usando equipo de purificación QIAquick® (Qiagen) y luegó se digirió con Not I y Bam Hl y se donó en un vector de expresión eucariótica pCA/Myc-His que se describe en el ejemplo 2 (figura 3) con transcripción bajo el contra del promotor de CMV humano.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la preparadón del vector de expresión eucariótica pCA/Myc-His. Plásmido pcADN3.1(-)Myc-His C (Invitrogen) se restringió con Spe I y Bam Hl para remover el promotor de CMV y se aisló el fragmento de vector restante. El promotor de CMV e intrón A del plásmido VR-1012 (Vical) se aisló en un fragmento de Spe l/Bam Hl. Los fragmentos se ligaron para producir el plásmido pCA/Myc-His. El fragmento de PCR restringido de Spe l Bam Hl que contiene el gen ATP/ADP translocasa se ligó en el plásmido pCA/Myc-His que se restringió con Not I y Bam Hl para produdr el plásmido PCAI764 (figura 3).

El plásmido resultante, pCAI640, se transfirió por electroporación en E. coli XL-1 azul (Stratagene) el cual se desarrolló en caldo de LB que contiene 50 µa^?t?? de carbenicilina. El plásmido se aisló mediante sistema de purificación de ADN a gran escala Endo Free Plasmid Giga Kit ® (Qiagen). La concentración de ADN se determinó por absorbencia a 260 nm y el plásmido se verificó después de electrofóresis en gel y tinción con bromuro de etidio y comparación con estándares de peso molecular. Los extremos 5' y 3' del gen se verificaron por secuenciación usando un secuencíador de ADN LiCor modelo 4000 L e iniciadores marcados con IRD-800.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la inmunización de ratones para conseguir protección contra una exposición intranasal de C. pneumoniae. Se ha demostrado previamente (Yang, y otros, 1993) que los ratones son susceptibles a la infección intranasal con diferentes aislados de C. pneumoniae. La cepa AR-39 (Grayston,1989) se usó en ratones Balb/c como un modelo de infección por exposición para examinar la capacidad de los productos de gen de Chlamydia suministrados como ADN simple, para obtener una respuesta protectora contra una infección subletal de pulmones por C. pneumoniae. La inmunidad protectora se define como una depuración acelerada de infección pulmonar.

Grupos de ratones Balb/c de 7 a 9 semanas de edad (de 8 a 10 por grupo) fueron inmunizados intramuscularmente (i.m.) e intranasalmente (i.n.) con ADN plasmfdico que contenía la secuencia codificadora de un ATP/ADP translocasa de C. pneumoniae como se describió en los ejemplos 1 y 2. A grupos de animales de control se les dio solución salina o el vector plasmídico carente de un gen insertado de Chlamydia. Para la inmunización i.m., se inyectó alternadamente en los cuadríceps izquierdos y derechos, 100ug de ADN en 50µ? de PBS en tres ocasiones, en las semanas 0, 3 y 6. Para la inmunización i.n., los ratones anestesiados aspiraron 50 µ? de PBS que contenía 50 µg de ADN en tres ocasiones en las semanas 0, 3 y 6. En la semana 8, los ratones inmunizados fueron inoculados i.n. con 5 x 105 IFU de C. pneumoniae, cepa AR39 en 100 µ? de regulador de pH de SPG para probar su capacidad de limitar el crecimiento de una exposición subletal a C. pneumoniae. Los pulmones de los ratones se sacaron el día 5 y 9 después de la exposición y se homogeneizaron inmediatamente en regulador de pH de SPG (sacarosa 7.5%, glutamato 5 mM, fosfato 12.5 mM, pH 7.5). El homogeneizado se guardó congelado a -70°C hasta el momento de prueba. Se probaron diluciones del homogeneizado para detectar la presencia de Chlamydia infecciosa por inoculación en monocapas de células susceptibles. El inóculo se centrifugó en las células por una hora a 3000 rpm; después, las células se incubaron por tres días a 35°C en presencia de 1 µg ml de cicloheximida. Después de la incubación, las monocapas se fijaron con formalina y metanol, y luego se marcaron con inmunoperoxidasa para detectar la presencia de inclusiones de Chlamydia, usando suero convaleciente de conejos infectados con C. pneumoniae y DAB incrementado con metal, como un substrato de peroxidasa. La figura 4 y el cuadro 1 muestran que los ratones inmunizados i.n. e i.m. con pCAI764 tenían títulos de pulmón de Chlamydia inferiores a 2700 en 4 de 4 casos en el día 5 e inferiores a 3100 en 4 de 4 casos en el día 9, mientras que la escala de valores para el grupo control de ratones inmunizado en forma de placebo con solución salina fue de 6600-19000 IFU/puimón (media 12120) en el día 5 y 2000-19300 IFU/pulmón (media 9500) en el día 9. La inmunización de ADN por sí misma, no fue responsable del efecto de protección observado, ya que otra construcción de ADN plasmídico, pCAI426, no protegió, con títulos de pulmón en ratones inmunizados similares a los obtenidos para ratones control inmunizados con solución salina. La construcción de pCAI426 es idéntica a pCAI764, a excepción de que la secuencia de nudeótidos que codifica la ATP/ADP translocasa se reemplaza con la secuencia de nudeótidos de C. pneumoniae que codifica para una proteína de unión a ATP para transportar aminoácidos.

CUADRO 1 RATON CARGA BACTERIANA (UNIDADES FORMADORAS DE INCLUSION POR PULMON) EN LOS PULMONES DE RATONES BALB/C INMUNIZADOS CON DIFERENTES CONSTRUCCIONES DE INMUNIZACION CON ADN CONSTRUCCION DE INMUNIZACION Solución Salina Solución Salina PCAI426 PCAI426 PCAI764 PCAI764 Día 5 Día 9 Día 5 Día 9 Día 5 Día 9 1 13700 13400 10900 15000 1200 3000 2 19000 19300 9400 . 900 2300 2700 3 13300 10400 2900 9600 1200 2200 4 6600 2000 3500 4400 2600 200 8000 2400 MEDIA 12120 9500 6675 7475 1825 2025 DS 4966.59 7394.59 4066.428 6159.75 732.01 1260.62 LISTADO DE SECUENCIAS <110> Aventis Pasteur Limited <120> Antxgenos de Chlamydia y fragmentos de ADN correspondientes y usos de los mismos <130> 77813-6 <140> PCT/CA99/01224 <141> 1999-12-22 <150> US 60/114,060 <151> 1998-12-28 <150> US 60/123,967 <151> 1999-03-12 <150> US 60/141,271 <151> 1999-06-30 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1637 <212> ADN <213> Chlamydia pneu oniae <220> <221> CDS <222> (51) .. (1595) <400> 1 gaaataaaaa actatcagaa tagaaaataa aagtatttca gagggtaaat atg acá 56 Met Thr 1 aaa acc gaa gaa aaa cct ttt gga aaa ttg cgc tct ttc ttg tgg ccg 104 Lys Thr Glu Glu Lys Pro Phe Gly Lys Leu Arg Ser Phe Leu Trp Pro 5 10 15 ata cat act cae gag cta aag aaa gtt ctg cea atg ttc cta atg ttc 152 lie His Thr His Glu Leu Lys Lys Val Leu Pro Met Phe Leu Met Phe 20 25 30 ttc tgt att acá ttt aac tat acg gtg tta cgc gat ac aaa gac act 200 Phe Cys lie Thr Phe Asn Tyr Thr Val Leu Arg Asp Thr Lys Asp Thr 35 40 45 50 ctt att gtg gga gct cct ggt tct ggt gca gag gca ata cct ttc ate 248 Leu lie Val Gly Ala Pro Gly Ser Gly Ala Glu Ala He Pro Phe lie 55 60 65 aag ttt tgg ctt gtt gtc ccc tgt gct att ate ttt atg ctt att tat 296 Lys Phe Trp Leu Val Val Pro Cys Ala lie lie Phe Met Leu lie Tyr 70 75 80 gca aag cta agt aat att tta agt aag cag g c tta ttt tat gca gtg 344 Ala Lys Leu Ser Asn lie Leu Ser Lys Gln Ala Leu Phe Tyr Ala Val 85 90 95 gga acg ccc ttt tta att ttc ttt gcc ctg ttc ceg act gta att tat 392 Gly Thr Pro Phe Leu lie Phe Phe Ala Leu Phe Pro Thr Val lie Tyr 100 105 110 ceg cta cgc gat gtt tta cat ect acá gaa ttt gct gac cgt tta cag 440 Pro Leu Arg Asp Val Leu His Pro Thr Glu Phe Ala Asp Arg Leu Gln 115 120 125 130 gcc ate cta ect cea gga ttg cta gga etc gtt gcc ate tta aga aac 488 Ala lie Leu Pro Pro Gly Leu Leu Gly Leu Val Ala lie Leu Arg Asn 135 140 145 tgg acá ttt gct gca ttt tat gta ctt gct gaa cta tgg gga age gtc 536 Trp Thr Phe Ala Ala Phe Tyr Val Leu Ala Glu Leu Trp Gly Ser Val 150 155 160 atg cta tet cta atg ttc tgg gga ttt gct aat gaa att acá aaa ate 584 Met Leu Ser Leu Met Phe Trp Gly Phe Ala Asn Glu lie Thr Lys lie 165 170 175 cae gaa gca aag cgt ttc tac gct ctt ttc ggt ate gga gct aat att 632 His Glu Ala Lys Arg Phe Tyr Ala Leu Phe Gly lie Gly Ala Asn lie 180 185 190 tet tta cta gct tet ggt cgt gca att gtt tgg gct tea aag ttg aga 680 Ser Leu Leu Ala Ser Gly Arg Ala lie Val Trp Ala Ser Lys Leu Arg 195 200 205 210 gct tec gtt tet gaa ggt gta gat ect tgg gga att tet tta cgt ctt 728 Ala Ser Val Ser Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly lie Ser Leu Arg Leu 215 220 225 ttg atg gct atg act att gta tet gga ctt gtt ctt atg gcc agt tac 776 Leu Met Ala Met Thr lie Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Ser Tyr 230 235 240 tgg tgg ate aat aag aac gta ttg acc gat ect cgc ttc tat aat cea 824 Trp Trp lie Asn Lys Asn Val Leu Thr Asp Pro Arg Phe Tyr Asn Pro 245 250 255 gaa gaa atg caá aag ggg aaa aaa ggt gct aaa ect aaa atg aat atg 872 Glu Glu Met Gln Lys Gly Lys Lys Gly Ala Lys Pro Lys Met Asn Met 260 265 270 aaa gat age ttc etc tat ctt gat aga tet ect tat att ctt tta tta 920 Lys Asp Ser Phe Leu Tyr Leu Asp Arg Ser Pro Tyr lie Leu Leu Leu 275 2B0 285 290 act ctc ttg gtt att gcc tat ggt att tgc att aac tta atc gaa gtg 968 Thr Leu Leu Val lie Ala Tyr Gly lie Cys lie Asn Leu lie Glu Val 295 300 305 act tgg aaa agt cag ctg aaa ctg caá tat cct aat atg aat gac tat 1016 Thr Trp Lys Ser Gln Leu Lye Leu Gln Ty Pro Asn Met Asn Asp Tyr 310 315 320 agt gag ttc atg ggg aac ttc tcc ttc tgg act ggc gta gta tcc gta 1064 Ser Glu Phe Met Gly Asn Phe Ser Phe Trp Thr Gly Val Val Ser Val 325 330 335 ctt ate atg cta ttt gtt ggt ggt aac gtc att cgt aaa ttt gga tgg 1112 Leu lie Met Leu Phe Val Gly Gly Asn Val lie Arg Lys Phe Gly Trp 340 345 350 tta act gga gcc cta gtc act cct gtc atg gtt ctc cta acá ggt atc 1160 Leu Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Val Met Val Leu Leu Thr Gly lie 355 360 365 370 gtt ttc ttc gct ctt gtt atc ttt aga aac caá gct tet ggg ctg gtc 1208 Val Phe Phe Ala Leu Val lie Phe Arg Asn Gln Ala Ser Gly Leu Val 375 380 385 gct atg ttc ggt acá act cct ctc atg cta gct gtg gtt gtc gga gct 1256 Ala Met Phe Gly Thr Thr Pro Leu Met Leu Ala Val Val Val Gly Ala 390 395 400 ata cag aat att ctt teg aaa tcc acá aaa tac gct ctc ttf gac tea 1304 lie Gln Asn lie Leu Ser Lys Ser Thr Lys Tyr Ala Leu Phe Asp Ser 405 410 415 act aaa gaa atg gcc tat atc cct ctt gac caá gag caá aaa gtc aaa 1352 Thr Lys Glu Met Ala Tyr lie Pro Leu Asp Gln Glu Gln Lys Val Lys 420 425 430 ggggtt aaaagg ggcctt ggcctt aatttt ggaatt ggttaa ggtttt ggcccc ggcccc ccggcc ttttcc ggggaa aaaaaa tteeaa ggggaa 1400 Gly Lys Ala Ala lie Asp Val Val Ala Ala Arg Phe Gly Lys Ser Gly 435 440 445 450 gga gct tta atc caá ca ggt ttg ctc gtt atc tgt gga agt att gga 1448 Gly Ala Leu lie Gln Gln Gly Leu Leu Val lie Cys Gly Ser lie Gly 455 460 465 gct atg acc cct tat ctt gca gtg att ctt ctt ttc atc att gct att 1496 Ala Met Thr Pro Tyr Leu Ala Val lie Leu Leu Phe lie lie Ala lie 470 475 480 tgg ttg gtt tet gca act aag tta aac aaa cta ttc tta gcg cag tet 1544 Trp Leu Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Lys Leu Phe Leu Ala Gln Ser 485 490 495 gct ctt aaa gaa caá gaa gtg gct caá gaa gat tea gct cct gct tet 1592 Ala Leu Lys Glu Gln Glu Val Ala Gln Glu Asp Ser Ala Pro Ala Ser 500 505 510 tea tagagttgct tctcttactc ttgttgatcc ctacctgctt tt 1637 Ser 515 <210> 2 <211> 515 <212> PRT <213> Chlamydia pneumoniae <400> 2 Met Thr Lys Thr Glu Glu Lys Pro Phe Gly Lys Leu Arg Ser Phe Leu 1 5 10 15 Trp Pro lie His Thr His Glu Leu Lys Lys .Val Leu Pro Met Phe Leu 20 25 30 Met Phe Phe Cys lie Thr Phe Asn Tyr Thr Val Leu Arg Asp Thr Lys 35 40 45 Asp Thr Leu lie Val Gly Ala Pro Gly Ser Gly Ala Glu Ala lie Pro 50 55 60 Phe lie Lys Phe Trp Leu Val Val Pro Cys Ala l e lie Phe Met Leu 65 70 75 80 lie Tyr Ala Lye Leu Ser Aen lie Leu Ser Lys Gln Ala Leu Phe Tyr B5 90 95 Ala Val Gly Thr Pro Phe Leu lie Phe Phe Ala Leu Phe Pro Thr Val 100 105 110 lie Tyr Pro Leu Arg Asp Val Leu His Pro Thr Glu Phe Ala Asp Arg 115 120 125 Leu Gln Ala lie Leu Pro Pro Gly Leu Leu Gly Leu Val Ala lie Leu 130 135 140 Arg Asn Trp Thr Phe Ala Ala Phe Tyr Val Leu Ala Glu Leu Trp Gly 145 150 155 160 Ser Val Met Leu Ser Leu Met Phe Trp Gly Phe Ala Asn Glu lie Thr 165 170 175 Lys lie His Glu Ala Lys Arg Phe Tyr Ala Leu Phe Gly lie Gly Ala 180 185 190 Asn lie Ser Leu Leu Ala Ser Gly Arg Ala lie Val Trp Ala Ser Lys 195 200 205 Leu Arg Ala Ser Val Ser Glu Gly Val Asp Pro Trp Gly lie Ser Leu 210 215 220 Arg Leu Leu Met Ala Met Thr lie Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala 225 230 235 240 Ser Tyr Trp Trp lie Asn Lys Asn Val Leu Thr Asp Pro Arg Phe Tyr 245 250 255 Asn Pro Glu Glu Met Gln Lys Gly Lys Lys Gly Ala Lys Pro Lys Met 260 265 270 Asn Met Lys Asp Ser Phe Leu Tyr Leu Asp Arg Ser Pro Tyr lie Leu 275 2B0 285 Leu Leu Thr Leu Leu Val lie Ala Tyr Gly lie Cys lie Asn Leu lie 290 295 300 Glu Val Thr Trp Lys Ser Gln Leu Lys Leu Gln Tyr Pro Asn Met Asn 305 310 315 320 Asp Tyr Ser Glu Phe Met Gly Asn Phe Ser Phe Trp Thr Gly Val Val 325 330 335 Ser Val Leu lie Met Leu Phe Val Gly Gly Asn Val lie Arg Lys Phe 340 345 350 Gly Trp Leu Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Val Met Val Leu Leu Thr 355 360 365 Gly lie Val Phe Phe Ala Leu Val lie Phe Arg Asn Gln- Ala Ser Gly 370 375 380 Leu Val Ala Met Phe Gly Thr Thr Pro Leu Met Leu Ala Val Val Val 385 390 395 400 Gly Ala lie Gln Asn lie Leu Ser Lys Ser Thr Lys Tyr Ala Leu Phe 405 410 415 Asp Ser Thr Lys Glu Met Ala Tyr lie Pro Leu Asp Gln Glu Gln Lys 420 425 430 Val Lys Gly Lys Ala Ala lie Asp Val Val Ala Ala Arg Phe Gly Lys 435 440 445 Ser Gly Gly Ala Leu lie Gln Gln Gly Leu Leu Val lie Cys Gly Ser 450 455 460 lie Gly Ala Met Thr Pro Tyr Leu Ala Val lie Leu Leu Phe lie lie 465 470 475 480 Ala lie Trp Leu Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Lys Leu Phe Leu Ala 485 490 495 Gln Ser Ala Leu Lys Glu Gln Glu Val Ala Gln Glu Asp Ser Ala Pro 500 505 510 Ala Ser Ser 515 <210> 3 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223» iniciador de PCR 5' <400> 3 ataagaatgc ggccgccacc atgacaaaaa ccgaagaaaa acc 43 <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> iniciador de PCR 3' <400> 4 gcgccggatc cctgaagaag caggagctg 29

Claims (44)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION
2. REIVINDICACIONES s 1.- Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 20 aminoácidos consecutivos de un polipéptido de (a); y (c) un polipéptido de (a) o (b) que se ha modificado o sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido modificado es por lo menos 80% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (a) o (b). 2. - Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de cualquiera de: s (a) SEQ ID No: 1 ; (b) una secuencia que codifica un polipéptido codificado por SEQ ID No: 1 ; (c) una secuencia que comprende por lo menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de (a) y (b); y (d) una secuencia que codifica un polipéptido que es por lo menos 80% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido codificado 0 por SEQ ID No: 1.
3. 3. - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es de antisentido a la molécula de ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 1 6 2.
4. 4. - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, caracterizada porque dicha proteína de fusión comprende un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico como la que se reclama en la reivindicación 1, y un segundo polipéptido.
5. 5. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el segundo polipéptido es un péptido de señal heterólogo.
6. 6. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el segundo polipéptido tiene actividad de adyuvante.
7. 7. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque está ligada operativamente a una o más secuencias de control de expresión.
8. 8.- Una vacuna caracterizada porque comprende un vector de vacuna y por lo menos un primer ácido nucleico seleccionado de cualquiera de: (i) SEQ ID No: 1 ; (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido codificado por SEQ ID No: 1; (iii) una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 38 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de (i) y (ii); (iv) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido codificado por SEQ ID No: 1 ; (v) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia se describe en SEQ ID No: 2; (vi) una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 12 aminoácidos consecutivos de SEQ ID No: 2; y (vii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se define en (i) a (v), o un fragmento inmunogénico como ei que se define en (vi), que se ha modificado sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido o fragmento modificado es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (i) a (v) o al fragmento correspondiente de (vi); en donde cada primer ácido nucleico es capaz de expresarse, y en donde la vacuna comprende opcionalmente un segundo ácido nucleico que codifica, y es capaz de expresar, un polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al polipéptido expresado por el primer ácido nucleico.
9. 9.- Una vacuna caracterizada porque comprende un vector de vacuna y por lo menos un primer ácido nucleico que codifica una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende: (a) un primer polipéptido seleccionado de cualquiera de: (i) un polipéptido codificado por SEQ ID No: 1 ; (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 38 nucleótidos consecutivos de SEQ ID No: 1 ; (iii) un polipéptido que es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido codificado por SEQ ID No: 1 ; (iv) un polipéptido cuya secuencia se establece en SEQ ID No: 2; (v) un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 12 aminoácidos consecutivos de SEQ ID No: 2; y (vi) un polipéptido como el que se define en (i) a (iv) o un fragmento inmunogénico como el que se define en (v), que se ha modificado sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido o fragmento modificado es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (i) a (iv) o el fragmento correspondiente de (v); y (b) un segundo polipéptido; en donde cada primer ácido nucleico es capaz de expresarse, y en donde la vacuna comprende opcionalmente un segundo ácido nucleico que codifica, y es capaz de expresar, un polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al primer polipéptido.
10. 10. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el segundo polipéptido es un péptido de señal heterólogo.
11. 11. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el segundo polipéptido tiene actividad de adyuvante.
12. 12. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 , caracterizada además porque cada primer ácido nucleico está ligado operativamente a una o más secuencias de control de expresión.
13. 13. - Una vacuna caracterizada porque comprende por lo menos un primer ácido nucleico como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 7, y un vector de vacuna, en donde cada primer ácido nucleico se expresa como un polipéptido, comprendiendo la vacuna opcionalmente un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al polipéptido expresado por dicho primer ácido nucleico.
14. 14. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizada además porque el segundo ácido s nucleico codifica un polipéptido adicional de Chlamydia.
15. 15. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un ácido nucleico como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. 16. - Una composición farmacéutica caracterizada porque o comprende una vacuna como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. 17. - Un hospedero unicelular transformado con la molécula de ácido nucleico que se reclama en la reivindicación 7.
18. 18. - Una sonda de ácido nucleico de 5 a 100 nucleótidos que son s al menos 75% similares a la molécula de ácido nucleico de SEQ ID No: 1, o una secuencia homóloga o complementaría o de antisentido de dichas moléculas de ácido nucleico.
19. 19. - Un iniciador de 10 a 40 nucleótidos que son al menos 75% similares a la molécula de ácido nucleico de SEQ ID No: 1 , o una secuencia 0 homóloga o complementaría o de antisentido de dichas moléculas de ácido nucleico.
20. 20. - Un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2 y 4 a 7.
21. 21. - Un polipéptido caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de: (a) SEQ ID No: 2; (b) un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 20 aminoácidos contiguos de un polipéptido de (a); y (c) un polipéptido de (a) o (b), que se ha modificado sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido modificado es por lo menos 80% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (a) o (b).
22. 22. - Una proteína de fusión caracterizada porque comprende un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 20 ó 21 , y un segundo polipéptido.
23. 23. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el segundo polipéptido es un péptido de señal heterólogo.
24. 24. - La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el segundo polipéptido tiene actividad de adyuvante.
25. 25. - Un método para producir un polipéptido como el que se reclama en la reivindicación 20 ó 21 , o una proteína de fusión como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado porque comprende el paso de cultivar un hospedero unicelular como el que se reclama en la reivindicación 17.
26. 26. - Un anticuerpo contra el polipéptido que se reclama en la reivindicación 20 ó 21, o contra una protefna de fusión como la que se s reclama en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24.
27. 27. - Una vacuna que comprende por lo menos un primer polipéptido seleccionado de cualquiera de: (i) un polipéptido codificado por SEQ ID No: 1; (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 38 nucleótidos consecutivos de o cualquiera de SEQ ID No: 1 ; (iii) un polipéptido que es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido codificado por SEQ ID No: 1; (iv) un polipéptido cuya secuencia se describe en SEQ ID No: 2; (v) un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 12 aminoácidos consecutivos de cualquiera de SEQ ID No: 2; y (vi) un polipéptido como se 5 define en (i) a (iv), o un fragmento inmunogénico como se define en (v), que se ha modificado sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido o fragmento modificado es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (i) a (iv) o el fragmento correspondiente de (v); en donde la vacuna comprende opcionalmente un 0 polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al primer polipéptido.
28. 28. - Una vacuna que comprende por lo menos una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende: (a) un primer polipéptido seleccionado de cualquiera de: (i) un polipéptido codificado por SEQ ID No: 1 ; (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos 38 nucleótidos consecutivos de SEQ ID No: 1; (iii) un polipéptido que es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido codificado por SEQ ID No: 1; (iv) un polipéptido cuya secuencia se describe en SEQ ID No: 2; (v) un fragmento inmunogénico que comprende por lo menos 12 aminoácidos consecutivos de SEQ ID No: 2; y (vi) un polipéptido como el que se define en (i) a (iv) o un fragmento inmunogénico como el que se define en (v), que se ha modificado sin pérdida de inmunogenicidad, en donde dicho polipéptido o fragmento modificado es por lo menos 75% idéntico en secuencia de aminoácidos al polipéptido correspondiente de (i) a (iv) o el fragmento correspondiente de (v); y (b) un segundo polipéptido; en donde la vacuna comprende opcionalmente un polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al primer polipéptido.
29. 29. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el segundo polipéptido es un péptido de señal heterólogo.
30. 30. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el segundo polipéptido tiene actividad de adyuvante.
31. 31. - Una vacuna caracterizada porque comprende por lo menos un primer polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que comprende opdonalmente un polipéptido adicional que incrementa la respuesta inmune al primer polipéptido.
32. 32. - La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizada además porque el polipéptido adicional comprende un polipéptido de Chfamydia.
33. 33. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un polipéptido como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
34. 34. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una vacuna como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
35. 35. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo como ei que se reclama en la reivindicación 26, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
36. 36. - El uso de (a) el ácido nucleico que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, (b) el polipéptido que se reclama en la reivindicación 20 ó 21, o una proteína de fusión como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24; o (c) el anticuerpo que se reclama en la reivindicación 26; para preparar un medicamento para prevenir o tratar infección por Chlamydia en un mamífero.
37. 37. - Un método para detectar infección por Chlamydia caracterizado porque comprende el paso de poner a prueba un fluido corporal de un mamífero que va a someterse a prueba, con un componente seleccionado de cualquiera de: (a) el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; (b) el polipéptido de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, o una protefna de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24; y (c) el anticuerpo de la reivindicación 26. s
38. 38.- Un equipo de diagnóstico que comprende instrucciones para utilizarse y un componente seleccionado de cualquiera de: (a) el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; (b) el polipéptido como el que se reclama en las reivindicaciones 20 ó 21 , o una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24; y (c) el anticuerpo de la o reivindicación 26.
39. 39. - El uso de un vector y el ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para fabricar una vacuna para evitar infección por Chlamydia en un mamífero.
40. 40. - Plásmido pCAI764 de expresión como se muestra en la 5 figura 3.
41. 41. - Una molécula de ácido nucleico de SEQ ID No. 3 ó 4.
42. 42. - Una ATP/ADP translocasa aislada de especies de Chlamydia diferentes a Chlamydia trachomatis.
43. 43. - Una ATP/ADP translocasa aislada de Chlamydia 0 pneumoniae.
44. 44. - El uso de un polipéptido como el que se reclama en las reivindicaciones 20 ó 21 , o la proteína de fusión como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, para fabricar una vacuna para evitar infección por Chlamydia en un mamífero.