DE69938059T2

DE69938059T2 - Chlamydia antigene, entsprechende dna-fragmente und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69938059T2
Application number: DE69938059T
Authority: DE
Inventors: Andrew D. Richmond Hill Murdin; Raymond P. Schomberg OOMEN; Joe Toronto WANG; Pamela Woodbridge DUNN
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: AU774902B2; DE69938059D1; ATE384738T1; MXPA01006663A; EP1140998B1; WO2000039157A1; NZ512448A; JP2002541766A; US20020081682A1; CA2356057A1; AU1765200A; EP1140998A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Chlamydia-98kDa-Antigen des Proteins der äußeren Membran und entsprechende DNA-Moleküle, die zum Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion in Säugern, wie Menschen, verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chlamydien sind Prokaryoten. Sie zeigen morphologische und strukturelle Ähnlichkeiten zu gramnegativen Bakterien, einschließlich einer trilaminären, äußeren Membran, die Lipopolysaccharid und mehrere Membranproteine enthält, die strukturell und funktionell analog zu Proteinen sind, die sich in E. coli finden. Sie sind obligate intrazelluläre Parasiten mit einem einzigartigen biphasischen Lebenszyklus, der aus einem metabolisch inaktiven aber infektiösen extrazellulären Stadium und einem replizierenden aber nicht infektiösen intrazellulären Stadium besteht. Das replikative Stadium des Lebenszyklus findet innerhalb eines membrangebundenen Einschlusses statt, der die Bakterien von dem Cytoplasma der infizierten Wirtszelle absondert.
C. pneumoniae ist ein weit verbreitetes menschliches Pathogen, das ursprünglich als der TWAR-Stamm von Chlamydia psittaci beschrieben wurde, von dem aber anschließend erkannt wurde, dass es eine neue Spezies ist. C. pneumoniae ist von anderen Chlamydia-Spezies (C. trachomatis, C. pecorum und C. psittaci) antigen, genetisch und morphologisch verschieden. Es zeigt eine 10%ige DNA-Sequenzhomologie oder weniger mit entweder C. trachomatis oder C. psittaci.
C. pneumoniae ist eine häufige Ursache von ambulant erworbenen Pneumonien ("community acquired pneumonia"), lediglich weniger häufig als Streptococcus pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168: 1231; Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477). Es kann auch Symptome und Erkrankungen der oberen Atemwege verursachen, einschließlich Bronchitis und Sinusitis (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168: 1231; Grayston et al. (1990) Journal of Infectious Diseases 161: 618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases. 18: 501; Wang et al. (1986) Chlamydial infections Cambridge University Press, Cambridge. S. 329). Die große Mehrzahl der erwachsenen Bevölkerung (über 60%) weist Antikörper gegen C. pneumoniae auf (Wang et al. (1986) Chlamydial infections. Cambridge University Press, Cambridge. S. 329), was eine vergangene Infektion anzeigt, die nicht erkannt wurde oder asymptomatisch war.
Eine Infektion mit C. pneumoniae stellt sich gewöhnlich als eine akute respiratorische Erkrankung dar (d. h. Husten, Halsschmerzen, Heiserkeit und Fieber, abnormale Brustgeräusche beim Abhören). Bei den meisten Patienten bleibt der Husten 2 bis 6 Wochen bestehen und eine Erholung ist langsam. Bei ungefähr 10% dieser Fälle folgt auf die Infektion der oberen Atemwege Bronchitis oder Pneumonie. Ferner wurde beschrieben, dass während einer Epidemie mit C. pneumoniae eine an schließende Co-Infektion mit Pneumococcus bei etwa der Hälfte dieser Pneumonie-Patienten auftrat, insbesondere bei den Schwachen und Älteren. Wie vorstehend beschrieben, gibt es immer mehr Hinweise, dass eine Infektion mit C. pneumoniae auch mit Erkrankungen verbunden ist, die von respiratorischen Infektionen verschieden sind.
Das Reservoir für den Organismus sind wahrscheinlich die Menschen. Im Gegensatz zu Infektionen mit C. psittaci gibt es kein bekanntes Vogel- oder Tierreservoir. Eine Übertragung wurde nicht eindeutig definiert. Sie kann von einem direkten Kontakt mit Sekreten, von Infektionsträgern oder von einer Luftausbreitung herrühren. Es gibt eine lange Inkubationszeitspanne, die viele Monate andauern kann. Basierend auf der Analyse von Epidemien scheint C. pneumoniae sich langsam über eine Population auszubreiten (ein Mittel des Intervalls von Fall zu Fall beträgt 30 Tage), da infizierte Personen ineffektive Überträger des Organismus sind. Die Anfälligkeit für C. pneumoniae ist universal. Erneute Infektionen treten während des Erwachsenseins auf, nach der primären Infektion als Kind. C. pneumoniae scheint eine endemische Erkrankung weltweit zu sein, die für überlagernde Intervalle erhöhter Inzidenz (Epidemien) bekannt ist, die zwei bis drei Jahre andauern. Eine Infektion mit C. trachomatis verleiht keine Überkreuzimmunität gegenüber C. pneumoniae. Infektionen werden leicht mit oralen Antibiotika, Tetracyclin oder Erythromy cin (2 g/d für mindestens 10 bis 14 Tage) behandelt. Ein kürzlich entwickeltes Arzneimittel, Azithromycin, ist als eine Einzeldosistherapie gegen Chlamydien-Infektionen hochgradig wirksam.
In den meisten Fällen ist eine Infektion mit C. pneumoniae mild und ohne Komplikationen und bis zu 90% der Infektionen sind subakut oder werden nicht erkannt. Es wurde angenommen, dass unter Kindern in industrialisierten Ländern Infektionen bis zu dem Alter von fünf Jahren selten sind, obwohl eine kürzliche Untersuchung (E. Norman et al., Chlamydia pneumoniae in children with acute respiratory tract infections, Acta Paediatrica, 1998, Band 87, Ausgabe 1, S. 23–27) berichtet hat, dass viele Kinder in dieser Altersgruppe einen PCR-Beleg einer Infektion zeigen, obwohl sie seronegativ sind, und veranschlagt eine Prävalenz von 17–19% bei den 2- bis 4-Jährigen. In Entwicklungsländern ist die Seroprävalenz von Antikörpern gegen C. pneumoniae unter jungen Kinder erhöht und es gibt den Verdacht, dass C. pneumoniae eine wichtige Ursache für eine akute Erkrankung der unteren Atemwege und Mortalität für Kleinkinder und Kinder in tropischen Regionen der Welt sein kann.
Aus Seroprävalenzstudien und Studien von lokalen Epidemien tritt die initiale Infektion mit C. pneumoniae gewöhnlich im Alter von 5 bis 20 Jahren auf. Es wird abgeschätzt, dass z. B. in den USA 30000 Fälle von Pneumonie in Kindesalter jedes Jahr durch C. pneumoniae verursacht werden. Infektionen können sich unter Gruppen von Kindern oder jungen Erwachsenen anhäufen (z. B. Schüler oder Wehrpflichtige).
C. pneumoniae verursacht 10 bis 25% der ambulant erworbenen Infektionen der unteren Atemwege (wie aus Schweden, Italien, Finnland und den USA berichtet). Während einer Epidemie kann eine Infektion mit C. pneumonia 50 bis 60% der Fälle von Pneumonie ausmachen. Während dieser Zeitspannen wurden auch mehrere Episoden von gemischten Infektionen mit S. pneumoniae berichtet.
Eine erneute Infektion während des Erwachsenseins ist häufig. Die klinische Präsentation scheint milder zu sein. Basierend auf Populationsseroprävalenzstudien scheint es eine erhöhte Exposition mit dem Alter zu geben, was unter Männern besonders offensichtlich ist. Einige Forscher haben spekuliert, dass ein persistentes, asymptomatisches Stadium einer Infektion mit C. pneumoniae häufig ist.
Bei Erwachsenen mittleren Alters oder älter kann eine Infektion mit C. pneumoniae zu chronischer Bronchitis und Sinusitis fortschreiten. Eine Studie in den USA deckte auf, dass die Inzidenz von Pneumonie, die durch C. pneumoniae verursacht wird, bei Personen, die jünger als 60 Jahre sind, ein Fall pro tausend Personen pro Jahr beträgt. Jedoch stieg bei den Älteren die Erkrankungsinzidenz dreifach an. Die Infektion mit C. pneumoniae führt kaum zu einem Krankenhausaufenthalt mit der Ausnahme von Patienten mit einer Grunderkrankung.
Von beachtlicher Wichtigkeit ist die Verbindung von Atherosklerose und einer Infektion mit C. pneumoniae. Es gibt mehrere epidemiologische Untersuchungen, die eine Korrelation von vorhergehenden Infektionen mit C. pneumoniae und Herzinfarkten, Erkrankungen der koronaren Arterie und Carotis zeigen (Saikku et al. (1988) Lancet; ii: 983; Thom et al. (1992) JAMA 268: 68; Linnanmaki et al. (1993), Circulation 87: 1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116: 273; Melnick et al. (1993) American Journal of Medicine 95: 499). Außerdem wurden die Organismen in Atheromen und Fettschichten der Koronar-, Halsschlag- und peripheren Arterien und Aorta nachgewiesen (Shor et al. (1992) South African. Medical Journal 82: 158; Kuo et al. (1993) Journal of Infectious Diseases 167: 841; Kuo et al. (1993) Arteriosclerosis and Thrombosis 13: 1500; Campbell et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 172: 585; Chiu et al. Circulation, 1997 (in Druck)). Lebende C. pneumoniae wurden aus der Herzkranzarterie und Carotis wieder gewonnen (Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medicine 125: 979; Jackson et al. Abst. K121, p272, 36. ICAAC, 15.–18. Sept. 1996, New Orleans). Ferner wurde gezeigt, dass C. pneumoniae Änderungen von Atherosklerose in einem Kaninchenmodell induzieren kann (Fong et al. (1997) Journal of Clinical Microbiology 35: 48). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass C. pneumoniae Atherosklerose in Menschen verursachen kann, obwohl es verbleibt, die epidemiologische Wichtigkeit einer Chlamydien-Atherosklerose zu zeigen.
Eine Reihe von kürzlichen Untersuchungen hat auch eine Verbindung zwischen einer Infektion mit C. pneumoniae und Asthma angegeben. Eine Infektion wurde mit Keuchen, asthmatischer Bronchitis, Altersasthma und akuter Verschlimmerung von Asthma bei Erwachsenen in Verbindung gebracht und Studien mit kleinem Umfang zeigten, dass eine andauernde antibiotische Behandlung wirksam war, die Schwere der Erkrankung in einigen Individuen stark zu vermindern (Hahn DL et al., Evidence for Chlamydia pneumoniae infection in steroid-dependent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45–49.; Hahn DL et al., Association of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomatic asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dez; 117(3): 513–517; Bjornsson E et al., Serology of Chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperresponsiveness. Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63–69.; Hahn DL. Treatment of Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a before-after trial. J Fam Pract. 1995 Okt; 41(4): 345–351.; Allegra L et al. Acute exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae infection. Eur Respir J. 1994 Dez; 7(12): 2165–2168.; Hahn DL et al. Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 225–230).
Im Lichte dieser Ergebnisse würde ein schützender Impfstoff gegen eine Infektion mit C. pneumoniae sehr wichtig sein. Es gibt bis jetzt keinen wirksamen Impfstoff für irgendeine menschliche Chlamydien-Infektion. Es ist vorstellbar, dass ein wirksamer Impfstoff unter Verwendung von physikalisch oder chemisch inaktivierten Chlamydien entwickelt werden kann. Jedoch weist ein solcher Impfstoff keinen großen Sicherheitsspielraum auf. Im Allgemeinen werden sicherere Impfstoffe durch genetisches Manipulieren des Organismus durch Attenuierung oder durch rekombinante Mittel hergestellt. Demzufolge war ein Haupthindernis beim Erzeugen eines wirksamen und sicheren Impfstoffs gegen eine menschliche Chlamydien-Infektion der Mangel an genetischer Information hinsichtlich Chlamydia, insbesondere C. pneumoniae.
Untersuchungen mit C. trachomatis und C. psittaci zeigen an, dass ein sicherer und wirksamer Impfstoff gegen Chlamydien ein erreichbares Ziel ist. Zum Beispiel werden Mäuse, die sich von einer Lungeninfektion mit C. trachomatis erholt haben, vor einer Unfruchtbarkeit geschützt, die durch eine anschließende vaginale Challenge induziert wird (Pal et al. (1996) Infektion and Immunity. 64: 5341). In ähnlicher Weise wurden Schafe, die mit inaktivierten C. psittaci immunisiert worden waren, vor anschließenden von Chlamydien induzierten Fehlgeburten und Totgeburten geschützt (Jones et al. (1995) Vaccine 13: 715). Ein Schutz vor Chlamydien-Infektionen wurde mit Th1-Immunantworten, insbesondere der Induktion von INFg-produzierenden CD4+T-Zellen assoziiert (Igietsemes et al. (1993) Immunology 5: 317). Der adoptive Transfer von CD4+-Zelllinien oder -klonen zu Nackt- oder SCID-Mäusen verlieh einen Schutz gegen eine Challenge oder geklärte chronische Erkrankung (Igietseme et al. (1993) Regional Immunology 5: 317; Magee et al. (1993) Regional Immunology 5: 305), und eine in vivo-Verarmung an CD4+-T-Zellen verschlimmerte eine Erkrankung nach einer Challenge (Landers et al. (1991) Infection & Immunity 59: 3774; Magee et al (1995) Infection & Immunity 63: 516). Jedoch kann die Anwesenheit von ausreichend hohen Titern an neutralisierendem Antikörper bei Schleimhautoberflächen auch eine schützende Wirkung zeigen (Cotter et al. (1995) Infection and Immunity 63: 4704).
Eine antigene Variation innerhalb der Spezies C. pneumoniae ist nicht gut dokumentiert aufgrund der unzureichenden genetischen Information, obwohl erwartet wird, dass eine Variation basierend auf C. trachomatis besteht. Serotypen von C. trachomatis werden auf der Grundlage einer antigenen Variation in dem Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) definiert, aber veröffentlichte MOMP-Gensequenzen von C. pneumoniae zeigen keine Variation zwischen mehreren unterschiedlichen Isolaten des Organismus (Campbell et al. (1990) Infection and Immunity 58: 93; McCafferty et al. (1995) Infection and Immunity 63: 2387–9; Knudsen et al. (1996) Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Wien). Das Gen, das für ein 76 kDa-Antigen kodiert, wurde aus einem einzigen Stamm von C. pneumoniae kloniert und die Sequenz wurde veröffentlicht (Perez Melgosa et al. Infect. Immun. 1994. 62: 880). Ein Operon, das für die 9 kDa- und 60 kDa-cysteinreichen äußeren Membranproteingene kodiert, wurde beschrieben (Watson et al., Nucleic Acids Res (1990) 18: 5299; Watson et al., Microbiology (1995) 141: 2489). Viele Antigene, die durch Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden, sind quer durch alle Chlamydien konserviert, aber das 98 kDa-, 76 kDa- und mehrere andere Proteine könnten spezifisch für C. pneumoniae sein (Perez Melgosa et al., Infect. Immun. 1994. 62: 880; Melgosa et al., FEMS Microbiol Lett (1993) 112: 199; Campbell et al., J Clin Microbiol (1990) 28: 1261; Iijima et al., J Clin Microbiol (1994) 32: 583). Eine Untersuchung der Anzahl und relativen Häufigkeit von jeglichen Serotypen von C. pneumoniae und der definierenden Antigene ist noch nicht möglich. Die vollständige Genomsequenz des C. pneumoniae-Stamms CWL-029 ist nun bekannt (http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/) und, wie weitere Sequenzen verfügbar werden, kann ein besseres Verständnis der antigenen Variation erhalten werden.
Viele Antigene, die von Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden, sind quer durch alle Chlamydien konserviert, aber die 98 kDa-, 76 kDa- und 54 kDa-Proteine scheinen spezifisch für C. pneumoniae zu sein (Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36: 1477; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases. 18: 501; Wiedmann-Al-Ahmad M et al. Reactions of polyclonal and neutralizing anti-p54 monoclonal antibodies with an isolated, species-specific 54- kilodalton Protein of Chlamydia pneumoniae. Clin Diagn Lab Immunol. 1997 Nov; 4(6): 700–704).
Ein Immunblotten von Isolaten mit Seren von Patienten zeigt eine Variation von Blotmustern zwischen Isolaten, was anzeigt, dass Serotypen von C. pneumoniae existieren können (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168: 1231; Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medicine 125: 979). Jedoch sind die Ergebnisse möglicherweise durch den Infektionsstatus der Patienten vermengt, da Immunblotprofile von Seren eines Patienten sich über die Zeit nach einer Infektion verändern. Eine Untersuchung der Anzahl und relativen Häufigkeit von jeglichen Serotypen und der definierenden Antigene ist noch nicht möglich.
Dementsprechend besteht ein Bedarf zum Identifizieren und Isolieren von Polynukleotidsequenzen von C. pneumoniae für eine Verwendung beim Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird ein Impfstoff bereitgestellt, der aufgereinigte und isolierte Polynukleotidmoleküle umfasst, die für die als ATP/ADP-Translokase (SEQ ID Nr: 1) bezeichneten Chlamydia-Polypeptide kodieren, die in Verfahren zum Verhindern, Behandeln und Diagnostizieren einer Chlamydia-Infektion verwendet werden können. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform sind die Polynukleotidmoleküle DNA, die für das Polypeptid von SEQ ID Nr: 2 kodieren.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt einen Impfstoff bereit, der Polypeptide umfasst, die zu den isolierten DNA-Molekülen korrespondieren. Die Aminosäuresequenz des entsprechenden kodierten Polypeptids ist als SEQ ID Nr: 2 gezeigt.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass die Erfindung, die die Polynukleotidsequenzen bereitgestellt hat, die für das Chlamydia-ATP/ADP-Translokase-Protein kodieren, auch Polynukleotide bereitstellt, die für Fragmente kodieren, die sich von einem solchen Polypeptid ableiten. Außerdem soll die Erfindung dahingehend verstanden werden, Mutanten und Derivate solcher Polypeptide und Fragmente, die sich davon ableiten, bereitzustellen, die von der Addition, Deletion oder Substitution von nicht essenziellen Aminosäuren herrühren, wie hierin beschrieben. Der Fachmann würde auch leicht verstehen, dass die Erfindung, die die Polynukleotidsequenzen bereitgestellt hat, die für Chlamydia-Polypeptide kodieren, ferner monospezifische Antikörper bereitstellt, die spezifisch an solche Polypeptide binden.
Die Erfindung weist eine breite Anwendbarkeit auf und beinhaltet Expressionskassetten, Vektoren und Zellen, die mit den erfindungsgemäßen Polynukleotiden transformiert oder transfiziert sind. Dementsprechend werden ferner erfindungsgemäß (i) ein Verfahren zum Erzeugen eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einem rekombinanten Wirtssystem und verwandten Expressionskassetten, Vektoren und transformierten oder transfizierten Zellen; (ii) ein Impfstoff oder ein Lebendimpfstoffvektor wie ein Pockenvirus-, Salmonella typhimurium- oder Vibrio cholerae-Vektor, der ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthält, wie Impfstoffe und Impfstoffvektoren, die z. B. zum Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion verwendbar sind, zusammen mit einem Verdünner oder Träger, und verwandte pharmazeutische Zusammensetzungen und assoziierte therapeutische und/oder prophylaktische Verfahren; (iii) eine therapeutische und/oder prophylaktische Verwendung eines erfindungsgemäßen RNA- oder DNA-Moleküls, entweder in einer nackten Form oder formuliert mit einem Zufuhrvehikel, eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder einer Kombination von erfindungsgemäßen Polypeptiden oder eines erfindungsgemäßen monospezifischen Antikörpers, und verwandte pharmazeutische Zusammensetzungen; (iv) ein Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einer biologischen Probe, das die Verwendung eines erfindungsgemäßen DNA- oder RNA-Moleküls, eines erfindungsgemäßen monospezifischen Antikörpers oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids beinhalten kann; und (v) ein Verfahren zum Aufreinigen eines erfindungsgemäßen Polypeptids durch auf Antikörper basierende Affinitätschromatographie bereitgestellt.
Erfindungsgemäß werden Nukleinsäure-Hybridmoleküle und Verschmelzungsproteine bereitgestellt, wie sie in den Ansprüchen 1 und 6 definiert sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Erfindung wird weiter durch die nachstehende Beschreibung in Bezugnahme auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen:
1 die Nukleotidsequenz des ATP/ADP-Translokase-Gens (SEQ ID Nr: 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz der ATP/ADP-Translokase aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID Nr: 2) zeigt.
2 die Restriktionsenzymanalyse des ATP/ADP-Translokase-Gens von C. pneumoniae zeigt.
3 die Konstruktion und Elemente des Plasmids pCAI764 zeigt.
4 einen Schutz gegen eine Infektion mit C. pneumoniae durch pCAI764 nach DNA-Immunisierung veranschaulicht.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein offener Leserahmen (ORF), der für das Chlamydien-ATP/ADP-Translokase-Protein kodiert, wurde aus dem Genom für C. pneumoniae identifiziert. Das Gen, das für dieses Protein kodiert, wurde in ein Expressionsplasmid inseriert und es wurde gezeigt, dass es einen Immunschutz gegen eine Chlamydien-Infektion verleiht. Dementsprechend kann dieses ATP/ADP-Translokase-Protein und verwandte Polypeptide zum Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion verwendet werden.
Isolierte Polynukleotide werden bereitgestellt, die für Chlamydia-Polypeptide kodieren, deren Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr: 2 gezeigt sind.
Der Begriff "isoliertes Polynukleotid" wird als ein Polynukleotid definiert, das aus der Umgebung entfernt wurde, in der es natürlicherweise auftritt. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes DNA-Molekül, das in dem Genom eines lebenden Bakteriums oder als Teil einer Genbank vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Molekül, das von dem übrigen Teil des Bakteriengenoms abgetrennt ist, als ein Ergebnis z. B. eines Klonierungsvorgangs (Amplifikation), ist isoliert. Typischerweise ist ein isoliertes DNA-Molekül frei von DNA-Bereichen (z. B. kodierenden Bereichen), mit denen es direkt bei dem 5'- oder 3'-Ende in dem natürlich vorkommenden Genom benachbart ist. Solche isolierten Polynukleotide können Teil eines Vektors oder einer Zusammensetzung sein und können immer noch als isoliert in der Weise definiert sein, dass ein solcher Vektor oder eine solche Zusammensetzung kein Teil der natürlichen Umgebung eines solchen Polynukleotids ist.
In der Anmeldung ist ein Polynukleotid entweder RNA oder DNA (cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA) oder Modifikationen, Varianten, Homologe oder Fragmente davon. Die DNA ist entweder doppelsträngig oder einzelsträngig und, falls einzelsträngig, ist entweder der kodierende Strang oder der nicht kodierende (Antisense)-Strang. Eine jegliche der Sequenzen, die für das ATP/ADP-Translokase-Protein und verwandte Polypeptide kodieren, wie in SEQ ID Nr: 1 gezeigt, ist (a) eine kodierende Sequenz, (b) eine Ribonukleotidsequenz, die sich von einer Transkription von (a) ableitet, oder (c) eine kodierende Sequenz, die die Redundanz oder Degeneriertheit des genetischen Codes verwendet, um für die gleichen Polypeptide zu kodieren. Unter "Polypeptid" oder "Protein" wird eine jegliche Kette von Aminosäuren verstanden, ungeachtet der Länge oder posttranslationalen Modifikation (z. B. Glykosylierung oder Phosphorylierung). Beide Begriffe werden austauschbar in der vorliegenden Anmeldung verwendet.
Aminosäuresequenzen werden bereitgestellt, die homolog zu SEQ ID Nr: 2 sind. Wie hierin verwendet, ist eine "homologe Aminosäuresequenz" ein jegliches Polypeptid, das insgesamt oder teilweise durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die bei 25–35°C unter der kritischen Schmelztemperatur (Tm) an einen jeglichen Teil der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID Nr: 1 hybridisiert. Eine homologe Aminosäuresequenz ist eine, die sich von einer in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Eine solche Sequenz umfasst auch serotypische Varianten (nachstehend definiert) als auch Sequenzen, die Deletionen oder Insertionen enthalten, die inhärente Merkmale des Polypeptids wie Immunogenizität beibehalten. Vorzugsweise ist eine solche Sequenz mindestens 75%, mehr bevorzugt 80% und am meisten bevorzugt 90% identisch zu SEQ ID Nr: 2.
Homologe Aminosäuresequenzen beinhalten Sequenzen, die zu SEQ ID Nr: 2 identisch oder im Wesentlichen identisch sind. Unter "im Wesentlichen identisch zu einer Aminosäuresequenz" wird eine Sequenz verstanden, die mindestens 90%, vorzugsweise 95%, mehr bevorzugt 97% und am meisten bevorzugt 99% identisch zu einer Bezugsaminosäuresequenz ist und die sich vorzugsweise von der Bezugssequenz durch mehrheitlich konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet.
Konservative Aminosäuresubstitutionen sind Substitutionen unter Aminosäuren der gleichen Klasse. Diese Klassen beinhalten z. B. Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten, wie Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin und Tyrosin, Aminosäuren mit basischen Seitenketten, wie Lysin, Arginin und Histidin, Aminosäuren mit sauren Seitenketten, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, und Aminosäuren mit nicht polaren Seitenketten, wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cystein.
Homologie wird unter Verwendung einer Sequenzanalysensoftware wie Sequence Analysis Software Package von der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, gemessen. Aminosäuresequenzen werden angeordnet, um die Identität zu maximieren. Lücken können künstlich in die Sequenz eingebracht werden, um eine passende Anordnung zu erreichen. Sobald die optimale Anordnung festgestellt wurde, wird der Homologiegrad dadurch ermittelt, dass alle Positionen, bei denen die Aminosäuren beider Sequenzen identisch sind, relativ zu der Gesamtanzahl von Positionen erfasst werden.
Homologe Polynukleotidsequenzen werden in einer ähnlichen Weise definiert. Vorzugsweise ist eine homologe Sequenz eine, die mindestens 45%, mehr bevorzugt 60% und am meisten bevorzugt 85% identisch zu der kodierenden Sequenz von SEQ ID Nr: 1 ist.
Polypeptide mit einer Sequenz, die zu SEQ ID Nr: 2 homolog ist, beinhalten natürlich vorkommende allelische Varianten als auch Mutanten oder jegliche andere nicht natürlich vorkommende Varianten, die die inhärenten Merkmale des Polypeptids von SEQ ID Nr: 2 beibehalten.
Wie im Stand der Technik bekannt, ist eine allelische Variante eine alternierende Form eines Polypeptids, die dadurch charakterisiert ist, dass sie eine Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren aufweist, die die biologische Funktion des Polypeptids nicht verändert. Unter "biologischer Funktion" wird die Funktion des Polypeptids in den Zellen, in denen es natürlicherweise auftritt, verstanden, selbst wenn die Funktion nicht notwendig für das Wachstum oder Überleben der Zellen ist. Zum Beispiel ist die biologische Funktion eines Porins, den Eintritt in Zellen von Verbindungen zu ermöglichen, die in dem extrazellulären Medium vorhanden sind. Eine biologische Funktion unterscheidet sich von einer antigenen Eigenschaft. Ein Polypeptid kann mehr als eine biologische Funktion aufweisen.
Allelische Varianten sind in der Natur sehr häufig. Zum Beispiel wird eine Bakterienspezies wie C. pneumoniae gewöhnlich durch eine Vielzahl von Stämmen repräsentiert, die sich von jedem anderen durch kleinere allelische Variationen unterscheiden. Tatsächlich kann ein Polypeptid, das die gleiche biologische Funktion in unterschiedlichen Stämmen erfüllt, eine Aminosäuresequenz (und Polynukleotidsequenz) aufweisen, die nicht identisch in einer jeglichen der Stämme ist. Trotz dieser Variation wurde eine Immunantwort, die sich allgemein gegen viele allelische Varianten richtet, gezeigt. In Untersuchungen des Chlamydien-Antigens MOMP tritt eine Kreuzstammantikörperbindung zusammen mit einer Neutralisierung der Infektiosität trotz einer Aminosäuresequenzvariation von MOMP von Stamm zu Stamm auf, was anzeigt, dass das MOMP, wenn es als ein Immunogen verwendet wird, tolerant gegenüber Aminosäurevariationen ist.
Polynukleotide, die für homologe Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, werden durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) von genomischer Bakterien-DNA, die durch herkömmliche Verfahren extrahiert wurde, wieder gewonnen. Dies beinhaltet die Verwendung von synthetischen Oligonukleotid-Primern, die zu stromaufwärts liegenden und stromabwärts liegenden Bereichen der 5'- und 3'-Enden der kodierenden Domäne passen. Geeignete Primer werden gemäß der Nukleotidsequenzinformation, die in der SEQ ID Nr: 1 bereitgestellt wird, entworfen. Das Verfahren ist wie folgt: ein Primer wird ausgewählt, der aus 10 bis 40, vorzugsweise 15 bis 25 Nukleotiden besteht. Es ist vorteilhaft, Primer auszuwählen, die C- und G-Nukleotide in einem Verhältnis enthalten, das ausreichend ist, um eine wirksame Hybridisierung sicherzustellen, d. h. eine Menge von C- und G-Nukleotiden von mindestens 40%, vorzugsweise 50% des gesamten Nukleotidgehalts. Eine Standard-PCR-Reaktion beinhaltet typischerweise 0,5 bis 5 Einheiten an Taq-DNA-Polymerase pro 100 μl, 20 bis 200 μM an jedem Desoxynukleotid, vorzugsweise bei äquivalenten Konzentrationen, 0,5 bis 2,5 mM Magnesium gegenüber der Gesamtdesoxynukleotidkonzentration, 10⁵ bis 10⁶ Zielmoleküle und etwa 20 pmol eines jeden Primers. Etwa 25 bis 50 PCR-Zyklen mit einer Anlagerungstemperatur von 15°C bis 5°C unter dem wirklichen Tm-Wert der Primer werden durchgeführt. Eine stringentere Anlagerungstemperatur verbessert eine Unterscheidung gegenüber nicht korrekt angelagerten Primer und vermindert einen Einbau von nicht korrekten Nukleotiden an dem 3'-Ende der Primer. Eine Denaturierungstemperatur von 95°C bis 97°C ist typisch, obwohl höhere Temperaturen für eine Denaturierung von C + G-reichen Zielen geeignet sein können. Die Anzahl von durchgeführten Zyk len hängt von der Anfangskonzentration der Zielmoleküle ab, obwohl typischerweise mehr als 40 Zyklen nicht empfohlen werden, da nicht spezifische Hintergrundprodukte dazu neigen, sich anzuhäufen.
Ein alternatives Verfahren zum Wiedergewinnen von Polynukleotiden, die für homologe Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, ist durch Hybridisierungsscreening einer DNA- oder RNA-Bibliothek. Hybridisierungsverfahren sind bekannt und in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994), Silhavy et al. (Silhavy et al. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1984) und Davis et al. (Davis et al. A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980) beschrieben. Wichtige Parameter zum Optimieren von Hybridisierungsbedingungen sind in einer Formel wiedergegeben, die verwendet wird, um die kritische Schmelztemperatur zu erhalten, über der sich zwei komplementäre DNA-Stränge voneinander trennen (Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1997) 4: 1539). Für Polynukleotide mit einer Länge von etwa 600 Nukleotiden oder mehr ist diese Formel wie folgt: Tm = 81,5 + 0,41 × (% G + C) + 16,6 log (Kationenkonzentration) – 0,63 × (% Formamid) – 600/Basenanzahl. Unter geeigneten Stringenzbedingungen liegt die Hybridisierungstemperatur (Th) etwa 20 bis 40°C, 20 bis 25°C oder vorzugsweise 30 bis 40°C unter dem berechneten Tm-Wert. Der Fachmann wird verstehen, dass die optimale Temperatur und optimalen Salzbedingungen leicht bestimmt werden können.
Stringente Bedingungen werden für sowohl Vorhybridisierungs- als auch Hybridisierungsinkubationen (i) innerhalb von 4–16 Stunden bei 42°C in 6 × SSC mit 50% Formamid oder (ii) innerhalb von 4–16 Stunden bei 65°C in einer wässrigen 6 × SSC-Lösung (1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat (pH-Wert von 7,0)) erreicht. Typischerweise werden Hybridisierungsexperimente bei einer Temperatur von 60 bis 68°C, z. B. 65°C, durchgeführt. Bei einer solchen Temperatur können stringente Hybridisierungsbedingungen in 6 × SSC, vorzugsweise in 2 × SSC oder 1 × SSC, mehr bevorzugt in 0,5 × SSC, 0,3 × SSC oder 0,1 × SSC (ohne Formamid) erreicht werden. 1 × SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat.
Geeignete Homologe und Fragmente davon, die nicht natürlich auftreten, werden unter Verwendung bekannter Verfahren zum Identifizieren von Bereichen eines Antigens entwickelt, die wahrscheinlich Aminosäuresequenzänderungen und/oder -deletionen tolerieren werden. Als ein Beispiel werden homologe Polypeptide von verschiedenen Spezies verglichen. Konservierte Sequenzen werden identifiziert. Je unterschiedlicher Sequenzen sind, desto wahrscheinlicher werden Sequenzänderungen toleriert. Homologie unter Sequenzen kann dadurch analysiert werden, dass z. B. der BLAST-Homologie-Suchalgorithmus von Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 (1997), verwendet wird. Alternativ dazu werden Sequenzen derart modifiziert, dass sie reaktiver gegenüber T- und/oder B-Zellen werden, basierend auf einer computergestützten Analyse von vermutlichen T- oder B-Zell-Epitopen. Eine noch weitere Alternative ist ein Mutieren eines spezifischen Aminosäurerestes oder einer spezifischen Aminosäuresequenz innerhalb des Polypeptids in vitro, sodann Screenen der mutierten Polypeptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine Chlamydia-Infektion gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren zu verhindern oder zu behandeln.
Ein Fachmann wird leicht verstehen werden, dass durch Befolgen des nachstehend beschriebenen Screening-Verfahrens ohne unangemessenes Experimentieren bestimmt werden wird, ob ein spezifisches Homolog von SEQ ID Nr: 2 beim Verhindern oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion verwendbar sein kann. Das Screening-Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Immunisieren eines Tiers, vorzugsweise einer Maus, mit dem Testhomolog oder -fragment,
(ii) Beimpfen des immunisierten Tiers mit Chlamydia und
(iii) Selektieren derjenigen Homologe oder Fragmente, die einen Schutz gegenüber Chlamydia verleihen.

Unter "Verleihen eines Schutzes" wird verstanden, dass es eine Verminderung der Schwere irgendeiner der Wirkungen einer Chlamydia-Infektion im Vergleich zu einem Kontrolltier, das nicht mit dem Testhomolog oder -fragment immunisiert worden war, auftritt.
Polypeptidderivate werden bereitgestellt, die Teilsequenzen von SEQ ID Nr: 2, Teilsequenzen von Polypeptidsequenzen, die zu SEQ ID Nr: 2 homolog sind, Polypeptide, die sich von Volllängen-Polypeptiden durch innere Deletion ableiten und Verschmelzungsproteine sind.
Es ist eine anerkannte Praxis auf dem Gebiet der Immunologie, Fragmente und Varianten von Proteinimmunogenen als Impfstoffe zu verwenden, da alles, was benö tigt wird, um eine Immunantwort auf ein Protein zu induzieren, ein kleiner (z. B. 8 bis 10 Aminosäuren) immunogener Bereich des Proteins ist. Es wurde gezeigt, dass verschiedene kurze synthetische Peptide, die oberflächenexponierten Antigenen von Pathogenen entsprechen, die von Chlamydia verschieden sind, wirksame Impfstoff-Antigene gegenüber ihren entsprechenden Pathogenen sind, z. B. ein Peptid mit 11 Resten eines Mausbrusttumorvirus (Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4: 1539), ein Peptid mit 16 Resten des Semliki-Forest-Virus (Snijders et al., 1991. J. Gen. Virol. 72: 557–565) und zwei überlappende Peptide mit jeweils 15 Resten vom Hundeparvovirus (Langeveld et al., Vaccine 12(15): 1473–1480, 1994).
Dementsprechend wird es einem Fachmann, der die gegenwärtige Beschreibung gelesen hat, leicht ersichtlich sein, dass Teilsequenzen von SEQ ID Nr: 2 oder ihre homologen Aminosäuresequenzen inhärent zu den Volllängen-Sequenzen sind und erfindungsgemäß gelehrt werden. Solche Polypeptidfragmente weisen vorzugsweise eine Länge von mindestens 12 Aminosäuren auf. Vorteilhafterweise weisen sie eine Länge von mindestens 20 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 50 Aminosäuren, mehr bevorzugt mindestens 75 Aminosäuren und am meisten bevorzugt mindestens 100 Aminosäuren auf.
Polynukleotide mit 30 bis 600 Nukleotiden, die für Teilsequenzen von Sequenzen, die zu SEQ ID Nr: 2 homolog sind, kodieren, werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Parameter und unter Verwendung von Primern wieder gewonnen, die zu Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der 5'- und 3'-Enden des zu amplifizierenden Fragments passen. Das Matrizenpolynukleotid für eine solche Amplifikation ist entweder das Volllängen-Polynukleotid, das zu SEQ ID Nr: 1 homolog ist, oder ein Polynukleotid, das in einem Gemisch von Polynukleotiden, wie eine DNA- oder RNA-Bibliothek enthalten ist. Als ein alternatives Verfahren zum Wiedergewinnen der Teilsequenzen wird eine Screeninghybridisierung unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen und unter Verwendung der Formel zum Berechnen des Tm-Werts durchgeführt. Wenn Fragmente mit 30 bis 600 Nukleotiden wieder gewonnen werden sollen, wird der berechnete Tm-Wert durch Subtrahieren (600/Polynukleotidgröße in Basenpaaren) korrigiert und die Stringenzbedingungen werden durch eine Hybridisierungstemperatur definiert, die 5 bis 10°C unter dem Tm-Wert liegt. Wenn Oligonukleotide mit weniger als 20 bis 30 Basen erhalten werden sollen, ist die Formel zum Berechnen des Tm-Werts wie folgt: Tm = 4 × (G + C) + 2 (A + T). Zum Beispiel würde ein 18-Nukleotid-Fragment mit 50% G + C einen ungefähren Tm-Wert von 54°C aufweisen. Kurze Peptide, die Frag mente von SEQ ID Nr: 2 oder ihren homologen Sequenzen sind, werden direkt durch chemische Synthese erhalten (E. Gross und H. J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesis, John Wiley & Sons (1981), und M. Bodanzki, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984)).
Geeignete Polypeptidderivate, z. B. Polypeptidfragmente, werden unter Verwendung einer computergestützten Analyse von Aminosäuresequenzen entwickelt. Dies würde vermutliche oberflächenexponierte antigene Bereiche identifizieren (Hughes et al., 1992. Infect. Immun. 60(9): 3497). Eine Analyse von sechs Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID Nr: 2 enthalten sind, basierend auf dem Produkt von Flexibilitäts- und Hydrophobizitätsneigungen unter Verwendung des Programms SEQSEE (Wishart DS, et al. "SEQSEE: a comprehensive program suite for Protein sequence analysis." Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10(2): 121–32) kann potentielle B- und T-Zell-Epitope aufdecken, die als eine Grundlage zum Selektieren geeigneter immunogener Fragmente und Varianten verwendet werden können. Diese Analyse verwendet eine angemessene Kombination von Merkmalen der äußeren Oberfläche, die wahrscheinlich von Antikörpern erkannt wird. Vermutliche T-Zell-Epitope für die HLA-A0201-MHC-Unterklasse können durch Algorithmen aufgedeckt werden, die einen bei dem NIH entwickelten Ansatz nachahmen (Parker KC et al. "Peptide binding to MHC class I molecules: implications for antigenic peptide prediction." Immunol Res 1995; 14(1): 34–57).
Epitope, die eine schützende T-Zell-abhängige Immunantwort induzieren, sind über die gesamte Länge des Polypeptids vorhanden. Jedoch können einige Epitope durch sekundäre und tertiäre Strukturen des Polypeptids maskiert sein. Um solche maskierten Epitope aufzudecken, werden große innere Deletionen erzeugt, die viel der ursprünglichen Proteinstruktur entfernen und die maskierten Epitope exponieren. Solche inneren Deletionen bewirken manchmal den zusätzlichen Vorteil eines Entfernens von immundominanten Bereichen hoher Variabilität unter Stämmen.
Polynukleotide, die für Polypeptidfragmente und Polypeptide mit großen inneren Deletionen kodieren, werden unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994). Solche Verfahren beinhalten Standard-PCR, inverse PCR, Restriktionsenzymbehandlung von klonierten DNA-Molekülen oder das Verfahren von Kunkel et al. (Kunkel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 448). Komponenten für diese Verfahren und Anweisungen für ihre Verwendung sind leicht aus verschiedenen käuflichen Quellen wie Stratagene erhältlich. Sobald die Deletionsmutanten konstruiert wurden, werden sie hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine Chlamydia-Infektion zu verhindern oder zu behandeln, wie vorstehend beschrieben getestet.
Wie hierin verwendet, ist ein Verschmelzungspolypeptid eines, das ein Polypeptid oder ein Polypeptidderivat, wie hierin beschrieben, enthält, das an dem N- oder C-terminalen Ende mit einem jeglichen andere Polypeptid (hierin nachstehend als ein Peptidschwanz bezeichnet) verschmolzen ist. Ein einfacher Weg zum Erhalten eines solchen Verschmelzungspolypeptids besteht in der Translation einer In-Frame-Verschmelzung der Polynukleotidsequenzen, d. h. eines Hybridgens. Das Hybridgen, das für das Verschmelzungspolypeptid kodiert, wird in einen Expressionsvektor inseriert, der zum Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle verwendet wird. Alternativ dazu wird die Polynukleotidsequenz, die für das Polypeptid oder Polypeptidderivat kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert, in dem das Polynukleotid, das für den Peptidschwanz kodiert, bereits vorhanden ist. Solche Vektoren und Anweisungen für ihre Verwendung sind käuflich erhältlich, z. B. das pMal-c2- oder pMal-p2-System von New England Biolabs, bei dem der Peptidschwanz ein maltosebindendes Protein ist, das Glutathion-S-Transferase-System von Pharmacia oder das von Novagen erhältliche His-Tag-System. Diese und andere Expressionssysteme stellen geeignete Mittel zum weiteren Aufreinigen von Polypeptiden und Derivaten, die erfindungsgemäß geeignet sind, bereit.
Ein vorteilhaftes Beispiel eines Verschmelzungspolypeptids ist eines, bei dem das Polypeptid oder Homolog oder Fragment, wie hierin beschrieben, mit einem Polypeptid mit einer Adjuvans-Aktivität, wie einer Untereinheit B von entweder Choleratoxin oder hitzelabilem E. coli-Toxin, verschmolzen ist. Eine weitere vorteilhafte Verschmelzung ist eine, bei der das Polypeptid, Homolog oder Fragment mit einem starken T-Zell-Epitop oder B-Zell-Epitop verschmolzen ist. Ein solches Epitop kann eines, das bekannt ist (z. B. das Hepatitis B-Virus-Kernartigen, D. R. Millich et al., "Antibody production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 329: 547–549), oder eines sein, das in einem weiteren Polypeptid, wie hierin beschrieben, basierend auf einer computergestützten Analyse von vermutlichen T- oder B-Zell-Epitopen, identifiziert worden ist. Übereinstimmend mit diesem erfindungsgemäßen Aspekt ist ein Verschmelzungspolypeptid, das T- oder B-Zell-Epitope aus SEQ ID Nr: 2 umfasst, oder sein Homolog oder Fragment, wobei die Epitope sich von vielen Varianten des Poly peptids oder Homologs oder Fragments ableiten, wobei sich jede Variante von einer weiteren in seiner Lage und Sequenz seines Epitops innerhalb des Polypeptids unterscheidet. Eine solche Verschmelzung ist beim Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion wirksam, da es die T- und B-Zellantwort auf das Gesamtpolypeptid, -homolog oder -fragment optimiert.
Um eine Verschmelzung zu bewirken, wird das Polypeptid mit dem N-, oder vorzugsweise mit dem C-terminalen Ende des Polypeptids mit einer Adjuvans-Aktivität oder T- oder B-Zell-Epitop verschmolzen. Alternativ dazu wird ein Polypeptidfragment intern innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids mit Adjuvans-Aktivität inseriert. Das T- oder B-Zell-Epitop kann auch intern in die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids inseriert werden.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide kodieren auch für Hybridvorläuferpolypeptide mit heterologen Signalpeptiden, die in erfindungsgemäße Polypeptide reifen. Unter einem "heterologen Signalpeptid" wird ein Signalpeptid verstanden, das nicht in natürlich vorkommenden Vorläufern von erfindungsgemäßen Polypeptiden gefunden wird.
Erfindungsgemäße Polynukleotidmoleküle, die RNA, DNA oder Modifikationen oder Kombinationen davon beinhalten, weisen verschiedene Anwendungen auf. Ein DNA-Molekül wird z. B. (i) in einem Verfahren zum Herstellen des kodierten Polypeptids in einem rekombinanten Wirtssystem, (ii) bei der Konstruktion von Impfstoffvektoren wie Pockenviren, die weiter in Verfahren und Zusammensetzungen zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion verwendet werden, (iii) als ein Impfstoffmittel (als auch ein RNA-Molekül) in einer nackten Form oder formuliert mit einem Zufuhrvehikel und (iv) bei der Konstruktion von attenuierten Chlamydia-Stämmen, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid überexprimieren oder es in einer nicht toxischen, mutierten Form exprimieren, verwendet.
Dementsprechend umfasst ein zweiter erfindungsgemäßer Aspekt (i) eine Expressionskassette mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, das unter der Kontrolle der Elemente, die für eine Expression benötigt werden, insbesondere unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, steht, (ii) einen Expressionsvektor mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, (iii) eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette und/oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert oder transfiziert ist, als auch (iv) ein Ver fahren zum Produzieren eines Polypeptids oder Polypeptidderivats, das durch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodiert wird, das ein Kultivieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette und/oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert oder transfiziert ist, unter Bedingungen, die eine Expression des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls ermöglichen, und Wiedergewinnen des kodierten Polypeptids oder Polypeptidderivats aus der Zellkultur beinhaltet.
Ein rekombinantes Expressionssystem wird aus prokaryotischen und eukaryotischen Wirten ausgewählt. Eukaryotische Wirte beinhalten Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris), Sängerzellen (z. B. COS1-, NIH3T3- oder JEG3-Zellen), Arthropodenzellen (z. B. Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen) und Pflanzenzellen. Ein bevorzugtes Expressionssystem ist ein prokaryotischer Wirt wie E. coli. Bakterielle und eukaryotische Zellen sind von einer Reihe von unterschiedlichen Quellen erhältlich, einschließlich kommerzieller Quellen, z. B. der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland). Kommerzielle Quellen von Zellen, die zum Exprimieren von rekombinantem Protein verwendet werden, stellen auch Anweisungen für eine Verwendung der Zellen bereit.
Die Auswahl des Expressionssystems hängt von den für das exprimierte Polypeptid gewünschten Merkmalen ab. Zum Beispiel kann es verwendbar sein, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid in einer besonderen lipidierten Form oder einer jeglichen anderen Form zu produzieren.
Ein Fachmann würde leicht verstehen, dass nicht erwartet werden würde, dass alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen und Wirte gleichermaßen gut die erfindungsgemäßen Polynukleotide exprimieren. Mit den nachstehend beschriebenen Richtlinien kann jedoch eine Selektion von Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten ohne unangemessenes Experimentieren und ohne Abweichung von dem Umfang der Erfindung durchgeführt werden.
Beim Selektieren eines Vektors muss der Wirt derart ausgewählt werden, dass er mit dem Vektor kompatibel ist, der in ihm existiert und möglicherweise in ihm repliziert. Überlegungen werden hinsichtlich der Vektorkopienanzahl, der Fähigkeit zum Kontrollieren der Kopienanzahl, der Expression von anderen Proteinen wie antibiotischer Resistenz angestellt. Beim Selektieren einer Expressionskontrollsequenz wird eine Reihe von Variablen berücksichtigt. Unter den wichtigen Variablen sind die relative Stärke der Sequenz (z. B. die Fähigkeit, eine Expression unter verschiedenen Bedingungen zu betreiben), die Fähigkeit, die Sequenzfunktion zu steuern, die Kompatibilität zwischen dem zu exprimierenden Polynukleotid und der Kontrollsequenz (z. B. Sekundärstrukturen werden berücksichtigt, um Haarnadelstrukturen zu vermeiden, die eine wirksame Transkription verhindern). Beim Selektieren des Wirts werden unizelluläre Wirte selektiert, die mit dem ausgewählten Vektor kompatibel, hinsichtlich jeglichen möglichen toxischen Wirkungen des exprimierten Produkts tolerant, zum wirksamen Sekretieren des exprimierten Produkts, falls so gewünscht, zum Exprimieren des Produkts in der gewünschten Konformation, zur maßstäblichen Vergrößerung und zum leichten Aufreinigen des Endprodukts fähig sind.
Die Auswahl der Expressionskassette hängt von dem selektierten Wirtssystem als auch von den für das exprimierte Polypeptid gewünschten Merkmalen ab. Typischerweise beinhaltet eine Expressionskassette einen Promotor, der in dem selektierten Wirtssystem funktionell ist und konstitutiv oder induzierbar sein kann, eine Ribosombindungsstelle, ein Start-Codon (ATG), falls erforderlich, einen Bereich, der für ein Signalpeptid, z. B. ein Lipidierungssignalpeptid, kodiert, ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, ein Stopp-Codon und gegebenenfalls einen 3'-terminalen Bereich (Translations- und/oder Transkriptionsterminator). Der Signalpeptid-kodierende Bereich ist benachbart zu dem erfindungsgemäßen Polynukleotid und befindet sich in einem geeigneten Leserahmen. Der für das Signalpeptid kodierende Bereich ist homolog oder heterolog zu dem DNA-Molekül, das für das reife Polypeptid kodiert, und ist mit dem Sekretionsapparat des für eine Expression verwendeten Wirts kompatibel. Der offene Leserahmen, der durch das erfindungsgemäße DNA-Molekül, allein oder zusammen mit dem Signalpeptid, konstituiert wird, befindet sich unter der Kontrolle des Promotors, so dass eine Transkription und Translation in dem Wirtssystem auftritt. Promotoren und Signalpeptid-kodierende Bereiche sind bekannt und dem Fachmann erhältlich und beinhalten z. B. den Promotor von Salmonella typhimurium (und Derivate), der durch Arabinose induzierbar ist (Promotor araB) und in gramnegativen Bakterien wie E. coli funktionell ist (wie in der US-PS 5,028,530 und in Cagnon et al. (Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7): 843) beschrieben), den Promotor des Gens des Bakteriophagen T7, das für eine RNA-Polymerase kodiert, der in einer Reihe von E. coli-Stämmen funktionell ist, die T7-Polymerase exprimieren (beschrieben in der US-PS 4,952,496 ), das OspA-Lipidierungssignalpeptid, und das R1pB-Lipidierungssignalpeptid (Takase et al., J. Bact. (1987) 169: 5692).
Die Expressionskassette ist typischerweise Teil eines Expressionsvektors, der für seine Fähigkeit, in dem ausgewählten Expressionssystem zu replizieren, selektiert wird. Expressionsvektoren (z. B. Plasmide oder virale Vektoren) können z. B. aus denjenigen ausgewählt werden, die in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985, Ergänzung 1987) beschrieben worden sind. Geeignete Expressionsvektoren können von verschiedenen kommerziellen Quellen erworben werden.
Verfahren zum Transformieren/Transfizieren von Wirtszellen mit Expressionsvektoren sind bekannt und hängen von dem selektierten Wirtssystem ab, wie in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994) beschrieben.
Nach Expression wird ein rekombinantes erfindungsgemäßes Polypeptid (oder ein Polypeptidderivat) produziert und verbleibt in dem intrazellulären Kompartiment, wird in das extrazelluläre Medium oder in den periplasmatischen Raum sekretiert/ausgeschieden oder wird in die zelluläre Membran eingebettet. Das Polypeptid wird in einer im Wesentlichen aufgereinigten Form aus dem Zellextrakt oder aus dem Überstand nach Zentrifugation der rekombinanten Zellkultur wieder gewonnen. Typischerweise wird das rekombinante Polypeptid durch auf Antikörper basierende Affinitätsaufreinigung oder durch andere bekannte Verfahren aufgereinigt, die leicht durch einen Fachmann angepasst werden können, wie eine Verschmelzung des Polynukleotids, das für das Polypeptid oder sein Derivat kodiert, an eine kleine affinitätsbindende Domäne. Antikörper, die zum Immunaffinitätsaufreinigen der erfindungsgemäßen Polypeptide verwendbar sind, werden wie nachstehend beschrieben erhalten.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann auch als ein Impfstoff verwendbar sein. Es gibt zwei Hauptwege, entweder unter Verwendung eines viralen oder bakteriellen Wirts als ein Genzufuhrvehikel (Lebendimpfstoffvektor) oder Verabreichen des Gens in einer freien Form, z. B. inseriert in ein Plasmid. Eine therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Polynukleotids wird wie nachstehend beschrieben evaluiert.
Dementsprechend stellt ein dritter erfindungsgemäßer Aspekt (i) einen Impfstoffvektor wie ein Pockenvirus mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, das unter der Kontrolle von Elementen steht, die für eine Expression benötigt werden, (ii) eine Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Impfstoffvektor zusammen mit einem Verdünner oder Träger umfasst, insbesondere (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors, (iv) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger (z. B. einem Menschen, alternativ kann das Verfahren in Veterinäranwendungen zum Behandeln oder Verhindern einer Chlamydia-Infektion von Tieren, z. B. Katzen oder Vögeln, verwendet werden), das ein Verabreichen an den Säuger einer immunogen wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors umfasst, um eine schützende oder therapeutische Immunantwort gegenüber Chlamydia hervorzurufen, und insbesondere (v) ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumonia, C. pecorum), die ein Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors an ein infiziertes Individuum beinhaltet, bereit. Zusätzlich umfasst der dritte erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
Wie hierin verwendet, exprimiert ein Impfstoffvektor ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide oder Derivate. Der Impfstoffvektor kann zusätzlich ein Cytokin, wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12), exprimieren, das die Immunantwort (Adjuvans-Wirkung) verstärkt. Es wird verstanden, dass eine jegliche der zu exprimierenden Komponenten unter die Kontrolle von Elementen platziert wird, die für eine Expression in einer Säugerzelle benötigt werden.
Übereinstimmend mit dem dritten erfindungsgemäßen Aspekt ist eine Zusammensetzung, die mehrere Impfstoffvektoren umfasst, wobei ein jeglicher von diesem zum Exprimieren eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats fähig ist. Eine Zusammensetzung kann auch einen Impfstoffvektor, der zum Exprimieren eines zusätzlichen Chlamydia-Antigens oder einer Untereinheit, eines Fragments, Homologs, einer Mutante oder eines Derivats davon, fähig ist, gegebenenfalls zusammen mit einem Cytokin wie IL-2 oder IL-12 umfassen.
Impfungsverfahren zum Behandeln oder Verhindern einer Infektion in einem Säuger umfassen eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors, der über einen jeglichen herkömmlichen Weg verabreicht werden soll, insbesondere an eine mukosale (z. B. okkulare, intranasale, orale, gastritische, pulmonare, intestinale, rektale, vaginale oder Harnweg-) Oberfläche oder über den parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Weg. Bevorzugte Wege hängen von der Auswahl des Impfstoffvektors ab. Eine Behandlung kann in einer einzigen Dosis oder wiederholt bei Intervallen erfolgen. Die geeignete Dosierung hängt von verschiedenen Parametern ab, die vom Fachmann verstanden werden, wie dem Impfstoffvektor selbst, dem Verabreichungsweg oder dem Zustand des zu impfenden Säugers (Gewicht, Alter und dergleichen).
Lebendimpfstoffvektoren, die im Stand der Technik erhältlich sind, beinhalten virale Vektoren wie Adenoviren und Pockenviren als auch bakterielle Vektoren, z. B. Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille bilié de Calmette-Guérin (BOG) und Streptococcus.
Ein Beispiel eines Adenovirus-Vektors als auch eines Verfahrens zum Konstruieren eines Adenovirus-Vektors, der zum Exprimieren eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls fähig ist, ist in der US-PS 4,920,209 beschrieben. Pockenvirusvektoren beinhalten Vaccinia- und Kanarienpockenvirus, die in der US-PS 4,722,848 bzw. US-PS 5,364,773 beschrieben sind. (Vgl. auch z. B. Tartaglia et al., Virology (1992) 188: 217 für eine Beschreibung eines Vaccinia-Virus-Vektors und Taylor et al., Vaccine (1995) 13: 539 für eine Referenz eines Kanarienpockenvirus.) Pockenvirusvektoren, die zum Exprimieren eines erfindungsgemäßen Polynukleotids fähig sind, werden durch homologe Rekombination erhalten, wie in Kieny et al., Nature (1984) 312: 163 beschrieben, so dass das erfindungsgemäße Polynukleotid in das virale Genom unter geeigneten Bedingungen für eine Expression in Sängerzellen inseriert wird. Im Allgemeinen kann die Dosis eines viralen Impfstoffvektors für eine therapeutische oder prophylaktische Verwendung etwa 1 × 10⁴ bis etwa 1 × 10¹¹, vorteilhafterweise etwa 1 × 10⁷ bis etwa 1 × 10¹⁰, vorzugsweise etwa 1 × 10⁷ bis etwa 1 × 10⁹ Plaque bildende Einheiten pro kg betragen. Vorzugsweise werden virale Vektoren parenteral, z. B. in drei Dosen mit vierwöchigem Abstand, verabreicht. Es ist bevorzugt, eine Zugabe eines chemischen Adjuvans zu einer Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen viralen Vektor enthält, und dadurch Minimieren der Immunantwort auf den viralen Vektor selbst zu vermeiden.
Nicht toxigene, mutierte Stämme von Vibrio cholerae, die als ein oraler Lebendimpfstoff verwendbar sind, sind bekannt. Mekalanos et al., Nature (1983) 306: 551 und die US-PS 4,882,278 beschreiben Stämme, bei denen eine wesentliche Menge der kodierenden Sequenz jeder der zwei ctxA-Allele deletiert wurde, so dass kein funkti onelles Cholerae-Toxin produziert wird. Die WO 92/11354 beschreibt einen Stamm, bei dem der irgA-Lokus durch Mutation inaktiviert ist. Diese Mutation kann in einem einzigen Stamm mit ctxA-Mutationen kombiniert werden. Die WO 94/01533 beschreibt eine Deletionsmutante, der funktionelle ctxA- und attRS1-DNA-Sequenzen fehlen. Diese mutierten Stämme sind genetisch manipuliert, um heterologe Antigene zu exprimieren, wie in der WO 94/19482 beschrieben. Eine wirksame Impfstoffdosis eines Stamms von Vibrio cholerae, die zum Exprimieren eines Polypeptids oder Polypeptidderivats fähig ist, dass von einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül kodiert wird, enthält etwa 1 × 10⁵ bis etwa 1 × 10⁹, vorzugsweise etwa 1 × 10⁶ bis etwa 1 × 10⁸ lebensfähige Bakterien in einem Volumen, das für den selektierten Verabreichungsweg geeignet ist. Bevorzugte Verabreichungswege beinhalten alle mukosalen Wege. Am meisten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
Attenuierte Stämme von Salmonella typhimurium, die für eine rekombinante Expression von heterologen Antigenen genetisch manipuliert sind oder nicht, und deren Verwendung als orale Impfstoffe sind in Nakayama et al. (Bio/Technology (1988) 6: 693) und in der WO 92/11361 beschrieben. Bevorzugte Verabreichungswege beinhalten alle mukosalen Wege. Am meisten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
Andere bakterielle Stämme, die als Impfstoffvektoren im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden, sind für Shigella flexneri in High et al., EMBO (1992) 11: 1991 und Sizemore et al., Science (1995) 270: 299, für Streptococcus gordonii in Medaglini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 6868, und für Bacille Calmette Guerin in Flynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (Ergänzung I): 31, der WO 88/06626 , WO 90/00594 , WO 91/13157 , WO 92/01796 und WO 92/21376 beschrieben.
In bakteriellen Vektoren wird das erfindungsgemäße Polynukleotid in das bakterielle Genom inseriert oder verbleibt in einem freien Zustand als Teil eines Plasmids.
Die Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen bakteriellen Impfstoffvektor umfasst, kann ferner ein Adjuvans beinhalten. Eine Reihe von Adjuvanzien ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Adjuvanzien werden selektiert, wie nachstehend bereitgestellt.
Dementsprechend stellt ein vierter erfindungsgemäßer Aspekt (i) eine Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zusammen mit einem Verdünner oder Träger umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polynukleotids umfasst, (iii) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger durch Verabreichung einer immunogen wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polynukleotids zum Auslösen einer schützenden Immunantwort gegen Chlamydia, und insbesondere (iv) ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae oder C. pecorum) durch Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines erfindungsgemäßen Polynukleotids an ein infiziertes Individuum bereit. Zusätzlich umfasst der vierte erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polynukleotids bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion. Eine bevorzugte Verwendung beinhaltet die Verwendung eines DNA-Moleküls, das unter Bedingungen für eine Expression in einer Sängerzelle platziert ist, insbesondere in einem Plasmid, das nicht zum Replizieren in Sängerzellen und zum im Wesentlichen Integrieren in ein Säugergenom fähig ist.
Eine Verwendung der erfindungsgemäßen Polynukleotide beinhaltet deren Verabreichung an einen Säuger als ein Impfstoff für therapeutische oder prophylaktische Zwecke. Solche Polynukleotide werden in der Form von DNA als Teil eines Plasmids verwendet, der nicht fähig ist, sich in einer Sängerzelle zu replizieren, und nicht fähig ist, sich in das Säugergenom zu integrieren. Typischerweise wird ein solches DNA-Molekül unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, der für eine Expression in einer Sängerzelle geeignet ist. Der Promotor fungiert entweder ubiquitär oder gewebespezifisch. Beispiele für nicht gewebespezifische Promotoren beinhalten den frühen Cytomegalovirus(CMV)-Promotor (der in der US-PS 4,168,062 beschrieben ist) und den Rous-Sarcoma-Virus-Promotor (der in Norton & Coffin, Molec. Cell Biol. (1985) 5: 281 beschrieben ist). Ein Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist der Desmin-Promotor, der eine Expression in Muskelzellen lenkt (Li et al., Gene (1989) 78: 243, Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266: 6562 und Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1993) 268: 10403). Eine Verwendung von Promotoren ist dem Fachmann bekannt. Geeignete Vektoren sind in zahlreichen Publikationen, insbesondere in der WO 94/21797 und Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7: 1205, beschrieben.
Erfindungsgemäße Polynukleotide, die als Impfstoffe verwendet werden, kodieren entweder einen Vorläufer oder eine reife Form des entsprechenden Polypeptids. In der Vorläuferform ist das Signalpeptid entweder homolog oder heterolog. In dem letzteren Fall wird eine eukaryotische Leitsequenz wie die Leitsequenz des gewebespezifischen Plasminogenfaktors (tPA) bevorzugt.
Wie hierin verwendet, enthält eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein oder mehrere Polynukleotide mit gegebenenfalls mindestens einem zusätzlichen Polynukleotid, das für ein weiteres Chlamydia-Antigen kodiert, wie Urease-Untereinheit A, B oder beide, oder ein Fragment, Derivat, eine Mutante oder ein Analogon davon. Die Zusammensetzung kann auch ein zusätzliches Polynukleotid enthalten, das für ein Cytokin, wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12) kodiert, so dass die Immunantwort verstärkt wird. Diese zusätzlichen Polynukleotide werden unter die geeignete Kontrolle für eine Expression gestellt. Vorteilhafterweise sind erfindungsgemäße DNA-Moleküle und/oder zusätzliche DNA-Moleküle, die in die gleiche Zusammensetzung eingeschlossen werden sollen, in dem gleichen Plasmid vorhanden.
Standardtechniken der Molekularbiologie zum Herstellen und Aufreinigen von Polynukleotiden werden bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Polynukleotid-Therapeutika verwendet. Für eine Verwendung als Impfstoff wird ein erfindungsgemäßes Polynukleotid gemäß verschiedener nachstehend beschriebener Verfahren formuliert.
Ein Verfahren verwendet das Polynukleotid in einer nackten Form, frei von jeglichen Zufuhrvehikeln. Ein solches Polynukleotid wird einfach in einer physiologisch akzeptablen Lösung wie steriler Salzlösung oder steril gepufferter Salzlösung mit oder ohne einen Träger verdünnt. Wenn vorhanden, ist der Träger vorzugsweise isoton, hypoton oder schwach hyperton und weist eine relativ niedrige ionische Stärke auf, wie von einer Sucroselösung bereitgestellt, z. B. eine Lösung mit 20% Sucrose.
Ein alternatives Verfahren verwendet das Polynukleotid in Verbindung mit Mitteln, die eine zelluläre Aufnahme unterstützen. Beispiele solcher Mittel sind (i) Chemikalien, die eine zelluläre Permeabilität modifizieren, wie Bupivacain (vgl. z. B. die WO 94/16737 ), (ii) Liposome für eine Einkapselung des Polynukleotids oder (iii) kationische Lipide oder Silica-, Gold- oder Wolframmikropartikel, die selbst mit den Polynukleotiden assoziieren.
Anionische und neutrale Liposome sind auf dem Gebiet bekannt (vgl. z. B. Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990), für eine detaillierte Beschreibung von Verfahren zum Herstellen von Liposomen) und sind zum Zuführen eines großen Bereichs von Produkten, einschließlich Polynukleotiden, verwendbar.
Kationische Lipide sind auch auf dem Fachgebiet bekannt und werden üblicherweise für eine Genzufuhr verwendet. Solche Lipide beinhalten Lipofectin^TM, das auch als DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid) bekannt ist, DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin) und Cholesterinderivate wie DC-Chol (3-beta-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin). Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide findet sich in der EP 187,702 , WO 90/11092 , US-PS 5,283,185 , WO 91/15501 , WO 95/26356 und US-PS 5,527,928 . Kationische Lipide für eine Genzufuhr werden vorzugsweise in Verbindung mit einem neutralen Lipid wie DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) verwendet, wie in der WO 90/11092 als Beispiel beschrieben.
Eine Formulierung mit kationischen Liposomen kann gegebenenfalls andere transfektionserleichternde Verbindungen enthalten. Eine Reihe von diesen sind in der WO 93/18759 , WO 93/19768 , WO 94/25608 und WO 95/02397 beschrieben. Sie beinhalten Sperminderivate, die zum Erleichtern des Transports von DNA durch die nukleäre Membran verwendbar sind (vgl. z. B. die WO 93/18759 ), und membranpermeabilisierende Verbindungen wie GALA, Gramicidin S und kationische Gallensäuresalze (vgl. z. B. die WO 93/19768 ).
Gold- oder Wolframmikropartikel werden für eine Genzufuhr verwendet, wie in der WO 91/00359 , WO 93/17706 und in Tang et al. Nature (1992) 356: 152 beschrieben. Das mit Mikropartikeln beschichtete Polynukleotid wird über intradermale oder intraepidermale Wege unter Verwendung einer nadelfreien Injektionsvorrichtung ("gene gun") injiziert, wie denjenigen, die in der US-PS 4,945,050 , US-PS 5,015,580 und in der WO 94/24263 beschrieben sind.
Die Menge an DNA, die in einem Impfstoffempfänger verwendet werden soll, hängt z. B. von der Stärke des in dem DNA-Konstrukt verwendeten Promotors, der Immunogenizität des exprimierten Genprodukts, dem Zustand des für eine Verabreichung vorgesehenen Säugers (z. B. dem Gewicht, Alter und allgemeinen Gesundheitszustands des Säugers), der Verabreichungsart und dem Typ der Formulierung ab. Allgemein kann eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 10 μg bis etwa 800 μg und mehr bevorzugt etwa 25 μg bis etwa 250 μg an erwachsene Menschen verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer einzelnen Dosis oder wiederholt bei Intervallen erreicht werden.
Der Verabreichungsweg ist ein jeglicher herkömmlicher Weg, der auf dem Impfstoffgebiet verwendet wird. Als allgemeine Richtschnur wird ein erfindungsgemäßes Polynukleotid über eine mukosale Oberfläche, z. B. einer okkularen, intranasalen, pulmonalen, oralen, intestinalen, rektalen, vaginalen und Harnwegoberfläche, oder über einen parenteralen Weg, z. B. über einen intravenösen, subkutanen, intraperitonealen, intradermalen, intraepidermalen oder intramuskulären Weg, verabreicht. Die Wahl eines Verabreichungswegs hängt von der Formulierung ab, die selektiert wird. Ein Polynukleotid, das in Verbindung mit Bupivacain formuliert ist, wird vorteilhafterweise in Muskeln verabreicht. Wenn ein neutrales oder anionisches Liposom oder ein kationisches Lipid wie DOTMA oder DC-Chol verwendet wird, kann die Formulierung vorteilhafterweise über intravenöse, intranasale (Aerosolisation), intramuskuläre, intradermale und subkutane Wege injiziert werden. Ein Polynukleotid in einer nackten Form kann vorteilhafterweise über die intramuskulären, intradermalen oder subkutanen Wege verabreicht werden.
Obwohl nicht absolut benötigt, kann eine solche Zusammensetzung auch ein Adjuvans enthalten. Falls so, ist ein systemisches Adjuvans, das keine gleichzeitige Verabreichung benötigt, um eine Adjuvans-Wirkung zu zeigen, bevorzugt, wie z. B. QS21, das in der US-PS 5,057,546 beschrieben ist.
Die Sequenzinformation, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, ermöglicht die Entwicklung von spezifischen Nukleotidsonden und -primern, die für diagnostische Zwecke verwendet werden. Dementsprechend stellt ein fünfter erfindungsgemäßer Aspekt eine Nukleotidsonde oder -primer mit einer Sequenz bereit, die sich in einer in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Sequenz findet oder durch die Degeneriertheit des genetischen Codes davon abgeleitet ist.
Der Begriff "Sonde", wie erfindungsgemäß verwendet, betrifft Moleküle von DNA (vorzugsweise einzelsträngig) oder RNA (oder Modifikationen oder Kombinationen davon), die unter den stringenten Bedingungen, wie vorstehend definiert, an Nukleinsäuremoleküle mit SEQ ID Nr: 1 oder an Sequenzen, die zu SEQ ID Nr: 1 ho molog sind, oder an ihre komplementäre oder Antisense-Sequenz hybridisieren. Allgemein sind Sonden signifikant kürzer als Volllängen-Sequenzen. Solche Sonden beinhalten etwa 5 bis etwa 100, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 80 Nukleotide. Insbesondere weisen Sonden Sequenzen auf, die mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 85%, mehr bevorzugt 95% homolog zu einem Teil von SEQ ID Nr: 1 sind oder die komplementär zu solchen Sequenzen sind. Sonden können modifizierte Basen wie Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Desoxyuridin, Dimethylamino-5-desoxyuridin oder Diamino-2,6-purin enthalten. Zucker- oder Phosphatreste können auch modifiziert oder substituiert sein. Zum Beispiel kann ein Desoxyriboserest durch ein Polyamid ersetzt sein (Nielsen et al., Science (1991) 254: 1497) und Phosphatreste können durch Estergruppen wie Diphosphat-, Alkyl-, Arylphosphonat- und Phosphorothioatester ersetzt sein. Zusätzlich kann die 2'-Hydroxylgruppe an Ribonukleotiden durch Einschluss solcher Gruppen wie Alkylgruppen modifiziert sein.
Erfindungsgemäße Sonden werden in diagnostischen Tests als Fang- oder Nachweissonden verwendet. Solche Fangsonden werden herkömmlicherweise auf einem Festträger direkt oder indirekt durch kovalente Mittel oder durch passive Adsorption immobilisiert. Eine Nachweissonde wird durch einen Nachweismarker ausgewählt aus radioaktiven Isotopen, Enzymen wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase und Enzymen, die zum Hydrolysieren eines chromogenen, fluorogenen oder lumineszenten Substrats fähig sind, Verbindungen, die chromogen, fluorogen oder lumineszent sind, Nukleotidbasenanaloga und Biotin, markiert.
Erfindungsgemäße Sonden werden in einer jeglichen herkömmlichen Hybridisierungstechnik wie Dot Blot (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), Southern Blot (Southern J. Mol. Biol. (1975) 98: 503), Northern Blot (identisch zu Southern Blot mit der Ausnahme, dass RNA als ein Ziel verwendet wird) oder der Sandwichtechnik (Dunn et al., Cell (1977) 12: 23) verwendet. Die letztere Technik beinhaltet die Verwendung einer spezifischen Fangsonde und/oder einer spezifischen Nachweissonde mit Nukleotidsequenzen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden.
Ein Primer ist eine Sonde mit gewöhnlich etwa 10 bis etwa 40 Nukleotiden, die zum Starten einer enzymatischen Polymerisation von DNA in einem Amplifikationsverfahren (z. B. PCR), in einem Verlängerungsverfahren oder in einem Verfahren einer reversen Transkription verwendet wird. Primer, die in diagnostischen Verfahren verwendet werden, die PCR beinhalten, werden durch bekannte Verfahren markiert.
Wie hierin beschrieben, werden erfindungsgemäß auch (i) ein Reagenz, das eine erfindungsgemäße Sonde umfasst, zum Nachweisen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem biologischen Material, (ii) ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem biologischen Material, bei dem (a) eine Probe von dem biologischen Material wieder gewonnen wird oder sich davon ableitet, (b) DNA oder RNA von dem Material extrahiert und denaturiert wird und (c) einer erfindungsgemäßen Sonde, z. B. einer Fang-, Nachweissonde oder beidem, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt wird, so dass eine Hybridisierung nachgewiesen wird, und (iii) ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem biologischen Material umfasst, bei dem (a) eine Probe von dem biologischen Material wieder gewonnen wird oder sich davon ableitet, (b) DNA davon extrahiert wird, (c) die extrahierte DNA mit mindestens einem und vorzugsweise zwei erfindungsgemäßen Primer versetzt wird und durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird und (d) das amplifizierte DNA-Fragment produziert wird.
Es ist offensichtlich, dass eine Offenbarung von Polynukleotidsequenzen von SEQ ID Nr: 1, ihren Homologen und Teilsequenzen ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen ermöglicht. Dementsprechend stellt ein sechster erfindungsgemäßer Aspekt ein im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid oder Polypeptidderivat mit einer Aminosäuresequenz bereit, die durch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kodiert wird.
Ein "im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid", wie hierin verwendet, wird als ein Polypeptid definiert, das von der Umgebung abgetrennt ist, in der es natürlich auftritt und/oder das frei von dem Hauptteil der Polypeptide ist, die in der Umgebung vorhanden sind, in der es synthetisiert wurde. Zum Beispiel ist ein im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid frei von cytoplasmatischen Polypeptiden. Der Fachmann würde leicht verstehen, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide aus einer natürlichen Quelle, d. h. einem Chlamydia-Stamm, aufgereinigt sein oder durch rekombinante Mittel produziert werden können.
Übereinstimmend mit dem sechsten erfindungsgemäßen Aspekt sind Polypeptide, Homologe oder Fragmente, die modifiziert oder behandelt sind, um deren Immuno genizität in einem Zieltier zu erhöhen, in dem das Polypeptid, Homolog oder die Fragmente einen Schutz gegen Chlamydia verleihen sollen. Solche Modifikationen oder Behandlungen beinhalten: Aminosäuresubstitutionen mit einem Aminosäurederivat wie 3-Methylhistidin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, etc., Modifikationen oder Deletionen, die nach Präparation des Polypeptids, Homologs oder Fragments durchgeführt werden, wie die Modifikation von freien Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylseitengruppen der Aminosäuren.
Eine Identifizierung von Homologen, Polypeptiden oder Polypeptidderivaten, die durch erfindungsgemäße Polynukleotide kodiert werden und die eine spezifische Antigenizität aufweisen, wird durch Screenen auf Kreuzreaktivität mit einem Antiserum erreicht, das gegen das Bezugspolypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 1 gerichtet ist. Das Verfahren ist wie folgt: ein monospezifisches Hyperimmunantiserum wird gegen ein aufgereinigtes Bezugspolypeptid, ein Verschmelzungspolypeptid (z. B. ein Expressionsprodukt von MBP-, GST- oder His-Tag-Systemen, wobei die Beschreibung und Anweisungen für eine Verwendung davon in den Invitrogen-Benutzerhandbüchern für pcDNA3.1/Myc-His(+) A, B und C und für das Proteinaufreinigungssytem Xpress^TM enthalten sind) oder ein synthetisches Peptid, das antigen sein soll, gerichtet. Falls ein Antiserum gegen ein Verschmelzungspolypeptid gerichtet wird, werden zwei unterschiedliche Verschmelzungssysteme verwendet. Spezifische Antigenizität kann gemäß einer Reihe von Verfahren bestimmt werden, einschließlich Western Blot (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 4350), Dot Blot und ELISA, wie nachstehend beschrieben.
In einem Western Blot-Assay wird das zu screenende Produkt, entweder als eine aufgereinigte Präparation oder ein Gesamtextrakt aus E. coli, einer SDS-Page-Elektrophorese unterzogen, wie von Laemmli (Nature (1970) 227: 680) beschrieben. Nach Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran wird das Material weiter mit dem monospezifischen Hyperimmunantiserum inkubiert, das in einem Bereich von Verdünnungen von etwa 1:5 bis etwa 1:5000, vorzugsweise etwa 1:100 bis etwa 1:500 verdünnt wird. Eine spezifische Antigenizität wird gezeigt, sobald eine Bande, die dem Produkt entspricht, eine Reaktivität bei einer jeglichen der Verdünnungen in dem vorstehenden Bereich zeigt.
In einem ELISA-Assay wird das zu screenende Produkt vorzugsweise als das beschichtende Antigen verwendet. Eine aufgereinigte Präparation wird bevorzugt, obwohl ein Gesamtzellextrakt auch verwendet werden kann. Kurz gesagt, werden etwa 100 μl einer Präparation bei etwa 10 μg Protein pro ml in Wells einer 96-Well-Polycarbonat-ELISA-Platte verteilt. Die Platte wird zwei Stunden bei 37°C sodann bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Platte wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS/Tween-Puffer) gewaschen. Die Wells werden mit 250 μl PBS mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) gesättigt, um ein nicht spezifisches Antikörperbinden zu verhindern. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wird die Platte mit PBS/Tween-Puffer gewaschen. Das Antiserum wird seriell in PBS/Tween-Puffer mit 0,5% BSA verdünnt. 100 μl der Verdünnungen werden pro Well zugegeben. Die Platte wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert, gewaschen und gemäß Standardverfahren evaluiert. Zum Beispiel wird ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat zu den Wells gegeben, wenn spezifische Antikörper gegen Kaninchen gerichtet wurden. Eine Inkubation erfolgt 90 Minuten bei 37°C und die Platte wird gewaschen. Die Reaktion wird mit dem geeigneten Substrat entwickelt und die Reaktion wird durch Kolorimetrie (die Absorption wird spektrophotometrisch gemessen) gemessen. Unter den vorstehenden experimentellen Bedingungen wird eine positive Reaktion durch O. D.-Werte gezeigt, die größer sind als diejenigen eines Kontrollserums ohne Immunisierung.
In einem Dot Blot-Assay wird ein aufgereinigtes Produkt bevorzugt, obwohl ein Gesamtzellextrakt auch verwendet werden kann. Kurz gesagt, wird eine Lösung des Produkts bei etwa 100 μg/ml seriell zweifach in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5) verdünnt. 100 μl jeder Verdünnung werden auf eine Nitrocellulosemembran von 0,45 μm aufgetragen, die sich in einer 96-Well-Dot Blot-Vorrichtung (Biorad) befindet. Der Puffer wird durch Anwenden von vermindertem Druck an das System entfernt. Wells werden durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5) gewaschen und die Membran wird luftgetrocknet. Die Membran wird in Blockpuffer (50 mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5), 0,15 M NaCl, 10 g/l Magermilch) gesättigt und mit einer Antiserum-Verdünnung von etwa 1:50 bis etwa 1:5000, vorzugsweise etwa 1:500 inkubiert. Die Reaktion wird gemäß Standardverfahren deutlich gemacht. Zum Beispiel wird ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat zu den Wells gegeben, wenn Kaninchenantikörper verwendet werden. Eine Inkubation erfolgt 90 Minuten bei 37°C und der Blot wird gewaschen. Die Reaktion wird mit dem geeigneten Substrat entwickelt und abgestoppt. Die Reaktion wird visuell durch das Auftreten eines farbigen Punkts, z. B. durch Kolorimetrie, gemessen. Unter den vorstehenden experimentellen Bedingungen wird eine positive Reaktion gezeigt, sobald ein farbiger Punkt mit einer Verdünnung von mindestens etwa 1:5, vorzugsweise mindestens etwa 1:500 assoziiert ist.
Eine therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats kann wie nachstehend beschrieben evaluiert werden. Ein siebter erfindungsgemäßer Aspekt stellt (i) eine Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid zusammen mit einem Verdünner oder Träger umfasst, insbesondere (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids enthält, (iii) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger durch Verabreichen an den Säuger einer immunogen wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids, um eine schützende Immunantwort gegen Chlamydia hervorzurufen, und insbesondere (iv) ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae oder C. pecorum) durch Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptids an ein infiziertes Individuum bereit. Zusätzlich umfasst der siebte erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
Wie hierin verwendet, werden die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen durch herkömmliche Wege, die auf dem Impfstoffgebiet bekannt sind, insbesondere an eine mukosale (z. B. okkulare, intranasale, pulmonale, orale, gastritische, intestinale, rektale, vaginale oder Harnweg-) Oberfläche oder über den parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Weg verabreicht. Die Wahl des Verabreichungsweges hängt von einer Reihe von Parametern ab, wie dem mit dem Polypeptid assoziierten Adjuvans. Falls ein mukosales Adjuvans verwendet wird, ist der intranasale oder orale Weg bevorzugt. Falls eine Lipidformulierung oder eine Aluminiumverbindung verwendet wird, ist der parenterale Weg bevorzugt, wobei der subkutane oder intramuskuläre Weg am meisten bevorzugt ist. Die Wahl hängt auch von der Art des Impfstoffmittels ab. Zum Beispiel wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das mit CTP oder LTB verschmolzen ist, am besten an eine mukosale Oberfläche verabreicht.
Wie hierin verwendet, enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide oder Derivate. Die Zusammensetzung enthält gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches Chlamydia-Antigen oder eine Untereinheit, ein Fragment, Homolog, eine Mutante oder ein Derivat davon.
Für eine Verwendung in einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird ein Polypeptid oder Derivat davon in oder mit Liposomen, vorzugsweise neutralen oder anionischen Liposomen, Mikrosphären, ISCOMS oder virusartigen Partikeln (VLPs) formuliert, um eine Zufuhr zu erleichtern und/oder die Immunantwort zu erhöhen. Diese Verbindungen sind dem Fachmann leicht erhältlich. Vgl. z. B. Liposomes: A Practical Approach, RCP New Ed, IRL Press (1990).
Adjuvanzien, die von Liposomen und dergleichen verschieden sind, werden auch verwendet und sind bekannt. Adjuvanzien können vor einer schnellen Verteilung durch Absondern davon in ein lokales Depot schützen oder sie können Substanzen enthalten, die den Wirt stimulieren, Faktoren zu sekretieren, die für Makrophagen und andere Komponenten des Immunsystems chemotaktisch sind. Eine geeignete Selektion kann geeigneterweise durch den Fachmann z. B. aus denjenigen, die nachstehend (unter dem elften erfindungsgemäßen Aspekt) beschrieben sind, erfolgen.
Eine Behandlung wird in einer einzigen Dosis oder wiederholt, wie benötigt, bei Intervallen erfolgen, wie es leicht durch den Fachmann bestimmt werden kann. Zum Beispiel folgen auf eine Grundimmunisierungsdosis ("priming dose") drei Boosterdosen bei wöchentlichen oder monatlichen Intervallen. Eine geeignete Dosis hängt von zahlreichen Parametern ab, einschließlich des Empfängers (z. B. Erwachsener oder Säugling) des spezifischen Impfstoffantigens, des Wegs und der Häufigkeit einer Verabreichung, des Vorhandenseins/Fehlens oder Typs des Adjuvans und der gewünschten Wirkung (z. B. Schutz und/oder Behandlung), wie es durch den Fachmann bestimmt werden kann. Allgemein wird ein erfindungsgemäßes Impfstoffantigen durch einen mukosalen Weg in einer Menge von etwa 10 μg bis etwa 500 mg, vorzugsweise etwa 1 mg bis etwa 200 mg verabreicht. Für den parenteralen Verabreichungsweg übersteigt die Dosis gewöhnlich nicht etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 100 μg.
Wenn als Impfstoffmittel verwendet, können die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide sequenziell als Teil eines Vielschrittimmunisierungsverfahrens verwendet werden. Zum Beispiel wird ein Säuger anfangs mit einem erfindungsgemäßen Impfstoffvektor wie einem Pockenvirus, z. B. über den parenteralen Weg, grundimmunisiert ("primed") und sodann zweimal mit dem Polypeptid, das durch den Impfstoffvektor kodiert wird, z. B. über den mukosalen Weg, verstärkt ("boosted"). In einem weiteren Beispiel werden Liposomen, die mit einem erfindungsgemäßen Poly peptid oder Derivat assoziiert sind, auch zum Grundimmunisieren verwendet, wobei ein Verstärken mukosal unter Verwendung eines löslichen erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats zusammen mit einem mukosalen Adjuvans (z. B. LT) durchgeführt wird.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptidderivat wird auch gemäß dem siebten Aspekt als ein diagnostisches Reagenz zum Nachweisen des Vorhandenseins von Anti-Chlamydia-Antikörpern, z. B. in einer Blutprobe, verwendet. Solche Polypeptide weisen eine Länge von etwa 5 bis etwa 80, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 50 Aminosäuren auf. Sie sind entweder markiert oder nicht markiert, abhängig von dem diagnostischen Verfahren. Diagnostische Verfahren, die ein solches Reagenz beinhalten, sind nachstehend beschrieben.
Nach Expression eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls wird ein Polypeptid oder Polypeptidderivat produziert und unter Verwendung bekannter Labortechniken aufgereinigt. Wie vorstehend beschrieben, kann das Polypeptid oder Polypeptidderivat als ein Verschmelzungsprotein produziert werden, das einen verschmolzenen Schwanz enthält, der eine Aufreinigung erleichtert. Das Verschmelzungsprodukt wird verwendet, um einen kleinen Säuger, z. B. eine Maus oder ein Kaninchen zu immunisieren, um Antikörper gegen das Polypeptid oder Polypeptidderivat bereitzustellen (monospezifische Antikörper). Dementsprechend stellt ein achter erfindungsgemäßer Aspekt einen monospezifischen Antikörper bereit, der an ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Polypeptidderivat bindet.
Unter einem "monospezifischen Antikörper" wird ein Antikörper verstanden, der fähig ist, mit einem einzigartigen natürlich vorkommenden Chlamydia-Polypeptid zu reagieren. Ein erfindungsgemäßer Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal. Monospezifische Antikörper können rekombinant, z. B. chimär (z. B. durch einen variablen Bereich mit Mausursprung begründet, der mit einem menschlichen konstanten Bereich assoziiert ist), humanisiert (ein menschliches immunglobulinkonstantes Rückgrat zusammen mit einem hypervariablen Bereich eines tierischen, z. B. murinen, Ursprungs) und/oder einzelkettig sein. Sowohl polyklonale als auch monospezifische Antikörper können auch in der Form von Immunglobulinfragmenten, z. B. F(ab)'₂- oder Fab-Fragmenten, vorliegen. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind von einem jeglichen Isotyp, z. B. IgG oder IgA, und polyklonale Antikörper sind von einem einzigen Isotyp oder ein Gemisch von Isotypen.
Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide, Homologe oder Fragmente werden durch Immunisieren eines Säugers mit einer Zusammensetzung erzeugt, die das Polypepid, Homolog oder Fragment umfasst. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Verfahren zum Erzeugen von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sind bekannt. Für eine Übersicht vergleiche "Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. E. Harlow und D. Lane (1988), und D. E. Yelton et al., 1981. Ann. Rev. Biochem. 50: 657-680. Für monoklonale Antikörper vgl. Kohler & Milstein (1975) Nature 256: 495–497.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Polypeptidderivat gerichtet werden, werden produziert und unter Verwendung von immunologischen Standardassays, z. B. Western Blot-Analyse, Dot Blot-Assay oder ELISA (vgl. z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY) identifiziert. Die Antikörper werden in diagnostischen Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Chlamydia-Antigens in einer Probe wie einer biologischen Probe verwendet. Die Antikörper werden auch in Affinitätschromatographie zum Aufreinigen eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polypeptidderivats verwendet. Wie weiter nachstehend beschrieben, können solche Antikörper in prophylaktischen und therapeutischen passiven Immunisierungsverfahren verwendet werden.
Dementsprechend stellt ein neunter erfindungsgemäßer Aspekt (i) ein Reagenz zum Nachweisen des Vorhandenseins von Chlamydia in einer biologischen Probe, das einen erfindungsgemäßen Antikörper, ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Polypeptidderivat enthält, und (ii) ein diagnostisches Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von Chlamydia in einer biologischen Probe durch In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem erfindungsgemäßen Antikörper, einem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Polypeptidderivat, so dass sich ein Immunkomplex bildet, und Nachweisen eines solchen Komplexes, um das Vorhandensein von Chlamydia in der Probe oder dem Organismus, von dem sich die Probe ableitet, anzuzeigen, bereit.
Der Fachmann wird leicht verstehen, dass der Immunkomplex zwischen einer Komponente der Probe und dem Antikörper, Polypeptid oder Polypeptidderivat, was auch immer verwendet wird, ausgebildet wird und dass ein jegliches nicht gebundenes Material vor einem Nachweisen des Komplexes entfernt wird. Es wird verstanden, dass ein Polypeptidreagenz zum Nachweisen des Vorhandenseins von Anti- Chlamydia-Antikörpern in einer Probe, z. B. einer Blutprobe, verwendbar ist, während ein erfindungsgemäßer Antikörper zum Screenen einer Probe, wie einem gastritischen Extrakt oder einer Biopsie, auf das Vorhandensein von Chlamydia-Polypeptiden verwendet wird.
Für diagnostische Anwendungen liegt das Reagenz (d. h. der erfindungsgemäße Antikörper, das erfindungsgemäße Polypeptid oder Polypeptidderivat) entweder in einem freien Zustand vor oder ist an einem Festträger wie einem Röhrchen, einem Kügelchen oder einem anderen herkömmlichen Träger, der auf dem Gebiet verwendet wird, immobilisiert. Eine Immobilisierung wird unter Verwendung von direkten oder indirekten Mitteln erreicht. Direkte Mittel beinhalten passive Adsorption (nicht kovalentes Binden) oder kovalentes Binden zwischen dem Träger und dem Reagenz. Unter einem "indirekten Mittel" wird verstanden, dass eine Anti-Reagenz-Verbindung, die mit einem Reagenz wechselwirkt, zuerst an den Festträger angebunden wird. Zum Beispiel kann, falls ein Polypeptidreagenz verwendet wird, ein Antikörper, der daran bindet, als ein Anti-Reagenz dienen, mit der Maßgabe, dass er an ein Epitop bindet, das nicht bei der Erkennung von Antikörpern in biologischen Proben beteiligt ist. Indirekte Mittel können auch ein Ligand-Rezeptor-System verwenden, zum Beispiel bei dem ein Molekül wie ein Vitamin auf das Polypeptidreagenz gepfropft ist und der entsprechende Rezeptor an der Festphase immobilisiert ist. Dies wird durch das Biotin-Streptavidin-System veranschaulicht. Alternativ dazu wird ein Peptidschwanz chemisch oder durch genetisches Manipulieren an das Reagenz angefügt und das gepfropfte oder verschmolzene Produkt durch passive Adsorption oder kovalente Bindung an den Peptidschwanz immobilisiert.
Solche diagnostischen Mittel können in einem Kit enthalten sein, der auch Anweisungen für eine Verwendung umfasst. Das Reagenz ist mit einem Nachweismittel markiert, das den Nachweis des Reagenzes ermöglicht, wenn es an sein Ziel gebunden ist. Das Nachweismittel kann ein fluoreszierendes Mittel wie ein Fluoresceinisocyanat oder Fluoresceinisothiocyanat oder ein Enzym wie Meerrettichperoxidase oder Luciferase oder alkalische Phosphatase oder ein radioaktives Element wie ¹²⁵I oder ⁵¹Cr sein.
Dementsprechend stellt ein zehnter erfindungsgemäßer Aspekt ein Verfahren zum Aufreinigen aus einer biologischen Probe eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder Polypeptidderivats bereit, das ein Durchführen einer auf Antikörper basierenden Af finitätschromatographie mit der biologischen Probe beinhaltet, wobei der Antikörper ein monospezifischer erfindungsgemäßer Antikörper ist.
Für eine Verwendung in einem erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahren ist der Antikörper entweder polyklonal oder monospezifisch und vorzugsweise ist er von dem IgG-Typ. Aufgereinigte IgGs werden aus einem Antiserum unter Verwendung von Standardverfahren (vgl. z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY) präpariert. Herkömmliche Chromatographieträger wie auch Standardverfahren zum Pfropfen von Antikörpern sind in z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, D. Lane, E. Harlow, Hrsg. (1998), beschrieben und nachstehend angegeben.
Kurz gesagt, wird eine biologische Probe, wie ein Extrakt von C. pneumoniae, vorzugsweise in einer Pufferlösung, auf ein chromatographisches Material, das vorzugsweise mit dem Puffer äquilibriert ist, der zum Verdünnen der biologischen Probe verwendet wurde, aufgetragen, so dass dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder Polypeptidderivat (d. h. dem Antigen) ermöglicht wird, auf das Material zu adsorbieren. Das chromatographische Material, wie ein Gel oder ein Harz, das an einen erfindungsgemäßen Antikörper gekoppelt ist, liegt entweder in einer chargenartigen Form oder als eine Säule vor. Die nicht gebundenen Komponenten werden herausgewaschen und das Antigen wird sodann mit einem geeigneten Elutionspuffer, wie einem Glycinpuffer, oder einem Puffer mit einem chaotropen Mittel, z. B. Guanidin-HCl, oder mit Hochsalzkonzentration (z. B. 3 M MgCl₂) eluiert. Eluierte Fraktionen werden wieder gewonnen und das Vorhandensein des Antigens wird nachgewiesen, z. B. durch Messen der Absorption bei 280 nm.
Ein elfter erfindungsgemäßer Aspekt stellt (i) eine Zusammensetzung, die einen monospezifischen erfindungsgemäßen Antikörper zusammen mit einem Verdünner oder Träger umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines monospezifischen erfindungsgemäßen Antikörpers umfasst, und (iii) ein Verfahren zum Behandeln oder Verhindern einer Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae oder C. pecorum) durch Verabreichen einer therapeutischen oder prophylaktischen Menge eines erfindungsgemäßen monospezifischen Antikörpers an ein infiziertes Individuum bereit. Zusätzlich umfasst der elfte erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemäßen monospezifischen Antikörpers bei der Herstel lung eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern einer Chlamydia-Infektion.
Der monospezifische Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, vorzugsweise von dem IgA-Isotyp (vorherrschend). Bei einer passiven Immunisierung wird der Antikörper an eine mukosale Oberfläche eines Säugers, z. B. die gastritische Mukosa, z. B. oral oder intragastrikal, vorteilhafterweise in Gegenwart eines Bicarbonatpuffers, verabreicht. Alternativ erfolgt eine systemische Verabreichung, die keinen Bicarbonatpuffer benötigt. Ein erfindungsgemäßer monospezifischer Antikörper wird als eine einzige aktive Komponente oder als ein Gemisch mit mindestens einem monospezifischen Antikörper, der für ein unterschiedliches Chlamydia-Polypeptid spezifisch ist, verabreicht. Die Menge an Antikörper und der spezifische verwendete Dosierungsplan werden leicht durch den Fachmann bestimmt. Zum Beispiel sind eine tägliche Verabreichung von etwa 100 bis 1 000 mg an Antikörpern über eine Woche oder drei Dosen pro Tag an etwa 100 bis 1 000 mg an Antikörpern über zwei oder drei Tage wirksame Dosierungsplane für die meisten Zwecke.
Die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit wird unter Verwendung von Standardverfahren, z. B. durch Messen einer Induktion einer mukosalen Immunantwort oder Induktion einer schützenden und/oder therapeutischen Immunität, unter Verwendung von z. B. dem C. pneumoniae-Mausmodell evaluiert. Der Fachmann wird leicht anerkennen, dass der Stamm von C. pneumoniae des Modells durch einen anderen Chlamydia-Stamm ersetzt werden kann. Zum Beispiel wird die Wirksamkeit von DNA-Molekülen und Polypeptiden aus C. pneumoniae vorzugsweise in einem Mausmodell evaluiert, das einen Stamm von C. pneumoniae verwendet. Ein Schutz wird durch Vergleichen des Grads der Chlamydia-Infektion zu dem einer Kontrollgruppe bestimmt. Ein Schutz wird gezeigt, wenn eine Infektion im Vergleich zu der Kontrollgruppe vermindert ist. Eine solche Evaluierung erfolgt für erfindungsgemäße Polynukleotide, Impfstoffvektoren, Polypeptide und Derivate davon als auch Antikörper.
Adjuvanzien, die in einer jeglichen der vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen verwendbar sind, sind wie folgt.
Adjuvanzien für eine parenterale Verabreichung beinhalten Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxyphos phat. Das Antigen wird mit der Aluminiumverbindung gemäß Standardprotokollen präzipitiert oder darauf adsorbiert. Andere Adjuvanzien, wie RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT) werden bei einer parenteralen Verabreichung verwendet.
Adjuvanzien für eine mukosale Verabreichung beinhalten bakterielle Toxine, z. B. das Choleratoxin (CT), das hitzelabile Toxin (LT) von E. coli, das Toxin A von Clostridium difficile und das Pertussis-Toxin (PT) oder Kombinationen, Untereinheiten, Toxoide oder Mutanten davon, wie eine aufgereinigte Präparation von nativer Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Fragmente, Homologe, Derivate und Verschmelzungen an ein jegliches dieser Toxine sind auch geeignet, mit der Maßgabe, dass sie eine Adjuvans-Aktivität beibehalten. Vorzugsweise wird eine Mutante mit einer verminderten Toxizität verwendet. Geeignete Mutanten sind z. B. in der WO 95/17211 (Arg-7-Lys-CT-Mutante), WO 96/06627 (Arg-192-Gly-LT-Mutante) und WO 95/34323 (Arg-9-Lys- und Glu-129-Gly-PT-Mutante) beschrieben. Zusätzliche LT-Mutanten, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, beinhalten z. B. Ser-63-Lys-, Ala-69-Gly-, Glu-110-Asp- und Glu-112-Asp-Mutanten. Andere Adjuvanzien wie ein bakterielles Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) von z. B. E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium oder Shigella flexneri, Saponine oder Polylactidglycolid(PLGA)-Mikrosphären werden auch bei einer mukosalen Verabreichung verwendet.
Adjuvanzien, die für sowohl mukosale als auch parenterale Verabreichungen verwendbar sind, beinhalten Polyphosphazene ( WO 95/02415 ), DC-Chol (3-b-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin, US-PS 5,283,185 und WO 96/14831 ) und QS-21 ( WO 88/09336 ).
Eine jegliche erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, ein erfindungsgemäßes Polypeptidderivat oder einen erfindungsgemäßen Antikörper enthält, wird in herkömmlicher Art und Weise hergestellt. Insbesondere wird sie mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünner oder Träger, z. B. Wasser oder einer Salzlösung wie Phosphat-gepufferter Salzlösung, formuliert. Allgemein wird ein Verdünner oder Träger auf der Grundlage der Art und des Weges einer Verabreichung und pharmazeutischer Standardpraxis selektiert. Geeignete pharmazeutische Träger oder Verdünner als auch pharmazeutische Bedürfnisse für ihre Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, einem Standardbezugstext in diesem Gebiet, und in der USP/NF beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch Verfahren eingeschlossen, bei denen eine Chlamydia-Infektion durch orale Verabreichung eines erfindungsgemäßen Chlamydia-Polypeptids und eines mukosalen Adjuvans zusammen mit einem Antibiotikum, einem Antiacidum, Sucralfat oder einer Kombination davon behandelt wird. Beispiele solcher Verbindungen, die mit dem Impfstoffantigen und dem Adjuvans verabreicht werden können, sind Antibiotika, einschließlich z. B. Makroliden, Tetracyclinen und Derivaten davon (spezifische Beispiele von Antibiotika, die verwendet werden können, beinhalten Azithromycin oder Doxicyclin oder Immunmodulatoren wie Cytokine oder Steroide). Zusätzlich werden Verbindungen verwendet, die mehr als eine der vorstehend aufgeführten Komponenten enthalten, die aneinander gekoppelt sind. Erfindungsgemäß sind auch Zusammensetzungen zum Durchführen dieser Verfahren eingeschlossen, d. h. Zusammensetzungen mit einem erfindungsgemäßen Chlamydia-Antigen (oder Antigenen), einem Adjuvans und einem oder mehreren der vorstehend aufgeführten Verbindungen in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner.
Es wurde kürzlich gezeigt, dass das cysteinreiche 60 kDa-Membranprotein eine Sequenz enthält, die kreuzreaktiv mit dem alpha-Myosin-schwere Kette-Epitop M7A-alpha aus Maus ist, einem Epitop, das im Menschen konserviert ist (Bachmaier et al., Science (1999) 283: 1335). Es wird vorgeschlagen, dass diese Kreuzreaktivität zur Entwicklung einer kardiovaskulären Erkrankung beiträgt, und daher kann es vorteilhaft sein, dieses Epitop und jegliche andere Epitope, die mit menschlichen Antigenen kreuzreagieren, von dem Protein zu entfernen, falls es als ein Impfstoff verwendet wird. Demzufolge beinhaltet eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform die Modifikation der kodierenden Sequenz, z. B. durch Deletion oder Substitution der Nukleotide, die für das Epitop kodieren, von Polynukleotiden, die das Protein kodieren, um die Wirksamkeit und Sicherheit des Proteins als Impfstoff zu verbessern. Ein ähnlicher Ansatz kann für ein schützendes Antigen geeignet sein, von dem festgestellt wurde, dass es nicht gewünschte Homologien oder Kreuzreaktivitäten mit menschlichen Antigenen aufweist.
Mengen der vorstehend aufgeführten Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, werden leicht durch den Fachmann bestimmt. Behandlungs-/Immunisierungspläne sind auch bekannt und werden durch den Fachmann leicht entwickelt. Zum Beispiel können die Nichtimpfstoffkomponenten an den Tagen 1–14 verabreicht werden und das Impfstoffantigen zusammen mit dem Adjuvans kann an den Tagen 7, 14, 21 und 28 verabreicht werden.
BEISPIELE
Die vorstehende Beschreibung beschreibt im Allgemeinen die Erfindung. Ein vollständigeres Verstehen kann durch Bezug auf die nachstehenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele werden lediglich für Veranschaulichungszwecke beschrieben und sollen den Umfang der Erfindung nicht begrenzen. Änderungen in der Form und Substitution von Äquivalenten sind vorgesehen, wie Umstände es nahe legen oder zweckdienlich machen können. Obwohl spezifische Begriffe hierin verwendet wurden, sollen solche Begriffe beschreibend sein und nicht für Zwecke einer Begrenzung dienen.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Plasmid-Vektors pCAI764 mit dem ATP/ADP-Translokase-Gen.
Das ATP/ADP-Translokase-Gen wurde aus genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers (5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGACAAAAACCGAAGAAAAACC 3') (SEQ ID Nr: 3) und eines 3'-Primers (5' GCGCCGGATCCCTGAAGAAGCAGGAGCTG 3') (SEQ ID Nr: 4) amplifiziert. Der 5'-Primer enthält eine Not I-Restriktionsstelle, eine Ribosombindungsstelle, ein Initiationscodon und eine Sequenz am 5'-Ende der Sequenz, die für die ATP/ADP-Translokase kodiert. Der 3'-Primer beinhaltet die Sequenz, die für die C-terminale Sequenz der ATP/ADP-Translokase kodiert, und eine Bam HI-Restriktionsstelle. Das Stopp-Codon wurde ausgeschlossen und ein zusätzliches Nukleotid wurde inseriert, um eine In-Frame-Verschmelzung mit dem Histidin-Tag zu erhalten.
Nach Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des PCR-Aufreinigungskits QIAquick^TM (Qiagen) aufgereinigt und sodann mit Not I und Bam HI verdaut und in den eukaryotischen Expressionsvektor pCA-Myc-His, der in Beispiel 2 (3) beschrieben ist, kloniert, wobei die Transkription unter der Kontrolle des menschlichen CMV-Promotors steht.
Beispiel 2:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung des eukaryotischen Expressionsvektors pCA/Myc-His.
Das Plasmid pcDNA3.1(–)Myc-His C (Invitrogen) wurde mit Spe I und Bam HI restriktiert, um den CMV-Promotor zu entfernen, und das verbleibende Vektorfragment wurde isoliert. Der CMV-Promotor und Intron A aus dem Plasmid VR-1012 (Vical) wurden auf einem Spe I/Bam HI-Fragment isoliert. Die Fragmente wurden zusammen ligiert, um das Plasmid pCA/Myc-His zu erzeugen. Das Not I/Bam HI-restriktierte PCR-Fragment mit dem ATP/ADP-Translokase-Gen wurde in das Not I- und Bam HI-restriktierte Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um das Plasmid pCAI764 (3) zu erzeugen.
Das sich ergebende Plasmid, pCAI764, wurde durch Elektroporation in E. coli XL-1 blue (Stratagene) transferiert, die in LB-Medium mit 50 μg/ml Carbenicillin wachsen gelassen wurden. Das Plasmid wurde durch Endo Free Plasmid Giga Kit^TM (Qiagen), einem DNA-Aufreinigungssystem großen Maßstabs, isoliert. Die DNA-Konzentration wurde durch Absorption bei 260 nm bestimmt und das Plasmid wurde nach Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit Molekulargewichtsstandards verifiziert. Die 5'- und 3'-Enden des Gens wurden durch Sequenzierung unter Verwendung von einem LiCor-DNA-Sequenziergerät Modell 4000 L und IRD-800-markierten Primern verifiziert.
Beispiel 3:
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunisierung von Mäusen, um einen Schutz gegen eine intranasale Challenge von C. pneumoniae zu erreichen.
Es wurde früher gezeigt (Yang et al., 1993), dass Mäuse gegenüber einer intranasalen Infektion mit unterschiedlichen Isolaten von C. pneumoniae empfänglich sind. Der Stamm AR-39 (Grayston, 1989) wurde in Balb/c-Mäusen als ein Challenge-Infektionsmodell verwendet, um die Kapazität, eine schützende Antwort gegen eine subletale Lungeninfektion mit C. pneumoniae hervorzurufen, von Chlamydia-Genprodukten, die als nackte DNA zugeführt werden, zu untersuchen. Eine schützende Immunität wird als eine erhöhte Clearance von pulmonaler Infektion definiert.
Gruppen von 7- bis 9-Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen (8 bis 10 pro Gruppe) wurden intramuskulär (i. m.) zusammen mit intranasal (i. n.) mit Plasmid-DNA, die die kodierende Sequenz der ATP/ADP-Translokase von C. pneumoniae enthält, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, immunisiert. Salzlösung oder der Plasmid-Vektor, dem ein inseriertes Chlamydien-Gen fehlte, wurden Gruppen von Kontrolltieren gegeben.
Für eine i. m.-Immunisierung wurden alternierende linke und rechte Quadrizeps mit 100 μg an DNA in 50 μl PBS an drei Anlässen bei 0, 3 und 6 Wochen injiziert. Für eine i. n.-Immunisierung aspirierten anästhesierte Mäuse 50 μl an PBS mit 50 μg DNA an drei Anlässen bei 0, 3 und 6 Wochen. Bei der Woche 8 wurden immunisierte Mäuse i. n. mit 5 × 10⁵ IFU an C. pneumoniae, Stamm AR39, in 100 μl SPG-Puffer angeimpft, um deren Fähigkeit, das Wachstum einer subletalen Challenge mit C. pneumoniae zu begrenzen, zu testen.
Lungen wurden aus Mäusen bei den Tagen 5 und 9 nach der Challenge entnommen und sofort in SPG-Puffer (7,5% Sucrose, 5 mM Glutamat, 12,5 mM Phosphat, pH-Wert von 7,5) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei –70°C bis zu einem Test eingefroren gelagert. Verdünnungen des Homogenats wurden auf das Vorhandensein von infektiösen Chlamydien durch Animpfen auf Monoschichten von empfänglichen Zellen untersucht. Das Inokulum wurde auf die Zellen bei 3000 UpM für eine Stunde zentrifugiert, sodann wurden die Zellen 3 Tage bei 35°C in Gegenwart von 1 μg/ml Cycloheximid inkubiert. Nach Inkubation wurden die Monoschichten mit Formalin und Methanol fixiert, sodann auf das Vorhandensein von Chlamydien-Einschlüssen unter Verwendung von konvaleszenten Seren aus Kaninchen, die mit C. pneumoniae infiziert worden waren, und metallverbessertem DAB als ein Peroxidase-Substrat mittels Immunperoxidase angefärbt.

4 und Tabelle 1 zeigen, dass Mäuse, die i. n. und i. m. mit pCAI764 immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter von weniger als 2700 in 4 von 4 Fällen bei Tag 5 und weniger als 3100 in 4 von 4 Fällen bei Tag 9 aufwiesen, während der Wertebereich für Kontrollmäuse, die mit Salzlösung scheinimmunisiert worden waren, 6600 bis 19000 IFU/Lunge (Mittel 12120) bei Tag 5 und 2000 bis 19300 IFU/Lunge (Mittel 9500) bei Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung war per se für die beobachtete schützende Wirkung nicht verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt, pCAI426, nicht fähig war, zu schützen, wobei Lungentiter in immunisierten Mäusen ähnlich zu denjenigen waren, die für Kontrollmäuse erhalten wurden, die mit Salzlösung immunisiert worden waren. Das Konstrukt pCAI426 ist identisch zu pCAI764, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für die ATP/ADP-Translokase kodiert, durch eine Nukleotidsequenz von C. pneumoniae ersetzt wurde, die für ein ATP-bindendes Aminosäuretransportprotein kodiert. Tabelle 1

MAUS	BAKTERIENLAST (EINSCHLUSS FORMENDE EINHEITEN PRO LUNGE) IN DEN LUNGEN VON BALG/C-MÄUSEN, DIE MIT VERSCHIEDENEN DNA-IMMUNISIERUNGSKONSTRUKTEN IMMUNISIERT WURDEN
	IMMUNISIERENDES KONSTRUKT
	Salzlösung	Salzlösung	pCAI426	pCAI426	pCAI764	pCAI764
	Tag 5	Tag 9	Tag 5	Tag 9	Tag 5	Tag 9
1	13700	13400	10900	15000	1200	3000
2	19000	19300	9400	900	2300	2700
3	13300	10400	2900	9600	1200	2200
4	6600	2000	3500	4400	2600	200
5	8000	2400

MITTEL	12120	9500	6675	7475	1825	2025
SD	4966.59	7394.59	4066.428	6159.75	732.01	1260.62

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäure-Hybridmolekül, das aufweist: eine erste Nucleinsäure, die für ein erstes Polypeptid codiert, das mit einer für ein zweites Polypeptid codierenden Nucleinsäure Inframe verschmolzen ist, wobei das erste Polypeptid aus einem von den folgenden ausgewählt ist: (a) SEQ ID Nr: 2; (b) einem immunogenen Fragment, das mindestens 20 konsekutive Aminosäuren aus einem Polypeptid von (a) aufweist; und (c) einem Polypeptid von (a) oder (b), das ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (a) oder (b) identisch ist; und wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist oder Adjuvans-Aktivität hat.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das zweite Polypeptid Adjuvans-Aktivität hat.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das mit einer oder mehr Expressionskontrollsequenzen wirksam gekoppelt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Verschmelzungsprotein, das aufweist: eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus einem von: (a) SEQ ID Nr: 2; (b) einem immunogenen Fragment, das mindestens 20 konsekutive Aminosäuren aus einem Polypeptid von (a) aufweist; und (c) der Aminosäuresequenz von (a) oder (b), die ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (a) oder (b) identisch ist; und ein zweites Polypeptid, das ein heterologes Signalpeptid ist oder Adjuvans-Aktivität hat.
Verschmelzungsprotein nach Anspruch 6, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Verschmelzungsprotein nach Anspruch 6, wobei das zweite Polypeptid Adjuvans-Aktivität hat.
Verfahren zum Erzeugen des Verschmelzungsproteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8, das den Schritt aufweist: Züchten eines einzelligen Wirts, der mit einer für das Verschmelzungsprotein codierenden Nucleinsäure transformiert ist.
Verfahren zum Erkennen des Verschmelzungsproteins nach einem der Ansprüche 6 bis 8, das eine Immunantwort induziert, die wirksam ist, um eine Chlamydia-Infektion in einem Säuger, der vorher mit Polypeptid immunisiert worden ist, zu verhindern oder deren Schwere zu mildern, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (a) Immunisieren einer Maus mit dem Verschmelzungsprotein; und (b) Impfen der immunisierten Maus mit Chlamydia; wobei das Polypeptid oder Verschmelzungsprotein, das die Chlamydia-Infektion in der immunisierten Maus verhindert oder deren Schwere mildert, im Vergleich mit einer nichtimmunisierten Kontrollmaus erkannt wird.
Expressionsplasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es Plasmid pCAI764, wie in 3 gezeigt, ist und daß es folgendes aufweist: (a) den Cytomegaloviruspromotor (pCMV); (b) die Intron-A-Sequenz; (c) die codierende Sequenz des Polynucleotidmoleküls von SEQ ID Nr: 1, die für die Polypeptid-bezeichnete ATP/ADP-Translokase codiert; (d) die Myc-His-Sequenz; (e) die BGH-Poly-A-Sequenz; (f) das Neomycin-Resistenzgen; und (g) das Ampicillin-Resistenzgen; wie in 3 gezeigt ist.
Das isolierte Nucleinsäuremolekül von SEQ ID Nr: 3 oder 4.
Impfstoff, der folgendes aufweist: einen physiologisch akzeptablen Verdünner oder Träger, der zur Verwendung in einem Impfstoff geeignet ist, und eines von den folgenden: (a) eine erste Nucleinsäure, die für ein erstes Polypeptid codiert; (b) das erste Polypeptid; (c) ein Verschmelzungsprotein, welches das erste Polypeptid und ein zweites Polypeptid aufweist; oder (d) eine Hybrid-Nucleinsäure, welche die erste Nucleinsäure aufweist, die mit einer für das zweite Polypeptid codierenden Nucleinsäure Inframe verschmolzen ist; wobei das erste Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) einem Polypeptid, das von SEQ ID Nr: 1 codiert wird; (ii) einem Polypeptid, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die mindestens 38 konsekutive Nucleotide von SEQ ID Nr: 1 aufweist; (iii) einem Polypeptid, dessen Sequenz in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist; (iv) einem Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit SEQ ID Nr: 2 identisch ist; (v) einem immunogenen Fragment, das mindestens 12 konsekutive Aminosäuren aus SEQ ID Nr: 2 aufweist; und (vi) einem Polypeptid gemäß der Definition in (i) bis (iv) oder einem immunogenen Fragment gemäß der Definition in (v), das ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid oder Fragment in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (i) bis (iv) oder dem entsprechenden Fragment von (v) identisch ist; und wobei die erste Nucleinsäure fähig ist, exprimiert zu werden.
Impfstoff nach Anspruch 13, wobei der Impfstoff die erste Nucleinsäure und einen Impfstoffvektor aufweist und wobei die erste Nucleinsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) SEQ ID Nr: 1; (ii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, das von SEQ ID Nr: 1 codiert wird; (iii) einer Nucleinsäuresequenz, die mindestens 38 konsekutive Nucleotide aus jeder von den Nucleinsäuresequenzen von (i) und (ii) aufweist; (iv) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, das in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem Polypeptid identisch ist, das von SEQ ID Nr: 1 codiert wird; (v) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist; (vi) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein immunogenes Fragment codiert, das mindestens 12 konsekutive Aminosäuren aus SEQ ID Nr: 2 aufweist; und (vii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid gemäß der Definition in (ii) bis (v) oder ein immunogenes Fragment gemäß der Definition in (vi) codiert, das ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid oder Fragment in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (ii) bis (v) oder dem entsprechenden Fragment von (vi) identisch ist.
Impfstoff nach Anspruch 13, wobei der Impfstoff die Hybrid-Nucleinsäure und einen Impfstoffvektor aufweist und wobei die Hybrid-Nucleinsäure eine erste Nucleinsäure aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) SEQ ID Nr: 1; (ii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, das von SEQ ID Nr: 1 codiert wird; (iii) einer Nucleinsäuresequenz, die mindestens 38 konsekutive Nucleotide aus einer von den Nucleinsäuresequenzen von (i) und (ii) aufweist; (iv) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, das in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem von SEQ ID Nr: 1 codierten Polypeptid identisch ist; (v) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid codiert, dessen Sequenz in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist; (vi) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein immunogenes Fragment codiert, das mindestens 12 konsekutive Aminosäuren aus SEQ ID Nr: 2 aufweist; und (vii) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid gemäß der Definition in (ii) bis (v) oder ein immunogenes Fragment gemäß der Definition in (vi) codiert, das ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid oder Fragment in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (ii) bis (v) oder dem entsprechenden Fragment von (vi) identisch ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das zweite Polypeptid Adjuvans-Aktivität hat.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die erste Nucleinsäure mit einer oder mehr Expressionskontrollsequenzeⁿ wirksam gekoppelt ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die erste Nucleinsäure als ein Polypeptid exprimiert wird und wobei der Impfstoff eine zweite Nucleinsäure aufweist, die für ein zusätzliches Polypeptid codiert, das die Immunantwort auf das von der ersten Nucleinsäure exprimierte Polypeptid verstärkt.
Impfstoff nach Anspruch 19, wobei die zweite Nucleinsäure für ein zusätzliches Chlamydia-Polypeptid codiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 20 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Impfstoff nach Anspruch 13, wobei der Impfstoff das erste Polypeptid aufweist.
Impfstoff nach Anspruch 13, wobei der Impfstoff das Verschmelzungsprotein aufweist.
Impfstoff nach Anspruch 23, wobei das zweite Polypeptid ein heterologes Signalpeptid ist.
Impfstoff nach Anspruch 23, wobei das zweite Polypeptid Adjuvans-Aktivität hat.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 22 bis 25, der ferner ein zusätzliches Polypeptid aufweist, das die Immunantwort auf das erste Polypeptid verstärkt.
Impfstoff nach Anspruch 26, wobei das zusätzliche Polypeptid ein Chlamydia-Polypeptid aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Impfstoff nach einem der Ansprüche 22 bis 27 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Bei der Herstellung eines Medikaments zum Verhindern oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion, Verwendung von einem von: (a) einer ersten Nucleinsäure, die für ein erstes Polypeptid codiert; (b) dem ersten Polypeptid; (c) einem Verschmelzungsprotein, welches das erste Polypeptid und ein zweites Polypeptid aufweist; oder (d) einer Hybrid-Nucleinsäure, welche die erste Nucleinsäure aufweist, die mit einer für das zweite Polypeptid codierenden Nucleinsäure Inframe verschmolzen ist; wobei das erste Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: (i) einem Polypeptid, das von SEQ ID Nr: 1 codiert wird; (ii) einem Polypeptid, das von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, die mindestens 38 konsekutive Nucleotide aus SEQ ID Nr: 1 aufweist; (iii) einem Polypeptid, dessen Sequenz in SEQ ID Nr: 2 angegeben ist; (iv) einem Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% identisch mit SEQ ID Nr: 2 ist; (v) einem immunogenen Fragment, das mindestens 12 konsekutive Aminosäuren aus SEQ ID Nr: 2 aufweist; und (vi) einem Polypeptid gemäß der Definition in (i) bis (iv) oder einem immunogenen Fragment gemäß der Definition in (v), das ohne Immunogenitätsverlust modifiziert worden ist, wobei das modifizierte Polypeptid oder Fragment in der Aminosäuresequenz zu mindestens 75% mit dem entsprechenden Polypeptid von (i) bis (iv) oder dem entsprechenden Fragment von (v) identisch ist.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff das Expressionsplasmid pCAI764 aufweist, wie in 3 gezeigt ist, das folgendes aufweist: (a) den Cytomegalovirus-Promotor (pCMV); (b) die Intron-A-Sequenz; (c) die codierende Sequenz des Polynucleotidmoleküls von SEQ ID Nr: 1, die für die Polypeptid-bezeichnete ATP/ADP-Translokase codiert; (d) die Myc-His-Sequenz; (e) die BGH-Poly-A-sequenz; (f) das Neomycin-Resistenzgen; und (g) das Ampicillin-Resistenzgen; wie in 3 gezeigt ist.