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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Impfstoffe, die das Chlamydia-OMP(Protein der äußeren Membran)-Antigen
umfassen, und entsprechende DNA-Moleküle, die zum Verhindern und
Behandeln einer Chlamydia-Infektion in Säugern, wie Menschen, verwendet
werden können.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Chlamydien
sind Prokaryoten. Sie zeigen morphologische und strukturelle Ähnlichkeiten
zu gramnegativen Bakterien, einschließlich einer trilaminären, äußeren Membran,
die Lipopolysaccharid und mehrere Membranproteine enthält, die
strukturell und funktionell analog zu Proteinen sind, die sich in
E. coli finden. Sie sind obligate intrazelluläre Parasiten mit einem einzigartigen
biphasischen Lebenszyklus, der aus einem metabolisch inaktiven aber
infektiösen
extrazellulären
Stadium und einem replizierenden aber nicht infektiösen intrazellulären Stadium
besteht. Das replikative Stadium des Lebenszyklus findet innerhalb
eines membrangebundenen Einschlusses statt, der die Bakterien von
dem Cytoplasma der infizierten Wirtszelle absondert.
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C.
pneumoniae ist ein weit verbreitetes menschliches Pathogen, das
ursprünglich
als der TWAR-Stamm von Chlamydia psittaci beschrieben wurde, von
dem aber anschließend
erkannt wurde, dass es eine neue Spezies ist. C. pneumoniae ist
von anderen Chlamydia-Spezies (C. trachomatis, C. pecorum und C.
psittaci) antigen, genetisch und morphologisch verschieden. Es zeigt
eine 10%ige DNA-Sequenzhomologie oder weniger mit entweder C. trachomatis
oder C. psittaci.
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C.
pneumoniae ist eine häufige
Ursache von ambulant erworbenen Pneumonien ("community acquired pneumonia"), lediglich weniger
häufig
als Streptococcus pneumoniae und Mycoplasma pneumoniae (Grayston
et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168: 1231; Campos et
al. (1995) Investigation of Ophthalmology and Visual Science 36:
1477). Es kann auch Symptome und Erkrankungen der oberen Atemwege verursachen,
einschließlich
Bronchitis und Sinusitis (Grayston et al. (1995) Journal of Infectious
Diseases 168: 1231; Grayston et al. (1990) Journal of Infectious
Diseases 161: 618; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases. 18:
501; Wang et al. (1986) Chlamydial infections Cambridge University
Press, Cambridge. S. 329). Die große Mehrzahl der erwachsenen
Bevölkerung
(über 60%)
weist Antikörper
gegen C. pneumoniae auf (Wang et al. (1986) Chlamydial infections.
Cambridge University Press, Cambridge. S. 329), was eine vergangene
Infektion anzeigt, die nicht erkannt wurde oder asymptomatisch war.
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Eine
Infektion mit C. pneumoniae stellt sich gewöhnlich als eine akute respiratorische
Erkrankung dar (d. h. Husten, Halsschmerzen, Heiserkeit und Fieber,
abnormale Brustgeräusche
beim Abhören).
Bei den meisten Patienten bleibt der Husten 2 bis 6 Wochen bestehen
und eine Erholung ist langsam. Bei ungefähr 10% dieser Fälle folgt
auf die Infektion der oberen Atemwege Bronchitis oder Pneumonie.
Ferner wurde beschrieben, dass während
einer Epidemie mit C. pneumoniae eine anschließende Co-Infektion mit Pneumococcus
bei etwa der Hälfte
dieser Pneumonie-Patienten
auftrat, insbesondere bei den Schwachen und Älteren. Wie vorstehend beschrieben,
gibt es immer mehr Hinweise, dass eine Infektion mit C. pneumoniae
auch mit Erkrankungen verbunden ist, die von respiratorischen Infektionen
verschieden sind.
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Das
Reservoir für
den Organismus sind wahrscheinlich die Menschen. Im Gegensatz zu
Infektionen mit C. psittaci gibt es kein bekanntes Vogel- oder Tierreservoir.
Eine Übertragung
wurde nicht eindeutig definiert. Sie kann von einem direkten Kontakt
mit Sekreten, von Infektionsträgern
oder von einer Luftausbreitung herrühren. Es gibt eine lange Inkubationszeitspanne,
die viele Monate andauern kann. Basierend auf der Analyse von Epidemien
scheint C. pneumoniae sich langsam über eine Population auszubreiten
(ein Mittel des Intervalls von Fall zu Fall beträgt 30 Tage), da infizierte
Personen ineffektive Überträger des
Organismus sind. Die Anfälligkeit
für C.
pneumoniae ist universal. Erneute Infektionen treten während des
Erwachsenseins auf, nach der primären Infektion als Kind. C.
pneumoniae scheint eine endemische Erkrankung weltweit zu sein, die
für überlagernde
Intervalle erhöhter
Inzidenz (Epidemien) bekannt ist, die zwei bis drei Jahre andauern. Eine
Infektion mit C. trachomatis verleiht keine Überkreuzimmunität gegenüber C. pneumo niae.
Infektionen werden leicht mit oralen Antibiotika, Tetracyclin oder
Erythromycin (2 g/d für
mindestens 10 bis 14 Tage) behandelt. Ein kürzlich entwickeltes Arzneimittel,
Azithromycin, ist als eine Einzeldosistherapie gegen Chlamydien-Infektionen
hochgradig wirksam.
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In
den meisten Fällen
ist eine Infektion mit C. pneumoniae mild und ohne Komplikationen
und bis zu 90% der Infektionen sind subakut oder werden nicht erkannt.
Es wurde angenommen, dass unter Kindern in industrialisierten Ländern Infektionen
bis zu dem Alter von fünf
Jahren selten sind, obwohl eine kürzliche Untersuchung (E. Norman
et al., Chlamydia pneumoniae in children with akute respiratory
tract infections, Acta Paediatrica, 1998, Band 87, Ausgabe 1, S.
23–27)
berichtet hat, dass viele Kinder in dieser Altersgruppe einen PCR-Beleg
einer Infektion zeigen, obwohl sie seronegativ sind, und veranschlagt
eine Prävalenz
von 17–19% bei
den 2- bis 4-Jährigen.
In Entwicklungsländern
ist die Seroprävalenz
von Antikörpern
gegen C. pneumoniae unter jungen Kindern erhöht und es gibt den Verdacht,
dass C. pneumoniae eine wichtige Ursache für eine akute Erkrankung der
unteren Atemwege und Mortalität
für Kleinkinder
und Kinder in tropischen Regionen der Welt sein kann.
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Aus
Seroprävalenzstudien
und Studien von lokalen Epidemien tritt die initiale Infektion mit
C. pneumoniae gewöhnlich
im Alter von 5 bis 20 Jahren auf. Es wird abgeschätzt, dass
z. B. in den USA 30000 Fälle
von Pneumonie in Kindesalter jedes Jahr durch C. pneumoniae verursacht
werden. Infektionen können
sich unter Gruppen von Kinder oder jungen Erwachsenen anhäufen (z.
B. Schüler
oder Wehrpflichtige).
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C.
pneumoniae verursacht 10 bis 25% der ambulant erworbenen Infektionen
der unteren Atemwege (wie aus Schweden, Italien, Finnland und den
USA berichtet). Während
einer Epidemie kann eine Infektion mit C. pneumonia 50 bis 60% der
Fälle von
Pneumonie ausmachen. Während
dieser Zeitspannen wurden auch mehrere Episoden von gemischten Infektionen
mit S. pneumoniae berichtet.
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Eine
erneute Infektion während
des Erwachsenseins ist häufig.
Die klinische Präsentation
scheint milder zu sein. Basierend auf Populationsseroprävalenzstudien
scheint es eine erhöhte
Exposition mit dem Alter zu geben, was unter Männern besonders offensichtlich
ist. Einige Forscher haben spekuliert, dass ein persistentes, asymptomatisches
Stadium einer Infektion mit C. pneumoniae häufig ist.
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Bei
Erwachsenen mittleren Alters oder älter kann eine Infektion mit
C. pneumoniae zu chronischer Bronchitis und Sinusitis fortschreiten.
Eine Studie in den USA deckte auf, dass die Inzidenz von Pneumonie, die
durch C. pneumoniae verursacht wird, bei Personen, die jünger als
60 Jahre sind, ein Fall pro tausend Personen pro Jahr beträgt. Jedoch
stieg bei den Älteren
die Erkrankungsinzidenz dreifach an. Die Infektion mit C. pneumoniae
führt kaum
zu einem Krankenhausaufenthalt mit der Ausnahme von Patienten mit
einer Grunderkrankung.
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Von
beachtlicher Wichtigkeit ist die Verbindung von Atherosklerose und
einer Infektion mit C. pneumoniae. Es gibt mehrere epidemiologische
Untersuchungen, die eine Korrelation von vorhergehenden Infektionen mit
C. pneumoniae und Herzinfarkten, Erkrankungen der koronaren Arterie
und Carotis zeigen (Saikku et al. (1988) Lancet; ii: 983; Thom et
al. (1992) JAMA 268: 68; Linnanmaki et al. (1993), Circulation 87:
1030; Saikku et al. (1992) Annals Internal Medicine 116: 273; Melnick
et al. (1993) American Journal of Medicine 95: 499). Außerdem wurden
die Organismen in Atheromen und Fettschichten der Koronar-, Halsschlag-
und peripheren Arterien und Aorta nachgewiesen (Shor et al. (1992)
South African. Medical Journal 82: 158; Kuo et al. (1993) Journal
of Infectious Diseases 167: 841; Kuo et al. (1993) Arteriosclerosis
and Thrombosis 13: 1500; Campbell et al. (1995) Journal of Infectious
Diseases 172: 585; Chiu et al. Circulation, 1997 (in Druck)). Lebende
C. pneumoniae wurden aus der Herzkranzarterie und Carotis wieder
gewonnen (Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medicine 125:
979; Jackson et al. Abst. K121, p272, 36. ICAAC, 15.-18. Sept. 1996,
New Orleans). Ferner wurde gezeigt, dass C. pneumoniae Änderungen
von Atherosklerose in einem Kaninchenmodell induzieren kann (Fong
et al. (1997) Journal of Clinical Microbiology 35: 48). Zusammengenommen
zeigen diese Ergebnisse an, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass
C. pneumoniae Atherosklerose in Menschen verursachen kann, obwohl
es verbleibt, die epidemiologische Wichtigkeit einer Chlamydien-Atherosklerose
zu zeigen.
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Eine
Reihe von kürzlichen
Untersuchungen hat auch eine Verbindung zwischen einer Infektion
mit C. pneumoniae und Asthma angegeben. Eine Infektion wurde mit
Keuchen, asthmatischer Bronchitis, Altersasthma und akuter Verschlimmerung
von Asthma bei Erwachsenen in Verbindung gebracht und Studien mit
kleinem Umfang zeigten, dass eine andauernde antibiotische Behandlung
wirksam war, die Schwere der Erkrankung in einigen Individuen stark
zu vermindern (Hahn DL et al., Evidence for Chlamydia pneumoniae
infection in steroid-dependent asthma.
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Ann
Allergy Asthma Immunol. 1998 Jan; 80(1): 45–49.; Hahn DL et al., Association
of Chlamydia pneumoniae IgA antibodies with recently symptomatic
asthma. Epidemiol Infect. 1996 Dez; 117(3): 513–517; Bjornsson E et al., Serology
of Chlamydia in relation to asthma and bronchial hyperresponsiveness.
Scand J Infect Dis. 1996; 28(1): 63–69.; Hahn DL. Treatment of
Chlamydia pneumoniae infection in adult asthma: a before-after trial.
J Fam Pract. 1995 Okt; 41(4): 345–351.; Allegra L et al. Acute
exacerbations of asthma in adults: role of Chlamydia pneumoniae
infection. Eur Respir J. 1994 Dez; 7(12): 2165–2168.; Hahn DL et al. Association
of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic
bronchitis, and adult-onset asthma. JAMA. 1991 Jul 10; 266(2): 225–230).
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Im
Lichte dieser Ergebnisse würde
ein schützender
Impfstoff gegen eine Infektion mit C. pneumoniae sehr wichtig sein.
Es gibt bis jetzt keinen wirksamen Impfstoff für irgendeine menschliche Chlamydien-Infektion.
Es ist vorstellbar, dass ein wirksamer Impfstoff unter Verwendung
von physikalisch oder chemisch inaktivierten Chlamydien entwickelt
werden kann. Jedoch weist ein solcher Impfstoff keinen großen Sicherheitsspielraum
auf. Im Allgemeinen werden sicherere Impfstoffe durch genetisches
Manipulieren des Organismus durch Attenuierung oder durch rekombinante
Mittel hergestellt. Demzufolge war ein Haupthindernis beim Erzeugen
eines wirksamen und sicheren Impfstoffs gegen eine menschliche Chlamydien-Infektion
der Mangel an genetischer Information hinsichtlich Chlamydia, insbesondere
C. pneumoniae.
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Untersuchungen
mit C. trachomatis und C. psittaci zeigen an, dass ein sicherer
und wirksamer Impfstoff gegen Chlamydia ein erreichbares Ziel ist.
Zum Beispiel werden Mäuse,
die sich von einer Lungeninfektion mit C. trachomatis erholt haben,
vor einer Unfruchtbarkeit geschützt,
die durch eine anschließende
vaginale Challenge induziert wird (Pal et al. (1996) Infection and
Immunity. 64: 5341). In ähnlicher
Weise wurden Schafe, die mit inaktivierten C. psittaci immunisiert
worden waren, vor anschließenden
von Chlamydien induzierten Fehlgeburten und Totgeburten geschützt (Jones
et al. (1995) Vaccine 13: 715). Ein Schutz vor Chlamydien-Infektionen
wurde mit Th1-Immunantworten assoziiert, insbesondere der Induktion
von INFg-produzierenden CD4+T-Zellen (Igietsemes et al. (1993) Immunology
5: 317). Der adoptive Transfer von CD4+-Zelllinien oder -klonen
zu Nackt- oder SCID-Mäusen
verlieh einen Schutz gegen eine Challenge oder geklärte chronische
Erkrankung (Igietseme et al. (1993) Regional Immunology 5: 317;
Magee et al. (1993) Regional Immunology 5: 305), und eine in vivo-Verarmung
an CD4+-T-Zellen verschlimmerte eine Erkrankung nach einer Challenge
(Landers et al. (1991) Infection & Immunity
59: 3774; Magee et al. (1995) Infection & Immunity 63: 516). Jedoch kann die
Anwesenheit von ausreichend hohen Titern an neutralisierendem Antikörper bei
Schleimhautoberflächen
auch eine schützende
Wirkung zeigen (Cotter et al. (1995) Infection and Immunity 63:
4704).
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Eine
antigene Variation innerhalb der Spezies C. pneumoniae ist nicht
gut dokumentiert aufgrund der unzureichenden genetischen Information,
obwohl erwartet wird, dass eine Variation basierend auf C. trachomatis
besteht. Serotypen von C. trachomatis werden auf der Grundlage einer
antigenen Variation in dem Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) definiert,
aber veröffentlichte
MOMP-Gensequenzen von C. pneumoniae zeigen keine Variation zwischen
mehreren unterschiedlichen Isolaten des Organismus (Campbell et
al. Infection and Immunity (1990) 58: 93; McCafferty et al. Infection
and Immunity (1995) 63: 2387–9;
Gaydos et al. Infection and Immunity (1992) 60(12): 5319–5323).
Das Gen, das für
ein 76 kDa-Antigen
kodiert, wurde aus einem einzigen Stamm von C. pneumoniae kloniert
und die Sequenz wurde veröffentlicht
(Perez Melgosa et al. Infection and Immunity (1994) 62: 880). Ein
Operon, das die 9 kDa- und 60 kDa-cysteinreichen äußeren Membranproteingene
kodiert, wurde beschrieben (Watson et al., Nucleic Acids Res (1990)
18: 5299; Watson et al., Microbiology (1995) 141: 2489). Viele Antigene,
die durch Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden, sind quer
durch alle Chlamydien konserviert, aber das 98 kDa-, 76 kDa- und
mehrere andere Proteine könnten
spezifisch für
C. pneumoniae sein (Perez Melgosa et al., Infection and Immunity
(1994) 62: 880; Melgosa et al., FEMS Microbiol Lett (1993) 112:
199; Campbell et al., J Clin Microbiol (1990) 28: 1261; Iijima et
al., J Clin Microbiol (1994) 32: 583). Eine Untersuchung der Anzahl
und relativen Häufigkeit
von jeglichen Serotypen von C. pneumoniae und der definierenden
Antigene ist noch nicht möglich.
Die vollständige
Genomsequenz des C. pneumoniae-Stamms CWL-029 ist nun bekannt (http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/)
und, wie weitere Sequenzen verfügbar
werden, kann ein besseres Verständnis
der antigenen Variation erhalten werden.
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Viele
Antigene, die von Immunseren gegen C. pneumoniae erkannt werden,
sind quer durch alle Chlamydien konserviert, aber die 98 kDa-, 76
kDa- und 54 kDa-Proteine
scheinen spezifisch für
C. pneumoniae zu sein (Campos et al. (1995) Investigation of Ophthalmology
and Visual Science 36: 1477; Marrie (1993) Clinical Infectious Diseases.
18: 501; Wiedmann-Al-Ahmad M et al. Reactions of polyclonal and neutralizing
anti-p54 monoclonal antibodies with an isolated, species-specific
54-kilodalton Protein
of Chlamydia pneumoniae. Clin Diagn Lab Immunol. 1997 Nov; 4(6):
700–704).
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Ein
Immunblotten von Isolaten mit Seren von Patienten zeigt eine Variation
von Blotmustern zwischen Isolaten, was anzeigt, dass Serotypen von
C. pneumoniae existieren können
(Grayston et al. (1995) Journal of Infectious Diseases 168: 1231;
Ramirez et al. (1996) Annals of Internal Medicine 125: 979). Jedoch
sind die Ergebnisse möglicherweise
durch den Infektionsstatus der Patienten vermengt, da Immunblotprofile
von Seren eines Patienten sich über
die Zeit nach einer Infektion verändern. Eine Untersuchung der
Anzahl und relativen Häufigkeit
von jeglichen Serotypen und der definierenden Antigene ist noch
nicht möglich.
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Dementsprechend
besteht ein Bedarf zum Identifizieren und Isolieren von Polynukleotidsequenzen von
C. pneumoniae für
eine Verwendung beim Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß werden
Impfstoffe bereitgestellt, die aufgereinigte und isolierte Polynukleotidmoleküle umfassen,
die für
die als OMP (Protein der äußeren Membran)
bezeichneten Chlamydia-Polypeptide (SEQ ID Nr: 1) kodieren, die
in Verfahren zum Verhindern, Behandeln und Diagnostizieren einer
Chlamydia-Infektion verwendet werden können. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfasst der Impfstoff DNA-Polynukleotidmoleküle, die für das Polypeptid von SEQ ID
Nr: 2 kodieren.
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In
einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfasst der Impfstoff Polypeptide, die zu den isolierten DNA-Molekülen korrespondieren.
Die Aminosäuresequenz
des entsprechenden kodierten Polypeptids ist als SEQ ID Nr: 2 gezeigt.
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Der
Fachmann wird leicht verstehen, dass die Anmeldung, die die Polynukleotidsequenzen
beschrieben hat, die für
das Chlamydia-OMP(Protein der äußeren Membran)-Protein
kodieren, auch Polynukleotide beschreibt, die für Fragmente kodieren, die sich
von einem solchen Polypeptid ableiten. Außerdem soll die Erfindung dahingehend
verstanden werden, Mutanten und Derivate solcher Polypeptide und
Fragmente, die sich davon ableiten, bereitzustellen, die von der
Addition, Deletion oder Substitution von nicht essenziellen Aminosäuren herrühren, wie
hierin beschrieben. Der Fachmann würde auch leicht verstehen,
dass die Anmeldung, die die Polynukleotidsequenzen beschrieben hat,
die für
Chlamydia-Polypeptide kodieren, ferner monospezifische Antikörper beschreibt,
die spezifisch an solche Polypeptide binden.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt Expressionskassetten, Vektoren
und Zellen, die mit den Polynukleotiden der Anmeldung transformiert
oder transfiziert sind. Dementsprechend beschreibt die vorliegende Anmeldung
ferner (i) ein Verfahren zum Erzeugen eines in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptids in einem rekombinanten Wirtssystem und verwandte Expressionskassetten,
Vektoren und transformierte oder transfizierte Zellen; (ii) ein
Verfahren zum Diagnostizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in
einer biologischen Probe, das die Verwendung eines in der Anmeldung
beschriebenen DNA- oder RNA-Moleküls, eines in der Anmeldung
beschriebenen monospezifischen Antikörpers oder eines in der Anmeldung
beschriebenen Polypeptids beinhalten kann; und (iii) ein Verfahren
zum Aufreinigen eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids
durch auf Antikörper
basierende Affinitätschromatographie.
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Die
Erfindung betrifft (i) einen Impfstoff oder einen Lebendimpfstoffvektor
wie einen Pockenvirus-, Salmonella typhimurium- oder Vibrio cholerae-Vektor,
der ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid enthält, wie
Impfstoffe und Impfstoffvektoren, die z. B. zum Verhindern und Behandeln
einer Chlamydia-Infektion verwendbar sind, zusammen mit einem Verdünner oder
Träger,
und verwandte pharmazeutische Zusammensetzungen und assoziierte
therapeutische und/oder prophylaktische Verfahren; (ii) eine therapeutische und/oder
prophylaktische Verwendung eines in der Anmeldung beschriebenen
RNA- oder DNA-Moleküls,
entweder in einer nackten Form oder formuliert mit einem Zufuhrvehikel,
eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids oder einer Kombination
von in der Anmeldung beschriebenen Polypeptiden oder eines in der
Anmeldung beschriebenen monospezifischen Antikörpers, und verwandter pharmazeutischer
Zusammensetzungen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
Erfindung wird weiter durch die nachstehende Beschreibung in Bezugnahme
auf die Zeichnungen verstanden werden, in denen:
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1 die
Nukleotidsequenz des Gens (SEQ ID Nr: 1) von OMP (Protein der äußeren Membran)
und die abgeleitete Aminosäuresequenz
von OMP (Protein der äußeren Membran)
aus Chlamydia pneumoniae (SEQ ID Nr: 2) zeigt.
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2 die
Restriktionsenzymanalyse des Gens von OMP (Protein der äußeren Membran)
von C. pneumoniae zeigt.
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3 die
Konstruktion und Elemente des Plasmids pCAmgp002 zeigt.
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4 einen
Schutz gegen eine Infektion mit C. pneumoniae durch pCAmgp002 nach
DNA-Immunisierung veranschaulicht.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Ein
offener Leserahmen (ORF), der für
das OMP (Protein der äußeren Membran)
aus Chlamydien kodiert, wurde aus dem Genom für C. pneumoniae identifiziert.
Das Gen, das für
dieses Protein kodiert, wurde in ein Expressionsplasmid inseriert
und es wurde gezeigt, dass es einen Immunschutz gegen eine Chlamydien-Infektion
verleiht. Dementsprechend kann dieses OMP (Protein der äußeren Membran)
und verwandte Polypeptide zum Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion
verwendet werden.
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In
dieser Anmeldung werden isolierte Polynukleotide beschrieben, die
für Chlamydia-Polypeptide
kodieren, deren Aminosäuresequenz
in SEQ ID Nr: 2 gezeigt sind.
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Der
Begriff "isoliertes
Polynukleotid" wird
als ein Polynukleotid definiert, das aus der Umgebung entfernt wurde,
in der es natürlicherweise
auftritt. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes DNA-Molekül, das in
dem Genom eines lebenden Bakteriums oder als Teil einer Genbank
vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Molekül, das von
dem übrigen
Teil des Bakteriengenoms abgetrennt ist, als ein Ergebnis z. B.
eines Klonierungsvorgangs (Amplifikation), ist isoliert. Typischerweise
ist ein isoliertes DNA-Molekül
frei von DNA-Bereichen (z. B. kodierenden Bereichen), mit denen
es direkt bei dem 5'-
oder 3'-Ende in
dem natürlich vorkommenden
Genom benachbart ist. Solche isolierten Polynukleotide können Teil
eines Vektors oder einer Zusammensetzung sein und können immer
noch als isoliert in der Weise definiert sein, dass ein solcher
Vektor oder eine solche Zusammensetzung kein Teil der natürlichen
Umgebung eines solchen Polynukleotids ist.
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Das
in der Anmeldung beschriebene Polynukleotid ist entweder RNA oder
DNA (cDNA, genomische DNA oder synthetische DNA) oder Modifikationen,
Varianten, Homologe oder Fragmente davon. Die DNA ist entweder doppelsträngig oder
einzelsträngig
und, falls einzelsträngig,
ist entweder der kodierende Strang oder der nicht kodierende (Antisense)-Strang.
Eine jegliche der Sequenzen, die für die in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptide kodieren, wie in der SEQ ID Nr: 1 gezeigt, ist (a) eine
kodierende Sequenz, (b) eine Ribonukleotidsequenz, die sich von
einer Transkription von (a) ableitet, oder (c) eine kodierende Sequenz,
die die Redundanz oder Degeneriertheit des genetischen Codes verwendet,
um für
die gleichen Polypeptide zu kodieren. Unter "Polypeptid" oder "Protein" wird eine jegliche Kette von Aminosäuren verstanden,
ungeachtet der Länge
oder posttranslationalen Modifikation (z. B. Glykosylierung oder
Phosphorylierung). Beide Begriffe werden austauschbar in der vorliegenden
Anmeldung verwendet.
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Übereinstimmend
mit dem ersten Aspekt der Anmeldung werden Aminosäuresequenzen
beschrieben, die homolog zu SEQ ID Nr: 2 sind. Wie hierin verwendet,
ist eine "homologe
Aminosäuresequenz" ein jegliches Polypeptid,
das insgesamt oder teilweise durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die
bei 25–35°C unter der
kritischen Schmelztemperatur (Tm) an einen jeglichen Teil der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID Nr: 1 hybridisiert. Eine homologe Aminosäuresequenz
ist eine, die sich von einer in SEQ ID Nr: 2 gezeigten Aminosäuresequenz
durch eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheidet.
Eine solche Sequenz umfasst auch serotypische Varianten (nachstehend
definiert) als auch Sequenzen, die Deletionen oder Insertionen enthalten,
die inhärente
Merkmale des Polypeptids wie Immunogenizität beibehalten. Vorzugsweise
ist eine solche Sequenz mindestens 75%, mehr bevorzugt 80% und am
meisten bevorzugt 90% identisch zu SEQ ID Nr: 2.
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Homologe
Aminosäuresequenzen
beinhalten Sequenzen, die zu SEQ ID Nr: 2 identisch oder im Wesentlichen
identisch sind. Unter "im
Wesentlichen identisch zu einer Aminosäuresequenz" wird eine Sequenz verstanden, die mindestens
90%, vorzugsweise 95%, mehr bevorzugt 97% und am meisten bevorzugt
99% identisch zu einer Bezugsaminosäuresequenz ist und die sich
vorzugsweise von der Bezugssequenz durch mehrheitlich konservative
Aminosäuresubstitutionen
unterscheidet.
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Konservative
Aminosäuresubstitutionen
sind Substitutionen unter Aminosäuren
der gleichen Klasse. Diese Klassen beinhalten z. B. Aminosäuren mit
ungeladenen polaren Seitenketten, wie Asparagin, Glutamin, Serin,
Threonin und Tyrosin, Aminosäuren
mit basischen Seitenketten, wie Lysin, Arginin und Histidin, Aminosäuren mit
sauren Seitenketten, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure, und
Aminosäuren
mit nicht polaren Seitenketten, wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin,
Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cystein.
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Homologie
wird unter Verwendung einer Sequenzanalysensoftware wie Sequence
Analysis Software Package von der Genetics Computer Group, University
of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison,
WI 53705, gemessen. Aminosäuresequenzen
werden angeordnet, um die Identität zu maximieren. Lücken können künstlich
in die Sequenz eingebracht werden, um eine passende Anordnung zu
erreichen. Sobald die optimale Anordnung festgestellt wurde, wird
der Homologiegrad dadurch ermittelt, dass alle Positionen, bei denen
die Aminosäuren
beider Sequenzen identisch sind, relativ zu der Gesamtanzahl von Positionen
erfasst werden.
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Homologe
Polynukleotidsequenzen werden in einer ähnlichen Weise definiert. Vorzugsweise
ist eine homologe Sequenz eine, die mindestens 45%, mehr bevorzugt
60% und am meisten bevorzugt 85% identisch zu der kodierenden Sequenz
von SEQ ID Nr: 1 ist.
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Übereinstimmend
mit dem ersten Aspekt der Anmeldung beinhalten Polypeptide mit einer
Sequenz, die zu SEQ ID Nr: 2 homolog ist, natürlich vorkommende allelische
Varianten als auch Mutanten oder jegliche andere nicht natürlich vorkommende
Varianten, die die inhärenten
Merkmale des Polypeptids von SEQ ID Nr: 2 beibehalten.
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Wie
im Stand der Technik bekannt, ist eine allelische Variante eine
alternierende Form eines Polypeptids, die dadurch charakterisiert
ist, dass sie eine Substitution, Deletion oder Addition einer oder
mehrerer Aminosäuren
aufweist, die die biologische Funktion des Polypeptids nicht verändert. Unter "biologischer Funktion" wird die Funktion
des Polypeptids in den Zellen, in denen es natürlicherweise auftritt, verstanden,
selbst wenn die Funktion nicht notwendig für das Wachstum oder Überleben
der Zellen ist. Zum Beispiel ist die biologische Funktion eines
Porins, den Eintritt in Zellen von Verbindungen zu ermöglichen,
die in dem extrazellulären
Me dium vorhanden sind. Eine biologische Funktion unterscheidet sich
von einer antigenen Eigenschaft. Ein Polypeptid kann mehr als eine
biologische Funktion aufweisen.
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Allelische
Varianten sind in der Natur sehr häufig. Zum Beispiel wird eine
Bakterienspezies wie C. pneumoniae gewöhnlich durch eine Vielzahl
von Stämmen
repräsentiert,
die sich von jedem anderen durch kleinere allelische Variationen
unterscheiden. Tatsächlich
kann ein Polypeptid, das die gleiche biologische Funktion in unterschiedlichen
Stämmen
erfüllt,
eine Aminosäuresequenz
(und Polynukleotidsequenz) aufweisen, die nicht identisch in einer
jeglichen der Stämme
ist. Trotz dieser Variation wurde eine Immunantwort, die sich allgemein
gegen viele allelische Varianten richtet, gezeigt. In Untersuchungen
des Chlamydien-Antigens MOMP tritt eine Kreuzstammantikörperbindung
zusammen mit einer Neutralisierung der Infektiosität trotz
einer Aminosäuresequenzvariation
von MOMP von Stamm zu Stamm auf, was anzeigt, dass das MOMP, wenn
es als ein Immunogen verwendet wird, tolerant gegenüber Aminosäurevariationen
ist.
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Polynukleotide,
die für
homologe Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, werden
durch Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) von genomischer
Bakterien-DNA, die durch herkömmliche Verfahren
extrahiert wurde, wieder gewonnen. Dies beinhaltet die Verwendung
von synthetischen Oligonukleotid-Primern, die zu stromaufwärts liegenden
und stromabwärts
liegenden Bereichen der 5'-
und 3'-Enden der kodierenden
Domäne
passen. Geeignete Primer werden gemäß der Nukleotidsequenzinformation,
die in der SEQ ID Nr: 1 bereitgestellt wird, entworfen. Das Verfahren
ist wie folgt: ein Primer wird ausgewählt, der aus 10 bis 40, vorzugsweise
15 bis 25 Nukleotiden besteht. Es ist vorteilhaft, Primer auszuwählen, die
C- und G-Nukleotide in einem Verhältnis enthalten, das ausreichend
ist, um eine wirksame Hybridisierung sicherzustellen, d. h. eine
Menge von C- und G-Nukleotiden von mindestens 40%, vorzugsweise
50% des gesamten Nukleotidgehalts. Eine Standard-PCR-Reaktion beinhaltet
typischerweise 0,5 bis 5 Einheiten an Taq-DNA-Polymerase pro 100 μl, 20 bis
200 μM an
jedem Desoxynukleotid, vorzugsweise bei äquivalenten Konzentrationen,
0,5 bis 2,5 mM Magnesium gegenüber
der Gesamtdesoxynukleotidkonzentration, 105 bis
106 Zielmoleküle und etwa 20 pmol eines jeden
Primers. Etwa 25 bis 50 PCR-Zyklen mit einer Anlagerungstemperatur
von 15°C
bis 5°C
unter dem wirklichen Tm-Wert der Primer werden durchgeführt. Eine
stringentere Anlagerungstemperatur verbessert eine Unterscheidung
gegenüber
nicht korrekt angelagerten Primern und vermindert einen Einbau von
nicht korrekten Nukleotiden an dem 3'-Ende der Primer. Eine Denaturierungstemperatur
von 95°C
bis 97°C ist
typisch, obwohl höhere
Temperaturen für
eine Denaturierung von C + G-reichen Zielen geeignet sein können. Die
Anzahl von durchgeführten
Zyklen hängt
von der Anfangskonzentration der Zielmoleküle ab, obwohl typischerweise
mehr als 40 Zyklen nicht empfohlen werden, da nicht spezifische
Hintergrundprodukte dazu neigen, sich anzuhäufen.
-
Ein
alternatives Verfahren zum Wiedergewinnen von Polynukleotiden, die
für homologe
Polypeptide oder allelische Varianten kodieren, ist durch Hybridisierungsscreening
einer DNA- oder RNA-Bibliothek. Hybridisierungsverfahren sind bekannt
und in Ausubel et al. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons
Inc., 1994), Silhavy et al. (Silhavy et al. Experiments with Gene
Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1984) und Davis et
al. (Davis et al. A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980) beschrieben. Wichtige
Parameter zum Optimieren von Hybridisierungsbedingungen sind in
einer Formel wiedergegeben, die verwendet wird, um die kritische Schmelztemperatur
zu erhalten, über
der sich zwei komplementäre
DNA-Stränge voneinander
trennen (Casey & Davidson,
Nucl. Acid Res. (1997) 4: 1539). Für Polynukleotide mit einer
Länge von
etwa 600 Nukleotiden oder mehr ist diese Formel wie folgt: Tm =
81,5 + 0,41 × (%
G + C) + 16,6 log (Kationenkonzentration) – 0,63 × (% Formamid) – 600/Basenanzahl.
Unter geeigneten Stringenzbedingungen liegt die Hybridisierungstemperatur
(Th) etwa 20 bis 40°C,
20 bis 25°C
oder vorzugsweise 30 bis 40°C
unter dem berechneten Tm-Wert. Der Fachmann wird verstehen, dass
die optimale Temperatur und optimalen Salzbedingungen leicht bestimmt
werden können.
-
Für die in
der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide werden stringente Bedingungen
für sowohl Vorhybridisierungs-
als auch Hybridisierungsinkubationen (i) innerhalb von 4–16 Stunden
bei 42°C
in 6 × SSC mit
50% Formamid oder (ii) innerhalb von 4–16 Stunden bei 65°C in einer
wässrigen
6 × SSC-Lösung (1
M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat (pH-Wert von 7,0)) erreicht. Typischerweise
werden Hybridisierungsexperimente bei einer Temperatur von 60 bis
68°C, z.
B. 65°C,
durchgeführt.
Bei einer solchen Temperatur können
stringente Hybridisierungsbedingungen in 6 × SSC, vorzugsweise in 2 × SSC oder
1 × SSC,
mehr bevorzugt in 0,5 SSC, 0,3 × SSC
oder 0,1 × SSC
(ohne Formamid) erreicht werden. 1 × SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M
Natriumcitrat.
-
Geeignete
Homologe und Fragmente davon, die nicht natürlich auftreten, werden unter
Verwendung bekannter Verfahren zum Identifizieren von Bereichen
eines Antigens entwickelt, die wahrscheinlich Aminosäuresequenzänderungen
und/oder -deletionen tolerieren werden. Als ein Beispiel werden
homologe Polypeptide von verschiedenen Spezies verglichen. Konservierte
Sequenzen werden identifiziert. Je unterschiedlicher Sequenzen sind,
desto wahrscheinlicher werden Sequenzänderungen toleriert. Homologie
unter Sequenzen kann dadurch analysiert werden, dass z. B. der BLAST-Homologie-Suchalgorithmus
von Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389–3402 (1997),
verwendet wird. Alternativ dazu werden Sequenzen derart modifiziert,
dass sie reaktiver gegenüber
T- und/oder B-Zellen werden, basierend auf einer computergestützten Analyse
von vermutlichen T- oder B-Zell-Epitopen. Eine noch weitere Alternative
ist ein Mutieren eines spezifischen Aminosäurerestes oder einer spezifischen
Aminosäuresequenz
innerhalb des Polypeptids in vitro, sodann Screenen der mutierten
Polypeptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
eine Chlamydia-Infektion gemäß dem vorstehend
beschriebenen Verfahren zu verhindern oder zu behandeln.
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Ein
Fachmann wird leicht verstehen werden, dass durch Befolgen des in
der Anmeldung beschriebenen Screening-Verfahrens ohne unangemessenes
Experimentieren bestimmt werden wird, ob ein spezifisches Homolog
von SEQ ID Nr: 2 beim Verhindern oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion
verwendbar sein kann. Das Screening-Verfahren umfasst die Schritte:
Immunisieren
eines Tiers, vorzugsweise einer Maus, mit dem Testhomolog oder -fragment,
Beimpfen
des immunisierten Tiers mit Chlamydia und
Selektieren derjenigen
Homologe oder Fragmente, die einen Schutz gegenüber Chlamydia verleihen.
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Unter "Verleihen eines Schutzes" wird verstanden,
dass es eine Verminderung der Schwere irgendeiner der Wirkungen
einer Chlamydia-Infektion im Vergleich zu einem Kontrolltier, das
nicht mit dem Testhomolog oder -fragment immunisiert worden war,
auftritt.
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Übereinstimmend
mit dem ersten in der Anmeldung beschriebenen Aspekt werden Polypeptidderivate beschrieben,
die Teilsequenzen von SEQ ID Nr: 2, Teilsequenzen von Polypeptidsequenzen,
die zu SEQ ID Nr: 2 homolog sind, Polypeptide, die sich von Volllängen-Polypeptiden
durch innere Deletion ableiten und Verschmelzungsproteine sind.
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Es
ist eine anerkannte Praxis auf dem Gebiet der Immunologie, Fragmente
und Varianten von Proteinimmunogenen als Impfstoffe zu verwenden,
da alles, was benötigt
wird, um eine Immunantwort auf ein Protein zu induzieren, ein kleiner
(z. B. 8 bis 10 Aminosäuren)
immunogener Bereich des Proteins ist. Es wurde gezeigt, dass verschiedene
kurze synthetische Peptide, die oberflächenexponierten Antigenen von
Pathogenen entsprechen, die von Chlamydia verschieden sind, wirksame
Impfstoffantigene gegenüber
ihren entsprechenden Pathogenen sind, z. B. ein Peptid mit 11 Resten
eines Mausbrusttumorvirus (Casey & Davidson,
Nucl. Acid Res. (1977) 4: 1539), ein Peptid mit 16 Resten des Semliki-Forest-Virus
(Snijders et al., 1991. J. Gen. Virol. 72: 557–565) und zwei überlappende
Peptide mit jeweils 15 Resten vom Hundeparvovirus (Langeveld et al.,
Vaccine 12(15): 1473–1480,
1994).
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Dementsprechend
wird es einem Fachmann, der die gegenwärtige Beschreibung gelesen
hat, leicht ersichtlich sein, dass Teilsequenzen von SEQ ID Nr:
2 oder ihre homologen Aminosäuresequenzen
inhärent zu
den Volllängen-Sequenzen
sind und durch die vorliegende Anmeldung gelehrt werden. Solche
Polypeptidfragmente weisen vorzugsweise eine Länge von mindestens 12 Aminosäuren auf.
Vorteilhafterweise weisen sie eine Länge von mindestens 20 Aminosäuren, vorzugsweise
mindestens 50 Aminosäuren,
mehr bevorzugt mindestens 75 Aminosäuren und am meisten bevorzugt
mindestens 100 Aminosäuren
auf.
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Polynukleotide
mit 30 bis 600 Nukleotiden, die für Teilsequenzen von Sequenzen,
die zu SEQ ID Nr: 2 homolog sind, kodieren, werden durch PCR-Amplifikation
unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Parameter und unter
Verwendung von Primern wieder gewonnen, die zu Sequenzen stromaufwärts und
stromabwärts
der 5'- und 3'-Enden des zu amplifizierenden
Fragments passen. Das Matrizenpolynukleotid für eine solche Amplifikation
ist entweder das Volllängen-Polynukleotid,
das zu SEQ ID Nr: 1 homolog ist, oder ein Polynukleotid, das in
einem Gemisch von Polynukleotiden, wie einer DNA- oder RNA-Bibliothek
enthalten ist. Als ein alternatives Verfahren zum Wiedergewinnen
der Teilsequenzen wird eine Screeninghybridisierung unter den vorstehend
beschriebenen Bedingungen und unter Verwendung der Formel zum Berechnen
des Tm-Werts durchgeführt.
Wenn Fragmente mit 30 bis 600 Nukleotiden wieder gewonnen werden
sollen, wird der berechnete Tm-Wert durch Subtrahieren (600/Polynukleotidgröße in Basenpaaren)
korrigiert und die Stringenzbedingungen werden durch eine Hybridisierungstemperatur
definiert, die 5 bis 10°C
unter dem Tm-Wert liegt. Wenn Oligonukleotide mit weniger als 20
bis 30 Basen erhalten werden sollen, ist die Formel zum Berechnen
des Tm-Werts wie folgt: Tm = 4 × (G
+ C) + 2 (A + T). Zum Beispiel würde
ein 18-Nukleotid-Fragment mit 50% G + C einen ungefähren Tm-Wert
von 54°C
aufweisen. Kurze Peptide, die Fragmente von SEQ ID Nr: 2 oder ihren
homologen Sequenzen sind, werden direkt durch chemische Synthese
erhalten (E. Gross und H. J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology; Modern Techniques of Peptide Synthesis, John
Wiley & Sons
(1981), und M. Bodanzki, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag
(1984)).
-
Geeignete
Polypeptidderivate, z. B. Polypeptidfragmente, werden unter Verwendung
einer computergestützten
Analyse von Aminosäuresequenzen
entwickelt. Dies würde
vermutliche oberflächenexponierte
antigene Bereiche identifizieren (Hughes et al., 1992. Infect. Immun.
60(9): 3497). Eine Analyse von sechs Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID
Nr: 2 enthalten sind, basierend auf dem Produkt von Flexibilitäts- und
Hydrophobizitätsneigungen
unter Verwendung des Programms SEQ SEE (Wishart DS, et al. "SEQSEE: a comprehensive
program suite for Protein sequence analysis." Comput Appl Biosci. 1994 Apr; 10(2):
121–32)
kann potentielle B- und T-Zell-Epitope
aufdecken, die als eine Grundlage zum Selektieren geeigneter immunogener Fragmente
und Varianten verwendet werden können.
Diese Analyse verwendet eine angemessene Kombination von Merkmalen
der äußeren Oberfläche, die
wahrscheinlich von Antikörpern
erkannt wird. Vermutliche T-Zell-Epitope für die HLA-A0201-MHC-Unterklasse
können
durch Algorithmen aufgedeckt werden, die einen bei dem NIH entwickelten
Ansatz nachahmen (Parker KC et al. "Peptide binding to MHC class I molecules: implications
for antigenic Peptide prediction." Immunol Res 1995;14(1): 34–57).
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Epitope,
die eine schützende
T-Zell-abhängige
Immunantwort induzieren, sind über
die gesamte Länge
des Polypeptids vorhanden. Jedoch können einige Epitope durch sekundäre und tertiäre Strukturen
des Polypeptids maskiert sein. Um solche maskierten Epitope aufzudecken,
werden große
innere Deletionen erzeugt, die viel der ursprünglichen Proteinstruktur entfernen
und die maskierten Epitope exponieren. Solche inneren Deletionen
bewirken manchmal den zusätzlichen
Vorteil eines Entfernens von immundominanten Bereichen hoher Variabilität unter
Stämmen.
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Polynukleotide,
die für
Polypeptidfragmente und Polypeptide mit großen inneren Deletionen kodieren, werden
unter Verwendung von Standardverfahren konstruiert (Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994).
Solche Verfahren beinhalten Standard-PCR, inverse PCR, Restriktionsenzymbehandlung
von klonierten DNA-Molekülen
oder das Verfahren von Kunkel et al. (Kunkel et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1985) 82: 448). Komponenten für diese Verfahren und Anweisungen
für ihre
Verwendung sind leicht aus verschiedenen käuflichen Quellen wie Stratagene
erhältlich.
Sobald die Deletionsmutanten konstruiert wurden, werden sie hinsichtlich
ihrer Fähigkeit,
eine Chlamydia-Infektion zu verhindern oder zu behandeln, wie vorstehend
beschrieben getestet.
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Wie
hierin verwendet, ist ein Verschmelzungspolypeptid eines, das ein
erfindungsgemäßes Polypeptid oder
ein erfindungsgemäßes Polypeptidderivat
enthält,
das an dem N- oder C-terminalen Ende mit einem jeglichen anderen
Polypeptid (hierin nachstehend als ein Peptidschwanz bezeichnet)
verschmolzen ist. Ein einfacher Weg zum Erhalten eines solchen Verschmelzungspolypeptids
besteht in der Translation einer In-Frame-Verschmelzung der Polynukleotidsequenzen,
d. h. eines Hybridgens. Das Hybridgen, das für das Verschmelzungspolypeptid
kodiert, wird in einen Expressionsvektor inseriert, der zum Transformieren
oder Transfizieren einer Wirtszelle verwendet wird. Alternativ dazu
wird die Polynukleotidsequenz, die für das Polypeptid oder Polypeptidderivat
kodiert, in einen Expressionsvektor inseriert, in dem das Polynukleotid,
das für
den Peptidschwanz kodiert, bereits vorhanden ist. Solche Vektoren
und Anweisungen für
ihre Verwendung sind käuflich
erhältlich,
z. B. das pMal-c2- oder pMal-p2-System von New England Biolabs,
bei dem der Peptidschwanz ein maltosebindendes Protein ist, das
Glutathion-S-Transferase-System
von Pharmacia oder das von Novagen erhältliche His-Tag-System. Diese
und andere Expressionssysteme stellen geeignete Mittel zum weiteren Aufreinigen
von erfindungsgemäßen Polypeptiden
und Derivaten bereit.
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Ein
vorteilhaftes Beispiel eines Verschmelzungspolypeptids ist eines,
bei dem das erfindungsgemäßes Polypeptid
oder Homolog oder Fragment mit einem Polypeptid mit einer Adjuvans-Aktivität, wie einer
Untereinheit B von entweder Choleratoxin oder Hitze-labilem E. coli-Toxin,
verschmolzen ist. Eine weitere vorteilhafte Verschmelzung ist eine,
bei der das Polypeptid, Homolog oder Fragment mit einem starken
T-Zell-Epitop oder B-Zell-Epitop verschmolzen ist. Ein solches Epitop
kann eines, das bekannt ist (z. B. das Hepatitis B-Virus-Kernantigen,
D. R. Millich et al., "Antibody
production to the nucleocapsid and envelope of the Hepatitis B virus primed
by a single synthetic T cell site", Nature. 1987. 329: 547–549), oder
eines sein, das in einem weiteren, in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptid, basierend auf einer computergestützten Analyse von vermutlichen
T- oder B-Zell-Epitopen, identifiziert worden ist. Übereinstimmend
mit diesem Aspekt der Anmeldung ist ein Verschmelzungspolypeptid,
das T- oder B-Zell-Epitope aus SEQ ID Nr: 2 umfasst, oder sein Homolog oder
Fragment, wobei die Epitope sich von vielen Varianten des Polypeptids
oder Homologs oder Fragments ableiten, wobei sich jede Variante
von einer weiteren in seiner Lage und Sequenz seines Epitops innerhalb
des Polypeptids unterscheidet. Eine solche Verschmelzung ist beim
Verhindern und Behandeln einer Chlamydia-Infektion wirksam, da es
die T- und B-Zellantwort auf das Gesamtpolypeptid, -homolog oder
-fragment optimiert.
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Um
eine Verschmelzung zu bewirken, wird das in der Anmeldung beschriebene
Polypeptid mit dem N- oder vorzugsweise mit dem C-terminalen Ende
des Polypeptids mit einer Adjuvans-Aktivität oder T- oder B-Zell-Epitop
verschmolzen. Alternativ dazu wird ein in der Anmeldung beschriebenes
Polypeptidfragment intern innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids
mit Adjuvans-Aktivität
inseriert. Das T- oder B-Zell-Epitop
kann auch intern in die Aminosäuresequenz
des in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids inseriert werden.
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Übereinstimmend
mit dem ersten Aspekt kodieren die in der Anmeldung beschriebenen
Polynukleotide auch für
Hybridvorläuferpolypeptide
mit heterologen Signalpeptiden, die zu in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptiden reifen. Unter einem "heterologen Signalpeptid" wird ein Signalpeptid
verstanden, das nicht in natürlich
vorkommenden Vorläufern
von in der Anmeldung beschriebenen Polypeptiden gefunden wird.
-
In
der Anmeldung beschriebene Polynukleotidmoleküle, die RNA, DNA oder Modifikationen
oder Kombinationen davon beinhalten, weisen verschiedene Anwendungen
auf. Ein DNA-Molekül
wird z. B. (i) in einem Verfahren zum Herstellen des kodierten Polypeptids
in einem rekombinanten Wirtssystem, (ii) bei der Konstruktion von
Impfstoffvektoren wie Pockenviren, die weiter in Verfahren und Zusammensetzungen
zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion verwendet
werden, (iii) als ein Impfstoffmittel (als auch ein RNA-Molekül) in einer
nackten Form oder formuliert mit einem Zufuhrvehikel und (iv) bei
der Konstruktion von attenuierten Chlamydia-Stämmen, die ein in der Anmeldung
beschriebenes Poly nukleotid überexprimieren oder
es in einer nicht toxischen, mutierten Form exprimieren, verwendet.
-
Dementsprechend
umfasst ein zweiter in der Anmeldung beschriebener Aspekt (i) eine
Expressionskassette mit einem in der Anmeldung beschriebenen DNA-Molekül, das unter
der Kontrolle der Elemente, die für eine Expression benötigt werden,
insbesondere unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, steht,
(ii) einen Expressionsvektor mit einer in der Anmeldung beschriebenen
Expressionskassette, (iii) eine prokaryotische oder eukaryotische
Zelle, die mit einer in der Anmeldung beschriebenen Expressionskassette
und/oder einem in der Anmeldung beschriebenen Vektor transformiert
oder transfiziert ist, als auch (iv) ein Verfahren zum Produzieren
eines Polypeptids oder Polypeptidderivats, das durch ein in der
Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kodiert wird, das ein Kultivieren
einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die mit einer in der
Anmeldung beschriebenen Expressionskassette und/oder einem in der
Anmeldung beschriebenen Vektor transformiert oder transfiziert ist,
unter Bedingungen, die eine Expression des in der Anmeldung beschriebenen
DNA-Moleküls
ermöglichen,
und Wiedergewinnen des kodierten Polypeptids oder Polypeptidderivats
aus der Zellkultur beinhaltet.
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Ein
rekombinantes Expressionssystem wird aus prokaryotischen und eukaryotischen
Wirten ausgewählt.
Eukaryotische Wirte beinhalten Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae
oder Pichia pastoris), Säugerzellen
(z. B. COS1-, NIH3T3- oder JEG3-Zellen), Arthropodenzellen (z. B.
Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen) und Pflanzenzellen. Ein bevorzugtes
Expressionssystem ist ein prokaryotischer Wirt wie E. coli. Bakterielle
und eukaryotische Zellen sind von einer Reihe von unterschiedlichen
Quellen erhältlich,
einschließlich
kommerzieller Quellen, z. B. der American Type Culture Collection
(ATCC, Rockville, Maryland). Kommerzielle Quellen von Zellen, die
zum Exprimieren von rekombinantem Protein verwendet werden, stellen
auch Anweisungen für
eine Verwendung der Zellen bereit.
-
Die
Auswahl des Expressionssystems hängt
von den für
das exprimierte Polypeptid gewünschten Merkmalen
ab. Zum Beispiel kann es verwendbar sein, um ein in der Anmeldung
beschriebenes Polypeptid in einer besonderen lipidierten Form oder
einer jeglichen anderen Form zu produzieren.
-
Ein
Fachmann würde
leicht verstehen, dass nicht erwartet werden würde, dass alle Vektoren und
Expressionskontrollsequenzen und Wirte gleichermaßen gut
die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide exprimieren. Mit
den nachstehend beschriebenen Richtlinien kann jedoch eine Selektion
von Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirten ohne unangemessenes
Experimentieren und ohne Abweichung von der Offenbarung dieser Anmeldung
durchgeführt
werden.
-
Beim
Selektieren eines Vektors muss der Wirt derart ausgewählt werden,
dass er mit dem Vektor kompatibel ist, der in ihm existiert und
möglicherweise
in ihm repliziert. Überlegungen
werden hinsichtlich der Vektorkopienanzahl, der Fähigkeit
zum Kontrollieren der Kopienanzahl, der Expression von anderen Proteinen
wie antibiotischer Resistenz angestellt. Beim Selektieren einer
Expressionskontrollsequenz wird eine Reihe von Variablen berücksichtigt.
Unter den wichtigen Variablen sind die relative Stärke der
Sequenz (z. B. die Fähigkeit,
eine Expression unter verschiedenen Bedingungen zu betreiben), die
Fähigkeit,
die Sequenzfunktion zu steuern, die Kompatibilität zwischen dem zu exprimierenden
Polynukleotid und der Kontrollsequenz (z. B. Sekundärstrukturen
werden berücksichtigt,
um Haarnadelstrukturen zu vermeiden, die eine wirksame Transkription
verhindern). Beim Selektieren des Wirts werden unizelluläre Wirte
selektiert, die mit dem ausgewählten Vektor
kompatibel, hinsichtlich jeglichen möglichen toxischen Wirkungen
des exprimierten Produkts tolerant, zum wirksamen Sekretieren des
exprimierten Produkts, falls so gewünscht, zum Exprimieren des
Produkts in der gewünschten
Konformation, zur maßstäblichen
Vergrößerung und
zum leichten Aufreinigen des Endprodukts fähig sind.
-
Die
Auswahl der Expressionskassette hängt von dem selektierten Wirtssystem
als auch von den für das
exprimierte Polypeptid gewünschten
Merkmalen ab. Typischerweise beinhaltet eine Expressionskassette einen
Promotor, der in dem selektierten Wirtssystem funktionell ist und
konstitutiv oder induzierbar sein kann, eine Ribosombindungsstelle,
ein Start-Codon (ATG), falls erforderlich, einen Bereich, der für ein Signalpeptid, z.
B. ein Lipidierungssignalpeptid, kodiert, ein in der Anmeldung beschriebenes
DNA-Molekül,
ein Stopp-Codon und gegebenenfalls einen 3'-terminalen
Bereich (Translations- und/oder Transkriptionsterminator). Der Signalpeptid-kodierende
Bereich ist benachbart zu dem in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotid
und befindet sich in einem geeigneten Leserahmen. Der für das Signalpeptid
kodierende Bereich ist homolog oder heterolog zu dem DNA-Molekül, das für das reife
Polypeptid kodiert, und ist mit dem Sekretionsapparat des für eine Expression
verwendeten Wirts kompatibel. Der offene Leserahmen, der durch das
in der Anmeldung beschriebene DNA-Molekül, allein oder zusammen mit
dem Signal peptid, konstituiert wird, befindet sich unter der Kontrolle
des Promotors, so dass eine Transkription und Translation in dem
Wirtssystem auftritt. Promotoren und Signalpeptid-kodierende Bereiche
sind bekannt und dem Fachmann erhältlich und beinhalten z. B.
den Promotor von Salmonella typhimurium (und Derivate), der durch
Arabinose induzierbar ist (Promotor araB) und in gramnegativen Bakterien
wie E. coli funktionell ist (wie in der
US-PS 5,028,530 und in Cagnon et al.
(Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7): 843) beschrieben),
den Promotor des Gens des Bakteriophagen T7, das für eine RNA-Polymerase
kodiert, der in einer Reihe von E. coli-Stämmen funktionell ist, die T7-Polymerase
exprimieren (beschrieben in der
US-PS
4,952,496 ), das OspA-Lipidierungssignalpeptid, und das
RlpB-Lipidierungssignalpeptid (Takase et al., J. Bact. (1987) 169:
5692).
-
Die
Expressionskassette ist typischerweise Teil eines Expressionsvektors,
der für
seine Fähigkeit,
in dem ausgewählten
Expressionssystem zu replizieren, selektiert wird. Expressionsvektoren
(z. B. Plasmide oder virale Vektoren) können z. B. aus denjenigen ausgewählt werden,
die in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985,
Ergänzung
1987) beschrieben worden sind. Geeignete Expressionsvektoren können von
verschiedenen kommerziellen Quellen erworben werden.
-
Verfahren
zum Transformieren/Transfizieren von Wirtszellen mit Expressionsvektoren
sind bekannt und hängen
von dem selektierten Wirtssystem ab, wie in Ausubel et al. (Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994)
beschrieben.
-
Nach
Expression wird ein rekombinantes in der Anmeldung beschriebenes
Polypeptid (oder ein Polypeptidderivat) produziert und verbleibt
in dem intrazellulären
Kompartiment, wird in das extrazelluläre Medium oder in den periplasmatischen
Raum sekretiert/ausgeschieden oder wird in die zelluläre Membran
eingebettet. Das Polypeptid wird in einer im Wesentlichen aufgereinigten
Form aus dem Zellextrakt oder aus dem Überstand nach Zentrifugation
der rekombinanten Zellkultur wieder gewonnen. Typischerweise wird
das rekombinante Polypeptid durch auf Antikörper basierende Affinitätsaufreinigung
oder durch andere bekannte Verfahren aufgereinigt, die leicht durch
einen Fachmann angepasst werden können, wie eine Verschmelzung
des Polynukleotids, das für
das Polypeptid oder sein Derivat kodiert, an eine kleine affinitätsbindende
Domäne.
Antikörper,
die zum Immunaffinitätsaufreinigen
der in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide verwendbar sind, werden
wie nachstehend beschrieben erhalten.
-
Ein
in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kann auch als ein Impfstoff
verwendbar sein. Es gibt zwei Hauptwege, entweder unter Verwendung
eines viralen oder bakteriellen Wirts als ein Genzufuhrvehikel (Lebendimpfstoffvektor)
oder Verabreichen des Gens in einer freien Form, z. B. inseriert
in ein Plasmid. Eine therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit
eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids wird wie nachstehend
beschrieben evaluiert.
-
Dementsprechend
wird erfindungsgemäß (i) ein
Impfstoffvektor wie ein Pockenvirus mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, das unter
der Kontrolle von Elementen steht, die für eine Expression benötigt werden,
(ii) eine Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen Impfstoffvektor
zusammen mit einem Verdünner
oder Träger
umfasst, insbesondere (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung
mit einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge eines
erfindungsgemäßen Impfstoffvektors
bereitgestellt. Die Anmeldung beschreibt auch (i) ein Verfahren
zum Induzieren einer Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger (z.
B. einem Menschen, alternativ kann das Verfahren in Veterinäranwendungen
zum Behandeln oder Verhindern einer Chlamydia-Infektion von Tieren,
z. B. Katzen oder Vögeln,
verwendet werden), das ein Verabreichen an den Säuger einer immunogen wirksamen
Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors
umfasst, um eine schützende
oder therapeutische Immunantwort gegenüber Chlamydia hervorzurufen,
und auch (ii) ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln einer
Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumonia,
C. pecorum), die ein Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen
Menge eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors
an ein infiziertes Individuum beinhaltet. Zusätzlich umfasst der vorstehend
beschriebene erfindungsgemäße Aspekt
die Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors bei der
Herstellung eines Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln
einer Chlamydia-Infektion.
-
Wie
hierin verwendet, exprimiert ein Impfstoffvektor ein oder mehrere
in der Anmeldung beschriebene Polypeptide oder Derivate. Der Impfstoffvektor
kann zusätzlich
ein Cytokin, wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12),
exprimieren, das die Immunantwort (Adjuvans-Wirkung) verstärkt. Es
wird verstanden, dass eine jegliche der zu exprimierenden Komponenten
unter die Kontrolle von Elementen platziert wird, die für eine Expression
in einer Säugerzelle
benötigt
werden.
-
Übereinstimmend
mit dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Aspekt ist eine Zusammensetzung,
die mehrere Impfstoffvektoren umfasst, wobei ein jeglicher von diesem
zum Exprimieren eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids
oder Derivats fähig
ist. Eine Zusammensetzung kann auch einen Impfstoffvektor, der zum
Exprimieren eines zusätzlichen
Chlamydia-Antigens oder einer Untereinheit, eines Fragments, Homologs,
einer Mutante oder eines Derivats davon, fähig ist, gegebenenfalls zusammen
mit einem Cytokin wie IL-2 oder IL-12 umfassen.
-
Impfungsverfahren
zum Behandeln oder Verhindern einer Infektion in einem Säuger umfassen
eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Impfstoffvektors, der über einen
jeglichen herkömmlichen
Weg verabreicht werden soll, insbesondere an eine mukosale (z. B.
okkulare, intranasale, orale, gastritische, pulmonare, intestinale,
rektale, vaginale oder Harnweg-)Oberfläche oder über den parenteralen (z. B.
subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder
intraperitonealen) Weg. Bevorzugte Wege hängen von der Auswahl des Impfstoffvektors
ab. Eine Behandlung kann in einer einzigen Dosis oder wiederholt
bei Intervallen erfolgen. Die geeignete Dosierung hängt von
verschiedenen Parametern ab, die vom Fachmann verstanden werden,
wie dem Impfstoffvektor selbst, dem Verabreichungsweg oder dem Zustand
des zu impfenden Säugers
(Gewicht, Alter und dergleichen).
-
Lebendimpfstoffvektoren,
die im Stand der Technik erhältlich
sind, beinhalten virale Vektoren wie Adenoviren und Pockenviren
als auch bakterielle Vektoren, z. B. Shigella, Salmonella, Vibrio
cholerae, Lactobacillus, Bacille bilié de Calmette-Guérin (BOG)
und Streptococcus.
-
Ein
Beispiel eines Adenovirus-Vektors als auch eines Verfahrens zum
Konstruieren eines Adenovirus-Vektors, der zum Exprimieren eines
in der Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküls fähig ist, ist in der
US-PS 4,920,209 beschrieben.
Pockenvirusvektoren beinhalten Vaccinia- und Kanarienpockenvirus,
die in der
US-PS 4,722,848 bzw.
US-PS 5,364,773 beschrieben
sind. (Vgl. auch z. B. Tartaglia et al., Virology (1992) 188: 217
für eine
Beschreibung eines Vaccinia-Virus-Vektors und Taylor et al., Vaccine
(1995) 13: 539 für
eine Referenz eines Kanarienpockenvirus.) Pockenvirusvektoren, die
zum Exprimieren eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids
fähig sind,
werden durch homologe Rekombination erhalten, wie in Kieny et al., Nature
(1984) 312: 163 beschrieben, so dass das in der Anmeldung beschriebene
Polynukleotid in das virale Genom unter geeigneten Bedingungen für eine Expression
in Säugerzellen
inseriert wird. Im Allgemeinen kann die Dosis eines viralen Impfstoffvektors
für eine
therapeutische oder prophylaktische Verwendung etwa 1 × 10
4 bis etwa 1 × 10
11,
vorteilhafterweise etwa 1 × 10
7 bis etwa 1 × 10
10,
vorzugsweise etwa 1 × 10
7 bis etwa 1 × 10
9 Plaque
bildende Einheiten pro kg betragen. Vorzugsweise werden virale Vektoren
parenteral, z. B. in drei Dosen mit vierwöchigem Abstand, verabreicht.
Es ist bevorzugt, eine Zugabe eines chemischen Adjuvans zu einer
Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen viralen Vektor enthält, und
dadurch Minimieren der Immunantwort auf den viralen Vektor selbst
zu vermeiden.
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Nicht
toxigene, mutierte Stämme
von Vibrio cholerae, die als ein oraler Lebendimpfstoff verwendbar sind,
sind bekannt. Mekalanos et al., Nature (1983) 306: 551 und die
US-PS 4,882,278 beschreiben
Stämme, bei
denen eine wesentliche Menge der kodierenden Sequenz jeder der zwei
ctxA-Allele deletiert wurde, so dass kein funktionelles Cholerae-Toxin
produziert wird. Die
WO 92/11354 beschreibt
einen Stamm, bei dem der irgA-Lokus durch Mutation inaktiviert ist.
Diese Mutation kann in einem einzigen Stamm mit ctxA-Mutationen
kombiniert werden. Die
WO 94/01533 beschreibt
eine Deletionsmutante, der funktionelle ctxA- und attRS1-DNA-Sequenzen
fehlen. Diese mutierten Stämme
sind genetisch manipuliert, um heterologe Antigene zu exprimieren,
wie in der
WO 94/19482 beschrieben.
Eine wirksame Impfstoffdosis eines Stamms von Vibrio cholerae, die
zum Exprimieren eines Polypeptids oder Polypeptidderivats fähig ist,
dass von einem in der Anmeldung beschriebenen DNA-Molekül kodiert
wird, enthält
etwa 1 × 10
5 bis etwa 1 × 10
9,
vorzugsweise etwa 1 × 10
6 bis etwa 1 × 10
8 lebensfähige Bakterien
in einem Volumen, das für
den selektierten Verabreichungsweg geeignet ist. Bevorzugte Verabreichungswege
beinhalten alle mukosalen Wege. Am meisten bevorzugt werden diese
Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
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Attenuierte
Stämme
von Salmonella typhimurium, die für eine rekombinante Expression
von heterologen Antigenen genetisch manipuliert sind oder nicht,
und deren Verwendung als orale Impfstoffe sind in Nakayama et al.
(Bio/Technology (1988) 6: 693) und in der
WO 92/11361 beschrieben. Bevorzugte
Verabreichungswege beinhalten alle mukosalen Wege. Am meisten bevorzugt
werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
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Andere
bakterielle Stämme,
die als Impfstoffvektoren im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden,
sind für
Shigella flexneri in High et al., EMBO (1992) 11: 1991 und Sizemore
et al., Science (1995) 270: 299, für Streptococcus gordonii in Medaglini
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 6868, und für Bacille
Calmette Guerin in Flynn J. L., Cell. Mol. Biol. (1994) 40 (Ergänzung I):
31, der
WO 88/06626 ,
WO 90/00594 ,
WO 91/13157 ,
WO 92/01796 und
WO 92/21376 beschrieben.
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In
bakteriellen Vektoren wird das in der Anmeldung beschriebene Polynukleotid
in das bakterielle Genom inseriert oder verbleibt in einem freien
Zustand als Teil eines Plasmids.
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Die
Zusammensetzung, die einen erfindungsgemäßen bakteriellen Impfstoffvektor
umfasst, kann ferner ein Adjuvans beinhalten. Eine Reihe von Adjuvanzien
ist dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Adjuvanzien werden selektiert,
wie nachstehend bereitgestellt.
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Dementsprechend
stellt ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt (i) eine Impfstoffzusammensetzung, die
ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid zusammen mit einem
Verdünner
oder Träger
umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch
oder prophylaktisch wirksame Menge eines in der Anmeldung beschriebenen
Polynukleotids umfasst, (iii) ein Verfahren zum Induzieren einer
Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger durch Verabreichung einer
immunogen wirksamen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids
zum Auslösen
einer schützenden
Immunantwort gegen Chlamydia, und insbesondere (iv) ein Verfahren
zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion mit Chlamydia (z.
B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae oder C. pecorum) durch
Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines
in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids an ein infiziertes
Individuum bereit. Zusätzlich
umfasst dieser andere erfindungsgemäße Aspekt die Verwendung eines
in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotids bei der Herstellung
eines Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
Eine bevorzugte Verwendung beinhaltet die Verwendung eines DNA-Moleküls, das
unter Bedingungen für
eine Expression in einer Säugerzelle
platziert ist, insbesondere in einem Plasmid, das nicht zum Replizieren
in Säugerzellen
und zum im Wesentlichen Integrieren in ein Säugergenom fähig ist.
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Eine
Verwendung der in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide beinhaltet
deren Verabreichung an einen Säuger
als einen Impfstoff für
therapeutische oder prophylaktische Zwecke. Solche Polynukleotide
werden in der Form von DNA als Teil eines Plasmids verwendet, der
nicht fähig
ist, sich in einer Säugerzelle
zu repli zieren, und nicht fähig
ist, sich in das Säugergenom
zu integrieren. Typischerweise wird ein solches DNA-Molekül unter
die Kontrolle eines Promotors gestellt, der für eine Expression in einer
Säugerzelle geeignet
ist. Der Promotor fungiert entweder ubiquitär oder gewebespezifisch. Beispiele
für nicht
gewebespezifische Promotoren beinhalten den frühen Cytomegalovirus(CMV)-Promotor
(der in der
US-PS 4,168,062 beschrieben
ist) und den Rous-Sarkomvirus-Promotor (der in Norton & Coffin, Molec.
Cell Biol. (1985) 5: 281 beschrieben ist). Ein Beispiel eines gewebespezifischen
Promotors ist der Desmin-Promotor, der eine Expression in Muskelzellen
lenkt (Li et al., Gene (1989) 78: 243, Li & Paulin, J. Biol. Chem. (1991) 266:
6562 und Li & Paulin,
J. Biol. Chem. (1993) 268: 10403). Eine Verwendung von Promotoren
ist dem Fachmann bekannt. Geeignete Vektoren sind in zahlreichen
Publikationen, insbesondere in der
WO
94/21797 und Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996)
7: 1205, beschrieben.
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In
der Anmeldung beschriebene Polynukleotide, die als Impfstoffe verwendet
werden, kodieren entweder einen Vorläufer oder eine reife Form des
entsprechenden Polypeptids. In der Vorläuferform ist das Signalpeptid
entweder homolog oder heterolog. In dem letzteren Fall wird eine
eukaryotische Leitsequenz wie die Leitsequenz des gewebespezifischen
Plasminogenfaktors (tPA) bevorzugt.
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Wie
hierin verwendet, enthält
eine in der Anmeldung beschriebene Zusammensetzung ein oder mehrere
Polynukleotide mit gegebenenfalls mindestens einem zusätzlichen
Polynukleotid, das für
ein weiteres Chlamydia-Antigen kodiert, wie Urease-Untereinheit A, B
oder beide, oder ein Fragment, Derivat, eine Mutante oder ein Analogon
davon. Die Zusammensetzung kann auch ein zusätzliches Polynukleotid enthalten,
das für ein
Cytokin, wie Interleukin-2 (IL-2) oder Interleukin-12 (IL-12) kodiert,
so dass die Immunantwort verstärkt wird.
Diese zusätzlichen
Polynukleotide werden unter die geeignete Kontrolle für eine Expression
gestellt. Vorteilhafterweise sind in der Anmeldung beschriebene
DNA-Moleküle
und/oder zusätzliche
DNA-Moleküle,
die in die gleiche Zusammensetzung eingeschlossen werden sollen,
in dem gleichen Plasmid vorhanden.
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Standardtechniken
der Molekularbiologie zum Herstellen und Aufreinigen von Polynukleotiden
werden bei der Herstellung von in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotid-Therapeutika
verwendet. Für
eine Verwendung als Impfstoff wird ein in der Anmeldung beschriebenes
Polynukleotid gemäß verschiedener
nachstehend beschriebener Verfahren formuliert.
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Ein
Verfahren verwendet das Polynukleotid in einer nackten Form, frei
von jeglichen Zufuhrvehikeln. Ein solches Polynukleotid wird einfach
in einer physiologisch akzeptablen Lösung wie steriler Salzlösung oder steril
gepufferter Salzlösung
mit oder ohne einen Träger
verdünnt.
Wenn vorhanden, ist der Träger
vorzugsweise isoton, hypoton oder schwach hyperton und weist eine
relativ niedrige ionische Stärke
auf, wie von einer Sucroselösung
bereitgestellt, z. B. eine Lösung
mit 20% Sucrose.
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Ein
alternatives Verfahren verwendet das Polynukleotid in Verbindung
mit Mitteln, die eine zelluläre Aufnahme
unterstützen.
Beispiele solcher Mittel sind (i) Chemikalien, die eine zelluläre Permeabilität modifizieren,
wie Bupivacain (vgl. z. B. die
WO
94/16737 ), (ii) Liposome für eine Einkapselung des Polynukleotids oder
(iii) kationische Lipide oder Silica-, Gold- oder Wolframmikropartikel,
die selbst mit den Polynukleotiden assoziieren.
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Anionische
und neutrale Liposome sind auf dem Gebiet bekannt (vgl. z. B. Liposomes:
A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990), für eine detaillierte
Beschreibung von Verfahren zum Herstellen von Liposomen) und sind
zum Zuführen
eines großen
Bereichs von Produkten, einschließlich Polynukleotiden, verwendbar.
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Kationische
Lipide sind auch auf dem Fachgebiet bekannt und werden üblicherweise
für eine
Genzufuhr verwendet. Solche Lipide beinhalten Lipofectin
TM, das auch als DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid)
bekannt ist, DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan), DDAB
(Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin)
und Cholesterinderivate wie DC-Chol (3-beta-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin).
Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide findet sich in der
EP 187,702 ,
WO 90/11092 ,
US-PS 5,283,185 ,
WO 91/15501 ,
WO 95/26356 und
US-PS
5,527,928 . Kationische Lipide für eine Genzufuhr werden vorzugsweise
in Verbindung mit einem neutralen Lipid wie DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin)
verwendet, wie in der
WO 90/11092 als Beispiel
beschrieben.
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Eine
Formulierung mit kationischen Liposomen kann gegebenenfalls andere
transfektionserleichternde Verbindungen enthalten. Eine Reihe von
diesen sind in der
WO 93/18759 ,
WO 93/19768 ,
WO 94/25608 und
WO 95/02397 beschrieben. Sie beinhalten
Sperminderivate, die zum Erleichtern des Transports von DNA durch
die nukleäre
Membran verwendbar sind (vgl. z. B. die
WO 93/18759 ), und membran permeabilisierende Verbindungen
wie GALA, Gramicidin S und kationische Gallensäuresalze (vgl. z. B. die
WO 93/19768 ).
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Gold-
oder Wolframmikropartikel werden für eine Genzufuhr verwendet,
wie in der
WO 91/00359 ,
WO 93/17706 und in Tang
et al. Nature (1992) 356: 152 beschrieben. Das mit Mikropartikeln
beschichtete Polynukleotid wird über
intradermale oder intraepidermale Wege unter Verwendung einer nadelfreien
Injektionsvorrichtung ("gene
gun") injiziert,
wie denjenigen, die in der
US-PS
4,945,050 ,
US-PS 5,015,580 und
in der
WO 94/24263 beschrieben
sind.
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Die
Menge an DNA, die in einem Impfstoffempfänger verwendet werden soll,
hängt z.
B. von der Stärke
des in dem DNA-Konstrukt verwendeten Promotors, der Immunogenizität des exprimierten
Genprodukts, dem Zustand des für
eine Verabreichung vorgesehenen Säugers (z. B. dem Gewicht, Alter
und allgemeinen Gesundheitszustands des Säugers), der Verabreichungsart
und dem Typ der Formulierung ab. Allgemein kann eine therapeutisch
oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1 mg, vorzugsweise
etwa 10 μg
bis etwa 800 μg
und mehr bevorzugt etwa 25 μg
bis etwa 250 μg
an erwachsene Menschen verabreicht werden. Die Verabreichung kann
in einer einzelnen Dosis oder wiederholt bei Intervallen erreicht
werden.
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Der
Verabreichungsweg ist ein jeglicher herkömmlicher Weg, der auf dem Impfstoffgebiet
verwendet wird. Als allgemeine Richtschnur wird ein in der Anmeldung
beschriebenes Polynukleotid über
eine mukosale Oberfläche,
z. B. einer okkularen, intranasalen, pulmonalen, oralen, intestinalen,
rektalen, vaginalen und Harnwegoberfläche, oder über einen parenteralen Weg,
z. B. über
einen intravenösen,
subkutanen, intraperitonealen, intradermalen, intraepidermalen oder
intramuskulären
Weg, verabreicht. Die Wahl eines Verabreichungswegs hängt von
der Formulierung ab, die selektiert wird. Ein Polynukleotid, das
in Verbindung mit Bupivacain formuliert ist, wird vorteilhafterweise
in Muskeln verabreicht. Wenn ein neutrales oder anionisches Liposom oder
ein kationisches Lipid wie DOTMA oder DC-Chol verwendet wird, kann
die Formulierung vorteilhafterweise über intravenöse, intranasale
(Aerosolisation), intramuskuläre,
intradermale und subkutane Wege injiziert werden. Ein Polynukleotid
in einer nackten Form kann vorteilhafterweise über die intramuskulären, intradermalen
oder subkutanen Wege verabreicht werden.
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Obwohl
nicht absolut benötigt,
kann eine solche Zusammensetzung auch ein Adjuvans enthalten. Falls
so, ist ein systemisches Adjuvans, das keine gleichzeitige Verabreichung
benötigt,
um eine Adjuvans-Wirkung zu zeigen, bevorzugt, wie z. B. QS21, das
in der
US-PS 5,057,546 beschrieben
ist.
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Die
Sequenzinformation, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, ermöglicht die
Entwicklung von spezifischen Nukleotidsonden und -primern, die für diagnostische
Zwecke verwendet werden. Dementsprechend stellt ein zusätzlicher
Aspekt der Anmeldung eine Nukleotidsonde oder -primer mit einer
Sequenz bereit, die sich in einer in SEQ ID Nr: 1 gezeigten Sequenz
findet oder durch die Degeneriertheit des genetischen Codes davon
abgeleitet ist.
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Der
Begriff "Sonde", wie erfindungsgemäß verwendet,
betrifft Moleküle
von DNA (vorzugsweise einzelsträngig)
oder RNA (oder Modifikationen oder Kombinationen davon), die unter
den stringenten Bedingungen, wie vorstehend definiert, an Nukleinsäuremoleküle mit SEQ
ID Nr: 1 oder an Sequenzen, die zu SEQ ID Nr: 1 homolog sind, oder
an ihre komplementäre
oder Antisense-Sequenz hybridisieren. Allgemein sind Sonden signifikant
kürzer
als Volllängen-Sequenzen.
Solche Sonden beinhalten etwa 5 bis etwa 100, vorzugsweise etwa
10 bis etwa 80 Nukleotide. Insbesondere weisen Sonden Sequenzen
auf, die mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 85%, mehr bevorzugt
95% homolog zu einem Teil von SEQ ID Nr: 1 sind oder die komplementär zu solchen
Sequenzen sind. Sonden können
modifizierte Basen wie Inosin, Methyl-5-desoxycytidin, Desoxyuridin,
Dimethylamino-5-desoxyuridin oder Diamino-2,6-purin enthalten. Zucker-
oder Phosphatreste können
auch modifiziert oder substituiert sein. Zum Beispiel kann ein Desoxyriboserest
durch ein Polyamid ersetzt sein (Nielsen et al., Science (1991)
254: 1497) und Phosphatreste können
durch Estergruppen wie Diphosphat-, Alkyl-, Arylphosphonat- und
Phosphorothioatester ersetzt sein. Zusätzlich kann die 2'-Hydroxylgruppe an
Ribonukleotiden durch Einschluss solcher Gruppen wie Alkylgruppen
modifiziert sein.
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In
der Anmeldung beschriebene Sonden werden in diagnostischen Tests
als Fang- oder Nachweissonden
verwendet. Solche Fangsonden werden herkömmlicherweise auf einem Festträger direkt
oder indirekt durch kovalente Mittel oder durch passive Adsorption
immobilisiert. Eine Nachweissonde wird durch einen Nachweismarker
ausgewählt
aus radioaktiven Isotopen, Enzymen wie Peroxidase, alkalischer Phosphatase und
Enzymen, die zum Hydrolysieren eines chromogenen, fluorogenen oder lumineszenten
Substrats fähig sind,
Verbindungen, die chromogen, fluorogen oder lumineszent sind, Nukleotidbasenanaloga
und Biotin, markiert.
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In
der Anmeldung beschriebene Sonden werden in einer jeglichen herkömmlichen
Hybridisierungstechnik wie Dot Blot (Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York), Southern Blot (Southern J.
Mol. Biol. (1975) 98: 503), Northern Blot (identisch zu Southern
Blot mit der Ausnahme, dass RNA als ein Ziel verwendet wird) oder
der Sandwichtechnik (Dunn et al., Cell (1977) 12: 23) verwendet.
Die letztere Technik beinhaltet die Verwendung einer spezifischen
Fangsonde und/oder einer spezifischen Nachweissonde mit Nukleotidsequenzen,
die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden.
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Ein
Primer ist eine Sonde mit gewöhnlich
etwa 10 bis etwa 40 Nukleotiden, die zum Starten einer enzymatischen
Polymerisation von DNA in einem Amplifikationsverfahren (z. B. PCR),
in einem Verlängerungsverfahren
oder in einem Verfahren einer reversen Transkription verwendet wird.
Primer, die in diagnostischen Verfahren verwendet werden, die PCR
beinhalten, werden durch bekannte Verfahren markiert.
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Wie
hierin beschrieben, beschreibt die Anmeldung auch (i) ein Reagenz,
das eine in der Anmeldung beschriebene Sonde umfasst, zum Nachweisen
und/oder Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem
biologischen Material, (ii) ein Verfahren zum Nachweisen und/oder
Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem biologischen
Material, bei dem (a) eine Probe von dem biologischen Material wieder gewonnen
wird oder sich davon ableitet, (b) DNA oder RNA von dem Material
extrahiert und denaturiert wird und (c) einer in der Anmeldung beschriebenen
Sonde, z. B. einer Fang-, Nachweissonde oder beidem, unter stringenten
Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt wird, so dass eine Hybridisierung
nachgewiesen wird, und (iii) ein Verfahren zum Nachweisen und/oder
Identifizieren des Vorhandenseins von Chlamydia in einem biologischen
Material, bei dem (a) eine Probe von dem biologischen Material wieder
gewonnen wird oder sich davon ableitet, (b) DNA davon extrahiert
wird, (c) die extrahierte DNA mit mindestens einem und vorzugsweise zwei
in der Anmeldung beschriebenen Primer versetzt wird und durch Polymerasekettenreaktion
amplifiziert wird und (d) das amplifizierte DNA-Fragment produziert
wird.
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Es
ist offensichtlich, dass eine Offenbarung von Polynukleotidsequenzen
von SEQ ID Nr: 1, ihren Homologen und Teilsequenzen ihre entsprechenden
Aminosäuresequenzen
ermöglicht.
Dementsprechend beschreibt ein weiterer Aspekt der Anmeldung ein
im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid oder Polypeptidderivat
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid kodiert
wird.
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Ein "im Wesentlichen aufgereinigtes
Polypeptid", wie
hierin verwendet, wird als ein Polypeptid definiert, das von der
Umgebung abgetrennt ist, in der es natürlich auftritt und/oder das
frei von dem Hauptteil der Polypeptide ist, die in der Umgebung
vorhanden sind, in der es synthetisiert wurde. Zum Beispiel ist
ein im Wesentlichen aufgereinigtes Polypeptid frei von cytoplasmatischen
Polypeptiden. Der Fachmann würde
leicht verstehen, dass die in der Anmeldung beschriebenen Polypeptide
aus einer natürlichen
Quelle, d. h. einem Chlamydia-Stamm, aufgereinigt sein oder durch
rekombinante Mittel produziert werden können.
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Übereinstimmend
mit einem weiteren Aspekt der Anmeldung sind Polypeptide, Homologe
oder Fragmente, die modifiziert oder behandelt sind, um deren Immunogenizität in einem
Zieltier zu erhöhen,
in dem das Polypeptid, Homolog oder die Fragmente einen Schutz gegen
Chlamydia verleihen sollen. Solche Modifikationen oder Behandlungen
beinhalten: Aminosäuresubstitutionen
mit einem Aminosäurederivat
wie 3-Methylhistidin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, etc., Modifikationen
oder Deletionen, die nach Präparation
des Polypeptids, Homologs oder Fragments durchgeführt werden,
wie die Modifikation von freien Amino-, Carboxyl- oder Hydroxylseitengruppen
der Aminosäuren.
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Eine
Identifizierung von Homologen, Polypeptiden oder Polypeptidderivaten,
die durch in der Anmeldung beschriebene Polynukleotide kodiert werden
und die eine spezifische Antigenizität aufweisen, wird durch Screenen
auf Kreuzreaktivität
mit einem Antiserum erreicht, das gegen das Bezugspolypeptid mit
einer Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr: 1 gerichtet ist. Das Verfahren ist wie folgt: ein
monospezifisches Hyperimmunantiserum wird gegen ein aufgereinigtes
Bezugspolypeptid, ein Verschmelzungspolypeptid (z. B. ein Expressionsprodukt
von MBP-, GST- oder His-Tag-Systemen,
wobei die Beschreibung und Anweisungen für eine Verwendung davon in
den Invitrogen-Benutzerhandbüchern
für pcDNA3.1/Myc-His(+)
A, B und C und für
das Proteinaufreinigungssytem XpressTM enthalten
sind) oder ein synthetisches Peptid, das antigen sein soll, gerichtet. Falls
ein Antiserum gegen ein Ver schmelzungspolypeptid gerichtet wird,
werden zwei unterschiedliche Verschmelzungssysteme verwendet. Spezifische
Antigenizität
kann gemäß einer
Reihe von Verfahren bestimmt werden, einschließlich Western Blot (Towbin
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 4350), Dot Blot und ELISA,
wie nachstehend beschrieben.
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In
einem Western Blot-Assay wird das zu screenende Produkt, entweder
als eine aufgereinigte Präparation
oder ein Gesamtextrakt aus E. coli, einer SDS-Page-Elektrophorese
unterzogen, wie von Laemmli (Nature (1970) 227: 680) beschrieben.
Nach Übertragung
auf eine Nitrocellulosemembran wird das Material weiter mit dem
monospezifischen Hyperimmunantiserum inkubiert, das in einem Bereich
von Verdünnungen
von etwa 1:5 bis etwa 1:5000, vorzugsweise etwa 1:100 bis etwa 1:500
verdünnt
wird. Eine spezifische Antigenizität wird gezeigt, sobald eine
Bande, die dem Produkt entspricht, eine Reaktivität bei einer
jeglichen der Verdünnungen
in dem vorstehenden Bereich zeigt.
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In
einem ELISA-Assay wird das zu screenende Produkt vorzugsweise als
das beschichtende Antigen verwendet. Eine aufgereinigte Präparation
wird bevorzugt, obwohl ein Gesamtzellextrakt auch verwendet werden
kann. Kurz gesagt, werden etwa 100 μl einer Präparation bei etwa 10 μg Protein
pro ml in Wells einer 96-Well-Polycarbonat-ELISA-Platte verteilt.
Die Platte wird zwei Stunden bei 37°C sodann bei 4°C über Nacht inkubiert.
Die Platte wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,05% Tween
20 (PBS/Tween-Puffer) gewaschen. Die Wells werden mit 250 μl PBS mit
1% Rinderserumalbumin (BSA) gesättigt,
um ein nicht spezifisches Antikörperbinden
zu verhindern. Nach einstündiger
Inkubation bei 37°C
wird die Platte mit PBS/Tween-Puffer gewaschen. Das Antiserum wird
seriell in PBS/Tween-Puffer
mit 0,5% BSA verdünnt.
100 μl der
Verdünnungen
werden pro Well zugegeben. Die Platte wird 90 Minuten bei 37°C inkubiert,
gewaschen und gemäß Standardverfahren
evaluiert. Zum Beispiel wird ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat zu den Wells
gegeben, wenn spezifische Antikörper
gegen Kaninchen gerichtet wurden. Eine Inkubation erfolgt 90 Minuten
bei 37°C
und die Platte wird gewaschen. Die Reaktion wird mit dem geeigneten
Substrat entwickelt und die Reaktion wird durch Kolorimetrie (die
Absorption wird spektrophotometrisch gemessen) gemessen. Unter den
vorstehenden experimentellen Bedingungen wird eine positive Reaktion
durch O. D.-Werte gezeigt, die größer sind als diejenigen eines
Kontrollserums ohne Immunisierung.
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In
einem Dot Blot-Assay wird ein aufgereinigtes Produkt bevorzugt,
obwohl ein Gesamtzellextrakt auch verwendet werden kann. Kurz gesagt,
wird eine Lösung
des Produkts bei etwa 100 μg/ml
seriell zweifach in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5) verdünnt. 100 μl jeder Verdünnung werden
auf eine Nitrocellulosemembran von 0,45 μm aufgetragen, die sich in einer
96-Well-Dot Blot-Vorrichtung (Biorad) befindet. Der Puffer wird durch
Anwenden von vermindertem Druck an das System entfernt. Wells werden
durch Zugabe von 50 mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5) gewaschen und
die Membran wird luftgetrocknet. Die Membran wird in Blockpuffer (50
mM Tris-HCl (pH-Wert von 7,5), 0,15 M NaCl, 10 g/l Magermilch) gesättigt und
mit einer Antiserum-Verdünnung
von etwa 1:50 bis etwa 1:5000, vorzugsweise etwa 1:500 inkubiert.
Die Reaktion wird gemäß Standardverfahren
deutlich gemacht. Zum Beispiel wird ein Ziegen-Anti-Kaninchen-Peroxidase-Konjugat
zu den Wells gegeben, wenn Kaninchenantikörper verwendet werden. Eine
Inkubation erfolgt 90 Minuten bei 37°C und der Blot wird gewaschen.
Die Reaktion wird mit dem geeigneten Substrat entwickelt und abgestoppt.
Die Reaktion wird visuell durch das Auftreten eines farbigen Punkts,
z. B. durch Kolorimetrie, gemessen. Unter den vorstehenden experimentellen
Bedingungen wird eine positive Reaktion gezeigt, sobald ein farbiger
Punkt mit einer Verdünnung
von mindestens etwa 1:5, vorzugsweise mindestens etwa 1:500 assoziiert
ist.
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Eine
therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit eines hierin beschriebenen
Polypeptids oder Derivats kann wie nachstehend beschrieben evaluiert
werden. Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt stellt (i) eine
Impfstoffzusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid zusammen mit
einem Verdünner oder
Träger
umfasst, insbesondere (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines
in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids enthält, (iii) ein Verfahren zum
Induzieren einer Immunantwort gegen Chlamydia in einem Säuger durch
Verabreichen an den Säuger einer
immunogen wirksamen Menge eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids,
um eine schützende Immunantwort
gegen Chlamydia hervorzurufen, und insbesondere (iv) ein Verfahren
zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion mit Chlamydia
(z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae oder C. pecorum) durch
Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines
in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids an ein infiziertes Individuum
bereit. Zusätzlich
umfasst ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt die Verwendung eines
in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids bei der Herstellung eines
Medikaments zum Verhindern und/oder Behandeln einer Chlamydia-Infektion.
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Wie
hierin verwendet, werden die erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzungen
durch herkömmliche
Wege, die auf dem Impfstoffgebiet bekannt sind, insbesondere an
eine mukosale (z. B. okkulare, intranasale, pulmonale, orale, gastritische,
intestinale, rektale, vaginale oder Harnweg-)Oberfläche oder über den
parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder
intraperitonealen) Weg verabreicht. Die Wahl des Verabreichungsweges
hängt von
einer Reihe von Parametern ab, wie dem mit dem Polypeptid assoziierten
Adjuvans. Falls ein mukosales Adjuvans verwendet wird, ist der intranasale
oder orale Weg bevorzugt. Falls eine Lipidformulierung oder eine
Aluminiumverbindung verwendet wird, ist der parenterale Weg bevorzugt,
wobei der subkutane oder intramuskuläre Weg am meisten bevorzugt
ist. Die Wahl hängt
auch von der Art des Impfstoffmittels ab. Zum Beispiel wird ein
erfindungsgemäßes Polypeptid,
das mit CTP oder LTB verschmolzen ist, am besten an eine mukosale
Oberfläche
verabreicht.
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Wie
hierin verwendet, enthält
die in der Anmeldung beschriebene Zusammensetzung ein oder mehrere
in der Anmeldung beschriebene Polypeptide oder Derivate. Die Zusammensetzung
enthält
gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches Chlamydia-Antigen
oder eine Untereinheit, ein Fragment, Homolog, eine Mutante oder
ein Derivat davon.
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Für eine Verwendung
in einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung
wird ein Polypeptid oder Derivat davon in oder mit Liposomen, vorzugsweise
neutralen oder anionischen Liposomen, Mikrosphären, ISCOMS oder virusartigen
Partikeln (VLPs) formuliert, um eine Zufuhr zu erleichtern und/oder
die Immunantwort zu erhöhen.
Diese Verbindungen sind dem Fachmann leicht erhältlich. Vgl. z. B. Liposomes:
A Practical Approach, RCP New Ed, IRL Press (1990).
-
Adjuvanzien,
die von Liposomen und dergleichen verschieden sind, werden auch
verwendet und sind bekannt. Adjuvanzien können vor einer schnellen Verteilung
durch Absondern davon in ein lokales Depot schützen oder sie können Substanzen
enthalten, die den Wirt stimulieren, Faktoren zu sekretieren, die
für Makrophagen
und andere Komponenten des Immunsystems chemotaktisch sind. Eine
geeignete Selektion kann geeigneterweise durch den Fachmann z. B.
aus denjenigen, die nachstehend (unter einem weiteren Aspekt der
Anmeldung) beschrieben sind, erfolgen.
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Eine
Behandlung wird in einer einzigen Dosis oder wiederholt, wie benötigt, bei
Intervallen erfolgen, wie es leicht durch den Fachmann bestimmt
werden kann. Zum Beispiel folgen auf eine Grundimmunisierungsdosis
("priming dose") drei Boosterdosen
bei wöchentlichen
oder monatlichen Intervallen. Eine geeignete Dosis hängt von
zahlreichen Parametern ab, einschließlich des Empfängers (z.
B. Erwachsener oder Säugling) des
spezifischen Impfstoffantigens, des Wegs und der Häufigkeit
einer Verabreichung, des Vorhandenseins/Fehlens oder Typs des Adjuvans
und der gewünschten
Wirkung (z. B. Schutz und/oder Behandlung), wie es durch den Fachmann
bestimmt werden kann. Allgemein wird ein erfindungsgemäßes Impfstoffantigen durch
einen mukosalen Weg in einer Menge von etwa 10 μg bis etwa 500 mg, vorzugsweise
etwa 1 mg bis etwa 200 mg verabreicht. Für den parenteralen Verabreichungsweg übersteigt
die Dosis gewöhnlich
nicht etwa 1 mg, vorzugsweise etwa 100 μg.
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Wenn
als Impfstoffmittel verwendet, können
die in der Anmeldung beschriebenen Polynukleotide und Polypeptide
sequenziell als Teil eines Vielschrittimmunisierungsverfahrens verwendet
werden. Zum Beispiel wird ein Säuger
anfangs mit einem erfindungsgemäßen Impfstoffvektor
wie einem Pockenvirus, z. B. über
den parenteralen Weg, grundimmunisiert ("primed") und sodann zweimal mit dem Polypeptid,
das durch den Impfstoffvektor kodiert wird, z. B. über den
mukosalen Weg, verstärkt
("boosted"). In einem weiteren
Beispiel werden Liposomen, die mit einem in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptid oder Derivat assoziiert sind, auch zum Grundimmunisieren
verwendet, wobei ein Verstärken
mukosal unter Verwendung eines löslichen,
in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids oder Derivats zusammen
mit einem mukosalen Adjuvans (z. B. LT) durchgeführt wird.
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Ein
in der Anmeldung beschriebenes Polypeptidderivat wird auch gemäß einem
Aspekt der Anmeldung als ein diagnostisches Reagenz zum Nachweisen
des Vorhandenseins von Anti-Chlamydia-Antikörpern, z. B. in einer Blutprobe,
verwendet. Solche Polypeptide weisen eine Länge von etwa 5 bis etwa 80,
vorzugsweise etwa 10 bis etwa 50 Aminosäuren auf. Sie sind entweder
markiert oder nicht markiert, abhängig von dem diagnostischen
Verfahren. Diagnostische Verfahren, die ein solches Reagenz beinhalten,
sind nachstehend beschrieben.
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Nach
Expression eines in der Anmeldung beschriebenen DNA-Moleküls wird
ein Polypeptid oder Polypeptidderivat produziert und unter Verwendung
bekannter Labortechniken aufgereinigt. Wie vorstehend beschrieben,
kann das Polypeptid oder Polypeptidderivat als ein Verschmelzungsprotein
produziert werden, das einen verschmolzenen Schwanz enthält, der
eine Aufreinigung erleichtert. Das Verschmelzungsprodukt wird verwendet,
um einen kleinen Säuger,
z. B. eine Maus oder ein Kaninchen zu immunisieren, um Antikörper gegen
das Polypeptid oder Polypeptidderivat bereitzustellen (monospezifische
Antikörper).
Dementsprechend stellt ein zusätzlicher
Aspekt der Anmeldung einen monospezifischen Antikörper bereit,
der an ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid oder Polypeptidderivat
bindet.
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Unter
einem "monospezifischen
Antikörper" wird ein Antikörper verstanden,
der fähig
ist, mit einem einzigartigen natürlich
vorkommenden Chlamydia-Polypeptid zu reagieren. Ein in der Anmeldung
beschriebener Antikörper
ist entweder polyklonal oder monoklonal. Monospezifische Antikörper können rekombinant,
z. B. chimär
(z. B. durch einen variablen Bereich mit Mausursprung begründet, der
mit einem menschlichen konstanten Bereich assoziiert ist), humanisiert
(ein menschliches immunglobulinkonstantes Rückgrat zusammen mit einem hypervariablen
Bereich eines tierischen, z. B. murinen, Ursprungs) und/oder einzelkettig
sein. Sowohl polyklonale als auch monospezifische Antikörper können auch
in der Form von Immunglobulinfragmenten, z. B. F(ab)'2-
oder Fab-Fragmenten, vorliegen. Die in der Anmeldung beschriebenen
Antikörper
sind von einem jeglichen Isotyp, z. B. IgG oder IgA, und polyklonale
Antikörper
sind von einem einzigen Isotyp oder ein Gemisch von Isotypen.
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Antikörper gegen
die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Polypeptide, Homologe
oder Fragmente werden durch Immunisieren eines Säugers mit einer Zusammensetzung
erzeugt, die das Polypeptid, Homolog oder Fragment umfasst. Solche
Antikörper
können
polyklonal oder monoklonal sein. Verfahren zum Erzeugen von polyklonalen
oder monoklonalen Antikörpern
sind bekannt. Für
eine Übersicht
vergleiche "Antibodies,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. E. Harlow
und D. Lane (1988), und D. E. Yelton et al., 1981. Ann. Rev. Biochem.
50: 657–680.
Für monoklonale
Antikörper
vgl. Kohler & Milstein (1975)
Nature 256: 495–497.
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Die
in der Anmeldung beschriebenen Antikörper, die gegen ein in der
Anmeldung beschriebenes Polypeptid oder Polypeptidderivat gerichtet
werden, werden produziert und unter Verwendung von immunologischen
Standardassays, z. B. Western Blot-Analyse, Dot Blot-Assay oder
ELISA (vgl. z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology
(1994) John Wiley & Sons,
Inc., New York, NY) identifiziert. Die An tikörper werden in diagnostischen
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Chlamydia-Antigens
in einer Probe wie einer biologischen Probe verwendet. Die Antikörper werden
auch in Affinitätschromatographie
zum Aufreinigen eines in der Anmeldung beschriebenen Polypeptids
oder Polypeptidderivats verwendet. Wie weiter nachstehend beschrieben,
können
solche Antikörper
in prophylaktischen und therapeutischen passiven Immunisierungsverfahren
verwendet werden.
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Dementsprechend
beschreibt ein weiterer Aspekt der Anmeldung (i) ein Reagenz zum
Nachweisen des Vorhandenseins von Chlamydia in einer biologischen
Probe, das einen in der Anmeldung beschriebenen Antikörper, ein
in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid oder Polypeptidderivat
enthält,
und (ii) ein diagnostisches Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins
von Chlamydia in einer biologischen Probe durch In-Kontakt-Bringen
der biologischen Probe mit einem in der Anmeldung beschriebenen
Antikörper,
einem in der Anmeldung beschriebenen Polypeptid oder Polypeptidderivat,
so dass sich ein Immunkomplex bildet, und Nachweisen eines solchen
Komplexes, um das Vorhandensein von Chlamydia in der Probe oder
dem Organismus, von dem sich die Probe ableitet, anzuzeigen.
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Der
Fachmann wird leicht verstehen, dass der Immunkomplex zwischen einer
Komponente der Probe und dem Antikörper, Polypeptid oder Polypeptidderivat,
was auch immer verwendet wird, ausgebildet wird und dass ein jegliches
nicht gebundenes Material vor einem Nachweisen des Komplexes entfernt
wird. Es wird verstanden, dass ein Polypeptidreagenz zum Nachweisen
des Vorhandenseins von Anti-Chlamydia-Antikörpern in
einer Probe, z. B. einer Blutprobe, verwendbar ist, während ein
in der Anmeldung beschriebener Antikörper zum Screenen einer Probe,
wie einem gastritischen Extrakt oder einer Biopsie, auf das Vorhandensein
von Chlamydia-Polypeptiden verwendet wird.
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Für diagnostische
Anwendungen liegt das Reagenz (d. h. der in der Anmeldung beschriebene
Antikörper,
das in der Anmeldung beschriebene Polypeptid oder Polypeptidderivat)
entweder in einem freien Zustand vor oder ist an einem Festträger wie
einem Röhrchen,
einem Kügelchen
oder einem anderen herkömmlichen Träger, der
auf dem Gebiet verwendet wird, immobilisiert. Eine Immobilisierung
wird unter Verwendung von direkten oder indirekten Mitteln erreicht.
Direkte Mittel beinhalten passive Adsorption (nicht kovalentes Binden) oder
kovalentes Binden zwischen dem Träger und dem Reagenz. Unter
einem "indirekten
Mittel" wird verstanden,
dass eine Anti-Reagenz-Verbindung, die mit einem Reagenz wechselwirkt,
zuerst an den Festträger
angebunden wird. Zum Beispiel kann, falls ein Polypeptidreagenz
verwendet wird, ein Antikörper,
der daran bindet, als ein Anti-Reagenz dienen, mit der Maßgabe, dass
er an ein Epitop bindet, das nicht bei der Erkennung von Antikörpern in
biologischen Proben beteiligt ist. Indirekte Mittel können auch
ein Ligand-Rezeptor-System verwenden,
zum Beispiel bei dem ein Molekül
wie ein Vitamin auf das Polypeptidreagenz gepfropft ist und der entsprechende
Rezeptor an der Festphase immobilisiert ist. Dies wird durch das
Biotin-Streptavidin-System veranschaulicht. Alternativ dazu wird
ein Peptidschwanz chemisch oder durch genetisches Manipulieren an das
Reagenz angefügt
und das gepfropfte oder verschmolzene Produkt durch passive Adsorption
oder kovalente Bindung an den Peptidschwanz immobilisiert.
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Solche
diagnostischen Mittel können
in einem Kit enthalten sein, der auch Anweisungen für eine Verwendung
umfasst. Das Reagenz ist mit einem Nachweismittel markiert, das
den Nachweis des Reagenzes ermöglicht,
wenn es an sein Ziel gebunden ist. Das Nachweismittel kann ein fluoreszierendes
Mittel wie ein Fluoresceinisocyanat oder Fluoresceinisothiocyanat
oder ein Enzym wie Meerrettichperoxidase oder Luciferase oder alkalische
Phosphatase oder ein radioaktives Element wie 125I
oder 51Cr sein.
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Dementsprechend
beschreibt ein weiterer Aspekt der Anmeldung ein Verfahren zum Aufreinigen
aus einer biologischen Probe eines in der Anmeldung beschriebenen
Polypeptids oder Polypeptidderivats, das ein Durchführen einer
auf Antikörper
basierenden Affinitätschromatographie
mit der biologischen Probe beinhaltet, wobei der Antikörper ein
monospezifischer, in der Anmeldung beschriebener Antikörper ist.
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Für eine Verwendung
in einem in der Anmeldung beschriebenen Aufreinigungsverfahren ist
der Antikörper
entweder polyklonal oder monospezifisch und vorzugsweise ist er
von dem IgG-Typ. Aufgereinigte IgGs werden aus einem Antiserum unter
Verwendung von Standardverfahren (vgl. z. B. Coligan et al., Current
Protocols in Immunology (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY) präpariert.
Herkömmliche
Chromatographieträger
wie auch Standardverfahren zum Pfropfen von Antikörpern sind
in z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, D. Lane, E. Harlow, Hrsg.
(1998), beschrieben und nachstehend angegeben.
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Kurz
gesagt, wird eine biologische Probe, wie ein Extrakt von C. pneumoniae,
vorzugsweise in einer Pufferlösung,
auf ein chromatographisches Material, das vorzugsweise mit dem Puffer äquilibriert
ist, der zum Verdünnen
der biologischen Probe verwendet wurde, aufgetragen, so dass dem
in der Anmeldung beschriebenen Polypeptid oder Polypeptidderivat
(d. h. dem Antigen) ermöglicht
wird, auf das Material zu adsorbieren. Das chromatographische Material,
wie ein Gel oder ein Harz, das an einen in der Anmeldung beschriebenen Antikörper gekoppelt
ist, liegt entweder in einer chargenartigen Form oder als eine Säule vor.
Die nicht gebundenen Komponenten werden herausgewaschen und das
Antigen wird sodann mit einem geeigneten Elutionspuffer, wie einem
Glycinpuffer, oder einem Puffer mit einem chaotropen Mittel, z.
B. Guanidin-HCl, oder mit Hochsalzkonzentration (z. B. 3 M MgCl2) eluiert. Eluierte Fraktionen werden wieder
gewonnen und das Vorhandensein des Antigens wird nachgewiesen, z.
B. durch Messen der Absorption bei 280 nm.
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Ein
weiterer Aspekt der Anmeldung beschreibt (i) eine Zusammensetzung,
die einen monospezifischen, in der Anmeldung beschriebenen Antikörper zusammen
mit einem Verdünner
oder Träger
umfasst, (ii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch
oder prophylaktisch wirksame Menge eines monospezifischen, in der
Anmeldung beschriebenen Antikörpers
umfasst, und (iii) ein Verfahren zum Behandeln oder Verhindern einer
Infektion mit Chlamydia (z. B. C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae
oder C. pecorum) durch Verabreichen einer therapeutischen oder prophylaktischen
Menge eines monospezifischen, in der Anmeldung beschriebenen Antikörpers an
ein infiziertes Individuum. Zusätzlich
beschreibt dieser weitere Aspekt der Anmeldung die Verwendung eines
monospezifischen, in der Anmeldung beschriebenen Antikörpers bei
der Herstellung eines Medikaments zum Behandeln oder Verhindern
einer Chlamydia-Infektion.
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Der
monospezifische Antikörper
ist entweder polyklonal oder monoklonal, vorzugsweise von dem IgA-Isotyp
(vorherrschend). Bei einer passiven Immunisierung wird der Antikörper an
eine mukosale Oberfläche
eines Säugers,
z. B. die gastritische Mukosa, z. B. oral oder intragastrikal, vorteilhafterweise
in Gegenwart eines Bicarbonatpuffers, verabreicht. Alternativ erfolgt
eine systemische Verabreichung, die keinen Bicarbonatpuffer benötigt. Ein
monospezifischer, in der Anmeldung beschriebener Antikörper wird
als eine einzige aktive Komponente oder als ein Gemisch mit mindestens
einem monospezifischen Antikörper,
der für
ein unterschiedliches Chlamydia-Polypeptid spezifisch ist, verabreicht.
Die Menge an Antikörper und
der spezifische verwendete Dosierungsplan werden leicht durch den
Fachmann bestimmt. Zum Beispiel sind eine tägliche Verabreichung von etwa
100 bis 1000 mg an Antikörpern über eine
Woche oder drei Dosen pro Tag an etwa 100 bis 1000 mg an Antikörpern über zwei
oder drei Tage wirksame Dosierungspläne für die meisten Zwecke.
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Die
therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit wird unter Verwendung
von Standardverfahren, z. B. durch Messen einer Induktion einer
mukosalen Immunantwort oder Induktion einer schützenden und/oder therapeutischen
Immunität,
unter Verwendung von z. B. dem C. pneumoniae-Mausmodell evaluiert.
Der Fachmann wird leicht anerkennen, dass der Stamm von C. pneumoniae
des Modells durch einen anderen Chlamydia-Stamm ersetzt werden kann.
Zum Beispiel wird die Wirksamkeit von DNA-Molekülen und Polypeptiden aus C.
pneumoniae vorzugsweise in einem Mausmodell evaluiert, das einen
Stamm von C. pneumoniae verwendet. Ein Schutz wird durch Vergleichen
des Grads der Chlamydia-Infektion zu dem einer Kontrollgruppe bestimmt.
Ein Schutz wird gezeigt, wenn eine Infektion im Vergleich zu der
Kontrollgruppe vermindert ist. Eine solche Evaluierung erfolgt für in der
Anmeldung beschriebene Polynukleotide, Polypeptide und Derivate
davon als auch in der Anmeldung beschriebene Antikörper und
erfindungsgemäße Impfstoffvektoren.
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Adjuvanzien,
die in einer jeglichen der vorstehend beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen
verwendbar sind, sind wie folgt.
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Adjuvanzien
für eine
parenterale Verabreichung beinhalten Aluminiumverbindungen, wie
Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxyphosphat.
Das Antigen wird mit der Aluminiumverbindung gemäß Standardprotokollen präzipitiert
oder darauf adsorbiert. Andere Adjuvanzien, wie RIBI (ImmunoChem,
Hamilton, MT) werden bei einer parenteralen Verabreichung verwendet.
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Adjuvanzien
für eine
mukosale Verabreichung beinhalten bakterielle Toxine, z. B. das
Choleratoxin (CT), das hitzelabile Toxin (LT) von E. coli, das Toxin
A von Clostridium difficile und das Pertussis-Toxin (PT) oder Kombinationen,
Untereinheiten, Toxoide oder Mutanten davon, wie eine aufgereinigte
Präparation
von nativer Choleratoxin-Untereinheit B (CTB). Fragmente, Homologe,
Derivate und Verschmelzen mit einem jeglichen dieser Toxine sind
auch geeignet, mit der Maßgabe,
dass sie eine Adjuvans-Aktivität
beibehalten. Vorzugsweise wird eine Mutante mit einer vermin derten
Toxizität
verwendet. Geeignete Mutanten sind z. B. in der
WO 95/17211 (Arg-7-Lys-CT-Mutante),
WO 96/06627 (Arg-192-Gly-LT-Mutante)
und
WO 95/34323 (Arg-9-Lys-
und Glu-129-Gly-PT-Mutante) beschrieben. Zusätzliche LT-Mutanten, die in
den in der Anmeldung beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen
verwendet werden, beinhalten z. B. Ser-63-Lys-, Ala-69-Gly-, Glu-110-Asp-
und Glu-112-Asp-Mutanten. Andere Adjuvanzien wie ein bakterielles
Monophosphoryl-Lipid
A (MPLA) von z. B. E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimurium
oder Shigella flexneri, Saponine oder Polylactidglycolid(PLGA)-Mikrosphären werden
auch bei einer mukosalen Verabreichung verwendet.
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Adjuvanzien,
die für
sowohl mukosale als auch parenterale Verabreichungen verwendbar
sind, beinhalten Polyphosphazene (
WO
95/02415 ), DC-Chol (3-b-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyl)cholesterin,
US-PS 5,283,185 und
WO 96/14831 ) und QS-21
(
WO 88/09336 ).
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Eine
jegliche erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung, die ein in der Anmeldung beschriebenes Polynukleotid,
ein in der Anmeldung beschriebenes Polypeptid, ein in der Anmeldung
beschriebenes Polypeptidderivat oder einen in der Anmeldung beschriebenen
Antikörper
enthält,
wird in herkömmlicher Art
und Weise hergestellt. Insbesondere wird sie mit einem pharmazeutisch
akzeptablen Verdünner
oder Träger,
z. B. Wasser oder einer Salzlösung
wie Phosphat-gepufferter Salzlösung,
formuliert. Allgemein wird ein Verdünner oder Träger auf
der Grundlage der Art und des Weges einer Verabreichung und pharmazeutischer Standardpraxis
selektiert. Geeignete pharmazeutische Träger oder Verdünner als
auch pharmazeutische Bedürfnisse
für ihre
Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical
Sciences, einem Standardbezugstext in diesem Gebiet, und in der
USP/NF beschrieben.
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Die
Anmeldung beschreibt auch Verfahren, bei denen eine Chlamydia-Infektion
durch orale Verabreichung eines in der Anmeldung beschriebenen Chlamydia-Polypeptids
und eines mukosalen Adjuvans zusammen mit einem Antibiotikum, einem
Antiacidum, Sucralfat oder einer Kombination davon behandelt wird.
Beispiele solcher Verbindungen, die mit dem Impfstoffantigen und
dem Adjuvans verabreicht werden können, sind Antibiotika, einschließlich z.
B. Makroliden, Tetracyclinen und Derivaten davon (spezifische Beispiele
von Antibiotika, die verwendet werden können, beinhalten Azithromycin
oder Doxicyclin oder Immunmodulatoren wie Cytokine oder Steroide).
Zusätzlich
werden Verbindungen verwendet, die mehr als eine der vorstehend
aufgeführten
Komponenten enthalten, die aneinander gekoppelt sind. Die Anmeldung
beschreibt auch Zusammensetzungen zum Durchführen dieser Verfahren, d. h.
Zusammensetzungen mit einem in der Anmeldung beschriebenen Chlamydia-Antigen
(oder -Antigenen), einem Adjuvans und einem oder mehreren der vorstehend aufgeführten Verbindungen
in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünner.
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Es
wurde kürzlich
gezeigt, dass das cysteinreiche 60 kDa-Membranprotein eine Sequenz
enthält,
die kreuzreaktiv mit dem alpha-Myosin-schwere Kette-Epitop M7A-alpha aus Maus ist,
einem Epitop, das im Menschen konserviert ist (Bachmaier et al.,
Science (1999) 283: 1335). Es wird vorgeschlagen, dass diese Kreuzreaktivität zur Entwicklung
einer kardiovaskulären
Erkrankung beiträgt,
und daher kann es vorteilhaft sein, dieses Epitop und jegliche andere
Epitope, die mit menschlichen Antigenen kreuzreagieren, von dem
Protein zu entfernen, falls es als ein Impfstoff verwendet wird.
Dementsprechend beschreibt ein weiterer Aspekt der Anmeldung die
Modifikation der kodierenden Sequenz, z. B. durch Deletion oder
Substitution der Nukleotide, die für das Epitop kodieren, von
Polynukleotiden, die das Protein kodieren, um die Wirksamkeit und
Sicherheit des Proteins als Impfstoff zu verbessern. Ein ähnlicher
Ansatz kann für
ein schützendes
Antigen geeignet sein, von dem festgestellt wurde, dass es nicht
gewünschte
Homologien oder Kreuzreaktivitäten
mit menschlichen Antigenen aufweist.
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Mengen
der vorstehend aufgeführten
Verbindungen, die in den in der Anmeldung beschriebenen Verfahren
und Zusammensetzungen verwendet werden, werden leicht durch den
Fachmann bestimmt. Behandlungs-/Immunisierungspläne sind auch bekannt und werden
durch den Fachmann leicht entwickelt. Zum Beispiel können die
Nichtimpfstoffkomponenten an den Tagen 1–14 verabreicht werden und
das Impfstoffantigen zusammen mit dem Adjuvans kann an den Tagen
7, 14, 21 und 28 verabreicht werden.
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BEISPIELE
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Die
vorstehende Beschreibung beschreibt im Allgemeinen die Erfindung.
Ein vollständigeres
Verstehen kann durch Bezug auf die nachstehenden spezifischen Beispiele
erhalten werden. Diese Beispiele werden lediglich für Veranschaulichungszwecke
beschrieben und sollen den Umfang der Erfindung nicht begrenzen. Änderungen
in der Form und Substitution von Äquivalenten sind vorgesehen,
wie Um stände
es nahe legen oder zweckdienlich machen können. Obwohl spezifische Begriffe
hierin verwendet wurden, sollen solche Begriffe beschreibend sein
und nicht für
Zwecke einer Begrenzung dienen.
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Beispiel 1:
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Plasmid-Vektors pCAmgp002
mit dem Gen von OMP (Protein der äußeren Membran).
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Das
Gen von OMP (Protein der äußeren Membran)
wurde aus genomischer DNA von Chlamydia pneumoniae durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) unter Verwendung eines 5'-Primers
(5' ATAAGAATGCGGCCGCCACCATGGGACTATTCCATCTAACTCTC
3'; SEQ ID Nr: 3)
und eines 3'-Primers
(5' GCGCCGGATCCCCTCCACAATTTTTATGAGTAAGCC 3'; SEQ ID Nr: 4) amplifiziert.
Der 5'-Primer enthält eine
Not I-Restriktionsstelle, eine Ribosombindungsstelle, ein Initiationscodon
und eine Sequenz bei dem 5'-Ende
der Sequenz, die für
das OMP (Protein der äußeren Membran)
kodiert. Der 3'-Primer
beinhaltet die Sequenz, die für
die C-terminale Sequenz des OMP (Protein der äußeren Membran) kodiert, und
eine Bam HI-Restriktionsstelle. Das Stopp-Codon wurde ausgeschlossen
und ein zusätzliches
Nukleotid wurde inseriert, um eine In-Frame-Verschmelzung mit dem
Histidin-Tag zu erhalten.
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Nach
Amplifikation wurde das PCR-Fragment unter Verwendung des PCR-Aufreinigungskits
QIAquickTM (Qiagen) aufgereinigt und sodann
mit Not I und Bam HI verdaut und in den eukaryotischen Expressionsvektor
pCA-Myc-His, der in Beispiel 2 (3) beschrieben
ist, kloniert, wobei die Transkription unter der Kontrolle des menschlichen
CMV-Promotors steht.
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Beispiel 2:
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Herstellung des eukaryotischen Expressionsvektors pCA/Myc-His.
-
Das
Plasmid pcDNA3.1(–)Myc-His
C (Invitrogen) wurde mit Spe I und Bam HI restriktiert, um den CMV-Promotor
zu entfernen, und das verbleibende Vektorfragment wurde isoliert.
Der CMV-Promotor und Intron A aus dem Plasmid VR-1012 (Vical) wurden
auf einem Spe I/Bam HI-Fragment isoliert. Die Fragmente wurden zusammen
ligiert, um das Plasmid pCA/Myc-His zu erzeugen. Das Not I/Bam HI- restriktierte PCR-Fragment
mit dem Gen des OMP (Protein der äußeren Membran) wurde in das
Not I- und Bam HI-restriktierte Plasmid pCA/Myc-His ligiert, um
das Plasmid pCAmgp002 (3) zu erzeugen.
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Das
sich ergebende Plasmid, pCAmgp002, wurde durch Elektroporation in
E. coli XL-1 blue (Stratagene) transferiert, die in LB-Medium mit
50 μg/ml
Carbenicillin wachsen gelassen wurden. Das Plasmid wurde durch Endo
Free Plasmid Giga KitTM (Qiagen), einem
DNA-Aufreinigungssystem großen
Maßstabs,
isoliert. Die DNA-Konzentration wurde durch Absorption bei 260 nm
bestimmt und das Plasmid wurde nach Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung und
Vergleich mit Molekulargewichtsstandards verifiziert. Die 5'- und 3'-Enden des Gens wurden
durch Sequenzierung unter Verwendung von einem LiCor-DNA-Sequenziergerät Modell 4000
L und IRD-800-markierten Primern verifiziert.
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Beispiel 3:
-
Dieses
Beispiel veranschaulicht die Immunisierung von Mäusen, um einen Schutz gegen
eine intranasale Challenge von C. pneumoniae zu erreichen.
-
Es
wurde früher
gezeigt (Yang et al., 1993), dass Mäuse gegenüber einer intranasalen Infektion
mit unterschiedlichen Isolaten von C. pneumoniae empfänglich sind.
Der Stamm AR-39 (Grayston, 1989) wurde in Balb/c-Mäusen als
ein Challenge-Infektionsmodell verwendet, um die Kapazität, eine
schützende
Antwort gegen eine subletale Lungeninfektion mit C. pneumoniae hervorzurufen,
von Chlamydia-Genprodukten, die als nackte DNA zugeführt werden,
zu untersuchen. Eine schützende
Immunität
wird als eine erhöhte
Clearance von pulmonaler Infektion definiert.
-
Gruppen
von 7- bis 9-Wochen alten männlichen
Balb/c-Mäusen
(6 bis 10 pro Gruppe) wurden intramuskulär (i. m.) zusammen mit intranasal
(i. n.) mit Plasmid-DNA,
die die kodierende Sequenz des OMP (Protein der äußeren Membran) von C. pneumoniae
enthält,
wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, immunisiert. Salzlösung oder
der Plasmid-Vektor, dem ein inseriertes Chlamydien-Gen fehlte, wurden
Gruppen von Kontrolltieren gegeben.
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Für eine i.
m.-Immunisierung wurden alternierende linke und rechte Quadrizeps
mit 100 μg
an DNA in 50 μl
PBS an drei Anlässen
bei 0, 3 und 6 Wochen injiziert. Für eine i. n.-Immunisierung
aspirierten anästhesierte
Mäuse 50 μl an PBS
mit 50 μg DNA
an drei Anlässen
bei 0, 3 und 6 Wochen. Bei der Woche 8 wurden immunisierte Mäuse i. n.
mit 5 × 105 IFU an C. pneumoniae, Stamm AR39, in 100 μl SPG-Puffer
angeimpft, um deren Fähigkeit,
das Wachstum einer subletalen Challenge mit C. pneumoniae zu begrenzen,
zu testen.
-
Lungen
wurden aus Mäusen
bei Tag 9 nach der Challenge entnommen und sofort in SPG-Puffer
(7,5% Sucrose, 5 mM Glutamat, 12,5 mM Phosphat, pH-Wert von 7,5)
homogenisiert. Das Homogenat wurde bei –70°C bis zu einem Test eingefroren
gelagert. Verdünnungen
des Homogenats wurden auf das Vorhandensein von infektiösen Chlamydien
durch Animpfen auf Monoschichten von empfänglichen Zellen untersucht.
Das Inokulum wurde auf die Zellen bei 3000 UpM für eine Stunde zentrifugiert,
sodann wurden die Zellen 3 Tage bei 35°C in Gegenwart von 1 μg/ml Cycloheximid
inkubiert. Nach Inkubation wurden die Monoschichten mit Formalin
und Methanol fixiert, sodann auf das Vorhandensein von Chlamydien-Einschlüssen unter
Verwendung von konvaleszenten Seren aus Kaninchen, die mit C. pneumoniae
infiziert worden waren, und metallverbessertem DAB als ein Peroxidase-Substrat
mittels Immunperoxidase angefärbt.
-
4 und
Tabelle 1 zeigen, dass Mäuse,
die i. n. und i. m. mit pCAmgp002 immunisiert worden waren, Chlamydien-Lungentiter
von weniger als 41 000 in 5 von 6 Fällen bei Tag 9 (Mittel 29 783)
aufwiesen, während der
Wertebereich für
Kontrollmäuse,
die mit Salzlösung
scheinimmunisiert worden waren, 13 600 bis 458 100 IFU/Lunge (Mittel
107 641) bei Tag 9 betrug. Eine DNA-Immunisierung war per se für die beobachtete
schützende
Wirkung nicht verantwortlich, da ein weiteres Plasmid-DNA-Konstrukt,
pCABk917, nicht fähig
war, zu schützen,
wobei Lungentiter in immunisierten Mäusen ähnlich (Mittel 85 350 IFU/Lunge)
zu denjenigen waren, die für
Kontrollmäuse
erhalten wurden, die mit Salzlösung
immunisiert worden waren. Das Konstrukt pCABk917 ist identisch zu
pCAmgp002, mit der Ausnahme, dass die Nukleotidsequenz, die für das OMP
(Protein der äußeren Membran)
kodiert, durch eine Nukleotidsequenz von C. pneumoniae ersetzt wurde,
die für ein
weiteres, hypothetisches Protein der äußeren Membran, basierend auf
dem offenen Leserahmen, kodiert. Tabelle 1
MAUS | BAKTERIENLAST
(EINSCHLUSS FORMENDE EINHEITEN PRO LUNGE) IN DEN LUNGEN VON BALB/C-MÄUSEN, DIE MIT VERSCHIEDENEN
DNA-IMMUNISIERUNGSKONSTRUKTEN IMMUNISIERT WURDEN |
IMMUNISIERENDES
KONSTRUKT |
| Salzlösung | PCABk917 | pCA
mgp002 |
| Tag
9 | Tag
9 | Tag
9 |
| | | |
1 | 90000 | 72400 | 18100 |
2 | 69600 | 108000 | 40500 |
3 | 136400 | 24700 | 92700 |
4 | 458100 | 0 | 18600 |
5 | 166500 | 83600 | 5300 |
6 | 49500 | 223400 | 3500 |
7 | 13600 | | |
8 | 150600 | | |
9 | 37600 | | |
10 | 179700 | | |
11 | 91100 | | |
12 | 289400 | | |
13 | 16200 | | |
14 | 233300 | | |
15 | 36300 | | |
16 | 132700 | | |
17 | 57300 | | |
18 | 36900 | | |
19 | 115000 | | |
20 | 108000 | | |
21 | 32600 | | |
22 | 33400 | | |
23 | 16300 | | |
24 | 33300 | | |
| | | |
MITTEL | 107641.7 | 85350 | 29783.33 |
SD | 104011.6 | 78364.07 | 33541.52 |
| | | |
Wilcoxon
p | 0.6223 | 0.02756 |
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