JP2002531129A - クラミジア感染の処置および診断のための化合物および方法 - Google Patents
クラミジア感染の処置および診断のための化合物および方法Info
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Abstract
Description
は、本発明は、Chlamydia抗原を含むポリペプチドに、ならびにChl
amydia感染の血清診断および処置のためのそのようなポリペプチドの使用
に関する。
である、細胞内の細菌性病原体である。Chlamydia trachoma
tisは、最も一般的な性感染病の原因の一つであり、そして骨盤炎症性疾患(
PID)を導き得、そして卵管閉塞および不妊をもたらす。Chlamydia
trachomatisはまた、雄性不妊症においても役割を果たし得る。1
990年に、米国においてPIDを処置する費用は、40億ドルであると見積も
られた。Chlamydia trachomatisによる眼の感染に起因す
るトラコーマは、世界中の予防可能な失明の主な原因である。Chlamydi
a pneumoniaは、ヒトにおける急性気道感染の主な原因であり、そし
てまた、アテローム性動脈硬化の病因において、特に冠状心臓疾患において役割
を果たすと考えられる。Chlamydia pneumoniaに対する高い
力価の抗体を有する個体は、冠状心臓疾患を患う可能性が、セロネガティブ個体
の少なくとも2倍であることが示されている。従って、Chlamydia感染
は、米国および世界中における重要な健康の問題を構成する。
についての医学的注意を要求するときまでは、不可逆的な損傷が既に生じていて
、不妊となってい得る。従って、当該分野では、Chlamydia感染の予防
および処置のための改善されたワクチンおよび薬学的組成物についての必要性が
依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして関連の他の利点を
さらに提供する。
法を提供する。1つの局面では、本発明は、Chlamydia抗原またはこの
ような抗原の改変体の免疫原性部分を含むポリペプチドを提供する。特定の部分
および他の改変体は、免疫原性であり、その結果、この改変体が抗原特異的抗血
清と反応する能力は、実質的に減少していない。特定の実施形態では、このポリ
ペプチドは、以下からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコー
ドされるアミノ酸配列を含む:(a)配列番号1、15、21〜25、44〜6
4、66〜76、79〜88、110〜119、120、122、124、12
6、128、130、132、134、136、169〜174、181〜18
8、263、265および267〜290の配列;(b)上記配列の相補体;な
らびに(c)(a)または(b)の配列に、中程度にストリンジェントな条件下
でハイブリダイズする配列。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、以
下に記載される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むChlamy
diaタンパク質の少なくとも一部を含む:配列番号5〜14、17〜20、2
6、28、30〜32、34、39〜43、65、89〜109、138〜15
8、167、168、224〜262、246、247、254〜256、29
2およびそれらの改変体。
タンパク質の少なくとも15アミノ酸残基をコードする一部)をコードするポリ
ヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのよ
うな発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞をさらに提供
する。
これらのポリヌクレオチド配列の1つ以上を含む組換え発現ベクター、およびこ
のような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞もまた提
供される。
めの、生理学的に受容可能なキャリアまたは免疫刺激物質と組み合わせた、本発
明のポリペプチドを含む融合タンパク質、あるいは、本発明のポリペプチドおよ
び公知のChlamydia抗原を含む融合タンパク質、ならびにこのような融
合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
iaタンパク質に特異的に結合する、ポリクローナルおよびモノクローナルの両
方の抗体またはその抗原結合フラグメント;ならびに(b)生理学的に受容可能
なキャリア。他の局面では、本発明は、本明細書中に開示される1以上のChl
amydiaポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド分子、および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供
する。本発明はまた、開示されたポリペプチドのうちの1以上および本明細書中
で定義されたような免疫刺激物質を含む、予防または治療の目的のためのワクチ
ンを、このようなポリペプチドをコードする1以上のポリヌクレオチド配列およ
び免疫刺激物質を含むワクチンとともに提供する。
この方法は、有効量の1以上の上記の薬学的組成物またはワクチンを患者に投与
する工程を含む。
供され、この方法は、この患者由来の末梢血単核細胞(PBMC)を入手する工
程、このPBMCを本発明のポリペプチド(またはこのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド)とともにインキュベートして、インキュベートされ
たT細胞を提供する工程、およびこのインキュベートされたT細胞をこの患者に
投与する工程を含む。本発明はさらに、Chlamydia感染の処置方法を提
供し、この方法は、抗原提示細胞を、本発明のポリペプチド(またはこのような
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)とともにインキュベートしてイン
キュベートされた抗原提示細胞を提供する工程、およびこのインキュベートされ
た抗原提示細胞をこの患者に投与する工程を含む。増殖した細胞は、その患者へ
の投与の前にクローニングされてもよいが、その必要はない。特定の実施形態で
は、この抗原提示細胞は、以下からなる群より選択される:樹状細胞、マクロフ
ァージ、単球、B細胞および線維芽細胞。本発明のポリペプチドまたはポリヌク
レオチドとともにインキュベートされたT細胞または抗原提示細胞を含む、Ch
lamydia感染の処置のための組成物もまた提供される。関連する局面では
、以下を含むワクチンが提供される:(a)上記の通りのポリペプチドを発現す
る抗原提示細胞および(b)免疫刺激物質。
サンプルから除去するための方法を提供し、この方法は、生物学的サンプルを、
Chlamydiaタンパク質と特異的に反応するT細胞と接触させる工程を含
み、ここでこの接触させる工程は、このタンパク質を発現する細胞の、このサン
プルからの除去を可能にするに十分な条件下および時間で行われる。
めの方法が提供され、この方法は、上記の通りに処理した生物学的サンプルを患
者に投与する工程を含む。本発明のさらなる局面では、患者におけるChlam
ydia感染を検出するための方法および診断キットが提供される。1つの実施
形態では、この方法は以下を含む:(a)生物学的サンプルを、本明細書中に開
示されたポリペプチドまたは融合タンパク質のうちの少なくとも1つと接触させ
る工程;および(b)このサンプルにおいて、このポリペプチドまたは融合タン
パク質に結合する結合因子の存在を検出し、それによってこの生物学的サンプル
におけるChlamydia感染を検出する工程。適切な生物学的サンプルとし
ては、全血、痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿が挙げられる。1つの実
施形態では、診断キットは、本明細書中に開示されたポリペプチドまたは融合タ
ンパク質のうちの1以上を、検出試薬と組み合わせて含む。なお別の実施形態で
は、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する、モノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体のいずれかを含む。
a)患者から生物学的サンプルを入手する工程;(b)このサンプルを、ポリメ
ラーゼ連鎖反応における少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触
させる工程であって、このオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも一
方は、本明細書中に開示されたポリヌクレオチド配列と特異的である、工程;お
よび(c)このサンプルにおいて、このオリゴヌクレオチドプライマーの存在下
で増幅するポリヌクレオチド配列を検出する工程。1つの実施形態では、このオ
リゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示されるペプチドのポリヌクレ
オチド配列またはそれにハイブリダイズする配列のうちの少なくとも約10個の
連続したヌクレオチドを含む。
感染の検出方法を提供する:(a)生物学的サンプルを患者から入手する工程;
(b)このサンプルを、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程;および(c)このサンプルに
おいて、このオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド配列を検出する工程。1つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドプローブ
は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列またはそれにハイブリダイズ
する配列のうちの少なくとも約15個の連続したヌクレオチドを含む。
る。本明細書中に開示される全ての参考文献は、あたかも個々の援用されたかの
ように、その全体が本明細書中に参考として援用される。
の決定されたDNA配列である。
の決定されたDNA配列である。
の決定されたDNA配列である。
いての決定されたDNA配列である。
ある。
ある。
Iクローン2C7−8についての決定されたDNA配列である。
1の推定オープンリーディングフレームについての決定されたDNA配列である
。
1の推定オープンリーディングフレームによってコードされる推定アミノ酸配列
である。
2の推定オープンリーディングフレームによってコードされる推定アミノ酸配列
である。
4C9−18についての決定されたDNA配列である。
oamide Dehydrogenaseに相同な決定されたDNA配列であ
る。
ンパク質に相同な決定されたDNA配列である。
quinone Mehtyltransferaseに相同な決定されたDN
A配列である。
4C9−18#2 BL21 pLysSについての決定されたDNA配列であ
る。
18#2についての推定アミノ酸配列である。
ついての決定されたDNA配列である。
ついての推定アミノ酸配列である。
いての決定されたDNA配列である。
いての推定アミノ酸配列である。
ーのコンセンサスペプチドについてのアミノ酸配列である。
2C7−8についての推定アミノ酸配列である。
omatis serovar D由来のクローンの決定されたDNA配列であ
る。
酸配列である。
5’プライマー)についてのDNA配列である。
I(3’プライマー)についてのDNA配列である。
’プライマー)についてのDNA配列である。
(3’プライマー)についてのDNA配列である。
ib 52−67ペプチドについてのアミノ酸配列である。
プチドについてのアミノ酸配列である 配列番号41は、ヒトSWIドメイン由来のHuSwib 288−302ペ
プチドについてのアミノ酸配列である。
融合体由来のCtSWI−T 822−837ペプチドについてのアミノ酸配列
である。
体由来のCpSWI−T 828−842ペプチドについてのアミノ酸配列であ
る。
Iクローン19783.3(jen.seq(1>509)CTL2#11−3
’)についての第1の決定されたDNA配列である。
Iクローン19783.4(jen.seq(1>481)CTL2#11−5
’)についての第2の決定されたDNA配列である。
84CTL2 12consensus.seq((1>427)CTL2#1
2)についての決定されたDNA配列である。
Iクローン19785.4(jen.seq(1>600)CTL2#16−5
’)についての決定されたDNA配列である。
Iクローン19786.3(jen.seq(1>600)CTL2#18−3
’)についての第1の決定されたDNA配列である。
Iクローン19786.4(jen.seq(1>600)CTL2#18−5
’)についての第2の決定されたDNA配列である。
88CTL2 21consensus.seq(1>406)CTL2#21
についての決定されたDNA配列である。
90CTL2 23consensus.seq(1>602)CTL2#23
についての決定されたDNA配列である。
91CTL2 24consensus.seq(1>145)CTL2#24
についての決定されたDNA配列である。
2#4についての決定されたDNA配列である。
2#8bについての決定されたDNA配列である。
性を共有するC.trachomatis LGV IIクローンl5−G1−
89についての決定されたDNA配列である。
有するC.trachomatis LGV IIクローン14−H1−4につ
いての決定されたDNA配列である。
rachomatis LGV IIクローン12−G3−83についての決定
されたDNA配列である。
性を共有するC.trachomatis LGV IIクローン12−B3−
95についての決定されたDNA配列である。
rachomatis LGV IIクローン11−H4−28についての決定
されたDNA配列である。
T318に対する部分的相同性を共有するC.trachomatis LGV
IIクローン11−H3−68についての決定されたDNA配列である。
ーゲンデヒドロゲナーゼ遺伝子CT042に対する部分的相同性を共有する、C
.trachomatis LGV IIクローン11−G1−34についての
決定されたDNA配列である。
rachomatis LGV IIクローン11−G10−46についての決
定されたDNA配列である。
rachomatis LGV IIクローン11−C12−91についての決
定されたDNA配列である。
を共有するC.trachomatis LGV IIクローン11−A3−9
3についての決定されたDNA配列である。
有するC.trachomatis LGV IIクローン14−H1−4につ
いての決定されたアミノ酸配列である。
2#9についての決定されたDNA配列である。
2#7についての決定されたDNA配列である。
2#6についての決定されたDNA配列である。
2#5についての決定されたDNA配列である。
2#2についての決定されたDNA配列である。
2#1についての決定されたDNA配列である。
Iクローン23509.2CtL2#3−5’についての第1の決定されたDN
A配列である。
Iクローン23509.1CtL2#3−3’についての第2の決定されたDN
A配列である。
21.2CtL2#10−5’について第1の決定されたDNA配列であり、5
’末端を示す。
21.2CtL2#10−3’について第2の決定されたDNA配列であり、3
’末端を示す。
87.6CtL2#19−5’について決定されたDNA配列であり、5’末端
を示す。
13−Hisについて決定されたDNA配列である。
SSWIB−Hisについて決定されたDNA配列である。
G7−68について決定されたDNA配列であり、L11、L10およびL1リ
ボソームタンパク質に対する部分的相同性を共有する。
F8−91について決定されたDNA配列であり、pmpC遺伝子に対する相同
性を共有する。
E8−95について決定されたDNA配列であり、CT610−CT613遺伝
子に対する相同性を共有する。
F12−57について決定されたDNA配列であり、CT858およびrecA
遺伝子に対する相同性を共有する。
F12−53について決定されたDNA配列であり、グルタミルtRNAシンテ
ターゼをコードするCT445遺伝子に対する相同性を共有する。
A5−54について決定されたDNA配列であり、潜在プラスミド遺伝子に対す
る相同性を共有する。
E11−72について決定されたDNA配列であり、OppC_2およびpmp
D遺伝子に対する部分的相同性を共有する。
C1−77について決定されたDNA配列であり、CT857およびCT858
オープンリーディングフレームに対する部分的相同性を共有する。
H2−76について決定されたDNA配列であり、pmpDおよびSysE遺伝
子ならびにCT089ORFに対する部分的相同性を共有する。
A3−26について決定されたDNA配列であり、CT858ORFに対する相
同性を共有する。
sについて決定されたアミノ酸配列である。
2_LPDA_FLについて決定されたアミノ酸配列である。
ついて決定されたアミノ酸配列である。
2_TSA_FLについて決定されたアミノ酸配列である。
wib43−61ペプチドについてのアミノ酸配列である。
wib48−67ペプチドについてのアミノ酸配列である。
wib52−71ペプチドについてのアミノ酸配列である。
wib58−77ペプチドについてのアミノ酸配列である。
wib63−82ペプチドについてのアミノ酸配列である。
wib51−66ペプチドについてのアミノ酸配列である。
ペプチドについてのアミノ酸配列である。
1ペプチドについてのアミノ酸配列である。
1ペプチドについてのアミノ酸配列である。
6ペプチドについてのアミノ酸配列である。
50ペプチドについてのアミノ酸配列である。
65ペプチドについてのアミノ酸配列である。
80ペプチドについてのアミノ酸配列である。
0ペプチドについてのアミノ酸配列である。
65ペプチドについてのアミノ酸配列である。
75ペプチドについてのアミノ酸配列である。
5ペプチドについてのアミノ酸配列である。
−G12−60について決定されたDNA配列であり、ハイポセティカルタンパ
ク質CT875、CT229およびCT228についての部分的オープンリーデ
ィングフレームを含む。
−B3−53について決定されたDNA配列であり、GroELのCT110
ORFに対する相同性を共有する。
−A1−49について決定されたDNA配列であり、CT660およびCT65
9 ORFに対する部分的相同性を共有する。
−E2−9について決定されたDNA配列であり、CT611およびCT610
ORFに対する部分的相同性を共有する。
−C10−31について決定されたDNA配列であり、CT858 ORFに対
する部分的相同性を共有する。
−C7−66について決定されたDNA配列であり、dnaK様遺伝子に対する
相同性を共有する。
−G3−45について決定されたDNA配列であり、pmpB遺伝子CT413
の部分を含む。
−C5−2について決定されたDNA配列であり、S1リボソームタンパク質O
RFに対する相同性を共有する。
−C5−19について決定されたDNA配列であり、CT431およびCT43
0についてのORFの部分を含む。
−D4−22について決定されたDNA配列であり、哺乳動物細胞内の増殖につ
いてのプラスミドのORF3およびORF4の部分的配列を含む。
ap1遺伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
ap1遺伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
子CT529について決定された全長DNA配列である。
子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
子CT529について決定された全長DNA配列である。
子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
ap1遺伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
ap1遺伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
伝子CT529について決定された全長DNA配列である。
伝子CT529について推定された全長アミノ酸配列である。
1遺伝子CT529について決定された全長アミノ酸配列である。
1遺伝子CT529について推定された全長DNA配列である。
CT529 ORFペプチド#124−139について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#132−147について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#138−155について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#146−163について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#154−171について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#163−178について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#138−147について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#139−147について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#140−147について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#138−146について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#138−145について決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド#F140−>Iについて決定されたアミノ酸配列
である。
CT529 ORFペプチド##S139>Gaについて決定されたアミノ酸配
列である。
CT529 ORFペプチド##S139>Gbについて決定されたアミノ酸配
列である。
ORFのペプチド#2C7.8−6について決定されたアミノ酸配列である。
ORFのペプチド#2C7.8−7について決定されたアミノ酸配列である。
ORFのペプチド#2C7.8−8について決定されたアミノ酸配列である。
ORFのペプチド#2C7.8−9について決定されたアミノ酸配列である。
ORFのペプチド#2C7.8−10について決定されたアミノ酸配列である
。
C7.8内の216aa ORFの53アミノ酸残基ペプチドについて決定され
たアミノ酸配列である。
C7.8内のCT529 ORFの52アミノ酸残基ペプチドについて決定され
たアミノ酸配列である。
5’(正方向)プライマーについて決定されたDNA配列である。
5’(逆方向)プライマーについて決定されたDNA配列である。
クローニングするための5’(正方向)プライマーについて決定されたDNA配
列である。
クローニングするための5’(逆方向)プライマーについて決定されたDNA配
列である。
めの5’(正方向)プライマーについて決定されたDNA配列である。
めの5’(逆方向)プライマーについて決定されたDNA配列である。
て決定されたDNA配列である。
て決定されたDNA配列である。
#139−147について決定されたアミノ酸配列である。
139−147について決定されたアミノ酸配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長DNA配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定された全長アミノ酸配列である。
定されたDNA配列(シグナル配列を含まない)である。
いて決定された全長DNA配列である。
定されたDNA配列(シグナル配列を含まない)である。
カルボキシ末端を示す第1の決定されたDNA配列である。
アミノ末端を示す第2の決定されたDNA配列(シグナル配列を含まない)であ
る。
カルボキシ末端を示す第1の決定されたDNA配列である。
アミノ末端を示す第2の決定されたDNA配列(シグナル配列を含まない)であ
る。
s血液型亜型MOMPS pmp遺伝子を示す決定されたDNA配列である。
定されたアミノ酸配列(シグナル配列を含まない)である。
いて推定されたアミノ酸配列である。
定されたアミノ酸配列(シグナル配列を含まない)である。
カルボキシ末端を示す第1の推定されたアミノ酸配列である。
アミノ末端を示す推定されたアミノ酸配列(シグナル配列を含まない)である。
カルボキシ末端を示す第1の推定されたアミノ酸配列である。
アミノ末端を示す第2の推定されたアミノ酸配列である。
e血液型亜型MOMPS pmp遺伝子を示す推定されたアミノ酸配列である。
is pmpC遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpC遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpC遺伝子をクローニングするための挿入配列について決定されたD
NA配列である。
is pmpD遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpD遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpD遺伝子をクローニングするための挿入配列について決定されたD
NA配列である。
is pmpE遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpE遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpG遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
is pmpG遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて
決定されたDNA配列である。
s pmpC遺伝子のアミノ末端部分をクローニングするための5’オリゴプラ
イマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpC遺伝子のアミノ末端部分をクローニングするための3’オリゴプラ
イマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpC遺伝子のカルボキシ末端部分をクローニングするための5’オリゴ
プライマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpC遺伝子のカルボキシ末端部分をクローニングするための3’オリゴ
プライマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpD遺伝子のアミノ末端部分をクローニングするための5’オリゴプラ
イマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpD遺伝子のアミノ末端部分をクローニングするための3’オリゴプラ
イマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpD遺伝子のカルボキシ末端部分をクローニングするための5’オリゴ
プライマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpD遺伝子のカルボキシ末端部分をクローニングするための3’オリゴ
プライマーについて決定されたDNA配列である。
s pmpE遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
s pmpE遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
s pmpE遺伝子をクローニングするための挿入配列について決定されたDN
A配列である。
s pmpE遺伝子をクローニングするための挿入配列についてのアミノ酸配列
である。
s pmpG遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
s pmpG遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
s pmpG遺伝子をクローニングするための挿入配列についてのアミノ酸配列
である。
s pmpI遺伝子をクローニングするための5’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
s pmpI遺伝子をクローニングするための3’オリゴプライマーについて決
定されたDNA配列である。
ついて決定されたアミノ酸配列である。
ついて決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
について決定されたアミノ酸配列である。
122について決定されたアミノ酸配列である。
127について決定されたアミノ酸配列である。
132について決定されたアミノ酸配列である。
137について決定されたアミノ酸配列である。
143について決定されたアミノ酸配列である。
147について決定されたアミノ酸配列である。
152について決定されたアミノ酸配列である。
156について決定されたアミノ酸配列である。
161について決定されたアミノ酸配列である。
166について決定されたアミノ酸配列である。
171について決定されたアミノ酸配列である。
176について決定されたアミノ酸配列である。
181について決定されたアミノ酸配列である。
186について決定されたアミノ酸配列である。
190について決定されたアミノ酸配列である。
186について決定されたアミノ酸配列である。
186について決定されたアミノ酸配列である。
186について決定されたアミノ酸配列である。
98について決定されたアミノ酸配列である。
5について決定されたアミノ酸配列である。
20について決定されたアミノ酸配列である。
25について決定されたアミノ酸配列である。
30について決定されたアミノ酸配列である。
35について決定されたアミノ酸配列である。
40について決定されたアミノ酸配列である。
45について決定されたアミノ酸配列である。
50について決定されたアミノ酸配列である。
55について決定されたアミノ酸配列である。
伝子血液型亜型Iについて決定された全長DNA配列である。
伝子血液型亜型Iについて予測された全長アミノ配列である。
伝子血液型亜型Kについて決定された全長DNA配列である。
伝子血液型亜型Kについて予測された全長アミノ配列である。
d)RNAポリメラーゼβサブユニット−CT315のORFの一部に対する相
同性を共有するC.trachomatisクローン17−G4−36について
決定されたDNA配列である。
CT016遺伝子の部分配列について決定されたDNA配列である。
tRNAシンターゼ遺伝子の部分配列について決定されたDNA配列である。
clpX遺伝子の部分配列について決定されたDNA配列である。
L2gam−30について決定された第1のDNA配列である。
L2gam−30について決定された第2のDNA配列である。
8について決定されたDNA配列である。
7について決定されたDNA配列である。
6について決定されたDNA配列である。
4について決定されたDNA配列である。
3について決定されたDNA配列である。
1について決定されたDNA配列である。
8について決定されたDNA配列である。
7について決定されたDNA配列である。
L2gam−15について決定された第1のDNA配列である。
L2gam−15について決定された第2のDNA配列である。
3について決定されたDNA配列である。
0について決定されたDNA配列である。
について決定されたDNA配列である。
L2gam−6について決定された第1のDNA配列である。
L2gam−6について決定された第2のDNA配列である。
について決定されたDNA配列である。
について決定されたDNA配列である。
について決定されたDNA配列である。
ついて決定された全長DNA配列である。
ついて予測された全長アミノ酸配列である。
is pmpG遺伝子をクローニングするための挿入配列について決定されたD
NA配列である。
組成物および方法に関する。1つの局面において、本発明の組成物は、Chla
mydia抗原の少なくとも1つの免疫原性部分またはその改変体を含むポリペ
プチドを含む。
を含むポリペプチドを開示する。ここで、Chlamydia抗原は、(a)配
列番号1、15、21〜25、44〜64、66〜76、79〜88、110〜
119、120、122、124、126、128、130、132、134、
136、169〜174、181〜188、263、265および267〜29
0に記載されたヌクレオチド配列、(b)このヌクレオチド配列の相補体、なら
びに(c)このような配列の改変体からなる群より選択される配列を含むポリヌ
クレオチド分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。
ンパク質を含む)のアミノ酸鎖(すなわち、抗原)を含む。ここで、このアミノ
酸残基は、共有ペプチド結合により連結されている。従って、本発明の抗原のう
ちの1つの免疫原性部分を含むポリペプチドは、免疫原性部分全体からなっても
よいし、さらなる配列を含んでいてもよい。このさらなる配列は、ネイティブな
Clamydia抗原から誘導されてもよいし、異種でもよく、そしてこのよう
な配列は、免疫原性であり得る(しかし、必要ではない)。
クレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーを意
味し、そしてDNAおよび対応するRNA分子(HnRNAおよびmRNAの分
子を含む)、センス鎖およびアンチセンス鎖両方を含み、cDNA、ゲノムDN
Aおよび組換えDNA、ならびに合成ポリヌクレオチドの全体または一部を含む
。HnRNA分子はイントロンを含み、そして一般的に一対一の様式でDNA分
子に対応する。mRNA分子は、イントロンが切り出されたHnRNA分子およ
びDNA分子に対応する。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体、またはその一部か
らなり得る。作動可能なアンチセンスポリヌクレオチドは、対応するポリヌクレ
オチドのフラグメントを含み得、従って、「ポリヌクレオチド」の定義は、この
ような全ての作動可能なアンチセンスフラグメントを含む。
し得る(すなわち、感染個体由来の血清を用いた吸光度読み取り(これは、本明
細書に記載の代表的ELISAアッセイにおいて、非感染個体由来の血清を用い
て得た吸光度を少なくとも3標準偏差上回る)を生成する)部分である。このよ
うな免疫原性部分は、一般に、少なくとも約5アミノ酸残基、より好ましくは、
少なくとも10、そして最も好ましくは少なくとも20アミノ酸残基を含む。公
知の配列の抗原の免疫原性部分を調製および同定するための方法は、当該分野で
周知であり、そしてPaul,Fundamental Immunology
、第3版,Raven Press,1993,第243〜247頁およびそこ
に引用されている参考文献に要約されている方法を含む。このような技術として
は、抗原特異的抗体、抗血清および/またはT細胞株もしくはクローンと反応す
る能力についてポリペプチドをスクリーニングする技術を含む。本明細書におい
て用いる場合、抗血清および抗体は、抗原に特異的に結合する場合、「抗原特異
的」である(すなわち、抗血清および抗体は、ELISAまたは他のイムノアッ
セイにおいてそのタンパク質と反応し、そして関連しないタンパク質とは検出可
能に反応しない)。このような抗血清および抗体は、本明細書において記載され
るように、そして周知の技術を用いて調製され得る。ネイティブなChlamy
diaタンパク質の免疫原性部分は、(例えば、ELISAおよび/またはT細
胞反応性アッセイにおいて)全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低いレベ
ルで、このような抗血清および/またはT細胞と反応する部分である。このよう
な免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、全長ポリペプチドの反応性と
類似かまたはより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一
般に当業者に周知の方法(例えば、HarlowおよびLane、Antibo
dies:A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory,1988に記載の方法)を用いて実行
され得る。例えば、ポリペプチドは、個体支持体上に固定され得、そして患者の
血清と接触されて、固定されたポリペプチドに対する血清内の抗体の結合を可能
にする。次いで、非結合血清は、取り出され得、そして例えば、125I標識プロ
テインAを用いて検出した抗体と結合され得る。
9、10、18、19、31、39、93〜96、98、100〜102、10
6、108、138〜140、158、167、168、246、247および
354〜256において提供されるT細胞刺激エピトープが挙げられる。本明細
書に記載されるとおり、1つ以上のChlamydia抗原の少なくとも1つの
免疫原性部分を含むポリペプチドは、一般に、患者のChlamydia感染を
検出するために、単独かまたは組み合わせて、用いられ得る。
ド分子の改変体を含む。このような改変体としては、本発明の配列の天然に生じ
る対立遺伝子改変体が挙げられるがこれらに限定されない。特に、改変体は、他
のChlamydiaeの血清型亜型(例えば、血清型亜型D、EおよびF、な
らびにいくつかのLGV血清型亜型(本明細書に記載される、本発明のポリペプ
チドおよびポリヌクレオチド分子と相同性を共有する))を含む。好ましくは、
この血清型相同体は、本明細書に記載される対応するポリペプチド配列に対して
95〜99%の相同性を示す。
び/または改変のみにおいて示されたポリペプチドとは異なるポリペプチドであ
り、従ってこのポリペプチドの抗原性部分は保持されている。好ましい実施形態
において、改変ポリペプチドは、5つ以下のアミノ酸の置換、欠失または付加に
よって、同定された配列とは異なる。このような改変体は、一般に、上記のポリ
ペプチド配列のうちの1つを改変すること、および、例えば、本明細書において
記載されている代表的な手順を使用して、改変ポリペプチドの抗原特性を評価す
ることによって、同定され得る。換言すれば、抗原特異的抗血清とと反応する改
変体の能力は、ネイティブなタンパク質に対して、強化され得るかもしくは不変
であり得、またはネイティブなタンパク質に対して、50%未満および好ましく
は20%未満程度減らされ得る。このような改変体は、一般に、本明細書におい
て記載のように上記のポリペプチド配列のうちの1つを改変すること、および抗
原特異的抗体または抗血清との改変ポリペプチドの反応性を評価することよって
同定され得る。好ましい改変体は、1つ以上の部分(例えば、N末端リーダー配
列または膜貫通ドメイン)が除去された改変体を含む。他の好ましい改変体は、
小さい部分(例えば、1〜30アミノ酸、好ましくは5〜15アミノ酸)が、成
熟タンパクのN末端および/またはC末端から除去されている改変体を含む。ポ
リペプチド改変体は、好ましくは、同定されたポリペプチドに対して、少なくと
も約70%、より好ましくは、少なくとも約90%そして最も好ましくは少なく
とも約95%の同一性(下記のように決定される場合)を示す。
の性質を有する別のアミノ酸と置換されている、置換であり、従って、ペプチド
化学の当業者は、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標の性質が実質
的に不変であると予期する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解
度、疎水性、親水性および/または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得
る。例えば、負に荷電されるアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミ
ン酸が挙げられる;正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが
挙げられる;そして、類似の親水性値を有する荷電してない極性のヘッド基を有
するアミノ酸としては、以下が挙げられる:ロイシン、イソロイシンおよびバリ
ン;グリシンおよびアラニン;アスパラギンおよびグルタミン;ならびに、セリ
ン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシン。保存的変化を表し得るアミ
ノ酸の他の群としては、以下が挙げられる:(1)ala、pro、gly、g
lu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、ty
r、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)
lys、arg、his;ならびに(5)phe、tyr、trp、his。改
変体はまた、あるいは非保存的変化を含んでもよい。好ましい実施形態において
、改変体ポリペプチドは、5つ以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって
ネイティブな配列と異なる。改変体はまた(あるいは)、例えば、ポリペプチド
の免疫原性、二次構造および疎水性親水性指標の性質に対して最小の影響しか有
さないアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。改変体はまた(あるい
は)、ポリペプチドの抗原特性、二次構造および疎水性親水性指標性質に対して
最小の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加を含む、他の改変を含み得る
。例えば、ポリペプチドは、翻訳同時的に(co−translational
ly)または翻訳後的に(post−translationally)タンパ
クの移動を指向するタンパクのN末端における、シグナル配列(またはリーダー
配列)に対して複合体化し得る。このポリペプチドはまた、ポリペプチド(例え
ば、ポリ−His)の合成、精製または同定の容易さのために、または、固体支
持体へのポリペプチドの結合を強化するために、リンカーまたは他の配列に対し
て複合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのFc領域に対
して複合体化され得る。
低下しないように、ネイティブなタンパク質に対して、1つ以上のヌクレオチド
の欠失、置換または付加を有して、列挙されたヌクレオチド配列と異なる配列で
ある。本明細書において記載されるように、コードされたポリペプチドの免疫原
性に対する効果は、一般に評価され得る。このような改変は、例えば、Adel
manら(DNA、2:183、1983)によって教示されるように、オリゴ
ヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発のような標準的な変異誘発技術を用いて
容易に誘導され得る。ヌクレオチド改変体は、以下に議論されたような、天然に
存在する対立遺伝子改変体であってもよいし、または天然に存在しない改変体で
あってもよい。改変体ヌクレオチド配列は、列挙された配列に対して、少なくと
も好ましくは約70%、より好ましくは、少なくとも約80%および最も好まし
くは少なくとも約90%の同一性(下記のように決定した場合)を示す。
に列挙されるポリヌクレオチド配列の1つ以上に対して相同であるポリヌクレオ
チド配列によって、コードされる改変体を含む。本明細書において用いる場合、
「実質的な相同性」とは、適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし
得るポリヌクレオチド配列をいう。適切な適度にストリンジェントな条件は、以
下を含む:5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)
の溶液中でのプレ洗浄;一晩、50〜65℃、5×SSCでのハイブリダイゼー
ション、または種間交差相同性の事象の場合には、0.5×SSCを用いる45
℃でのハイブリダイゼーション;その後の、0.1%SDSを含有する2×、0
.5×および0.2×のSSCのいずれかでの65℃20分間の2回の洗浄。こ
のようなハイブリダイズするポリヌクレオチド配列はまた、本発明のポリペプチ
ドと同じポリペプチドをコードする(コドン縮重に起因して)ヌクレオチド配列
であることにより、本発明の範囲内である。
レオチド配列またはアミノ酸残基の配列が、下記のように最大一致について整列
されるときに、同じである場合、「同一である」といわれる。2つの配列間の比
較は、代表的に、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって実行さ
れ、配列類似性の局所領域を同定および、比較する。本明細書において用いられ
る場合、「比較ウインドウ(comparison window)」とは、少
なくとも約20の隣接する位置のセグメント(通常約30〜約75、40〜約5
0)のセグメントをいう。ここで、配列は、2つの配列が最適に整列されたあと
、連続する位置の同数の参照配列と比較され得る。
ンフォマティクスのソフトウェアのLasergeneパッケージソフト(su
ite)(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)における、Me
galignプログラムを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文
献に記載されているいくつかの整列スキームを具体化する:Dayhoff,M
.O.(1978)A model of evolutionary cha
nge in proteins−Matrices for detecti
ng distant relationships、Dayhoff,M.O
.編、Atlas of Protein Sequence and Str
ucture,National Biomedical Resarch F
oundation,Washington DC 第5巻,補遺3,第345
〜358頁;Hein J.(1990)Unified Approach
to Alignment and Phylogenes 第626〜645
頁、Methods in Enzymology、第183巻,Academ
ic Press, Inc.,San Diego,CA;Higgins,
D.G.およびSharp,P.M.(1989)Fast and sens
itive multiple sequence alignments o
n a microcomputer CABIOS 5:第151〜153頁
;Myers,E.W.およびMuller W.(1988)Optimal
alignments in linear space CABIOS 4
:11〜17;Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor
11:105;Santou,N.Nes,M.(1987)The nei
ghbor joining method.A new method fo
r reconstructing phylogenetic trees
Mol. Biol. Evol.4:406〜425;Sneath,P.H
.A.およびSokal,R.R.(1973)Numerical Taxo
nomy−the Principes and Practice of N
umerical Taxonomy,Freeman Press,San
Francisco,CA;Wilbur,W.J.およびLipman,D.
J.(1983)Rapid similarity searches of
nucleic acid and protein data banks
Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726〜730。
較のウインドウにわたる2つの最適に整列された配列を比較することにより決定
される。ここで、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列
の最適整列について、参照配列(これは、付加または欠失を含まない)と比較し
た場合、20パーセント以下、通常5〜15パーセントまたは、10〜12パー
セントの付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。このパーセンテー
ジは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定
してマッチした位置の数を得ること、マッチした位置の数を、参照配列(すなわ
ち、ウインドウサイズ)における位置の総数で割ること、および結果に100を
掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。
また、本発明の範囲に含まれる。本明細書において用いる場合、「対立遺伝子」
または「対立遺伝子配列」は、核酸配列中の少なくとも1つの変異から生じ得る
遺伝子の別の形態である。対立遺伝子は、その構造または機能が変更されていて
もされていなくてもよい、変化したmRNAまたはポリペプチドを生じ得る。任
意の所定の遺伝子は、対立遺伝子形態を有さないか、1つ有するか、または多数
有し得る。対立遺伝子を生じる共通の変異性変化は、一般にヌクレオチドの天然
の欠失、付加または置換だとされる。これらの型の変化のそれぞれは、所定の配
列中で1回以上、単独かまたは他と組み合わせて生じ得る。特定の実施形態にお
いて、本発明は、Chlamydia抗原(またはこのような抗原の改変体)の
少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドを開示する。このポリペプチドは、
以下:(a)配列番号1〜4、15、21〜25、44〜64、66〜76およ
び79〜88からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列、(b)このよう
なDNA配列の相補体、または(c)(a)もしくは(b)の配列に実質的に相
同であるDNA配列、によりコードされるアミノ酸配列の1つ以上を含む。以下
の実施例において記載するように、本明細書において開示されるいくつかのCh
lamydia抗原は、Chlamydia trachomatisおよびC
hlamydia pneumoniaeに感染した単核球由来樹状細胞の両方
を認識するT細胞株を認識する。このことは、それらの抗原がChlamydi
a trachomatisおよびChlamydia pneumoniae
により共有される免疫反応性エピトープを意味し得ることを示す。従ってこの抗
原は、C.trachomatis生殖管感染およびC.pneumonia感
染の両方のためにワクチンにおいて働き得る。交差反応性の程度を決定するため
の、Chlamidia trachomatisおよびChlamydia
pneumonia由来の、これらのChlamydia抗原のさらなる特徴付
けが、実施例6に提供される。さらに、実施例4は、Chlamidia特異的
マウスCD8+T細胞株を刺激し得るタンパク質(配列番号17〜19および3
2)をコードするC.trachomatisから単離されたcDNAフラグメ
ント(配列番号15、16および33)を記載する。
クレオチド配列は、任意の種々の手順を用いて調製され得る。例えば、Chla
mydia抗原をコードするポリヌクレオチド分子は、下記のようにChlam
ydia特異的T細胞株を用いるスクリーニングにより、Chlamydiaゲ
ノムライブラリーまたはChlamydiaのcDNA発現ライブラリーから単
離され得、そして当業者に周知の技術を用いて配列決定され得る。さらに、ポリ
ヌクレオチドは、Chlamydia関連発現のためのcDNAのマイクロアレ
イ(microarray)をスクリーニングすること(すなわち、本明細書に
おいて提供される代表的なアッセイを用いて決定した場合、Chlamydia
感染細胞においてコントロールより少なくとも2倍大きい発現)によって、以下
により詳細に記載したように、同定され得る。このようなスクリーニングは、製
造業者の指示に従ってSynteniマイクロアレイ(Palo Alto、C
A)を用いて、(そして、本質的にSchenaら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 93:10614〜10619、1996およびHel
lerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2150〜
2155,1997によって記載のとおり)実施され得る。あるいは、ポリペプ
チドは、本明細書において記載されるタンパク質を発現する細胞から調製された
cDNAから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プ
ライマーは、本明細書において提供される配列に基づいて設計され得、そして購
入され得るかまたは合成され得る。
列を挿入すること、および適切な宿主において抗原を発現することよって組換え
的に産生され得る。抗原は、所望の性状(例えば、本明細書において記載のよう
に、Chlamydia感染した個体から得られる血清と反応する能力)につい
て評価され得、そして例えば、従来のエドマン化学を使用して配列決定され得る
。EdmanおよびBerg、Eur.J.Biochem.80:116〜1
32、1967を参照のこと。
酸配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド配列について、適切なChlamydiaのcDNAライブラリーまたはゲノ
ムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。このよう
なスクリーニングにおける使用のための縮重オリゴヌクレオチド配列は、設計さ
れ、合成され得、そして、このスクリーニングは、(例えば)Sambrook
ら、Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual、Cold Spring Harbor Laboratories,
Cold Spring Harbor,NY(およびそこに引用される参考文
献)に記載のように、実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もまた、
使用され得る。ここでは、当該分野で周知の方法において上記のオリゴヌクレオ
チドを用いて、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーから核酸プロー
ブを単離し得る。次いで、単離したプローブを用いてライブラリースクリーニン
グを実施し得る。
amydia cDNAライブラリー)から全長遺伝子を単離するために用いら
れ得る。このような技術の範囲内で、ライブラリー(cDNAライブラリー、ま
たは、ゲノムライブラリー)を、増幅に適切な1つ以上のポリヌクレオチドプロ
ーブまたはプライマーを用いてスクリーニングする。好ましくは、ライブラリー
をより大きい分子を含むためようにサイズ選択する。ランダムプライムしたライ
ブラリーはまた、遺伝子の5’領域および上流領域を同定するために好適であり
得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを得て、5’配列を延長するために好
ましい。
ば、ニックトランスレーションまたは32Pを用いる末端標識によって)、標識さ
れ得る。次いで、変性した細菌コロニー(またはファージプラークを含むクロー
ン)を含有するフィルターと標識したプローブとをハイブリダイゼーションする
ことにより、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーをスクリ
ーニングする(例えば、Sambrookら、Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual、Cold Spring H
arbor Laboratories,Cold Spring Harbo
r,NY,1989を参照のこと)。ハイブリダイゼーションコロニーまたはプ
ラークを選択し増殖して、そしてDNAをさらなる分析のために単離する。cD
NAクローンは、例えば、部分的配列由来のプライマーおよびベクター由来のプ
ライマーを用いるPCRによって、さらなる配列の量を決定するために分析され
得る。1つ以上の重複クローンを同定するために、制限地図および部分配列が生
成され得る。次いで、一連の欠失クローンを生成する工程を包含し得る、標準的
な技術を用いて完全配列が決定され得る。次いで、得られた重複配列は、単一の
連続する配列にアセンブリされる。全長cDNA分子は、周知の技術を用いて、
適切なフラグメントを連結することによって生成され得る。
技術が存在する。このような技術の範囲内で、増幅は、一般にPCRを経て実行
される。任意の様々な市販のキットが、増幅工程を実行するために用いられ得る
。プライマーは、当該分野で周知の技術を用いて設計され得(例えば、Mull
isら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.51:263,1987;Erlich編、PCR Technolog
y、Stockton Press,NY,1989)、そして当該分野で周知
のソフトウェアもまた使用され得る。プライマーは好ましくは22〜30のヌク
レオチド長であり、少なくとも50%のGC含量を有し、そして約68℃〜72
℃の温度で標的配列にアニーリングする。この増幅された領域は、上記のように
配列決定され得、そして重複配列は連続する配列にアセンブリされ得る。
Nucl.Acids Res.16:8186,1988を参照のこと)。こ
れは、遺伝子の公知の領域のフラグメントを生成する制限酵素を用いる。次いで
、このフラグメントは、分子内連結により環状化され、そして公知の領域に由来
する相違するプライマーとともにPCRのための鋳型として用いられる。別のア
プローチにおいて、部分配列に隣接した配列は、リンカー配列に対するプライマ
ーおよび周知の領域に特異的なプライマーを用いる増幅によって回復され得る。
増幅された配列は、代表的に、同じリンカープライマーおよび公知の領域に特異
的な第2のプライマーを用いる2回目の増幅に供される。この手順上の変更(こ
れは公知の配列から反対方向の伸長を始める2つのプライマーを使用する)は、
WO96/38591に記載されている。さらなる技術は、キャプチャーPCR
(Lagerstromら、PCR Methods Applic.1:11
1−19、1991)およびウォーキングPCR(Parkerら、Nucl.
Acids.Res.19:3055〜60,1991)を含む。転写媒介増幅
(Transcriptional−Mediated Amplificat
ion)すなわちTMAは、特許番号PCT/US91/03184にて記載し
たように、DNA、rRNAまたはmRNAの増幅のために利用され得る別の方
法である。この自己触媒的かつ等温の、PCRに基づかない方法は、2つのプラ
イマーおよび以下の2つの酵素を利用する:RNAポリメラーゼおよび逆転写酵
素。1つのプライマーは、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む
。第1の増幅において、プロモーター−プライマーは、規定の部位で標的rRN
Aにハイブリダイズする。逆転写酵素は、プロモーター−プライマーの3’末端
からの伸長によって標的rRNAのDNAコピーをつくる。得られる複合体中の
RNAは、分解され、そして、第2のプライマーはDNAコピーに結合する。D
NAの新しい鎖は、二本鎖DNAをつくっている逆転写酵素によってプライマー
の末端から合成される。RNAポリメラーゼは、DNA鋳型におけるプロモータ
ー配列を認識して、転写を始める。新しく合成されたRNAアンプリコンの各々
は、TMAプロセスに再び入って、RNAアンプリコンの指数関数的な増幅を導
く複製の新しい回のための鋳型として役立つ。増幅を用いる他の方法はまた、全
長cDNA配列を得るために使用され得る。
れる配列(例えば、GenBankから入手可能な配列)の分析により全長cD
NA配列を得ることが可能である。重複するESTの検索は、一般に周知のプロ
グラム(例えば、NCBI BLAST searches)を用いて実行され
得、そして、このようなESTは連続する全長配列を生成するために用いられ得
る。全長cDNA配列はまた、ゲノムフラグメントの分析によって得られ得る。
成による化学合成を含む、当該分野において公知の任意の方法により調製され得
る。ポリヌクレオチド配列における修飾はまた、標準的な変異誘発技術(例えば
、オリゴヌクレオチ−定方向部位特異的変異誘発(Adelmanら、DNA
2:183,1983を参照のこと))を用いて導入され得る。あるいは、RN
A分子は、クラミジアタンパク質をコ−ドするDNA配列、またはその一部のイ
ンビトロまたはインビボでの転写により生成され得る。但し、このDNAは、適
切なポリメラーゼRNAプロモ−タ−(例えば、T7またはSP6)を用いてベ
クタ−中に取りこまれる。特定の部分を用いて、本明細書中に記載されるように
、コ−ドされるポリペプチドを調製し得る。さらに、あるいは、一部を患者に投
与して、その結果コ−ドされるポリペプチドを、(例えば、抗原提示細胞(例え
ば、樹状細胞)を、クラミジアポリペプチドをコ−ドするcDNAを用いてトラ
ンスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞を患者に投与することにより
)インビボで生成させ得る。
部はまた、プロ−ブとしてか、または遺伝子発現を調節するために用いられ得る
。アンチセンスRNAへと転写され得るcDNA構築物をまた、組織の細胞中に
導入させて、アンチセンスRNAの産生を容易にし得る。アンチセンスポリヌク
レオチドを、本明細書中に記載されるように用いて、クラミジアタンパク質の発
現を阻害し得る。アンチセンス技術を用いて、三重鎖形成を介して遺伝子発現を
制御し得る。この技術は、ポリメラ−ゼ、転写因子、または調節分子の結合を十
分に開始する二重鎖の能力を損なう(Geeら、In Huber and C
arr,Molecular and Immunologic Approa
ches,Futura Publishing Co.(Mt.Kisco,
NY; 1994)を参照のこと)。あるいは、アンチセンス分子は、遺伝子の
制御領域(例えば、プロモ−タ−、エンハンサ−、または転写開始部位)とハイ
ブリダイズし、そして遺伝子の転写をブロックするように設計され得るか;また
はリボゾ−ムに対する転写物の結合を阻害することにより、翻訳をブロックする
ように設計され得る。
ためのプロ−ブまたはプライマ−として設計され得る。プロ−ブは、種々のレポ
−タ−群(例えば、放射性ヌクレオチドおよび酵素)を用いて標識され得、そし
て好ましくは、少なくとも10ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは、少
なくとも20ヌクレオチドの長さであり、そしてなおより好ましくは、少なくと
も30ヌクレオチドの長さである。上記のようなプライマ−は、好ましくは22
〜30ヌクレオチドの長さである。
得る。可能な修飾としては、以下を含むが、それらに限定されない:5’末端お
よび/または3’末端での隣接配列の付加;骨格におけるリン酸ジエステル結合
よりむしろホスホロチオエ−トまたは2’O−メチルの使用;および/または非
伝統的塩基(例えば、イノシン、キュ−オシンおよびワイブトシン、ならびにア
セチル−、メチル−、チオ−、ならびにアデニン、シトシン、グアニン、チミン
、およびウリジンの他の修飾形態)の含有。
技術を用いて、種々の他のヌクレオチド配列に連結され得る。例えば、ポリヌク
レオチドは、種々のクロ−ニングベクタ−(プラスミド、ファ−ジミド、λファ
−ジ誘導体、およびコスミドを含む)のいずれかにクロ−ニングされ得る。特定
の目的のベクタ−としては、発現ベクタ−、複製ベクタ−、プロ−ブ生成ベクタ
−、および配列決定ベクタ−が挙げられる。一般に、ベクタ−は、少なくとも1
つの生物において機能的な複製起点、都合の良い制限エンドヌクレア−ゼ部位、
および一つ以上の選択可能なマ−カ−を含む。他の要素は、所望の使用に依存し
、そして当業者に明らかである。
リペプチドは、当該分野で周知の技術を用いて生成され得る。例えば、このよう
なポリペプチドは、市販の固相技術(例えば、Merrifield固相合成法
)のいずれかを用いて合成され得る。ここでアミノ酸は、伸長しているアミノ酸
鎖に連続的に添加される。Merrifield,J Am.Chem.Soc
.85:2149−2146,1963を参照のこと。ポリペプチドの自動合成
のための装置は、Perkin Elmer/Applied BioSyst
ems Division,Foster City,CAのような供給業者か
ら市販されており、そして製造業者の指示書に従って操作され得る。
ul、Fundamental Immunology、第3版、Raven
Press,1993,243−247頁およびそこに引用される参考文献に要
約される技術)を用いて調製され、そして同定され得る。このような技術は、免
疫原性特性に関してネイティブな抗原のポリペプチド部分をスクリ−ニングする
ことを含む。本明細書中に記載される例示的なELISAは、一般に、これらの
スクリ−ニングに用いられる。ポリペプチドの免疫原性部分は、このような例示
的アッセイにおいて、全長抗原により生成されるシグナルに実質的に類似する、
このようなアッセイにおけるシグナルを生成する部分である。換言すれば、クラ
ミジア抗原の免疫原性部分は、本明細書中に記載されるように、モデルELIS
Aにおいて全長抗原により誘導されるシグナルの、少なくとも約20%、そして
好ましくは約100%を生成する。
生成され得る。ネイティブ抗原の改変体は、一般に、標準的な変異誘発技術(例
えば、オリゴヌクレオチド−定方向部位特異的変異誘発)を用いて調製され得る
。ポリペプチド配列の部分はまた、標準的な技術を用いて取り出され得、短縮型
ポリペプチドの調製を可能にする。
当業者に周知の種々の技術を用いてポリペプチドをコ−ドするポリヌクレオチド
配列から容易に調製され得る。例えば、培養培地中に組換えタンパク質を分泌す
る適切な宿主/ベクタ−系由来の上清は、市販のフィルタ−を用いて初めに濃縮
され得る。濃縮の後、濃縮物は、適切な精製マトリクス(例えば、アフィニティ
−マトリクスまたはイオン交換樹脂)にアプライされ得る。最終的に、1つ以上
の逆相HPLC工程を用いて、組換えタンパク質をさらに精製し得る。
れるような組換えポリペプチドを発現し得る。発現は、組換えポリペプチドをコ
−ドするポリヌクレオチド分子を含む発現ベクタ−を用いて形質転換またはトラ
ンスフェクトされた任意の適切な宿主細胞において達成される。適切な宿主細胞
としては、原核生物細胞、酵母および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましく
は、用いられる宿主細胞は、E.coli、酵母、または哺乳動物細胞株(例え
ば、COSまたはCHO)である。この様式で発現されるDNA配列は、天然に
存在する抗原、天然に存在する抗原の一部、またはそれらの他の改変体をコ−ド
し得る。
単離され、実質的に純粋な形態で調製される。好ましくは、ポリペプチドは、少
なくとも約80%純粋、より好ましくは、少なくとも約90%純粋、そして最も
好ましくは約99%純粋である。
ポリペプチドを含む融合タンパク質か、または本明細書中に記載されるような少
なくとも1つのポリペプチドおよび公知のクラミジアタンパク質のような無関係
の配列を含む融合タンパク質であり得る。融合パ−トナ−は、例えば、Tヘルパ
−エピト−プ(免疫学的融合パ−トナ−)、好ましくは、ヒトにより認識される
Tヘルパ−エピト−プの提供を補助し得るか、ネイティブな組換えタンパク質よ
りも高い収量でのタンパク質(発現エンハンサ−)の発現を補助し得る。特定の
好ましい融合パ−トナ−は、免疫学的融合パ−トナ−および発現増強融合パ−ト
ナ−の両方である。他の融合パ−トナ−は、タンパク質の溶解性を増加させるか
、またはタンパク質を所望の細胞内区画に標的化し得るように選択される。なお
さらなる融合パ−トナ−としては、アフィニティ−タグが挙げられる。アフィニ
ティ−タグは、タンパク質の精製を容易にする。本発明の融合パ−トナ−をコ−
ドするDNA配列は、例えば、第1および第2のポリペプチドをコ−ドする別個
のDNA配列を適切な発現ベクタ−中に構築するための公知の組換えDNA技術
を用いて構築され得る。第1のポリペプチドをコ−ドするDNA配列の3’末端
は、ペプチドリンカ−の有り無しで、第2のポリペプチドをコ−ドするDNA配
列の5’末端に連結され、その結果、配列のリ−ディングフレ−ムは、第1また
は第2のポリペプチドの両方の生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質へ
の2つのDNA配列のmRNA翻訳を可能にする同じ相にある。
三次構造に折りたたまれることを保証するのに十分な距離で、第1および第2の
ポリペプチドを引き離し得る。このようなペプチドリンカ−配列は、当該分野で
周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質へと取りこまれる。適切なペプチド
リンカ−配列は、以下の要素に基づいて選択され得る:(1)可撓性の伸張した
立体配座に適合するそれらの能力;(2)第1および第2のポリペプチド上の機
能的エピト−プと相互作用し得る二次構造に適合するそれらの無能力;および(
3)ポリペプチドの機能的エピト−プと反応し得る疎水性残基または荷電残基の
欠如。好ましいペプチドリンカ−配列は、Gly残基、Asn残基およびSer
残基を含む。他の中性に近いアミノ酸(例えば、ThrおよびAla)はまた、
リンカ−配列に用いられ得る。リンカ−として有用に用いられ得るアミノ酸配列
としては、Marateaら,Gene 40:39−46,1985;Mur
phyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258−
8562,1986;米国特許第4,935,233号、および同第4,751
,180号に開示される配列が挙げられる。リンカ−配列は、1〜約50のアミ
ノ酸の長さであり得る。ペプチドリンカ−配列の使用の代替として(所望される
場合に)、第1および第2のポリペプチドにおける非必須N末端アミノ酸領域を
(存在する場合に)利用して、機能的ドメインを引き離しかつ立体障害を防ぎ得
る。
連結される。DNAの発現の原因である調節因子は、第1のポリペプチドをコ−
ドするDNA配列の5’側にのみ配置される。同様に、翻訳を終結するために必
要とされる停止コドン、および転写終結シグナルは、第2のポリペプチドをコ−
ドするDNA配列の3’側にのみ存在する。
チドを含むように提供される。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコ−ル(
recall)応答を誘発し得る。このようなタンパク質の例としては、テタヌ
スタンパク質、結核タンパク質、および肝炎タンパク質が挙げられる(例えば、
Stouteら、New Engl.J.Med.,336:8691,199
7を参照のこと)。
ム陰性細菌HaemophilusインフルエンザB(WO 91/18926
)の表面タンパク質)に由来する。好ましくは、プロテインD誘導体は、タンパ
ク質(例えば、はじめのN末端100〜110アミノ酸)の約1/3を含み、そ
してプロテインD誘導体は脂質化され得る。特定の好ましい実施形態において、
リポプロテインD融合パ−トナ−のはじめの109残基は、N末端上に含まれて
、さらなる外因性T細胞エピト−プを有するポリペプチドを提供し、かつE.c
oliにおける発現レベルを増加する(従って、発現エンハンサ−として機能す
る)。脂質テイルは、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示を保証する。他の
融合パ−トナ−としては、インフルエンザウイルス、NS1(赤血球凝集素)由
来の非構造タンパク質が挙げられる。代表的には、N末端の81アミノ酸を用い
るが、Tヘルパ−エピト−プを含む異なるフラグメントが、用いられ得る。
タンパク質であるか、その一部(好ましくは、C末端部分)である。LYTAは
、Streptococcus pneumoniaeに由来する。Strep
tococcus pneumoniaeは、アミダ−ゼLYTAとして知られ
ている、N−アセチル−L−アラニンアミダ−ゼ(LytA遺伝子によりコ−ド
される;Gene 43:265−292,1986)を合成する。LYTAは
、ペプチドグリカン骨格における特定の結合を特異的に分解する自己溶解素であ
る。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンまたはDEAEのようない
くつかのコリンアナログに対する親和性の原因である。この特性は、融合タンパ
ク質の発現に有用であるプラスミドを発現するE.coli C−LYTAの開
発のために開発された。アミノ末端にC−LYTAフラグメントを含むハイブリ
ッドタンパク質の精製は、記載されている(Biotechnology 10
:795−798,1992を参照のこと)。好ましい実施形態において、LY
TAの反復部分は、融合タンパク質に取りこまれ得る。反復部分は、残基178
で開始するC末端領域において見出される。特に好ましい反復部分は、残基18
8〜305に取り込まれる。さらに、融合タンパク質Ra12は、本発明のポリ
ヌクレオチドに連結されて、タンパク質発現を容易にし得る。
質(またはこのようなポリペプチドまたは融合タンパク質をコ−ドするポリヌク
レオチド)を用いるための方法を提供して、患者におけるクラミジア感染に対す
る防御免疫を誘導する。本明細書中で用いられる場合「患者」とは、任意の温血
動物、好ましくはヒトのことをいう。患者は、疾患に罹患していてもよいし、検
出可能な疾患および/または感染がなくてもよい。換言すれば、防御免疫は、ク
ラミジア感染を予防または処置するために誘導され得る。
分子は、一般に、薬学的組成物またはワクチン中に存在する。薬学的組成物は、
1つ以上のポリペプチド(これらの各々は、1つ以上の上記配列(またはその改
変体)を含み得る)、および生理学的に受容可能なキャリアを含み得る。ワクチ
ンは、1つ以上の上記ポリペプチドおよび免疫賦形剤(例えば、アジュバントま
たはリポソ−ム)(この中にポリペプチドが取り込まれる)を含み得る。このよ
うな薬学的組成物およびワクチンはまた、クラミジア抗原(組み合わせたポリペ
プチド中に組み込まれるか、または別々のポリペプチド内に存在する)を、含み
得る。
ク質をコ−ドするポリヌクレオチドを含み得、その結果、ポリペプチドは、イン
サイチュで生成される。このようなワクチンにおいて、ポリヌクレオチドは、当
業者に公知の種々の送達系のいずれかの中に存在し得る。この送達系としては、
核酸発現系、細菌発現系、およびウイルス発現系が挙げられる。適切な核酸発現
系は、患者における発現のために必要なポリヌクレオチド配列(例えば、適切な
プロモ−タ−および停止シグナル)を含む。細菌送達系は、その細胞表面上のポ
リペプチドの免疫原性部分を発現する細菌(例えば、Bacillus−Cal
mette−Guerrin)の投与を含む。好ましい実施形態では,ポリヌク
レオチドは、ウイルス発現系(例えば、ワクチンまたは他のポックスウイルス、
レトロウイルス、あるいはアデノウイルス)を用いて導入され得る。これらのウ
イルス発現系は、非病原性(欠損)ウイルスを用いて導入され得る。このような
発現系にポリヌクレオチドを組み込むための技術は、当業者に周知である。ポリ
ヌクレオチドはまた、例えば、Ulmerら、Science 259:174
5−1749,1993およびCohenによる総説、Science 259
:1691−1692,1993に記載されるような「裸の」プラスミドベクタ
−として投与され得る。このようなベクタ−にDNAを組み込むための技術は、
当業者に公知である。レトロウイルスベクタ−は、さらに、選択可能なマ−カ−
についての遺伝子(形質導入した細胞の同定または選択を補助し得る)および/
または標的部分(例えば、特定の標的細胞上のレセプタ−に対するリガンドをコ
−ドする遺伝子)を移入するか、または取り込んで、ベクタ−に標的特異性を与
え得る。標的化はまた、抗体を用いて、当業者に公知の方法により達成され得る
。
体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビ−ズ)、ならびに水中油懸濁液、ミセル
、混合ミセル、およびリポソ−ムを含む、脂質ベ−スの系が挙げられる。インビ
トロおよびインビボでの送達ビヒクルとしての使用のための、好ましいコロイド
分散系は、リポソ−ム(すなわち、人工膜小胞)である。裸のポリヌクレオチド
の取りこみは、生分解性ビ−ズ内および/または上にポリヌクレオチドを取り込
むことにより増加され得る。生分解性ビ−ズは、細胞中へ有効に輸送される。こ
のような系の調製および使用は、当該分野で周知である。
のポリペプチドまたは公知のクラミジア抗原のいずれかと、同時にもしくは連続
して投与され得る。例えば、本発明のポリペプチドをコ−ドするポリヌクレオチ
ドの投与(「裸」または上記のような送達系においてのいずれかで)に続いて、
ワクチンの防御免疫効果を増強するために抗原が投与され得る。
ジア感染の処置のために養子免疫治療において用いられ得る。養子免疫治療は、
能動的または受動的免疫治療のいずれかに広範に分類され得る。能動的免疫治療
において、処置は、免疫応答改変剤(immune response−mod
ifying agent)(例えば、ワクチン、細菌アジュバント、および/
またはサイトカイン)の投与を用いる内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存す
る。
hed immune reactivity)(例えば、エフェクタ−細胞ま
たは抗体)用いる生物学的薬剤の送達に関し、これは、抗クラミジア効果を直接
的または間接的に媒介し得、そしてインタクトな宿主免疫系に依存する必要がな
い。エフェクタ−細胞の例としては、Tリンパ球(例えば、CD8+細胞傷害性
T−リンパ球、CD4+ T−ヘルパ−)、キラ−細胞(例えば、ナチュラルキ
ラ−細胞、リンホカイン−活性化キラ−細胞)、B細胞、または開示される抗原
を発現する抗原提示細胞(例えば、樹状細胞およびマクロファ−ジ)が挙げられ
る。本明細書中に開示されるポリペプチドはまた、受動性免疫治療のために、抗
体または抗イディオタイプ抗体を生成するために用いられる得る。
免疫T細胞を増殖させることである。単一の抗原特異的T細胞を、インビボでの
抗原認識の保持を伴って数十億の数まで増殖するための培養条件は、当該分野で
周知である。これらのインビトロ培養条件は、代表的には、しばしばサイトカイ
ン(例えば、IL−2)、および非分裂支持細胞の存在下で、抗原による断続的
刺激を利用する。上記のように、本明細書中に記載される免疫反応性ポリペプチ
ドを用いて、免疫治療のために十分な数の細胞を生成するために、抗原特異的T
細胞培養物を迅速に増殖し得る。詳細には、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)
、マクロファージ、単球、線維芽細胞、またはB細胞は、免疫反応性ポリペプチ
ドを用いてパルスされ得るか、あるいはポリヌクレオチド配列は、当該分野で周
知の種々の標準的な技術を用いて、抗原提示細胞中に導入され得る。例えば、抗
原提示細胞は、ポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクトまたは形質導入
され得、ここでこの配列は、発現を増大させるのに適切なプロモ−タ−領域を含
み、そして組換えウイルスまたは他の発現系の一部として発現され得る。いくつ
かのウイルスベクタ−(ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ
ウイルスを含む)を用いて、抗原提示細胞を形質導入され;また抗原提示細胞は
、種々の手段(遺伝子銃技術、脂質媒介送達、エレクトロポレ−ション、浸透圧
衝撃、および粒子送達機構を含む)により、本明細書中に開示されるポリヌクレ
オチド配列を用いてトランスフェクトされて、当業者により決定されるような有
効かつ受容可能な発現レベルを生じ得る。治療において効果的である培養された
T細胞について、培養されたT細胞は、広範に増殖および分布すること、ならび
にインビボで長い期間、生存することが可能でなければならない。研究は、培養
したT細胞が、IL−2を補充した抗原を用いる刺激を繰り返すことにより、イ
ンビボで増殖すること、およびかなりの数が長い期間生存することを誘導し得る
ことを実証した(例えば、Cheever,M.ら、「Therapy Wit
h Cultured T Cells:Principles Revisi
ted」、Immunological Reviews,157:177,1
997を参照のこと)。
を生成および/または単離し得る。次いで、クラミジア反応性T細胞は、患者に
投与され得る。1つの技術において、抗原特異的T細胞株は、開示されるポリペ
プチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドを用いてインビボで免疫により生
成され得る。得られた抗原特異的CD8+またはCD4+ T細胞クロ−ンは、
患者から単離され得、標準的な組織培養技術を用いて増殖され得、そして患者に
戻され得る。
、Changら、(Crit.Rev.Oncol.Hematol.,22(
3),213,1996)に記載されるように、引き続いて、患者に移され得る
抗原特異的T細胞を提供するために自己T細胞の選択的インビトロ刺激および増
殖により、クラミジア反応性T細胞サブセットを生成する。免疫系の細胞(例え
ば、T細胞)は、市販の細胞分離システム(例えば、IsolexTM Syst
em、Nexell Therapeutics,Inc.Irvine,CA
から入手可能)を用いて、患者の末梢血から単離され得る。分離された細胞は、
送達ビヒクル(例えば、ミクロスフェア)内に含まれる1つ以上の免疫反応性ポ
リペプチドで刺激されて、抗原特異的T細胞を提供する。次いで、抗原特異的T
細胞の集団は、標準的な技術を用いて増殖され、そして細胞は、患者に再び投与
される。
胞および/または抗体レセプタ−は、クロ−ニングされ、増殖され、そして養子
免疫治療に用いるための他のベクタ−またはエフェクタ−細胞に移される。詳細
には、T細胞は、適切な遺伝子を用いてトランスフェクトされて、細胞外認識エ
レメントとして、クラミジア特異的モノクロ−ナル抗体由来の可変ドメインを発
現し得、そしてT細胞レセプタ−シグナル伝達鎖に結合され得、T細胞の活性化
、特異的溶解、およびサイトカイン放出を生じる。これは、T細胞を、その特異
性を、MHC非依存様式で再指向させ得る。例えば、Eshhar,Z.,Ca
ncer Immunol Immunother,45(3−4):131−
6,1997およびHwu,P.ら、Cancer Res,55(15):3
369−73,1995を参照のこと。別の実施形態としては、Cole,DJ
ら、Cancer Res,55(4):748−52,1995のように、ク
ラミジア抗原特異的αおよびβT細胞レセプター鎖の、別のT細胞へのトランス
フェクションが挙げられ得る。
るポリペプチドの少なくとも免疫原性部分に対応するペプチドを用いて適用(p
ulse)し得る。生じる抗原特異的樹状細胞は、患者に移入されるか、または
T細胞を刺激して抗原特異的T細胞(これが、次いで、患者に投与され得る)を
提供するために使用されるかのいずれかであり得る。抗原特異的T細胞を生成す
るためのペプチド適用した樹状細胞の使用、およびマウスモデルにおいて疾患を
根絶するためのこのような抗原特異的T細胞の引き続く使用は、Cheever
ら、Immunological Reviews 157:177、1997
により実証された。さらに、開示されたポリヌクレオチドを発現するベクターは
、患者から採取された幹細胞中に導入され得、そして同じ患者に自系移植片を戻
すために、インビトロでクローン的に増殖され得る。
T細胞および/または結合因子を、薬学的組成物または免疫原性組成物(すなわ
ち、ワクチン)中に組み込み得る。薬学的組成物は、1つ以上のこのような化合
物および生理的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、1つ以上のこのよう
な化合物および免疫刺激物質を含み得る。免疫刺激物質は、外因性の抗原に対す
る免疫応答を増強または強化する任意の物質であり得る。免疫刺激物質の例とし
ては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド(
polylactic galactide)およびリポソーム(この中に、化
合物を取り込む;例えば、Fullerton、米国特許第4,235,877
号を参照のこと)が挙げられる。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、M.F
.PowellおよびM.J.Newman編、「Vaccine Desig
n(the subunit and adjuvant approach)
」、Plenum Press(NY、1995)に記載される。本発明の範囲
内にある薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性または不活性であ
り得る他の化合物を含み得る。例えば、他のChlamydial抗原の1つ以
上の免疫原性部分は、組成物またはワクチンにおいて、融合ポリペプチドに組み
込まれてかまたは個々の化合物としてのいずれかで存在し得る。
ドするDNAを含み得、その結果、そのポリペプチドはインサイチュで生成され
る。上記のように、DNAは、当業者に公知の種々の任意の送達系(核酸発現系
、細菌性発現系、およびウイルス性発現系を含む)において存在し得る。多数の
遺伝子技術が当該分野において周知である(例えば、Rolland、Crit
.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15:
143−198、1998およびその中で引用される参考文献により記載される
技術)。適切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なDNA配列を含
む(例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル)。細菌性送達系は、細胞
表面上でポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープ
を分泌する細菌(例えば、Bacillus−Calmette−Guerri
n)の投与を含む。好ましい実施形態では、ウイルス性発現系(例えば、ワクシ
ニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス)
を使用してDNAを導入し得る。このウイルス発現系は、非病原性(欠損性)複
製コンピテントなウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下におい
て開示される:Fisher−Hochら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 86:317−321、1989;Flexnerら、Ann.
N.Y.Acad.Sci.569:86−103、1989;Flexner
ら、Vaccine 8:17−21、1990;米国特許第4,603,11
2号、同第4,769,330号、および同第5,017,487号;WO 8
9/01973;米国特許第4,777,127号;GB 2,200,651
;EP 0,345,242;WO 91/02805;Berkner、Bi
otechniques 6:616−627、1988;Rosenfeld
ら、Science 252:431−434、1991;Kollsら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215−219、1994
;Kass−Eislerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
90:11498−11502、1993;Guzmanら、Circula
tion 88:2838−2848、1993;およびGuzmanら、Ci
r.Res.73:1202−1207、1993。このような発現系にDNA
を組み込む技術は、当業者に周知である。DNAはまた、例えば、Ulmerら
、Science 259:1745−1749、1993において記載され、
そしてCohen、Science 259:1691−1692、1993に
よって概説されるように、「裸」であり得る。裸のDNAの取り込みは、生分解
性ビーズ(これは、細胞に効率的に輸送される)上にDNAをコーティングする
ことによって増加され得る。
され得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物
は、任意の適切な投与の様式(例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、静脈
内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋内投与を含む)について
処方され得る。非経口投与(例えば、皮下注射)については、キャリアは、好ま
しくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝液を含む。経口
投与については、任意の上記のキャリアまたは固体キャリア(例えば、マンニト
ール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム)
を使用し得る。生分解性ミクロスフェア(例えば、ポリラクテートポリグリコレ
ート)もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適
切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,897,268号およ
び同第5,075,109号に開示される。
またはリン酸緩衝化生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース
、スクロース、またはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチ
ド、またはアミノ酸(例えば、グリシン)、抗酸化薬、キレート剤(例えば、E
DTAまたはグルタチオン)、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、
および/または誘導体。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物(lyoph
ilizate)として処方され得る。化合物はまた、周知技術を使用して、リ
ポソーム内にカプセル化され得る。
ば、アジュバントが含められ得る。大半のアジュバントは、迅速な異化作用から
抗原を保護するために設計された物質(例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油
)、および免疫応答の刺激物質(例えば、リピドA、Bortadella p
ertussisまたはMycobacterium tuberculosi
s由来のタンパク質)を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイントの不
完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratori
es、Detroit、MI);Merck Adjuvant 65(Mer
ck and Company,Inc.、Rahway、NJ);アルミニウ
ム塩(例えば、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)またはリン酸アルミニウ
ム);カルシウム、鉄、または亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁液;ア
シル化糖;カチオン的またはアニオン的に誘導体化されたポリサッカリド;ポリ
フォスファゼン(polyphosphazene);生分解性ミクロスフェア
;モノホスホリルリピドAおよびクイルA(quil A)のように市販されて
いる。GM−CSFまたはインターロイキン−2、インターロイキン−7、もし
くはインターロイキン−12のようなサイトカインもまた、アジュバントとして
使用され得る。
、優勢にTh1型またはTh2型の免疫応答を誘導するように設計され得る。高
レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN−γ、TNFα、IL−2およ
びIL−12)は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導に有利な
傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン(例えば、IL−4、
IL−5、IL−6およびIL−10)は、体液性免疫応答の誘導に有利な傾向
がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用後、患者は、Th1型応
答およびTh2型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にTh1型である
好ましい実施形態では、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカイ
ンのレベルよりも高い程度に増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準
的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説に
ついては、MosmannおよびCoffman、Ann.Rev.Immun
ol.7:145−173、1989を参照のこと。
は、例えば、モノホスホリルリピドA(好ましくは、3−デ−O−アシル化モノ
ホスホルリピドA(3D−MPL)とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられ
る。MPLアジュバントは、Ribi ImmunoChem Researc
h Inc.(Hamilton、MT)から入手可能である(米国特許第4,
436,727号;同第4,877,611号;同第4,866,034号;お
よび同第4,912,094号を参照のこと)。CpGを含有するオリゴヌクレ
オチド(ここで、CpGジヌクレオチドはメチル化されていない)もまた、優勢
にTh1応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして
例えば、WO 96/02555に記載されている。別の好ましいアジュバント
はサポニン(好ましくは、QS21)であり、これは単独または他のアジュバン
トと組み合わせて使用され得る。例えば、増強される系としては、モノホスホル
リピドAとサポニン誘導体の組み合わせ(例えば、WO 94/00153に記
載のようなQS21と3D−MPLの組み合わせ)、またはWO 96/337
39に記載のような、反応原性の低い組成物(ここでは、QS21は、コレステ
ロールでクエンチされる)が挙げられる。他の好ましい処方物は、水中油エマル
ジョンおよびトコフェロールが挙げられる。水中油エマルジョン中にQS21、
3D−MPLおよびトコフェロールを含有する特定の強力なアジュバント処方物
が、WO 95/17210中に記載される。本明細書中に提供されるいずれの
ワクチンも、抗原、免疫応答エンハンサー、および適切なキャリアまたは賦形剤
の組み合わせを生じる周知の方法を使用して調製され得る。
放処方物(すなわち、カプセル、スポンジ、またはゲル(ポリサッカリドから構
成される)などのような処方物)の部分として投与され得る。このような処方物
は、一般的に、周知技術を使用して調製され得、そして、例えば、経口、直腸、
もしくは皮下移植によってか、または所望される標的部位での移植によって投与
され得る。徐放処方物は、キャリアマトリクス中に分散されたポリペプチド、ポ
リヌクレオチドもしくは抗体を含み得るか、および/または速度制御する膜によ
って取り囲まれたリザーバ中に含まれ得る。このような処方物における使用のた
めのキャリアは生体適合性であり、そしてまた生分解性でもあり得る;好ましく
は、処方物は、比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。徐放処方物中に含
まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、
ならびに処置または予防される状態の性質に依存する。
抗原特異的な免疫応答の産生を容易にするために、薬学的組成物およびワクチン
において使用され得る。送達ビヒクルは、抗原提示細胞(APC)(例えば、樹
状細胞、マクロファージ、B細胞、単球、および効率的なAPCとなるように操
作され得る他の細胞)を含む。このような細胞は、抗原を提示する能力を増加さ
せるために、T細胞応答の活性化および/または維持を改善するために、抗Ch
lamydia効果自体を有するように、および/または受け手(すなわち、整
合したHLAハプロタイプ)と免疫学的に適合性であるように、遺伝的に改変さ
れ得るが、必要ではない。APCは、一般的に、任意の種々の生物学的液体およ
び器官から単離され得、そして自系、同種異系、同系または異種の細胞であり得
る。
の前駆体を使用する。樹状細胞は、非常に強力なAPCであり(Bancher
eauおよびSteinman、Nature 392:245−251、19
98)、そして予防的または治療的な免疫を誘発するための生理的アジュバント
として有効であることが示された(TimmermanおよびLevy、Ann
.Rev.Med.50:507−529、1999を参照のこと)。一般的に
、樹状細胞は、その典型的な形状(インサイチュで星状、インビトロで可視的な
顕著な細胞質突起(樹状突起)を有する)、高い効率で抗原を取りこみ、プロセ
スし、そして提示するその能力、そして未処理のT細胞応答を活性化するその能
力に基づいて同定され得る。樹状細胞は、当然のことながら、インビボまたはエ
キソビボでは樹状細胞において一般に見出されない特定の細胞表面レセプターま
たはリガンドを発現するように操作され得、そしてこのように改変された樹状細
胞が、本発明によって意図される。樹状細胞に対する代替物として、分泌小胞抗
原を負荷した樹状細胞(エキソソーム(exosome)と呼ばれる)を、ワク
チンにおいて使用し得る(Zitvogelら、Nature Med.4:5
94−600、1998を参照のこと)。
たは任意の他の適切な組織もしくは液体から獲得され得る。例えば、樹状細胞は
、末梢血から回収された単球の培養物に対して、GM−CSF、IL−4、IL
−13および/またはTNFαのようなサイトカインの組み合わせを添加するこ
とによって、エキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血、または骨
髄から回収されたCD34陽性細胞は、GM−CSF、IL−3、TNFα、C
D40リガンド、LPS、flt3リガンドおよび/または樹状細胞の分化、成
熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを、培養培地に添加すること
によって、樹状細胞に分化され得る。
。これは、2つの十分に特徴付けられた表現型の間を識別するための単純な方法
を与える。しかし、この命名法は、分化の全ての可能な中間ステージを排除する
と解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシ
ングについての高い能力(これは、Fcγレセプターおよびマンノースレセプタ
ーの高発現と相関する)を有するAPCとして、特徴付けられる。成熟表現型は
、代表的に、これらのマーカーのより低い発現(しかし、クラスIおよびクラス
II MHC、接着分子(例えば、CD54およびCD11)、ならびに同時刺
激分子(例えば、CD40、CD80、CD86、および4−1BB)のような
、T細胞活性化を担う細胞表面分子の高発現)によって特徴付けられる。
しくは他の改変体)をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得、
その結果、Chlamydialポリペプチド、またはその免疫原性部分が、そ
の細胞表面において発現される。このようなトランスフェクションは、エキソビ
ボで生じ得、次いで、このようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物また
はワクチンが、本明細書中に記載のような治療目的のために使用され得る。ある
いは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的化する遺伝子送達ビヒクルが患者
に投与され得、インビボで生じるトランスフェクションを生じさせる。樹状細胞
のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションなどは、一般的に、当該
分野において公知の任意の方法(例えば、WO 97/24447に記載される
方法、またはMahviら、Immunology and cell Bio
logy 75:456−460、1997に記載される遺伝子銃アプローチ)
を使用して実施され得る。樹状細胞の抗原負荷は、Chlamidialのポリ
ペプチド、DNA(裸またはプラスミドベクター中)もしくはRNAと共に;ま
たは、抗原を発現する組換え細菌もしくはウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘
、アデノウイルス、またはレンチウイルスのベクター)と共に、樹状細胞または
前駆細胞をインキュベートすることによって、達成され得る。負荷の前に、ポリ
ペプチドは、T細胞補助(例えば、キャリア分子)を提供する、免疫学的パート
ナーと共有結合的に結合体化され得る。あるいは、樹状細胞に、個々にかまたは
ポリペプチドの存在下で、結合体化されていない免疫学的パートナーを適用し得
る。
体間で変動する。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射(例えば、皮
内、筋内、静脈内、または皮下)、鼻腔内(例えば、吸入)、または経口によっ
て投与され得る。1〜3の用量が、1〜36週間投与され得る。好ましくは、3
〜4ヶ月の間隔で、3用量が投与され、そしてブースターワクチン接種が、その
後定期的に与えられ得る。代替のプロトコールが、個々の患者に適切であり得る
。適切な用量は、上記のように投与される場合に、少なくとも1〜2年間患者を
Chlamydial感染から防御するに十分に、免疫した患者において免疫応
答を惹起し得るポリペプチドまたはDNAの量である。一般的に、1用量中に存
在する(または、1用量中のDNAによってインサイチュで産生される)ポリペ
プチドの量は、宿主1kgあたり約1pg〜約100mg、代表的には、約10
pg〜約1mg、そして好ましくは約100pg〜約1μgの範囲である。適切
な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、約0.1mL
〜約5mLの範囲である。
され得るが、キャリアの型は投与の様式に依存して変化する。非経口投与(例え
ば、皮下注射)について、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコー
ル、脂肪、ろう、または緩衝液を含む。経口投与について、マンニトール、ラク
トース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク
、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムのような、任
意の上記のキャリアまたは固体キャリアが使用され得る。生分解性ミクロスフェ
ア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド)もまた、本発明の薬学的組成物のキャリアと
して使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第4,
897,268号および同第5,075,109号に開示される。
利点を提供するに十分な量で活性化合物を提供する。このような応答は、処置さ
れていない患者と比較して、処置された患者において改善された臨床的結果を確
証することによって、モニターされ得る。Chlamydialタンパク質に対
する既存の免疫応答の増加は、一般的に改善された臨床的結果と相関する。この
ような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、ま
たはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これらは、処置前および処置
後の患者から得られるサンプルを用いて実施され得る。
されるポリペプチドを使用する方法を提供する。この局面では、方法は、1つ以
上の上記のポリペプチドを単独または組み合わせのいずれかで使用して、生物学
的サンプルにおけるChlamydial感染を検出するために提供される。明
確さのために、用語「ポリペプチド」は、本発明の診断方法の特定の実施形態を
記載する場合に使用される。しかし、本発明の融合タンパク質がまた、このよう
な方法において使用され得ることは、当業者に明らかである。
意の抗体を含有するサンプルである。好ましくは、サンプルは、全血、痰、血清
、血漿、唾液、脳脊髄液または尿である。より好ましくは、サンプルは、患者か
ら得られる血液サンプル、血清サンプル、または血漿サンプルである。ポリペプ
チドは、以下に記載されるように、予め決定されたカットオフ値と相対的な、サ
ンプル中のポリペプチドに対する抗体の存在または非存在を決定するためのアッ
セイにおいて用いられる。このような抗体の存在は、Chlamydia抗原に
対する以前の感作を示し、これは、Chlamydia感染の指標であり得る。
ドは、好ましくは、補完的である(すなわち、1つの成分ポリペプチドが、別の
成分ポリペプチドによって感染が検出されないサンプルにおいて、感染を検出す
る傾向にある)。補完的ポリペプチドは、各ポリペプチドを個々に使用して、C
hlamydiaに感染したことが既知の一連の患者から得られた血清サンプル
を評価することによって同定され得る。いずれのサンプルが、各ポリペプチドと
(以下に記載のように)陽性かを試験し決定した後、大半またはすべての試験し
たサンプルにおいて感染を検出し得る2つ以上のポリペプチドの組み合わせが処
方され得る。
、種々のアッセイ様式が当業者に周知である。例えば、HawlowおよびLa
ne、Antibodies:A Laboratory Manual、Co
ld Spring Harbor Laboratory、1988(これを
、本明細書中で参考として援用する)を参照のこと。好ましい実施形態では、ア
ッセイは、サンプル由来の抗体に結合し、そしてそれを取り除くために、固体支
持体上に固定されたポリペプチドの使用を含む。次いで、結合した抗体を、レポ
ーター基を含む検出試薬を用いて検出し得る。適切な検出試薬は、レポーター基
で標識された、抗体/ポリペプチド複合体および遊離ポリペプチドに結合する抗
体を含む(すなわち、半競合的アッセイにおいて)。あるいは、競合的アッセイ
が利用され得、ここではポリペプチドに結合する抗体をレポーター基で標識し、
そして抗原とサンプルとのインキュベーションの後、固定された抗原に結合させ
る。サンプルの成分がポリペプチドへの標識化抗体の結合を阻害する程度は、固
定されたポリペプチドとのサンプルの反応性の指標である。
る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、または
ニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビー
ズまたはディスク(例えば、ガラス、繊維ガラス、ラテックス、またはプラスチ
ック材料(例えば、ポリスチレンまたは塩化ビニル))であり得る。支持体はま
た、磁気粒子または光ファイバーセンサー(fiber optic sens
or)(例えば、米国特許第5,359,681号に開示されたもの)であり得
る。
れ得る。本発明の状況において、用語「結合した(された)」は、非共有結合性
会合(例えば、吸着)および共有結合性連結(これは、支持体上での抗原と官能
基との間の直接的な結合であり得るか、または架橋剤による結合であり得る)の
両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による結合
が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で適切な量の時間、ポリ
ペプチドを固体支持体と接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度
に伴って変動するが、代表的に、約1時間と1日との間である。一般的に、プラ
スチックマイクロタイタープレート(例えば、ポリスチレンまたは塩化ビニル)
のウェルを、約10ng〜約1μgの範囲(そして好ましくは、約100ng)
の量のポリペプチドと接触させることは、十分な量の抗原を結合するに十分であ
る。
官能性試薬と反応させることによって達成され得る。その二官能性試薬は、支持
体と官能基(例えば、ポリペプチド上のヒドロキシル基またはアミノ基)の両方
と反応する。例えば、そのポリペプチドは、ベンゾキノンを使用することにより
、または支持体上のアルデヒド基の、ポリペプチド上のアミンと活性水素との縮
合によって、適切なポリマー被覆を有する支持体に結合され得る(例えば、Pi
ece Immunotechnology Catalog and Han
dbook、1991、A12〜A13を参照のこと)。
セイは、固体支持体(一般的には、マイクロタイタープレートのウェル)上に固
定化されたポリペプチド抗原を、サンプルと最初に接触させることによって行い
得、その結果、サンプル中のポリペプチドに対する抗体は、固定されたポリペプ
チドに結合することが可能になる。次いで、未結合のサンプルが固定化されたポ
リペプチド複合体から取り除かれ、そして固定化されたポリペプチド複合体に結
合し得る検出試薬が添加される。次いで、固体支持体に結合したまま残っている
検出試薬の量が、特定の検出試薬に対して適切な方法を使用して決定される。
らば、支持体上の残っているタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる
。当業者に公知である任意の適切なブロッキング試薬(例えば、ウシ血清アルブ
ミン(BSA)またはTween20TM(Sigma Chemical Co
.,St.Louis,MO))が利用され得る。次いで、固定化されたポリペ
プチドを、サンプルとともにインキュベートし、そして抗体が抗原と結合可能に
する。サンプルを、インキュベーションに先立って、適切な希釈剤(例えば、リ
ン酸緩衝化生理食塩水(PBS))で希釈し得る。一般的には、適切な接触時間
(すなわち、インキュベーション時間)は、HGE−感染したサンプル中の抗体
の存在を検出するに十分な時間の期間である。好ましくは、接触時間は、結合し
た抗体と未結合の抗体との間の平衡において達成される少なくとも95%である
結合のレベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡を達成するのに十分な
時間が、時間の期間に渡って発生する結合のレベルをアッセイすることによって
容易に決定され得ることを理解する。室温において、約30分間のインキュベー
ション時間が、一般的に十分である。
20TMを含有するPBS)で支持体を洗浄することによって取り除く。次いで、
検出試薬を固体支持体に添加する。適切な検出試薬は、固定化された抗体−ポリ
ペプチド複合体に結合し、そして当業者に公知の種々の手段のいずれかによって
検出され得る任意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポーター基と結
合体化された結合剤(例えば、プロテインA、プロテインG、免疫グロブリン、
レクチン、または遊離の抗原)を含む。好ましいレポーター基は、酵素(例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼ)、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性
核種、発行基、蛍光基、およびビオチンを含む。レポーター基への結合剤の結合
体化は、当業者に公知の標準的な方法を用いて達成され得る。種々のレポーター
基に結合体化された一般的な結合剤はまた、多くの商業的な供給源(例えば、Z
ymed Laboratories,San Francisco,CAおよ
びPierce,Rockford,IL)から購入し得る。
た抗体−ポリペプチド複合体とともにインキュベートする。適切な時間の長さは
、一般的に、製造業者の指示書から、または時間の期間にわたって起こる結合の
レベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、未結合の検出試薬を
除去し、そしてレポーター基を用いて結合した検出試薬を検出する。レポーター
基を検出するために利用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性
活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が一
般的には適切である。分光学的方法は、色素、発光基および蛍光基を検出するた
めに使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基(一般的には、放射活性基
もしくは蛍光基または酵素)と結合したアビジンを使用して検出され得る。酵素
レポーター基は、一般的に、基質の添加によって検出され得(一般的には、特定
の時間の期間)、続いて反応生成物の分光学的分析または他の分析を行う。
、固体支持体に結合したまま残っているレポーター基からの検出されたシグナル
は、一般的に、所定のカットオフ値に対応するシグナルに匹敵する。1つの好ま
しい実施形態において、カットオフ値は、固定化された抗原が非感染患者由来の
サンプルとともにインキュベートされる場合に得られる平均のシグナルである。
一般的に、上記の所定のカットオフ値よりも上の3つの標準偏差であるシグナル
を生成するサンプルは、Chlamydia感染について陽性であるとみなされ
る。代替的な好ましい実施形態において、カットオフ値は、Sackettら、
Clinical Epidemiology:A Basic Scienc
e for Clinical Medicine,Little Brown
and Co.,1985、106〜107頁の方法に従って、Receiv
er Operator Curveを使用して決定される。手短に言えば、こ
の実施形態において、カットオフ値は、真の陽性の割合(すなわち、感受性)の
対、および診断試験の結果についての各々の可能なカットオフ値に対応する擬陽
性の割合(100%特異性)のプロットから決定され得る。上部の左側の端に最
も近接するプロット上のカットオフ値(すなわち、最も大きい領域を取り囲む値
)は、最も正確はカットオフ値であり、そしてこの方法によって決定されたカッ
トオフ値よりも高いシグナルを産生するサンプルが陽性であるとみなされる。あ
るいは、カットオフ値は、プロットに沿って左にシフトして、擬陽性の割合を最
小化し得るか、または右にシフトして、偽陰性の割合を最小化し得る。一般的に
、この方法によって決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを産生するサン
プルは、Chlamydial感染について陽性であるとみなされる。
試験形式で実行され、ここで抗原は、メンブレン(例えば、ニトロセルロース)
上に固定化される。フロースルー試験において、サンプル中の抗体は、サンプル
がメンブレンを通過する際に固定化されたポリペプチドに結合する。次いで、検
出試薬(例えば、プロテインA−コロイド金)は、検出試薬を含む溶液がメンブ
レンを通して流れるにつれて、抗体−ポリペプチド複合体に結合する。次いで、
結合した検出試薬の検出が上記のように行われ得る。ストリップ試験形式におい
て、ポリペプチドが結合するメンブレンの一方の端は、サンプルを含有する溶液
中に浸漬される。サンプルは、検出試薬を含む領域を通してメンブレンに沿って
移動し、そして固定化されたポリペプチドまで移動する。ポリペプチドでの検出
試薬の濃度は、サンプル中の抗Chlamydia抗体の存在を示す。代表的に
は、その部位での検出試薬の濃度は、視覚的に読みとれ得るような、線のような
パターンを生成する。このようなパターンの非存在は、ネガティブな結果を示す
。一般的に、メンブレン上に固定化されたポリペプチドの量は、生物学的サンプ
ルが、上記のように、ELASAにおいてポジティブシグナルを生成するのに十
分なレベルの抗体を含有する場合に、視覚的に識別可能なパターンを生成するよ
うに選択される。好ましくは、メンブレン上に固定化されたポリペプチドの量は
、約25ng〜約1μg、そしてより好ましくは、約50ng〜約500ngの
範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少量(例えば、1滴)の患
者の血清または血液で行われ得る。
ロトコルが存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。このような方法にお
いて有用に使用され得る代替的なアッセイプロトコルの1つの例は、ウェスタン
ブロットであり、ここで生物学的サンプル中に存在するタンパク質はゲル中で分
離され、その後結合剤に曝される。このような技術は、当業者に周知である。
びその抗体フラグメントのような因子を提供する。本明細書中で使用される場合
、抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能なレベルでChlamyd
ialタンパク質と反応し、かつ同様の条件下で関連しないタンパク質と検出可
能に反応しない場合(例えば、ELISA中で)に、Chlamydialタン
パク質に「特異的に結合する」。本明細書中で使用される場合、「結合する」と
は、複合体が形成されるように2つの別々の分子間の非共有的結合をいう。結合
する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することによって
評価され得る。結合定数は、複合体の濃度が成分濃度の積で割られた場合に得ら
れる値である。一般的に、複合体形成についての結合定数が、約103L/mo
lを超える場合に、2つの成分は、本発明の文脈において「結合する」といわれ
る。結合定数は、当該分野で周知の方法を使用して決定され得る。
lamydia感染を有する患者とChlamydia感染を有さない患者との
間を区別し得る。言い換えれば、Chlamydiaタンパク質に結合する抗体
または他の結合剤は、疾患を有する少なくとも約20%の患者においてChla
mydia感染の存在を示すシグナルを産生し、そして感染を有さない少なくと
も約90%の個体において疾患の非存在を示す陰性のシグナルを産生する。結合
剤がこの要件を満たすか否かを決定するために、Chlamydia感染を有す
る患者およびChlamydia感染を有さない患者(標準的な臨床試験を用い
て決定される)由来の生物学的サンプル(例えば、血液、血清、痰、尿、および
/または組織生検)を、結合剤に結合するポリペプチドの存在について、本明細
書中で記載されるようにアッセイし得る。統計学的に有意な数の、疾患を有する
サンプルおよび疾患を有さないサンプルがアッセイされるべきであることは明ら
かである。各結合剤は、上記の判断基準を満たすべきである;しかし、当業者は
、結合剤が、感度を改善するために組み合わせて使用され得ることを理解する。
チド成分を含むかまたは含まない、リボソーム、RNA分子、またはポリペプチ
ドであり得る。好ましい実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合
フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって調
製され得る。例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A
Laboratory Manual、Cold Spring Harbo
r Laboratory,1988を参照のこと。一般的に、抗体は、組換え
抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術(本明細書中で記載されるような
モノクローナル抗体の生成を含む)によって、または適切な細菌細胞宿主または
哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して生成され得る
。1つの技術において、ポリペプチドを含む免疫原は、最初に、広範な種々の哺
乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ)のいずれかに
注入される。この段階において、本発明のポリペプチドは、改変することなく免
疫原として働き得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドについて、卓越し
た免疫応答は、ポリペプチドがキャリアタンパク質(例えば、ウシ血清アルブミ
ンまたはキーホールリンペットヘモシアニン)と結合される場合に誘発され得る
。免疫原は、好ましくは、1回以上のブースター免疫を組み込む所定のスケジュ
ールに従って動物宿主に注入され、そして動物を定期的に採血する。次いで、ポ
リペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、このような血清から、例えば、適
切な固体支持体に結合させたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグ
ラフィーによって精製し得る。
lerおよびMilstein、Eur.J.Immunol.6:511−5
19、1976の技術およびそれに対する改良を使用して、調製され得る。手短
に言えば、これらの方法は、所望の特異性(すなわち、目的のポリペプチドとの
反応性)を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞
株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から生成さ
れ得る。次いで、脾臓細胞を、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー(好まし
くは免疫化された動物と同系であるもの)との融合によって不死化する。種々の
融合技術が利用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、非イオン
性界面活性剤とともに数分間混合し得、次いでハイブリッド細胞の増殖を支持す
るが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上で低密度でプレーティング
し得る。好ましい選択技術は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン)選択を使用する。十分な時間(通常1〜2週間)の後、ハイブリッドのコ
ロニーを観察する。単一のコロニーを選択し、そしてそれらの培養上清をポリペ
プチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハ
イブリドーマが好ましい。
し得る。さらに、種々の技術(例えば、適切な脊椎動物宿主(例えば、マウス)
の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入)が、収量を増大させるために利用さ
れ得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑
物を、通常の技術(例えば、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿、および抽出
)によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニテ
ィークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
のようなフラグメントは、標準的な技術を使用して調製され得るFabフラグメ
ントを含む。手短には、免疫グロブリンを、プロテインAビーズカラム上のアフ
ィニティークロマトグラフィー(HarlowおよびLane、Antibod
ies:A Laboratory Manual、Cold Spring
Harbor Laboratory、1988)によってウサギ血清から精製
し得、そしてパパインによって消化して、FabフラグメントおよびFcフラグ
メントを産生し得る。FabフラグメントおよびFcフラグメントは、プロテイ
ンAビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る
。
において適切な薬剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびその誘導
体を含む。好ましい放射性核種には、90Y、123I、125I、131I、186Re、21 1 At、および212Biが含まれる。好ましい薬物には、メトトレキセート、なら
びにピリミジンアナログおよびプリンアナログが含まれる。好ましい分化誘導剤
には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。好ましい毒素には、リシン、
アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン(gelonin)、Pse
udomonas体外毒素、Shigella毒素、およびアメリカヤマゴボウ
抗ウイルスタンパク質が含まれる。
クローナル抗体とカップリング(例えば、共有結合によって)され得る。薬剤と
抗体との直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能で
ある。例えば、一方の求核基(例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基)は、
もう一方の無水物もしくは酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、または
良好な遊離基(例えば、ハロゲン化物)を含むアルキル基と反応し得る。
望され得る。リンカー基は、結合の可能性の妨害を回避するために抗体を薬剤か
ら隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗
体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従ってカップリング効
率を増大させる。化学的な反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使
用を容易にし得る(さもなければ可能ではない)。
えば、Pierce Chemical Co.,Rockford,ILのカ
タログ中に記載されるもの)が、リンカー基として使用され得る。カップリング
は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された
炭水化物基を通してもたらされ得た。このような方法論を記載する多数の参考文
献(例えば、Rodwellらに対する米国特許第4,671,958号)が存
在する。
胞中への内部移行の間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用すること
が所望であり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これ
らのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の
還元(例えば、Spitlerらへの米国特許第4,489,710号)、感光
性結合の照射(例えば、Senterらへの米国特許第4,625,014号)
、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解(例えば、Kohnらへの米国特許第
4,638,045号)、血清補体媒介性加水分解(例えば、Rodwellら
への米国特許第4,671,958号)、および酸によって触媒される加水分解
(例えば、Blattlerらへの米国特許第4,569,789号)による切
断を含む。
施形態において、複数の薬剤の分子が1つの抗体分子にカップリングされる。別
の実施形態において、1つより多い薬剤の型が1つの抗体にカップリングされ得
る。特定の実施形態に関わらず、1つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々
の方法で調製され得る。例えば、1つより多い薬剤が、抗体分子に直接的にカッ
プリング抗体分子に直接的にカップリングされ得るか、または付着のための複数
の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る
。
共有結合を含む)で薬剤を保有し得る。適切なキャリアには、アルブミンのよう
なタンパク質(例えば、Katoらへの米国特許第4,507,234号)、ペ
プチド、およびアミノデキストランのようなポリサッカリド(例えば、Shih
らへの米国特許第4,699,784号)を含み得る。キャリアはまた、例えば
リポソームベシクル内に、非共有結合によって、またはカプセル化によって、薬
剤を保有し得る(例えば、米国特許第4,429,008号および同第4,87
3、088号)。放射性核種に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化された低
分子およびキレート化合物を含み得る。例えば、米国特許第4,735,792
号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性
核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種の結合のためのドナー原
子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例え
ば、Davisonらへの米国特許第4,673,562号は、代表的なキレー
ト化合物およびそれらの合成を開示する。
は、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または適切な方法による組織特異的領域に
おいてである。抗体/免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、抗原密度、
および抗体のクリアランスの速度に依存して変化することは明白である。
ッセイを使用する、Chlamydia抗原の存在を検出するための診断試験に
おいて使用され得、それによって患者においてChlamydia感染を検出す
るための方法を提供する。
配列、または1つ以上のその部分を含み得る。例えば、少なくとも2つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、生物学的サンプル由来のChlamydia特異的
cDNAを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくアッセイに
おいて利用され得、ここで、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーが
、本発明のポリペプチドをコードするDNA分子に特異的である。次いで、増幅
されたcDNAの存在が、当該分野で周知の技術(例えば、ゲル電気泳動)を使
用して検出される。同様に、本発明のポリペプチドをコードするDNA分子に特
異的なオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中の本発明のポリペプ
チドの存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され
得る。
ドプライマー/プローブ」とは、問題のDNA分子に少なくとも約80%、好ま
しくは少なくとも約90%、およびより好ましくは少なくとも約95%の同一性
を有するオリゴヌクレオチド配列を意味する。本発明の診断方法において有用に
利用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび/またはプローブは、好まし
くは少なくとも約10〜40ヌクレオチドを有する。好ましい実施形態において
、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される1つのポリペプチ
ドをコードする連続する少なくとも約10ヌクレオチドのDNA分子を含む。好
ましくは、本発明の診断方法において使用するためのオリゴヌクレオチドプロー
ブは、本明細書中で開示される1つのポリペプチドをコードする連続する少なく
とも約15の連続するオリゴヌクレオチドのDNA分子を含む。PCRに基づく
アッセイとハイブリダイゼーションアッセイとの両方についての技術は、当該分
野において周知である(例えば、Mullisら、同書;Ehrlich、同書
を参照のこと)。従って、プライマーまたはプローブは、生物学的サンプル中の
Chlamydia特異的配列を検出するために使用され得る。上記のオリゴヌ
クレオチド配列を含むDNAプローブまたはDNAプライマーは、単独でまたは
互いに組み合わせて使用され得る。
。
tis LGV IIのゲノムDNAライブラリーの発現クローニングによって
、本質的にSandersonら(J.Exp.Med.1995、182:1
751〜1757)に記載されるように単離し、そして免疫反応性T細胞株にお
いてPBMC増殖およびIFN−γを誘導することを示した。
atis LGV IIの基本小体によるクラミジア生殖管感染の既往症のない
正常なドナー由来のPBMCを刺激することによって生成した。このT細胞株(
TCL−8といわれる)は、Chlamydia trachomatisおよ
びChlamydia pneumoniaの両方に感染した単球由来の樹状細
胞の認識することが見出された。
したゲノムライブラリーを、λZAP(Stratagene、La Joll
a、CA)において構築し、そしてこの増幅されたライブラリーを、30クロー
ン/ウェルの密度で、96ウェルマイクロタイタープレートにプレートした。細
菌を、2mM IPTGの存在下で組換えタンパク質を発現するように、3時間
誘導し、次いで、ペレットにして、そして200μlのRPMI 10%FBS
中に再懸濁した。10μlの誘導された細菌懸濁液を、自己単球由来の樹状細胞
を含む96ウェルプレートに移した。2時間のインキュベーションの後に、樹状
細胞を洗浄して、フリーのE.coliを除去し、そしてChlamydia特
異的T細胞を添加した。陽性E.coliプールを、このプールに応答するIF
N−γ産生およびT細胞の増殖を決定することにより同定した。
B1−66、4−D7−28、3−G3−10および10−C10−31といわ
れる)を、それぞれ、481bp、183bp、110bpおよび1400bp
のインサートの大きさで得た。1−B1−66、4−D7−28、3−G3−1
0および10−C10−31について決定されたDNA配列を、それぞれ、配列
番号1〜4に提供する。クローン1−B1−66は、C.trachomati
sゲノムのおよその領域536690(NCBI C.trachomatis
データベース)にある。クローン1−B1−66内には、以前に同定された9k
Daタンパク質(Stephensら、Genbank登録番号AE00132
0)をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)が同定されており、
この配列を、配列番号5に提供する。クローン4−D7−28は、同じORFの
より小さな領域である(1−B1−66のアミノ酸22〜82)。クローン3−
G3−10は、C.trachomatisゲノムのおよその領域74559に
ある。このインサートを、このゲノムのその配向に関してアンチセンスの配向に
おいてクローニングする。クローン10−C10−31は、Chlamydia
trachomatis由来のS13リボソームタンパク質について以前に公
開された配列に対応するオープンリーディングフレームを含む(Gu,L.ら、
J.Bacteriology、177:2594〜2601、1995)。4
−D7−28および10−C10−31についての推定タンパク質配列を、それ
ぞれ、配列番号6および12に提供する。3−G3−10についての推定タンパ
ク質配列を、配列番号7〜11に提供する。
上記のChlamydia trachomatis LGV IIのゲノムD
NAライブラリーをスクリーニングした。Chlamydia特異的T細胞株(
TCT−1)は、Chlamydia trachomatis LGV II
の基本小体に感染した自己単球由来の樹状細胞を有する患者のPBMCを刺激す
ることによってクラミジア生殖管を患う患者に由来した。1256bpのインサ
ートを含む、1つのクローンである4C9−18(配列番号21)は、標準的な
増殖アッセイによって測定されるように、Chlamydia特異的T細胞株T
CT−1からの特異的免疫応答を誘発した。その後の分析により、このクローン
は、以下の3つの既知の配列を含むことが明らかにされた:配列番号22におい
て開示される、リポアミドデヒドロゲナーゼ(Genbank登録番号AE00
1326);配列番号23において開示される、ハイポセティカルタンパク質C
T429(Genbank登録番号AE001316);および配列番号24に
おいて開示される、ユビキノンメチルトランスフェラーゼCT428(Genb
ank登録番号AE001316)のオープンリーディングフレームの一部。
trachomatis(LGV II)由来のリポアミドデヒドロゲナーゼの
全長アミノ酸配列(配列番号22)を、配列番号90に開示されるクローンCt
L2−LPDA−FL中に発現させた。
るために、6×ヒスチジンタグをアミノ末端にコードするcDNA配列を有する
クローン4C9−18のヌクレオチド1〜695を含むcDNAフラグメントを
、pET17bベクター(Novagen、Madison、WI)のNdeI
/EcoRI部位にサブクローニングし(クローン4C9−18♯2 BL21
pLysS(配列番号25、配列番号26に提供される対応するアミノ酸配列
を有する)、そしてE.coli中に形質転換した。2mM IPTGでの3時
間の、形質転換されたE.coliの選択的誘導は、標準的なクマシー染色した
SDS−PAGEにより確証されるように、クローン4C9−18♯2 BL2
1 pLysSから26kDaのタンパク質の発現を生じた。クローン4C9−
18♯2 BL21 pLysSによりコードされるタンパク質の免疫原性を決
定するために、26kDaのタンパク質を発現するE.coliを、1×104
の単球由来の樹状細胞上で力価測定し、そして2時間インキュベートした。樹状
細胞培養物を、洗浄し、そして2.5×104のT細胞(TCT−1)を、添加
して、そしてさらに72時間インキュベートさせて、その時点で、培養物上清に
おけるIFN−γのレベルを、ELISAにより決定した。図1に示されるよう
に、T細胞株TCT−1は、IFN−gにより測定されるように、誘導した培養
物に応答することが見出され、これは、リポアミドデヒドロゲナーゼ配列に対す
るChlamydia特異的T細胞応答を示す。同様に、クローン4C9−18
♯2 BL21 pLysSによりコードされるタンパク質は、標準的な増殖ア
ッセイによりTCT−1 T細胞株を刺激することが示された。
mydia trachomatis抗原を同定するその後の研究は、さらなる
クローンを生じた。TCT−1およびTCL−8 Chlamydia特異的T
細胞株、ならびにTCP−21 T細胞株を利用して、Chlamydia t
rachomatis LGVIIゲノムライブラリーをスクリーニングした。
TCP−21 T細胞株は、Chlamydia pnuemoniaeに対す
る液性免疫応答を有する患者に由来した。TCT−1細胞株は、37の陽性プー
ルを同定し、TCT−3細胞株は、41の陽性プールを同定し、そしてTCP−
21細胞株は、2つの陽性プールを同定した。以下のクローンは、これらの陽性
プールのうちの10個に由来した。TCP−21細胞株により同定される、クロ
ーン11−A3−93(配列番号64)は、HADスーパーファミリーに対する
相同性を共有する1330bpのゲノムフラグメントである(CT103)。同
じクローンにおける第2のインサートは、相補鎖上に存在するfabI遺伝子(
CT104)と相同性を共有する。TCP−21細胞株を使用して同定された、
クローン11−C12−91(配列番号63)は、OMP2遺伝子(CT443
)の一部である269bpインサートを有し、そしてC.pnuemoniae
の60kDaのシステインに富む外膜タンパク質と相同性を共有する。
番号62)は、ハイポセティカルタンパク質CT610に対して相同性を共有す
る688bpのインサートを含む。TCT−3細胞株を使用して同定された、ク
ローン11−G1−34(配列番号61)は、1215bpのインサートの大き
さを有する、2つの部分的なオープンリーディングフレーム(ORF)を有する
。一方のORFは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(CT376)に対して相
同性を共有し、そして他方のORFは、グリコーゲンヒドロラーゼ遺伝子(CT
042)に対して相同性を共有する。TCT−3細胞株を使用して同定された、
クローン11−H3−68(配列番号60)は、全体のインサートの大きさが1
180bpである、2つのORFを有する。一方の部分的なORFは、プラスミ
ドによりコードされるPGP6−Dビルレンスタンパク質をコードし、一方、第
2のORFは、L1リボソーム遺伝子(CT318)に対する完全なORFであ
る。TCT−3細胞株を使用して同定される、クローン11−H4−28(配列
番号59)は、552bpのインサートの大きさを有し、そしてdnaK遺伝子
(CT396)に対するORFの一部である。TCT−1細胞株を使用して同定
される、クローン12−B3−95(配列番号58)は、463bpのインサー
トの大きさを有し、そしてリポアミドデヒドロゲナーゼ遺伝子(CT557)の
ORFの一部である。クローン15−G1−89および12−B3−95は同一
であり(それぞれ、配列番号55および58)、TCT−1細胞株を使用して同
定され、463bpのインサートの大きさを有し、そしてリポアミドデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子(CT557)のORFの一部である。TCT−1細胞株を使用し
て同定される、クローン12−G3−83(配列番号57)は、1537bpの
インサートの大きさを有し、そしてハイポセティカルタンパク質CT622のO
RFの一部である。
号79)は、950bpのインサートを含み、そしてL11リボソームORFの
小さな部分、L1リボソームタンパク質のORF全体、およびL10リボソーム
タンパク質のORFの一部を含む。TCT−1細胞株を使用して同定された、ク
ローン22−F8−91(配列番号80)は、このクローンの相補鎖上のpmp
C ORFの一部を含む395bpのインサートを含む。TCT−3細胞株を使
用して同定された、クローン21−E8−95(配列番号81)は、CT613
ORFの一部、CT612の完全ORF、CT611の完全ORFおよびCT
610のORFの一部を含む、2,085bpのインサートを含む。TCT−3
細胞株を使用して同定された、クローン19−F12−53(配列番号82)は
、CT858 ORFの部分およびrecA ORFの小さな部分を含む、40
5bpのインサートを含む。TCT−3細胞株を使用して同定された、クローン
19−F12−53(配列番号83)は、グルタミルtRNAシンテターゼをコ
ードするCT455のORFの一部である、379bpのインサートを含む。T
CT−3細胞株を使用して同定された、クローン19−A5−54(配列番号8
4)は、潜在性プラスミドのORF3(このクローンの相補鎖)の一部である7
15bpのインサートを含む。TCT−1細胞株を使用して同定された、クロー
ン17−E11−72(配列番号85)は、Opp 2およびpmpDのORF
の一部である、476bpのインサートを含む。このクローンのpmpD領域は
、クローン15−H2−76のpmpD領域に含まれる。TCT−3細胞株を使
用して同定された、クローン17−C1−77(配列番号86)は、CT857
ORFの一部、およびCT858 ORFの一部である、1551bpのイン
サートを含む。TCT−1細胞株を使用して同定された、クローン15−H2−
76(配列番号87)は、pmpD ORFの大きな部分、CT089 ORF
の一部、およびSycEのORFの一部を含む、3,031bpのインサートを
含む。クローン15−A3−26(配列番号88)は、CT858のORFの一
部を含む976bpのインサートを含む。TCT−10細胞株を使用して同定さ
れた、クローン17−G4−36(配列番号267)は、プラスミド中にβ-g
alをインフレーム(in frame)で含み、そしてDNA指向性RNAポ
リメラーゼβサブユニット(SerDにおけるCT315)のORFの一部に対
して相同性を共有する、680bpのインサートを含む。
有する。Chlamydia trachomatisのゲノム配列は、pmp
といわれる、9つの多型性膜タンパク質遺伝子のファミリーを含む。これらの遺
伝子は、pmpA、pmpB、pmpC、pmpD、pmpE、pmpF、pm
pG、pmpH、およびpmpIと命名される。これらの遺伝子から発現される
タンパク質は、Chlamydia感染に応答する防御免疫応答の生成において
生物学的関連性があると考えられている。特に、pmpC、pmpD、pmpE
およびpmpIは、推定シグナルペプチドを含み、このことは、それらが外膜タ
ンパク質であること、従って、潜在的な免疫学的標的であることを示唆する。
に基づいて、プライマー対を、pmpC、pmpD、pmpE、pmpG、pm
pHおよびpmpIの全長フラグメントをPCR増幅するために設計した。得ら
れたフラグメントを、DNAワクチンベクターJA4303またはJAL(これ
は、改変したリンカーを有するJA4303である)(SmithKline
Beecham、London、England)中にサブクローニングした。
詳細には、pmpCを、それぞれ、配列番号197および198において提供さ
れる、以下:
下でのこの遺伝子のPCR増幅、およびJALベクターの5’ASCI/3’
MluI部位中への連結を、Kozak様配列を作製するためにATGの上流に
短いヌクレオチド配列GCAATC(配列番号199)を挿入することによって
完了した。得られた発現ベクターは、ハイポセティカルシグナル配列を含む53
25個のヌクレオチド(配列番号173)を含む全長pmpC遺伝子(これは、
187kDのタンパク質(配列番号179)をコードする)を含んだ。pmpD
遺伝子を、以下のオリゴ:
中にサブクローニングした。この遺伝子を、当該分野において周知の標準的な技
術を使用して、JA4304ワクチンベクターの5’平滑化HIII/3’Ml
uI部位中に連結した。CAATC(配列番号202)を、ATGの上流に挿入
して、Kozak様配列を作製した。このクローンは、Kozak様配列の最後
のグリシンと同様に、HindIII部位の最後のトレオニンが平滑手順に起因
して欠けているという点で独特である。インサートの4593ヌクレオチドフラ
グメント(配列番号172)は、ハイポセティカルシグナル配列を含むpmpD
の全長遺伝子(これは、161kDのタンパク質(配列番号178)をコードす
る)である。pmpEを、以下:
に、この遺伝子を、JA4304の5’平滑化HIII/3’ MluI部位中
に連結した。これを容易にするために、短いヌクレオチド配列であるTGCAA
TC(配列番号293)を、Kozak様配列を作製し、かつHindIII部
位を再構成するために、開始コドンの上流に付加した。このインサートは、ハイ
ポセティカルシグナル配列を含む全長pmpE遺伝子(配列番号171)である
。pmpE遺伝子は、105kDのタンパク質(配列番号177)をコードする
。pmpG遺伝子を、以下:
した。同様のクローニングストラテジーは、pmpI遺伝子およびpmpK遺伝
子についても従った。さらに、プライマー対を、pmp遺伝子の全長フラグメン
トまたは重複フラグメントをPCR増幅するために設計し、次いで、これは、p
ET17bベクター(Novagen、Madison、WI)中でのタンパク
質発現のためにサブクローニングし、そして発現、およびNovagenによる
ヒスチジン−ニッケルクロマトグラフィー方法論を利用するその後の精製のため
にE.coli BL21 pLysS中にトランスフェクトした。以下に記載
されるような、組換えタンパク質をコードするいくつかの遺伝子は、このタンパ
ク質の発現を容易にするためにネイティブなシグナル配列を欠く。pmpCの全
長タンパク質の発現を、2つの重複フラグメント(アミノ酸末端およびカルボキ
シ末端を示す)の発現を通して達成した。シグナル配列を欠くpmpCアミノ末
端部分(配列番号187、配列番号195に提供される対応するアミノ酸配列を
有する)のサブクローニングは、このベクターの5’NdeI/3’KPNクロ
ーニング部位に、以下:
ラグメント(配列番号186、配列番号194に提供される対応するアミノ酸配
列を有する)を、以下のプライマー:
ブクローニングした。pmpDもまた、2つの重複タンパク質として発現させた
。シグナル配列を欠くpmpDアミノ酸末端部分(配列番号185、配列番号1
93に提供される対応するアミノ酸配列を有する)は、pET17bの開始コド
ンを含み、そして80kDのタンパク質として発現する。タンパク質の発現およ
び精製の目的のために、6個のヒスチジンのタグを開始コドンに続けて、そして
この遺伝子の28番目のアミノ酸(ヌクレオチド84)に融合させる。ベクター
の5’NdeI/3’KPNクローニング部位中にスプライスするために、以下
のプライマーを使用した:
(配列番号192)として発現させた。発現およびその後の精製のために、さら
なるメチオニン、アラニンおよびセリン(これは、pET17bベクター由来の
開始コドンおよび最初の2つのアミノ酸を示す)を、含ませた。メチオニン、ア
ラニン、およびセリンの下流の6個のヒスチジンのタグを、この遺伝子の691
番目のアミノ酸(ヌクレオチド2073)に融合させる。以下:
ング部位中にサブクローニングした。pmpEを、106kDのタンパク質(配
列番号183、配列番号191に提供される対応するアミノ酸配列を有すR)と
して発現させた。pmpEインサートはまた、ネイティブなシグナル配列を欠く
。当該分野において周知の条件下での遺伝子のPCR増幅を、以下のオリゴプラ
イマー:
I/3’EcoRI部位中に連結した。配列番号217に提供される、短いヌク
レオチド配列を、Kozak様配列を作製し、かつHindIII部位を再構成
するために、開始コドンの上流に挿入した。発現されたタンパク質は、pET1
7b発現ベクター由来の開始コドンおよび下流の21個のアミノ酸(すなわち、
MASMTGGQQMGRDSSLVPSSDP(配列番号218))を含む。
さらに、6個のヒスチジンのタグを、上記の配列の上流に含ませ、そしてこの遺
伝子の28番目のアミノ酸(ヌクレオチド84)(これは、ハイポセティカルシ
グナルペプチドを除去する)に融合する。配列番号191に提供される対応する
アミノ酸を有する配列番号183に提供される配列は、これらのさらなる配列を
含まない。pmpG遺伝子(配列番号182、配列番号190に提供される対応
するアミノ酸配列を有する)を、以下のオリゴプライマー:
の5’KPN/3’NotIクローニング部位中に連結した。発現されたタンパ
ク質は、アミノ末端にさらなるアミノ酸配列(すなわち、MASMTGGQQN
GRDSSLVPHHHHHH(配列番号221))を含み、これは、pET1
7b発現ベクター由来の開始コドンおよびさらなる配列を含む。pmpI遺伝子
(配列番号181、配列番号189に提供される対応するアミノ酸配列を有する
)を、以下のオリゴプライマー:
ーに5’NheI/3’SpeIクローニング部位において連結した。95kD
の発現したタンパク質は、このタンパク質のアミノ末端に、pET17bベクタ
ーに由来する、開始コドンとさらなるアラニンおよびセリンとを含む。さらに、
6個のヒスチジンのタグを、この遺伝子の21番目のアミノ酸に融合させる。こ
れは、ハイポセティカルシグナルペプチドを除去する。
6)は、TSA遺伝子(チオール特異的抗酸化剤−CT603)の完全なORF
を含む(CT603 ORFは、C.pnuemoniae由来のCPn077
8のホモログである)。クローン14−H1−4におけるTSAオープンリーデ
ィングフレームを、発現したタンパク質がさらなるメチオニンおよび6×ヒスチ
ジンタグ(アミノ末端)を有するように増幅した。増幅されたインサートを、p
ET17bベクターのNde/EcoRI部位中にサブクローニングした。IP
TGによるこのクローンの誘導の際に、22.6kDaのタンパク質を、Ni−
NTAアガロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。TSA
遺伝子をコードするクローン14−H1−4の195個のアミノ酸のORFにつ
いて決定されたアミノ酸配列を、配列番号65に提供する。さらなる分析により
、TSA遺伝子の全長クローン(CTL2−TSA−FLといわれる)が生成さ
れた。これは、配列番号92に提供される全長アミノ酸配列を有する。
より同定される10個のさらなるクローンが生成された。TCT−1株により同
定されたクローンは、16−D4−22、17−C5−19、18−C5−2、
20−G3−45および21−C7−66であり;TCT−3細胞株により同定
されるクローンは、17−C10−31、17−E2−9、22−A1−49お
よび22−B3−53である。クローン21−G12−60は、TCT−1細胞
株およびTCT−3細胞株の両方によって認識された。TCT−1細胞株を使用
して同定された、クローン16−D4−22(配列番号119)は、2つの遺伝
子(哺乳動物細胞内での増殖のためのC.trachomatisプラスミドの
オープンリーディングフレーム3(ORF3)およびORF4の一部)を含む9
53bpのインサートを含む。クローン17−C5−19(配列番号118)は
、clp 1プロテアーゼをコードする、DT431のORFの一部、およびC
T430(ジアミノピメレート(diaminopimelate)エピメラー
ゼ)のORFの一部を含む、951bpのインサートを含む。クローン18−C
5−2(配列番号117)は、TCT−1細胞株を使用して同定された446b
pのインサートを有する、S1リボソームタンパク質のORFの一部である。T
CT−1細胞株を使用して同定された、クローン20−G3−45(配列番号1
16)は、pmpB遺伝子(CT413)の一部である437bpのインサート
を含む。TCT−1株により同定された、クローン21−C7−66(配列番号
115)は、dnaK様タンパク質の一部をコードする、995bpのインサー
トを含む。このクローンのインサートは、dnaK遺伝子CT396の一部であ
ることが示された、TCT−3クローン11−H4−28(配列番号59)のイ
ンサートと重複しない。TCT−3細胞株により同定された、クローン17−C
10−31(配列番号114)は、976bpのインサートを含む。このクロー
ンは、CT858のORFの一部(IRBPドメインおよびDHRドメインを含
むプロテアーゼ)を含む。クローン17−E2−9(配列番号113)は、2つ
の遺伝子(CT611およびCT610)のORFの一部を含み、これは、11
4bpのインサートに及ぶ。TCT−3株を使用して同定された、クローン22
−A1−49(配列番号112)もまた、698bpのインサート中に2つの遺
伝子を含む。CT660(DNAジャイレース(gyrA 2)のORFの一部
は、頂鎖(top strand)上に存在し、ここでハイポセティカルタンパ
ク質CT659の完全ORFは、相補鎖上に存在する。TCT−1株により同定
された、クローン22−B3−53(配列番号111)は、GroEL(CT1
10)のORFの一部をコードする267bpのインサートを有する。TCT−
1細胞株およびTCT−3細胞株の両方によって同定された、クローン21−G
12−60(配列番号110)は、ハイポセティカルタンパク質CT875、C
T229およびCT228の部分的ORFを含む1461bpのインサートを含
む。
からプールした血清を用いてLambda Screen−1ベクター(Nov
agen、Madison、WI)中のChlamydia trachoma
tis(LGV II 血清型亜型)のゲノム発現ライブラリーを、当該分野に
おいて周知の技術を用いてスクリーニングすることによって得た。引き続き、免
疫反応性クローンを同定し、そしてChlamydia遺伝子を含む挿入物を配
列決定した:CTL2#1(配列番号71);CTL2#2(配列番号70);
CTL2#3−5’(配列番号72、5’末端を示す、最初に決定されたゲノム
配列);CTL2#3−3’(配列番号73、3’末端を示す、二番目に決定さ
れたゲノム配列);CTL2#4(配列番号53);CTL2#5(配列番号6
9);CTL2#6(配列番号68);CTL2#7(配列番号67);CTL
2#8b(配列番号54);CTL2#9(配列番号66);CTL2#10−
5’(配列番号74、5’末端を示す、二番目に決定されたゲノム配列);CT
L2#10−3’(配列番号75、3’末端を示す、二番目に決定されたゲノム
配列);CTL2#11−5’(配列番号45、5’末端を示す、最初に決定さ
れたゲノム配列);CTL2#11−3’(配列番号44、3’末端を示す、二
番目に決定されたゲノム配列);CTL2#12(配列番号46);CTL2#
16−5’(配列番号47);CTL2#18−5’(配列番号49、5’末端
を示す、最初に決定されたゲノム配列);CTL2#18−3’(配列番号48
、3’末端を示す、二番目に決定されたゲノム配列);CTL2#19−5’(
配列番号76、5’末端を示す、決定されたゲノム配列);CTL2#21(配
列番号50);CTL2#23(配列番号51);およびCTL2#24(配列
番号52)。
クローニングによって同定した。これらの研究で、上記のように、いくつかのC
hlamydia感染個体からプールした血清を用いたが、IgA抗体およびI
gM抗体を、二次抗体としてIgGに加えて用いた。クローンを、Chlamy
dial感染に対する早期免疫応答(すなわち、粘膜体液性免疫応答)によって
認識される抗体の増強した検出を、この方法によってスクリーニングした。引き
続く免疫応答性クローンを、特徴付け、そしてChlamydia遺伝子を含む
挿入物を、配列決定した:CTL2gam−1(配列番号290);CTL2g
am−2(配列番号289);CTL2gam−5(配列番号288);CTL
2gam−6−3’(配列番号287、3’末端を示す、二番目に決定されたゲ
ノム配列);CTL2gam−6−5’(配列番号286、5’末端を示す、最
初に決定されたゲノム配列);CTL2gam−8(配列番号285);CTL
2gam−10(配列番号284);CTL2gam−13(配列番号283)
;CTL2gam−15−3’(配列番号282、3’末端を示す、二番目に決
定されたゲノム配列);CTL2gam−15−5’(配列番号281、5’末
端を示す、最初に決定されたゲノム配列);CTL2gam−17(配列番号2
80);CTL2gam−18(配列番号279);CTL2gam−21(配
列番号278);CTL2gam−23(配列番号277);CTL2gam−
24(配列番号276);CTL2gam−26(配列番号275);CTL2
gam−27(配列番号274);CTL2gam−28(配列番号273);
CTL2gam−30−3’(配列番号272、3’末端を示す、二番目に決定
されたゲノム配列);およびCTL2gam−30−5’(配列番号271、5
’末端を示す、最初に決定されたゲノム配列)。
インターフェロン−γ産生の誘導) 組換えChlamydia trachomatis抗原のT細胞増殖および
インターフェロン−γ産生を誘導する能力を、以下のように決定する。
クロマトグラフィー(Webbら、J.Immunology 157:503
4〜5041、1996)によって精製した。次いで、精製したポリヌクレオチ
ドを、PBMC調製物においてT細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニン
グする。C.trachomatis親株由来のPBMC、およびそのT細胞が
Chlamydia trachomatis抗原に応答して増殖することが公
知である正常なドナー由来のPBMCを、10%のプールしたヒト血清および5
0μg/mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640を含む培地中で培
養する。精製したポリペプチドを、0.5〜10μg/mLの濃度で2連で加え
る。200μl容量の96ウェル丸底プレート中で6日間の培養後に、下記のよ
うにIFN−γレベルを決定するために50μlの培地を各ウェルから除去する
。次いで、プレートを、さらに18時間、1μCi/ウェルのトリチウム化チミ
ジンで標識し、収集し、そしてトリチウムの取りこみをガスシンチレーションカ
ウンターを用いて決定した。両方の複製物において、培地単独中で培養される細
胞において観察される増殖よりも3倍高い増殖を生じる画分を、陽性と見なす。
Aプレートを、PBS中のヒトIFN−γに対するマウスモノクローナル抗体(
PharMingen、San Diego、CA)で、室温で4時間コートす
る。次いで、ウェルを5%(W/V)脱脂乾燥ミルクを含有するPBSで、室温
で1時間ブロックする。プレートをPBS/0.2% TWEEN−20で6回
洗浄し、そして、ELISAプレート中で培養培地に1:2に希釈したサンプル
を、室温で一晩インキュベートする。プレートを再度洗浄し、そしてPBS/1
0%正常ヤギ血清中に1:3000に希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトIF
N−γ血清を、各ウェルに添加する。次いで、プレートを室温で2時間インキュ
ベートし、洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(S
igma Chemical So.,St,Louis、MO)を、PBS/
5%脱脂乾燥ミルク中に1:2000希釈で添加する。室温でのさらなる2時間
のインキュベートの後、プレートを洗浄し、そしてTMB基質を添加する。反応
を20分後に1N 硫酸で停止する。参照波長として570nmを用いて、吸光
度を450nmで決定する。両方の複製物に生じる画分が、培地単独で培養した
細胞由来の平均ODより2倍高いODプラス3標準偏差を示すことを、陽性と見
なす。
配列番号5のアミノ酸残基48−67(配列番号13;1−B1−66/48−
67と称する)およびアミノ酸残基58−77(配列番号14;1−B1−66
/58−77と称する)にそれぞれ対応する2つの合成ペプチドが、C.tra
chomatis LGV IIのゲノムライブラリーをスクリーニングするた
めに用いたChlamydia特異的T細胞株において、増殖応答およびIFN
−γ産生を誘導することを見出した。
s特異的T細胞エピトープを同定した。当該分野において周知の、標準エピトー
プマッピング技術を使用して、リボソームS13タンパク質(rS13)中の2
つのT細胞エピトープを、ドナーCL−8(T細胞株TCL−8 EB/DC)
由来のChlamidia特異的T細胞株で同定した。図8は、第一のペプチド
、rS13 1−20(配列番号106)が、対応するC.pneumonia
e配列と100%同一であることを示し、このことは組換えC.trachom
atis−rS13およびC.pneumonia−rS13に対するT細胞株
の交差反応性を説明する。第二のペプチドrS13 56−75(配列番号10
8)に対する応答は、C.trachomatis特異的であり、このことは、
この健常な無症候性ドナーにおけるrS13応答がC.trachomatis
に対する曝露によって誘発されたが、C.pneumoniaeに対する曝露、
または他の任意の微生物感染によっては誘発されなかったことを示す。
ン11−C12−91(配列番号63)は、OMP2遺伝子(CT443)の一
部であり、かつOMCBと称されるC.pneumoniaeの60kDaシス
テインリッチ外膜タンパク質と相同性を有する269bpの挿入物を有する。反
応性エピトープをさらに決定するために、エピトープマッピングを一連の重複ペ
プチドおよび以前に記載された免疫アッセイを用いて実施した。簡単には、増殖
応答を、1×104の単球由来樹状細胞の存在下で、C.trachomati
sおよびC.pneumoniae由来の非感染性基本小体、またはC.tra
chomatisもしくはC.pneumoniaeのOMCBタンパク質のタ
ンパク質配列由来のペプチドのいずれか(0.1μg/ml)を用いて、2.5
×104TCP−21 T細胞を刺激することによって決定した。TCP−21
T細胞は、エピトープCT−OMCB #167−186、CT−OMCB
#171−190、CT−OMCB #171−186、および、あまり重要で
ないがCT−OMCB #175−186(それぞれ、配列番号249〜252
)に応答した。特に、TCP−21 T細胞株はまた、相同なC.pneumo
niaeペプチドCP−OMCB #171−186(配列番号253)に対す
る増殖応答を示し、このペプチドに対する応答は、C.trachomatis
ペプチドに対する応答に等しいか、またはそれよりも高い。2位でのアミノ酸置
換(すなわち、GluからAsp)および4位でのアミノ酸置換(すなわち、S
erからCys)は、T細胞の増殖応答を変えず、したがって、このエピトープ
がC.trachomatisとC.pneumoniaeとの間の交差反応性
エピトープであることを示した。
3を、エピトープマッピング実験に用いた。免疫アッセイを、C.tracho
matis由来のペプチドのみを試験したことを除いて、上記のように実施した
。T細胞は、2つのペプチド(CT−OMCB #152−171およびCT−
OMCB #157−176(それぞれ、配列番号246および247))に増
殖応答を与え、それにより、C.trachomatisのシステインリッチ外
膜タンパク質中にさらなる免疫原性エピトープを決定した。
酸配列に対応する)を、以前に記載されたCD4 T細胞発現クローニング系中
のTCT−3細胞株を用いて同定し、そして、TSAと称されるチオール特異的
抗酸化物遺伝子(CT603)に関する完全ORFを含むことを示した。エピト
ープマッピング免疫アッセイを、上記のように実施し、エピトープをさらに規定
した。TCT−3 T細胞株は、重複エピトープCT−TSA #96−115
、CT−TSA #101−120およびCT−TSA #106−125(そ
れぞれ、配列番号254〜256)に対する強力な増殖性応答を示し、C.tr
achomatis血清型亜型LGV IIのチオール特異的抗酸化物遺伝子中
に免疫応答性のエピトープを示した。
テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート)活性を有するFMOC
化学を用いる、Millipore 9050 ペプチド合成器で合成し得る。
Gly−Cys−Gly配列を、ペプチドのアミノ末端に接続し、ペプチドの結
合法または標識法を提供し得る。固体支持相からのペプチドの切断を、以下の切
断混合物を用いて実施し得る:トリフルオロ酢酸:エタンジチオール:チオアニ
ソール:水:フェノール(40:1:2:2:3)。2時間の切断の後、ペプチ
ドを冷メチル−t−ブチルエーテルで沈殿し得る。次いで、ペプチドペレットを
、0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)含有水に溶解し、そしてC18逆相H
PLCによる精製の前に凍結乾燥し得る。水(0.1%のTFAを含有)中0〜
60%のアセトニトリル勾配(0.1%のTFAを含有)を用いて、ペプチドを
溶出し得る。純粋画分の凍結乾燥後、ペプチドをエレクトロスプレー質量分析を
用いて、およびアミノ酸分析によって特徴付け得る。
amydia抗原をコードするDNA配列の単離および特徴付け) Chlamydia trachomatis LGV IIのゲノムライブ
ラリーを、BamHI、BglII、BstYiおよびMboIの制限酵素を用
いる制限消化によって構築した。続いて、制限消化フラグメントを、レトロウイ
ルスベクターpBIB−KS1,2,3のBamHI部位に連結した。このベク
ターセットを改変して、図2に示すような、短いDNAゲノムフラグメント由来
のタンパク質を発現し得るためのKosak翻訳開始部位および停止コドンを含
めた。80クローンのDNAプールを調製し、そして、Pear,W.S.、S
cott,M.L.およびNolan,G.P.、Generation of
High Titre,Helper−free retroviruses
by Transient Transfection.Methods i
n Molecular Medicine:Gene Therapy Pr
otocols、Humana Press、Totowa、NJ、41−57
頁に記載のように、レトロウイルスパッケージング株Phoenix−Amph
oにトランスフェクトした。次いで、レトロウイルス形態のChlamudia
ライブラリーを、H2−Ld発現P815細胞に導入し、次いで、この細胞を、
抗原特異的T細胞株を刺激するための標的細胞として用いた。
nbach,M.,J.Immunol.153:5183、1994に記載の
ように、照射したC.trachomatis感染J774細胞および照射した
同系脾臓細胞を用いる反復回の刺激によって培養中で拡大させた。Chlamy
dia特異的T細胞株を用いて、レトロウイルス形質導入P815細胞によって
発現される上記のChlamydiaゲノムライブラリーをスクリーニングした
。陽性DNAプールを、Elispot分析(Lalvaniら、J.Expe
rimental Medcine 186:859−865、1997を参照
のこと)を用いるIFN−γ産生の検出によって同定した。
spot分析によって同定した。プール2C7由来のP815細胞の安定した形
質導入物を、制限希釈によってクローニングし、個々のクローンを、Chlam
ydia特異的CTL株からIFN−γ産生を誘発するこれらの能力に基づいて
選択した。このスクリーニングプロセスから、4つの陽性クローン(2C7−8
、2C7−9、2C7−19および2C7−21と称する)を選択した。同様に
、陽性プール2E10をさらにスクリーニングし、3つの挿入物を含むさらなる
陽性クローンを生じた。この3つの挿入物は、CT016、tRNAシンターゼ
およびclpXの遺伝子(それぞれ、配列番号268〜270)のフラグメント
である。
BIB−KS特異的プライマーを用いてPCR増幅し、Chlamydia D
NA挿入物を特異的に増幅した。増幅された挿入物をゲル精製し、そして配列決
定した。1つの免疫応答性クローンである2C7−8(配列番号15、配列番号
32に提供される推定アミノ酸を有する)は、Chlamydia trach
omatis,血清型亜型D(NCBI,BLASTN検索;配列番号33、配
列番号34に提供される推定アミノ酸を有する)のヌクレオチド597304−
597145に相同性を有する160bpのフラグメントである。クローン2C
7−8の配列は、すぐ上に記載された高い相同性の領域由来の、推定のオープン
リーディングフレーム内にマップする。そして、特に、298アミノ酸フラグメ
ント(配列番号16、配列番号17に提供される推定アミノ酸配列を有する)か
らなる、これらの推定オープンリーディングフレームの1つは、免疫学的活性を
示すことが実証された。
はCap1遺伝子と称される)の全長クローニングを、5’−ttttgaag
caggtaggtgaatatg(順方向)(配列番号159)プライマーお
よび5’−ttaagaaatttaaaaaatccctta(逆向き)(配
列番号160)プライマーを用いて、テンプレートとして精製C.tracho
matis L2ゲノムDNAを用いて、PCR増幅によって得た。このPCR
産物をゲル精製し、配列決定のためにpCRBlunt(Invitrogen
、Carlsbad、CA)にクローニングした。次いで、pBIB−KSの誘
導体pBIB−KMSのEcoRI部位に、発現のためにサブクローニングした
。CT529のChlamydia pnuemoniaeホモログを、配列番
号292に提供される対応するアミノ酸配列を有する配列番号291に提供する
。
する細菌溶解物からPCRによって(本質的に、Denamur,E.、C.S
ayada、A.Souriau、J.Orfila、A.Rodolakis
およびJ.Elion、1991 J.Gen.Microbiol。137:
2525に記載されるように)増幅した。以下の血清型亜型を、記載されるよう
に増幅した:Ba(配列番号134、配列番号135に提供される対応する推定
アミノ酸配列を有する);E(BOUR)およびE(MTW447)(配列番号
122、配列番号123に提供される対応する推定アミノ酸配列を有する);F
(NI1)(配列番号128、配列番号129に提供される対応する推定アミノ
酸配列を有する);G(配列番号126、配列番号127に提供される対応する
推定アミノ酸配列を有する);Ia(配列番号124、配列番号125に提供さ
れる対応する推定アミノ酸配列を有する);L1(配列番号130、配列番号1
31に提供される対応する推定アミノ酸配列を有する);L3(配列番号132
、配列番号133に提供される対応する推定アミノ酸配列を有する);I(配列
番号263、配列番号264に提供される対応する推定アミノ酸配列を有する)
;K(配列番号265、配列番号266に提供される対応する推定アミノ酸配列
を有する);およびMoPn(配列番号136、配列番号137に提供される対
応する推定アミノ酸配列を有する)。PCR反応を、Advantage Ge
nomic PCR Kit(Clontech、Palo Alto、CA)
を用いて、血清型亜型L2 DNA(ORFの外部)に特異的なプライマーを用
いて、実施した。プライマー配列は、5’−ttttgaagcaggtagg
tgaatatg(順方向、配列番号163)および5’−tttacaata
agaaaagctaagcactttgt(逆方向、配列番号164)を要求
するMoPnを除いて、5’−ggtataatatctctctaaattt
tg(順方向、配列番号161)および5’−agataaaaaaggctg
tttc’(逆方向、配列番号162)であった。PCR増幅されたDNAを、
QIAquick PCR purification kit(Qiagen
、Valencia、CA)を用いて精製し、そして配列決定のためにpCR2
.1(Invitrogen、Carlsbad、CA)にクローニングした。
自動配列決定器(ABI377)で、pBIB−KS特異的順方向プライマーで
ある5’−ccttacacagtcctgctgac(配列番号165)およ
び逆方向プライマーである3’−gtttccgggccctcacattg(
配列番号166)の両方を用いて行った。CT529血清型亜型L2をコードす
るDNAをクローニングしたPCRBlunt、およびCT529血清型亜型B
a、E(BOUR)、E(MTW447)、F(NI1)、G、Ia、K、L1
、L3およびMoPnをコードするDNAをクローニングしたpCR2.1を、
T7プロモータープライマーおよび一般的なM13順方向プライマーもしくはM
13逆方向プライマーを用いて、配列決定した。
が、関連する免疫学的機能を有するタンパク質をコードするか否かを決定するた
めに、2つのオープンリーディングフレームの長さにわたる重複ペプチド(17
〜20アミノ酸長)を、実施例3に記載されるように合成した。標準クロム放出
アッセイを利用して、ペプチド標識されたH2d制限標的細胞のパーセント特異
的溶解を決定した。このアッセイにおいて、P815細胞(H2d)のアリコー
トを、37℃で1時間、100μCiの51Crを用いて、1μg/mlの示され
たペプチドの存在下または非存在下において標識した。このインキュベート後、
標識P815細胞を洗浄し、過剰な51Crおよびペプチドを除き、続いて、1,
000細胞/ウェルの濃度でマイクロカルチャー(microcultute)
プレートに二連でプレートした。エフェクターCTL(Chlamydia特異
的CD8 T細胞)を、示されたエフェクター:標的の比で加えた。4時間のイ
ンキュベートの後、上清を回収し、51Crの上清への放出についてガンマカウン
ターで計測した。298アミノ酸オープンリーディングフレーム由来の2つの重
複ペプチドは、CTL株を特異的に刺激した。配列番号138−156に示され
るペプチドを合成し、CT529(Cap1遺伝子)についての血清型亜型D
オープンリーディングフレームのL2ホモログおよび216アミノ酸オープンリ
ーディングフレームの翻訳を示す。図3に示されるように、CtC7.8−12
(Cap1#132−147としてもまた称される配列番号18、配列番号13
9)およびCtC7.8−13(Cap1#138−155としてもまた称され
る配列番号19、配列番号140)は、エフェクター:標的の比が10:1で、
それぞれ38%パーセント特異的溶解から52%パーセント特異的溶解を誘導し
得る。特に、これら2つのペプチド間の重複は、予想されるH2d(KdおよびL d )結合ペプチドを含んだ。10アミノ酸のペプチドを合成して、この重複配列
(配列番号31)に対応させ、そしてelispotアッセイによって抗Chl
amydia CTL株から強力な免疫応答を産生することを見出した。特に、
もっとも新しいGenbankデータベースの検索は、これまでにこの遺伝子に
関する何のタンパク質も記載されていないことを明らかにした。従って、2C7
−8(配列番号15)をコードする推定オープンリーディングフレームは、MH
C−I制限様式において、抗原特異的CD8+ T細胞を刺激し得るChlam
ydia由来の抗原を含む遺伝子を規定し、このことは、この抗原がChlam
ydiaに対するワクチンを発達させるのに用い得ることを実証した。
ために、短縮されたペプチド(配列番号138〜156)を作製し、そしてIF
N−g ELISPOTアッセイにおいてT細胞による認識について試験した。
Ser139(Cap1#140〜147、配列番号146)またはLeu14
7(Cap1#138〜146、配列番号147)のいずれかの短縮がT細胞認
識を排除する。これらの結果は、9マーペプチドCap1#139−147(S
FIGGITYL、配列番号145)が、Chlamidia特異的なT細胞に
よって認識される最小エピトープであることを示す。
29、131、133、135、137および139)の選択された血液型亜型
からのCap(CT529)の配列アラインメントは、提案されたエピトープの
2位において1つのアミノ酸の差違が見出されることを示す。この相同な血液型
亜型Dは、SIGGITYL(配列番号168)である。SFIGGITYLお
よびSIIGGITYLがChlamydia特異的なT細胞による認識につい
て細胞を標識する能力を比較した。各ペプチドの連続希釈物を、上記のように、
P815細胞とともにインキュベートし、そして51Cr放出アッセイにおけるT
細胞による認識について試験した。Chlamydia特異的なT細胞は、血液
型亜型L2ペプチドを最小濃度1nMで、そして血液型亜型Dペプチドを最小濃
度10nMで認識する。
rachomatisに感染した細胞を認識することが示された。Cap1139- 147 がChlamydiaに感染した細胞の表面に提示されているか否かを確認
するために、Balb−3T3(H−2d)細胞を試験して、C.tracho
matis血液型亜型L2に感染させ、そしてこれらの細胞が、Cap#139
−147エピトープ(配列番号145)に対して特異的なCD8+T細胞クロー
ンによって認識されるか否かを決定した。Cap1#139−147エピトープ
に対して特異的なT細胞クローンを、T細胞69株の限界希釈を行うことによっ
て得た。このT細胞クローンは、Chlamydiaに感染した細胞を特異的に
認識した。これらの実験において、標的細胞は、C.trachmatisに感
染したBalb/3T3細胞(陽性コントロール)または感染していないBal
b/3T3細胞であり、これらは、それぞれ45%および36%および30%が
、30:1、10:1および3:1のエフェクター対標的の比で特異的な溶解を
示した。あるいは、Cap#139−147エピトープ(配列番号145)でコ
ーティングしたP815細胞、または処置されていないP815細胞は、それぞ
れ、83%、75%および58%が、エフェクター対標的の比で30:1、10
:1および3:1での特異的な溶解を示した(すべての場合において陰性コント
ロールは、5%未満の溶解を有した)。このデータは、このエピトープが感染の
間に提示されることを示唆する。
がC.trachomatisのマウス感染の間にプライム刺激されることが示
される。C.trachomatisでの感染が、Cap1#139−147エ
ピトープ特異的なT細胞応答をプライム刺激するか否かを決定するために、マウ
スに腹腔内投与で、108IFUのc.trachomatis血液型亜型L2
を感染させた。感染後2週間で、このマウスを屠殺し、そして脾細胞を、Cap
1#139−147エピトープペプチドでパルス刺激した照射した同系脾細胞に
対して刺激した。5日間の刺激の後、その培養物を、標準的な51Cr放出アッセ
イにおいて使用して、Cap1#139−147エピトープ特異的なT細胞がそ
の培養物に存在するか否かを決定した。具体的には、C.trachomati
s血液型亜型L2で免疫したマウス、またはPBSを注射したコントロールマウ
スからの脾細胞は、Cap1#139−147ペプチドコーティングした同系脾
細胞およびCap1#139−147エピトープを特異的に認識し得るCD8+
T細胞とともに5日間培養した後に、それぞれ、73%、60%および32%が
、30:1、10:1および3:1のエフェクター対標的の比で特異的な溶解を
与えた。このコントロールマウスは、30:1のエフェクター対標的比でおよそ
10%の溶解%を有し、そしてE:T比率を下げると安定して減少した。標的細
胞は、Cap1#139−147ペプチドコーティングされたP815細胞また
は処置されていない細胞であった。これらのデータは、Cap1#139−14
7ペプチド特異的なT細胞がC.trachomatisによるマウス感染の間
に初回刺激されることを示唆する。
よびT細胞応答の生成) 免疫原性研究を行って、Montanideアジュバントを用いて処方された
、精製されたSWIBタンパク質もしくはS13タンパク質のいずれか、または
SWIBもしくはS13に関するDNA配列を含むpcDNA−3発現ベクター
でのDNAベースの免疫を用いて免疫されたマウスにおける抗体およびCD4+
T細胞応答を決定した。SWIBはまた、クローン1−B1−66(配列番号1
、対応するアミノ酸配列は配列番号5において提供される)とも称され、そして
S13リボソームタンパク質はまた、クローン10−C10−31(配列番号4
、対応するアミノ酸配列は、配列番号12に提供される)とも称される。第一の
実験において、3匹のC57BL/6マウスの群を2回免疫し、そして抗体およ
びCD4+T細胞応答についてモニタリングした。DNA免疫を尾の根元で皮内
で行い、そしてポリペプチド免疫を皮下経路で投与した。免疫されたマウスから
の脾細胞の標準的な3H取り込みアッセイの結果は、精製された組換えSWIB
ポリペプチド(配列番号5)で免疫した群からの強力な増殖応答を示す。以前に
記載されるようなサイトカイン誘導アッセイによるさらなる分析によって、SW
IBポリペプチドにより免疫された群が測定可能なIFN−γおよびIL−4の
応答を生成したことが実証された。SWIBポリペプチドで免疫した実験群にお
ける優性な抗体アイソタイプ応答を決定するための、続いてのELISAベース
のアッセイを行った。図4は、SWIB免疫された群が主にIgG1である体液
性応答を与えたことを例示する。
はMontanideのいずれかにおいて処方された10μgの精製されたSW
IBタンパク質(これはまた、クローン1−B1−66、配列番号5とも呼ばれ
る)で免疫し、そして第三回の免疫の2週間後に採取した。SWIBタンパク質
に対して指向される抗体力価を、当該分野で周知の標準的なELISAベースの
技術によって決定し、Montanideアジュバントで処方したSWIBタン
パク質が強力な体液性免疫応答を誘導したことを実証した。T細胞増殖性応答を
、XTTベースのアッセイによって決定した(Scudieroら、Cance
r Research、1988、48:4827)。図5に示されるように、
SWIBポリペプチドおよびMontanideで免疫したマウス由来の脾細胞
は、抗原特異的な増殖性応答を惹起した。さらに、免疫された動物からの脾細胞
が可溶性の組換えSWIBポリペプチドに応答してIFN−γを分泌する能力を
、以前に記載されるようなサイトカイン誘導アッセイを用いて決定した。Mon
tanideアジュバントを用いて処方したSWIBポリペプチドで免疫した群
におけるすべての動物由来の脾細胞は、SWIB Chlamydia抗原への
曝露に応答してIFN−γを分泌し、これは、Chlamydia特異的な免疫
応答を実証した。
BAS2アジュバント(SmithKline Beecham、London
、England)を用いて処方された、精製された10μgのSWIBタンパ
ク質もしくはS13タンパク質(C.trachomatis、SWIBタンパ
ク質、クローン1−B1−66、配列番号5、およびS13タンパク質、クロー
ン10−C10−31、配列番号4)で免疫した。抗原特異的な抗体力価を、E
LISAによって測定し、両方のポリペプチドが、1×10-4〜1×10-5の力
価の範囲の強力なIgG応答を誘導したことを示した。この応答のIgG1およ
びIgG2の成分は、ほぼ等価量で存在した。免疫されたマウスから単離された
脾細胞に対する標準的な3H取り込みアッセイによって決定された、抗原特異的
なT細胞増殖応答は、SWIBに対してかなり強力であり(陰性コントロールよ
りも50、000cpm高い)、そしてs13についてはさらに強力であった(
陰性コントロールよりも100、000cpm高い)。このIFNγ産生を、増
殖中の培養物からの上清から、標準的なELISA技術によりアッセイした。S
13タンパク質でのその培養物のインビトロ再刺激は、高レベルのIFN−γ産
生を誘導し、これは、陰性コントロールについての2ng/mlに対して、およ
そ25ng/mlであった。SWIBタンパク質での再刺激はまた、IFNγを
誘導したが、より少ない程度であった。
ラ毒素と混合した、10μgの精製されたSWIBもしくはS13タンパク質(
C.trachomatis、SWIBタンパク質、クローン1−B1−66、
配列番号5、およびS13タンパク質、クローン10−C10−31、配列番号
4)で免疫した。粘膜免疫を、鼻腔内接種を通じてであった。抗原特異的抗体応
答を標準的なELISA技術によって決定した。抗原特異的なIgG抗体は、S
WIB免疫されたマウスの血液中に存在し、その力価は、1×10-3〜10-4の
範囲であったが、S13免疫した動物では検出不可能であった。IFNγ産生に
よって測定された単離された脾細胞からの抗原特異的なT細胞応答は、全身免疫
についてすぐ上記したようなものに類似の結果を与えた。
T529 10マーコンセンサスペプチド(CSFIGGITYL、配列番号3
1))(これは、H2−Kd制限されたCTLエピトープとして同定された)に
よって規定された)の免疫原性を決定した。BALB/cマウス(1群あたり3
匹のマウス)を、3回、種々のアジュバントと合わせた25μgのペプチドで免
疫した。このペプチドを、SKB Adjuvant System SBAS
−2’’、SBAS−7(SmithKline Beecham、Londo
n、England)、またはMontanideのいずれかの中で尾の根元で
全身投与した。このペプチドをまた、10μgのコレラ毒素(CT)と混合して
鼻腔内投与した。未刺激のマウスをコントロールとして使用した。3回目の免疫
後4週間で、脾細胞を、3つの異なるエフェクター対LPS刺激比(1×106
細胞/mlで6、1.5および0.4)で10μg/mlのCT529 10マ
ーコンセンサスペプチドを用いてパルス刺激したLPS刺激(blast)で再
刺激した。2回の再刺激後、エフェクター細胞を、ペプチドパルス刺激されたP
815細胞を溶解するその能力について、標準的なクロム放出アッセイを用いて
試験した。鶏卵オボアルブミンからの無関連のペプチドを陰性コントロールとし
て用いた。その結果は、有意な免疫応答が、CT529 10マーコンセンサス
ペプチドに対して惹起され、そしてペプチドパルス刺激された標的を溶解し得る
抗原特異的T細胞がそのペプチドでの免疫に応答して惹起されたことを実証した
。具体的には、抗原特異的溶解活性は、SBAS−7およびCTでアジュバント
補助された群において見出されたが、MontanideおよびSBAS−2’
’では、CTLエピトープ免疫をアジュバント補助しなかった。
び特徴付け) ヒトT細胞株TCL−8(実施例1に記載される)は、Chlamydia
trachomatisおよびChlamydia pneumoniaに感染
した単球由来の樹状細胞を認識する。このことは、Chlamydia tra
chomatisおよびChlamydia pneumoniaが交叉反応性
のT細胞エピトープをコードし得ることを示唆する。Chlamydia tr
achomatis LGV IIクローン1B1−66(これはまた、SWI
B(配列番号1)と呼ばれる)およびクローン10C10−31(これはまた、
S13リボゾームタンパク質(配列番号4)とも呼ばれる)に相同なChlam
ydia pneumonia遺伝子を単離するために、HeLa229細胞を
、C.pneumonia株TWAR(CDC/CWL−029)に感染させた
。3日間のインキュベーション後、このC.pneumonia感染させたHe
La細胞を採取し、洗浄し、そして200μlの水に再懸濁し、そして20分間
沸騰水中で加熱した。10μlの破壊された細胞懸濁物をPCRテンプレートと
して用いた。
ローン10C10−31について設計し、その結果、5’末端が、挿入された6
×ヒスチジンタグおよびNdeI部位を有し、そして3’末端が、包含された終
止コドンおよびBamHI部位を有した(図6)。PCR産物を、当該分野にお
いて周知の標準的な技術によって増幅し、そして配列決定した。C.pneum
onia特異的なPCR産物を発現ベクターpET17B(Novagen,M
adison、WI)中にクローニングし、そして発現およびNovagenに
よって提供されるヒスチジン−ニッケルクロマトグラフィー方法論を利用した続
きの精製のために、E.coli BL21 pLysSへと移入した。従って
、C.pnerumoniaからの2つのタンパク質が生成された:10−11
kDaのタンパク質(CpSWIB(配列番号27)と呼ばれる)および6×H
isタグを有する配列番号78(これは、それぞれ、配列番号28に提供される
対応するアミノ酸配列を有する)、CpS13と呼ばれる15kDaタンパク質
(配列番号29、および配列番号77(6×Hisタグを有する)、これらは、
それぞれ配列番号30および91において提供される対応するアミノ酸配列を有
する)。
増殖およびインターフェロンγ産生の誘導) 組換えChlamydia pneumoniae抗原がT細胞増殖およびイ
ンターフェロンγ産生を誘導する能力を以下のように決定した。
ニティークロマトグラフィーによって精製する(Webbら、J.Immuno
logy 157:5034−5041、1996)。次いで、この精製された
ポリペプチドを、T細胞増殖をPBMS調製物中で誘導する能力についてスクリ
ーニングする。C.pneumoniae患者からのPBMCおよびそのT細胞
がChlamydia抗原に応答して増殖することが公知の正常ドナーからのP
BMCを、10%のプールされたヒト血清および50μg/mlゲンタマイシン
を補充したRPMI1640を含む培地中で培養する。精製されたポリペプチド
を、二連で、0.5〜10μg/mLの濃度で添加する。容量200μLの容量
中、96ウェルの丸底プレート中での6日間の培養後、50μLの培地を各ウェ
ルから、以下に記載するように、IFN−γレベルの決定のために取り出した。
次いで、このプレートを1μCi/ウェルのトリチウム標識チミジンでさらに1
8時間パルス刺激し、採取し、そしてトリチウム取り込みを、ガスシンチレーシ
ョンカウンタを用いて決定した。二連両方で、培地単独において培養された細胞
において観察される増殖よりも3倍多い増殖をもたらした画分を陽性とみなす。
ELISAプレートを、PBS中のヒトIFN−γに対して指向されるマウスモ
ノクローナル抗体(PharMingen,San Diego,CA)で室温
で4時間コーティングした。次いで、ウェルを5%(W/V)の脱脂乾燥乳を含
むPBSを用いて、室温で1時間ブロッキングする。このプレートを、PBS/
0.2% TWEEN−20中で6回洗浄し、そしてELISAプレート中の培
養培地中で1:2に希釈したサンプルを、室温で一晩インキュベートする。この
プレートを再び洗浄し、そしてPBS/10%正常ヤギ血清中で1:3000に
希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトIFN−γ血清を各ウェルに添加する。次
いで、このプレートを室温で2時間インキュベートし、洗浄し、そして西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ連結抗ウサギIgG(Sigma Chemical Co
.,St.Louis、MO)を、PBS/5%脱脂乾燥乳中に1:2000希
釈で添加した。さらに2時間の室温でのインキュベーション後、そのプレートを
洗浄し、そしてTMB基質を添加する。この反応を、20分後、1N硫酸を用い
て終結させる。光学密度を570nmを参照波長として用いて450nmで測定
する。二連両方で、培地単独で培養された細胞からの平均ODおよび3標準偏差
より2倍大きなODを与えることを生じる画分を陽性とみなす。
し得るヒト抗Chlamydia T細胞株(TCL−8)を用いて、上記実施
例において記載される発現されたタンパク質(すなわち、CpSWIB、配列番
号27、および6×Hisタグを有する配列番号78(これらはそれぞれ、配列
番号28において提供される対応するアミノ酸配列を有する)、ならびにCpS
13と呼ばれる15kDaタンパク質(配列番号29)、および6×Hisタグ
を有する配列番号77(これらは、それぞれ、配列番号30および91に提供さ
れる対応するアミノ酸配列を有する))が、C.trachomatisおよび
C.pneumoniaeの両方に共通するT細胞エピトープを有するか否かを
決定した。手短には、Chlamydiaのタンパク質を発現するE.coli
を、1×104単球由来の樹状細胞に対して滴定した。2時間後、この樹状細胞
培養物を洗浄し、そして2.5×104T細胞(TCL−8)を添加し、そして
さらに72時間インキュベートさせた。次いで、その培養上清中のINF−γの
量を、ELISAによって決定した。図7Aおよび7Bにおいて示すように、T
CL−8 T細胞株は、IFN−γの抗原特異的誘導によって実証されるように
、C.trachomatisおよびC.pneumoniaの両方由来のS1
3リボソームタンパク質を特異的に認識したが、他方で、C.trachoma
tisからのSWIBタンパク質のみがそのT細胞株によって認識された。これ
らの結果を確認するために、C.trachomatis SWIBのT細胞エ
ピトープを、一連の重複するペプチドおよびT細胞株TCL−8を用いてパルス
刺激した標的細胞を用いてエピトープマッピングすることによって同定した。3
Hチミジン取り込みアッセイは、そのペプチド(C.t.SWIBと称される、
配列番号38の52−67)がTCL−8株の最も強力な増殖を与えたことを実
証した。C.pneumoniae配列のSWIB(配列番号40)、C.pn
eumoniae のトポイソメラーゼ−SWIB融合物(配列番号43)およ
びC.trachomatis (配列番号42)、ならびにヒトSWIドメイ
ン(配列番号41)に対応する相同ペプチドを合成し、そして上記アッセイにお
いて試験した。T細胞株TCL−8は、配列番号39のC.trachomat
isペプチドのみを認識し、そして対応するC.pneumoniaeペプチド
(配列番号40)も、上記の他の対応するポリペプチド(配列番号41〜43)
をも認識しなかった。
sまたはC.pneumoniaeに感染させた単球由来の樹状細胞のいずれか
を用いてドナーPBMCを刺激することによって、C.pneumoniaeに
対する陽性血清力価を有するドナーCP−21から生成した。C.pneumo
niaeに対して生成されたT細胞は、組換えC.pneumoniae−SW
IBに対して応答したが、C.trachomatis−SWIBには応答せず
、他方で、C.trachomatisに対して生成されたT細胞株は、C.t
rachomatisにもC.pneumoniae−SWIBにもいずれにも
応答しなかった(図9を参照のこと)。ドナーCP−21の、C.pneumo
niae−SWIB特異的な免疫応答は、C.pneumoniae感染を確認
し、そしてインビボのC.pneumoniae感染の間のC.pneumon
iae−SWIB特異的なT細胞の惹起を示唆する。
グは、Cp−SWIB特異的なT細胞が重複するペプチドCp−SWIB32−
51(配列番号101)およびCp−SWIB37−56(配列番号102)に
応答したことを示し、このことは、C.pneumoniae−SWIB特異的
T細胞エピトープCp−SWIB37−51(配列番号100)を示す。
umoniae血清型亜型ドナー)から、それぞれC.trachomatis
およびC.pneumoniaeからの非感染性基本小体(elementar
y body)を用いてPBMCを刺激することによって、生成した。特に、増
殖性応答を、1×104単球由来樹状細胞ならびにC.trachomatis
およびC.pneumoniae由来の非感染性基本小体または組換えC.tr
achomatisもしくはC.pneumoniaeのいずれかのSWIBタ
ンパク質の存在下で2.5×104のT細胞を刺激することによって決定した。
SWIBに対するT細胞応答は、CP−21からのT細胞株を用いて得られたデ
ータに対して、C.trachomatis−SWIBではなくC.pneum
oniae−SWIBがC.pneumoniae T細胞株による応答を惹起
するという点において類似した。さらに、C.trachomatis T細胞
株は、C.trachomatis SWIBにもC.pneumoniae
SWIBにもいずれに応答しても増殖しなかったが、この株は、CTおよびCP
の両方の基本小体に応答して増殖した。実施例1に記載されるように、クローン
11−C21−91(配列番号63)(TCP−21細胞株を用いて同定された
)は、269bpのインサートを有する。このインサートは、OMP2遺伝子(
CT443)の一部であり、そしてC.pneumoniaeの60kDaシス
テインリッチの外膜タンパク質(OMCBと呼ばれる)と相同性を共有する。反
応性エピトープをさらに規定するために、エピトープマッピングを、一連の重複
するポリペプチドおよび以前に記載される免疫アッセイを用いて行った。手短に
は、増殖性応答を、1×104単球由来の樹状細胞の存在下で、C.trach
omatisおよびC.pnerumoniaeに由来する非感染性基本小体、
またはC.trachomatisもしくはC.pneumoniaeのOMB
Cタンパク質のタンパク質配列に由来するペプチド(0.1μg/ml)のいず
れかを用いて、2.5×104のTCP−21T細胞を刺激することによって決
定した。TCP−21 T細胞は、エピトープCT−OMCB#167−186
、CT−OMCB#171−190、CT−OMCB#171−186に対して
応答し、そしてCT−OMCB#175−186に対してはより少ない程度で応
答した(それぞれ、配列番号249−252)。顕著なことに、このTCP−2
1のT細胞株はまた、相同なC.pneumoniaeペプチドCP−OMCB
#171−186(配列番号253)に対して増殖性の応答を与え、この応答は
、C.trachomatisペプチドに対する応答に等しいかまたはそれを超
えた。2位でのアミノ酸置換(すなわち、GluについてAsp)および4位で
のアミノ酸置換(すなわち、SerについてのCys)は、T細胞の増殖性応答
を変更せず、そして従ってこのエピトープがC.trachomatisとC.
pneumoiniaeとの間の交叉反応性エピトープであることを実証した。
免疫応答) 本明細書において提供される実施例は、C.trachomatisに感染し
、そしてC.trachomatis感染を制御する防禦性免疫応答を生成した
一般的な集団の中に健常ドナーの集団が存在することを示唆する。これらのドナ
ーは、臨床的には無症状のままであり、そしてC.trachomatisに対
して血清陰性のままであった。CD4発現クローニングによって同定された、C
hlamydia抗原に対する正常なドナーの免疫応答を特徴付けるために、1
2の健常ドナーから得たPBMCを、C.trachomatis−SWIB、
C.pneumoniae−SWIBおよびC.trachomatis−S1
3、C.pneumoniae−S13を含む組換えChlamydia抗原の
パネルに対して試験した。このデータを、以下の表Iにまとめる。すべてのドナ
ーが、C.trachomatisに対して血清陰性であったが、6/12がC
.pneumonieに対して陽性力価を有した。陽性応答の4倍を超える刺激
指数を用いて、11/12の被験体が、C.trachomatisの基本小体
に応答し、そして12/12がC.pneumonieの基本小体に応答した。
1つのドナーAD 104が、組換えC.pneumoniae−S13タンパ
ク質に応答したが、組換えC.trachomatis−S13タンパク質には
応答しなかった。このことは、C.pneumoniae特異的な応答であるこ
とを示す。12のドナーのうち3つがC.trachomatis−SWIBを
有したが、C.pneumoniae−SWIB特異的な応答を有さず、このこ
とは、C.trachomatis感染を確認した。C.trachomati
s−S13およびC.pneumoniae−S13は、8/12のドナーにお
いて応答を惹起し、このことは、クラミジア感染を示唆する。これらのデータは
、SWIBおよびS13が正常な研究被験体のPBMCにおいて、T細胞応答を
惹起する能力を実証する。
a pneumoniae;EB=Chlamydia基本小体;Swib=組
換えChlamydia Swibタンパク質;S13=組換えChlamyd
ia S13タンパク質;lpdA=組換えChlamydia lpdAタン
パク質;TSA=組換えChlamydia TSAタンパク質。値は、標準増
殖アッセイからの結果を示す。増殖応答を、それぞれの組換え抗原または基本小
体(EB)とともにプレインキュベートした1×104の単球由来樹状細胞を用
いて3×105のPBMCを刺激することによって決定した。アッセイを、最後
の18時間、3Hチミジンパルスを用いて、6日後に収集した。
chomatis LGV II基本小体を用いてT細胞を刺激することによっ
て、C.trachomatisに対する生殖器曝露(genital exp
osure)歴を有する、健常な女性個体(CT−10)から作成した。この研
究被験体を、C.trachomatisに対して曝露したが、この被験体は、
セロコンバーションを起こさず、そして臨床的症状を現さなかった。このことは
、ドナーCT−10がC.trachomatisに対して防御免疫応答を発達
させたかもしれないことを示唆する。図10に示されるように、ドナーCT−1
0由来の初代Chlamydia特異的T細胞株は、C.trachomati
s−SWIBに応答したが、しかし、C.pneumoniae−SWIB組換
えタンパク質には応答しなかった。このことは、C.trachomatisに
対するCT−10の曝露を確証する。C.trachomatis−SWIBに
対するT細胞応答のエピトープマッピングは、図11に示されるように、このド
ナーが、T細胞株TCL−8と同じエピトープCt−SWIB 52−67(配
列番号39)に応答したことを示した。
ように作製した。患者の臨床プロフィールならびに種々のC.trachoma
tisおよびC.pneumonieの基本小体および組換えタンパク質に対す
る増殖応答の要約を、表IIに要約する。
achomatis;CP=Chlamydia pneumoniae;EB
=Chlamydia基本小体;Swib=組換えChlamydia Swi
bタンパク質;S13=組換えChlamydia S13タンパク質;lpd
A=組換えChlamydia lpdAタンパク質;TSA=組換えChla
mydia TSAタンパク質。値は、標準増殖アッセイからの結果を示す。増
殖応答を、それぞれの組換え抗原または基本小体(EB)とともにプレインキュ
ベートした1×104の単球由来樹状細胞を用いて3×105のPBMCを刺激す
ることによって決定した。アッセイを、最後の18時間、3Hチミジンパルスを
用いて、6日後に得た。
被験体およびC.trachomatis患者のパネルを使用して、この2つの
群由来のPBMCの免疫応答の総合的な研究を行った。簡潔には、C.pneu
moniae患者由来のPBMCならびに正常ドナー由来のPMBCを、10%
のプールされたヒト血清および50μg/mlゲンタマイシンを補充したRPM
I 1640を含有する培地中で培養する。精製したポリペプチド、組換えch
lamydia抗原のパネル(C.trachomatis−、C pneum
oniae−SWIBおよびS13を含む)、ならびにC.trachomat
is lpdAおよびTSAを、0.5〜10μg/mLの濃度で二連に添加す
る。200μlの容量での96ウェル丸底プレートでの6日間の培養後、以下に
記載されるように、50μlの培地を、IFN−γレベルの決定のために各ウェ
ルから取り出す。次いで、このプレートを、1μCi/ウェルのトリチウム化チ
ミジンを用いてさらに18時間パルスし、収集し、そしてトリチウム取り込みを
、気体シンチレーションカウンターを使用して決定する。両方の複製物において
、培地単独で培養した細胞において観察される増殖よりも3倍多い増殖を生じる
画分は、陽性であるとみなされる。
C.trachomatis患者の大部分が、C.trachomatis S
13抗原を認識し(8/12)、そしてC.trachomatis患者の大部
分が、C.pneumonia S13抗原を認識し(8/12)、4/12の
無症候性ドナーもまた、C.pneumonia S13抗原を認識することを
、示した。また、12人のC.trachomatis患者のうち6人、および
12人の無症候性ドナーのうちの4人は、C.trachomatisのlpd
A抗原に対する増殖応答を与えた。これらの結果は、C.trachomati
sおよびC.pneumonia S13抗原、C.trachomatis
Swib抗原およびC.trachomatis lpdA抗原が、無症候性ド
ナーによって認識されることを示し、これらの抗原が、Chlamydiaに対
する曝露の間に認識され、そして免疫応答がそれらに対して惹起されたことを示
す。このことは、これらの抗原が、ヒト宿主において防御免疫を付与する際に役
割を果たし得ることを意味する。さらに、C.trachomatisおよびC
.pneumonia S13抗原は、C.trachomatis患者の間で
等しく十分に認識され、それゆえに、S13タンパク質においてC.trach
omatisとC.pneumoniaとの間で共有されるエピトープが存在し
得ることを示す。表IIIは、これらの研究の結果を要約する。
製された短期(short term)T細胞株に対する細胞性免疫応答を決定
するために開始した。細胞性免疫応答を、実施例7に記載されるように、標準的
な増殖アッセイおよびIFN−γによって測定した。詳細には、抗原の大部分は
、Chlamydia抗原を発現する単一のE.coliクローンの形態であっ
たが、いくつかの組換えタンパク質もまた、このアッセイにおいて使用された。
この単一のE.coliクローンを、1×104単球由来樹状細胞上で力価滴定
(titer)し、そして2時間後、この培養物を洗浄し、そして2.5×10 4 T細胞を添加した。組換えタンパク質を使用するアッセイを、以前に記載され
るように実施した。増殖を、最後の18時間、標準的3Hチミジンパルスを用い
て、4日後に決定した。IFN−γの誘導を、上記のように、標準的ELISA
アッセイを使用して4日後に収集した培養上清から決定した。この結果は、試験
されたC.trachomatis抗原すべて(C.T.Swibを除いて)が
、C.trachomatis患者由来の1つ以上の異なるT細胞株から増殖応
答を惹起したことを示す。さらに、増殖応答は、以下のChlamydia遺伝
子:CT622、groEL、pmpD、CT610およびrS13、について
、C.trachomatis患者および無症候性ドナーの両方から惹起された
。
764に対する配列を含み、従って、これらの遺伝子配列はまた、免疫反応性エ
ピトープを有し得る。同様に、クローン21G12−60は、CT875に加え
て、ハイポセティカルタンパク質遺伝子CT229およびCT228に対する配
列を含み;そして15H2−76はまた、CT812およびCT088からの配
列を含み、そしてsycE遺伝子に対する相同性を共有する。クローン11H3
−61はまた、PGP6−Dビルレンスタンパク質に対する相同性を共有する配
列を含む。
amydia接種から生じる生殖管疾患に対して影響を及ぼし得るか否かを決定
するために実施した。2つのモデルを利用した:Chlamydia psit
taci(MTW447)の株を含むヒト分離菌を使用する膣内接種のモデル、
およびChlamydia trachomatis、血液型亜型F(株NI1
)として同定されたヒト単離菌を含む子宮内接種のモデル。両方の株は、上部生
殖管(upper genital tract)において炎症を誘導し、この
炎症は、女性においてChlamydia trachomatisによって引
き起こされる子宮内膜炎および卵管炎に類似する。第1の実験において、C3H
マウス(1群あたり4匹のマウス)を、C.trachomatis SWIB
DNA(配列番号1、配列番号5において提供される対応するアミノ酸配列を
有する)を含有する100μgのpcDNA−3発現ベクターを用いて3回免疫
した。接種を、全身性免疫のために尾の基部(base)で行った。最後の免疫
の2週間後、動物を、プロゲステロン処置し、そして膣を介してかまたは子宮へ
の接種物の注射によってのいずれかで感染させた。感染の2週間後、このマウス
を屠殺し、そして生殖管を切り出し、染色し、そして組織病理学について試験し
た。炎症レベルをスコア付けした(非常に軽度な+から、非常に重篤な++++
+まで)。各々単一の卵管/卵巣に帰するスコアを合計し、そして試験された器
官の数で除算して、その群についての炎症の平均スコアを得た。子宮接種のモデ
ルにおいて、空のベクターを受ける免疫した陰性コントロール動物は、DNAで
免疫した群についての2.62とは対照的に、6.12の卵巣/卵管平均炎症ス
コアをともなう一貫した炎症を示した。膣接種および感染の上昇のモデルにおい
て、免疫した陰性コントロールマウスは、DNAで免疫した群についての5.0
0に対して、8.37の卵巣/卵管平均炎症スコアを有した。また、後者のモデ
ルにおいて、ワクチン接種したマウスは、管の閉塞の徴候を示さなかったが、一
方、ワクチン接種した陰性コントロール群は、卵管の管腔において炎症性細胞を
有した。
チドco−グリコリドマイクロスフェア(PLG)でカプセル化されたC.tr
achomatis SWIB DNA(配列番号1、配列番号5において提供
される対応するアミノ酸配列を有する)を含有する50μgのpcDNA−3発
現ベクターを用いて3回免疫し;免疫を、腹腔内で行った。最後の免疫の2週間
後、動物を、プロゲステロン処置し、そして膣におけるC.psittaciの
接種によって感染させた。感染の2週間後、マウスを屠殺し、そして生殖管を切
り出し、染色し、そして組織病理学について試験した。炎症レベルを、以前に記
載されるようにスコア付けした。各々単一の卵管/卵巣に帰するスコアを合計し
、そして試験された器官の数で除算して、その群についての炎症の平均を得た。
PLGでカプセル化した空のベクターを受ける、免疫した陰性コントロール動物
は、PLGでカプセル化したDNAで免疫した群についての5.71に対して、
7.28の卵巣/卵管平均炎症スコアをともなう一貫した炎症を示した。腹膜に
おける炎症は、コントロールについての3.75に対して、ワクチン接種した群
について1.75であった。
)と混合した10μgの精製組換えタンパク質(SWIB(配列番号1、配列番
号5において提供される対応するアミノ酸配列を有する)またはS13(配列番
号4、配列番号12において提供される対応するアミノ酸配列を有する)のいず
れか)を用いて3回免疫し;その調製物を、20μL容量で麻酔の際に鼻内投与
した。最後の免疫の2週間後、動物を、プロゲステロン処置し、そしてC.ps
ittaciの膣への接種によるかまたは子宮におけるC.trachomat
is血液型亜型Fの注射によるかのいずれかで感染させた。感染の2週間後、こ
のマウスを屠殺し、そして生殖管を切り出し、染色し、そして組織病理学につい
て試験した。炎症の程度を、上記のようにスコア付けした。各々単一の卵管/卵
巣に帰するスコアを合計し、そして試験された器官の数で除算して、その群につ
いての炎症の平均スコアを得た。子宮接種のモデルにおいて、コレラ毒素単独を
受ける、免疫した陰性コントロール動物は、s13およびコレラ毒素で免疫した
群についての5.00、ならびにSWIBおよびコレラ毒素で免疫した群につい
ての1.00に対して、4.25(分析した2匹のマウスのみ;他の2匹は死ん
だ)の卵巣/卵管平均炎症スコアを示した。未処置の感染動物は、7の卵巣/卵
管平均炎症スコアを有した。膣接種および感染の上昇のモデルにおいて、免疫し
た陰性コントロールマウスは、s13およびコレラ毒素で免疫した群についての
6.75、ならびにSWIBおよびコレラ毒素で免疫した群についての5.37
に対して、7.37の卵巣/卵管平均炎症スコアを有した。未処置の感染動物は
、8の卵巣/卵管平均炎症スコアを有した。
防御効果は、相同感染のモデルにおいて、より顕著であるが、しかしC.psi
ttaciを用いる異種チャレンジ感染における場合においてなお存在する。
載されているが、変更および改変は、本発明の範囲から逸脱することなく実施さ
れ得、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されるこ
とが意図される。
hlamydia特異的T細胞株からのINF−γの誘導を示す。
ロウイルスベクターpBIB−KS1,2,3を示す。
よびCtC7.8−13(配列番号19)でパルスしたP815細胞のクロム放
出アッセイの特異的溶解を示す。
Bl/6マウスにおける抗体アイソタイプの力価を示す。
マウス由来の脾細胞におけるChlamydia特異的T細胞増殖応答を示す。
離するために使用した、C.pneumoniaeから設計した5’および3’
プライマー配列を示す。
よる活性化の際に、C.trachomatisおよびC.pneumonia
eに対して交差反応し得るヒト抗ChlamydiaT細胞株(TCL−8)か
らのIFN−γの誘導を示す。
S13タンパク質におけるT細胞エピトープの同定を示す。
1 T細胞の、組換えC.pneumonia−SWIBタンパク質に対する増
殖性応答を示すが、C.trachomatis SWIBタンパク質に対して
は示さなかった。
trachomatis特異的SWIB増殖性応答を示す。
chomatis SWIBにおけるT細胞エピトープの同定を示す。
Claims (66)
- 【請求項1】 Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む、単離された
ポリペプチドであって、ここで、該抗原は、以下:(a)配列番号1、15、2
1〜25、44〜64、66〜76、79〜88、110〜119、120、1
22、124、126、128、130、132、134、136、169〜1
74、181〜188、263、265および267〜290に示される配列;
(b)(a)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェント
な条件下で(a)または(b)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配
列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を含む抗原である、単離されたポリペプチド。 - 【請求項2】 前記ポリペプチドが、配列番号5、26、32、65、90
、92〜98、103〜108、121、123、125、127、129、1
31、133、135、137、175〜180、189〜196、264およ
び266からなる群より選択される配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド
。 - 【請求項3】 請求項1および2のいずれか1項に記載のポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。 - 【請求項4】 請求項3に記載のポリヌクレオチド分子を含む、組換え発現
ベクター。 - 【請求項5】 請求項4に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞
。 - 【請求項6】 前期宿主細胞が、E.coli細胞、酵母細胞および哺乳動
物細胞からなる群より選択される、請求項5に記載の宿主細胞。 - 【請求項7】 請求項1および2のいずれか1項に記載のポリペプチドを含
む、融合タンパク質。 - 【請求項8】 請求項7に記載の融合タンパク質であって、ここで、該融合
タンパク質は、発現エンハンサーを含み、該発現エンハンサーは、該融合タンパ
ク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた宿主細胞において
、該融合タンパク質の発現を増加させる発現エンハンサーである、融合タンパク
質。 - 【請求項9】 請求項1に記載のポリペプチド中に存在しないTヘルパーエ
ピトープを含む、請求項7に記載の融合タンパク質。 - 【請求項10】 アフィニティータグを含む、請求項7に記載の融合タンパ
ク質。 - 【請求項11】 請求項7に記載の融合タンパク質をコードする、単離され
たポリヌクレオチド。 - 【請求項12】 請求項1に記載のポリヌクレオチド配列または該ポリヌク
レオチド配列のいずれかの相補体によってコードされるアミノ酸配列を含むCh
lamydiaタンパク質に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体
またはその抗原結合フラグメント。 - 【請求項13】 請求項1に記載のポリペプチドおよび生理学的に受容可能
なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項14】 請求項3に記載のポリヌクレオチド分子および生理学的に
受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。 - 【請求項15】 ポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む
、薬学的組成物であって、ここで、該ポリペプチドは、以下:(a)配列番号1
〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、
110〜119、122、124、126、128、130、132、134、
136、169〜174、181〜188、263、265および267〜29
1に示される配列;(b)(a)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度
にストリンジェントな条件下で(a)または(b)の配列にハイブリダイズする
配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子によってコードされるポ
リペプチドである、薬学的組成物。 - 【請求項16】 ポリヌクレオチド分子および生理学的に受容可能なキャリ
アを含む、薬学的組成物であって、ここで、該ポリヌクレオチド分子は、以下:
(a)配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜6
4、66〜88、110〜119、122、124、126、128、130、
132、134、136、169〜174、181〜188、263、265お
よび267〜291に示される配列;(b)(a)の配列に相補的な配列;なら
びに(c)中程度にストリンジェントな条件下で(a)または(b)の配列にハ
イブリダイズする配列、からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチド
分子である、薬学的組成物。 - 【請求項17】 生理学的に受容可能なキャリアならびに以下: (a)請求項7に記載の融合タンパク質; (b)請求項11に記載のポリヌクレオチド;および (c)請求項12に記載の抗体; からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、薬学的組成物。
- 【請求項18】 請求項1に記載のポリペプチドおよび免疫刺激物質を含む
、ワクチン。 - 【請求項19】 請求項3に記載のポリヌクレオチド分子および免疫刺激物
質を含む、ワクチン。 - 【請求項20】 ポリペプチドおよび免疫刺激物質を含む、ワクチンであっ
て、ここで、該ポリペプチドは、以下:(a)配列番号1〜4、15、16、2
1〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、12
2、124、126、128、130、132、134、136、169〜17
4、181〜188、263、265および267〜291に示される配列;(
b)(a)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな
条件下で(a)または(b)の配列にハイブリダイズする配列、からなる群より
選択される配列によってコードされるポリペプチドである、ワクチン。 - 【請求項21】 DNA分子および免疫刺激物質を含む、ワクチンであって
、ここで、該DNA分子は、以下:(a)配列番号1〜4、15、16、21〜
25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、122、
124、126、128、130、132、134、136、169〜174、
181〜188、263、265および267〜291に示される配列;(b)
(a)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな条件
下で(a)または(b)の配列にハイブリダイズする配列、からなる群より選択
される配列を含むDNA分子である、ワクチン。 - 【請求項22】 免疫刺激物質ならびに以下: (a)請求項7に記載の融合タンパク質; (b)請求項11に記載のポリヌクレオチド;および (c)請求項12に記載の抗体; からなる群より選択される少なくとも1つの成分を含む、ワクチン。
- 【請求項23】 前記免疫刺激物質が、アジュバントである、請求項18〜
22のいずれか1項に記載のワクチン。 - 【請求項24】 患者において保護免疫を誘導するための方法であって、請
求項13〜17のいずれか1項に記載の薬学的組成物を患者に投与する工程を包
含する、方法。 - 【請求項25】 患者において保護免疫を誘導するための方法であって、請
求項18〜22のいずれか1項に記載のワクチンを患者に投与する工程を包含す
る、方法。 - 【請求項26】 請求項1に記載のポリヌクレオチド配列または該ポリヌク
レオチド配列のいずれかの相補体によってコードされるアミノ酸配列を含むCh
lamydiaタンパク質に特異的に結合する、単離されたポリクローナル抗体
またはその抗原結合フラグメント。 - 【請求項27】 患者におけるChlamydia感染を検出するための方
法であって、以下: (a)該患者から生物学的サンプルを得る工程; (b)該サンプルにChlamydia抗原の免疫原性部分を含むポリペプチ
ドを接触させる工程であって、ここで、該抗原は、以下:(i)配列番号1〜4
、15、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、11
0〜119、120、122、124、126、128、130、132、13
4、136、169〜174、181〜188、263、265および267〜
291に示される配列;(ii)(i)の配列に相補的な配列;ならびに(c)
中程度にストリンジェントな条件下で(i)または(ii)の配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配
列によってコードされるアミノ酸配列を含む抗原である、工程:ならびに (c)該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項28】 患者におけるChlamydia感染を検出するための方
法であって、以下: (a)該患者から生物学的サンプルを得る工程; (b)該サンプルに、Chlamydia抗原の免疫原性部分を含むポリペプ
チドを含む融合タンパク質を接触させる工程であって、ここで、該抗原は、以下
:(i)配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜
64、66〜88、110〜119、120、122、124、126、128
、130、132、134、136、169〜174、181〜188、263
、265および267〜291に示される配列;(ii)(i)の配列に相補的
な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな条件下で(i)または(i
i)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、からなる群より選択さ
れるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む抗原である
、工程:ならびに (c)該融合タンパク質に結合する抗体の存在を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項29】 前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、唾液、脳脊
髄液および尿からなる群より選択される、請求項27および28のいずれか1項
に記載の方法。 - 【請求項30】 生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出
するための方法であって、以下: (a)ポリメラーゼ連鎖反応において、少なくとも2つのオリゴヌクレオチド
プライマーを該サンプルに接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオ
チドプライマーの少なくとも1つは、配列番号1〜4、15、16、21〜25
、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、120、12
2、124、126、128、130、132、134、136、169〜17
4、181〜188、263、265および267〜291の配列を含むポリヌ
クレオチド分子に特異的なプライマーである、工程;および (b)該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅
されるポリヌクレオチド配列を検出し、これによって、Chlamydia感染
を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項31】 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが、
配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜64、6
6〜88、110〜119、120、122、124、126、128、130
、132、134、136、169〜174、181〜188、263、265
および267〜291のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも約10個連続
するヌクレオチドを含む、請求項30に記載の方法。 - 【請求項32】 生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出
するための方法であって、以下: (a)該サンプルに、配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29
、33、44〜64、66〜88、110〜119、120、122、124、
126、128、130、132、134、136、169〜174、181〜
188、263、265および267〜291の配列を含むポリヌクレオチド分
子に特異的な1以上のオリゴヌクレオチドプローブを、接触させる工程;および (b)該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列を検出し、これによって、Chlamydia感染を
検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項33】 前記プローブが、配列番号1〜4、15、16、21〜2
5、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、120、1
22、124、126、128、130、132、134、136、169〜1
74、181〜188、263、265および267〜291のポリヌクレオチ
ド配列のうちの少なくとも約15個連続するヌクレオチドを含む、請求項32に
記載の方法。 - 【請求項34】 生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出
するための方法であって、以下: (a)該生物学的サンプルに、Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む
ポリペプチドに結合し得る結合剤を接触させる工程であって、ここで、該抗原は
、以下:(i)配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、
44〜64、66〜88、110〜119、120、122、124、126、
128、130、132、134、136、169〜174、181〜188、
263、265および267〜291に示される配列;(ii)(i)の配列に
相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな条件下で(i)また
は(ii)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、からなる群より
選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む抗原
である、工程:ならびに (b)該サンプルにおいて、該結合剤に結合するポリペプチドを検出し、これ
によって、該生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出する工程
、 を包含する、方法。 - 【請求項35】 生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出
するための方法であって、以下: (a)該生物学的サンプルに、Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む
ポリペプチドを含む融合タンパク質に結合し得る結合剤を、接触させる工程であ
って、ここで、該抗原は、以下:(i)配列番号1〜4、15、16、21〜2
5、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、120、1
22、124、126、128、130、132、134、136、169〜1
74、181〜188、263、265および267〜291に示される配列;
(ii)(i)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェン
トな条件下で(i)または(ii)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列を含む抗原である、工程:ならびに (b)該サンプルにおいて、該結合剤に結合するポリペプチドを検出し、これ
によって、該生物学的サンプルにおけるChlamydia感染を検出する工程
、 を包含する、方法。 - 【請求項36】 前記結合剤が、モノクローナル抗体である、請求項34お
よび35のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項37】 前記結合剤が、ポリクローナル抗体である、請求項34お
よび35のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項38】 前記生物学的サンプルが、全血、痰、血清、血漿、唾液、
脳脊髄液および尿からなる群より選択される、請求項34および35のいずれか
1項に記載の方法。 - 【請求項39】 以下: (a)Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む、ポリペプチドであって
、ここで、該抗原は、以下:(i)配列番号1〜4、15、16、21〜25、
27、29、33、44〜64、66〜88、110〜119、120、122
、124、126、128、130、132、134、136、169〜174
、181〜188、263、265および267〜291に示される配列;(i
i)(i)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな
条件下で(i)または(ii)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配
列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミ
ノ酸配列を含む抗原である、ポリペプチド:ならびに (b)検出試薬、 を備える、診断キット。 - 【請求項40】 以下: (a)Chlamydia抗原の免疫原性部分を含むポリペプチドを含む、融
合タンパク質であって、ここで、該抗原は、以下:(i)配列番号1〜4、15
、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜1
19、120、122、124、126、128、130、132、134、1
36、169〜174、181〜188、263、265および267〜291
に示される配列;(ii)(i)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程度
にストリンジェントな条件下で(i)または(ii)の配列にハイブリダイズす
るポリヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によ
ってコードされるアミノ酸配列を含む抗原である、融合タンパク質:ならびに (b)検出試薬、 を備える、診断キット。 - 【請求項41】 前記ポリペプチドが、固体支持体上に固定化されている、
請求項39または40に記載のキット。 - 【請求項42】 前記検出試薬が、結合剤に結合体化されたレポーター基を
含む、請求項39または40に記載のキット。 - 【請求項43】 前記結合剤が、抗免疫グロブリン、プロテインG、プロテ
インAおよびレクチンからなる群より選択される、請求項42に記載のキット。 - 【請求項44】 前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵
素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項42に記載のキ
ット。 - 【請求項45】 少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む、
診断キットであって、該オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つは、配
列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66
〜88、110〜119、120、122、124、126、128、130、
132、134、136、169〜174、181〜188、263、265お
よび267〜291のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に特異
的なプライマーである、診断キット。 - 【請求項46】 前記オリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも1つが、
配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、44〜64、6
6〜88、110〜119、120、122、124、126、128、130
、132、134、136、169〜174、181〜188、263、265
および267〜291の配列のうちの少なくとも約10個連続するヌクレオチド
を含む、請求項43に記載の診断キット。 - 【請求項47】 少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを含む、診
断キットであって、該オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号1〜4、15、
16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜11
9、120、122、124、126、128、130、132、134、13
6、169〜174、181〜188、263、265および267〜291の
配列を含むポリヌクレオチド分子に特異的なプローブである、診断キット。 - 【請求項48】 前記オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号1〜4、1
5、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜
119、120、122、124、126、128、130、132、134、
136、169〜174、181〜188、263、265および267〜29
1のポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも約15個連続するヌクレオチドを
含む、請求項47に記載のキット。 - 【請求項49】 以下: (a)請求項22に記載の少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメ
ント;および (b)検出試薬、 を備える、診断キット。 - 【請求項50】 患者におけるChlamydia感染を処置するための方
法であって、以下の工程: (a)該患者から末梢血細胞を得る工程; (b)Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む少なくとも1つポリペプ
チドの存在下で、該細胞をインキュベートする工程であって、ここで、該抗原は
、以下:(i)配列番号1〜4、15、16、21〜25、27、29、33、
44〜64、66〜88、110〜119、120、122、124、126、
128、130、132、134、136、169〜174、181〜188、
263、265および267〜291に示される配列;(ii)(i)の配列に
相補的な配列;ならびに(c)中程度にストリンジェントな条件下で(i)また
は(ii)の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、からなる群より
選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む抗原
であり、その結果、T細胞が増殖する、工程:ならびに (c)該患者に、該増殖されたT細胞を投与する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項51】 患者におけるChlamydia感染を処置するための方
法であって、以下の工程: (a)該患者から末梢血細胞を得る工程; (b)少なくとも1つのポリヌクレオチドの存在下で、該細胞をインキュベー
トする工程であって、該ポリヌクレオチドは、以下:(i)配列番号1〜4、1
5、16、21〜25、27、29、33、44〜64、66〜88、110〜
119、120、122、124、126、128、130、132、134、
136、169〜174、181〜188、263、265および267〜29
1に示される配列;(ii)(i)の配列に相補的な配列;ならびに(c)中程
度にストリンジェントな条件下で(i)または(ii)の配列にハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド分子であり、その結果、T細胞が増殖する、工程:ならび
に (c)該患者に、該増殖されたT細胞を投与する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項52】 前記T細胞をインキュベートする工程が、1回以上繰り返
される、請求項50および51のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項53】 工程(a)が、前記末梢血細胞からT細胞を分離する工程
をさらに包含し、そして工程(b)においてインキュベートされる細胞が、該T
細胞である、請求項50および51のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項54】 工程(a)が、前記末梢血細胞からCD4+細胞またはC
D8+T細胞を分離する工程をさらに包含し、そして工程(b)において増殖さ
れる細胞が、CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、請求項50および5
1のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項55】 工程(a)が、前記末梢血細胞からγ/δTリンパ球を分
離する工程をさらに包含し、そして工程(b)において増殖される細胞が、γ/
δTリンパ球である、請求項50および51のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項56】 工程(b)が、前記ポリペプチドの存在下で増殖される1
以上のT細胞をクローニングする工程をさらに包含する、請求項50および51
のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項57】 患者におけるChlamydia感染を処置するための薬
学的組成物であって、請求項1に記載のポリペプチドの存在下で増殖されたT細
胞を、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。 - 【請求項58】 患者におけるChlamydia感染を処置するための薬
学的組成物であって、請求項3に記載のポリヌクレオチドの存在下で増殖された
T細胞を、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬学的組成物。 - 【請求項59】 患者におけるChlamydia感染を処置するための方
法であって、以下の工程: (a)請求項1に記載の少なくとも1つのポリペプチドの存在下で、抗原提示
細胞をインキュベートする工程;および (b)該患者に、該インキュベートした抗原提示細胞を投与する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項60】 患者におけるChlamydia感染を処置するための方
法であって、以下の工程: (a)請求項3に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドを、抗原提示細胞
に導入する工程;および (b)該患者に、該抗原提示細胞を投与する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項61】 前記抗原提示細胞が、樹状細胞、マクロファージ細胞、B
細胞線維芽細胞、単球細胞および幹細胞からなる群より選択される、請求項59
または60に記載の方法。 - 【請求項62】 患者におけるChlamydia感染を処置するための薬
学的組成物であって、請求項1に記載のポリペプチドの存在下でインキュベート
された抗原提示細胞を、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、薬
学的組成物。 - 【請求項63】 患者におけるChlamydia感染を処置するための薬
学的組成物であって、請求項3に記載のポリヌクレオチドの存在下でインキュベ
ートされた抗原提示細胞を、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む
、薬学的組成物。 - 【請求項64】 Chlamydia抗原の免疫原性部分を含む、ポリペプ
チドであって、ここで、該免疫原性部分は、配列番号18、19、31、39、
93〜96、98、100〜102、106、108、138〜140、158
、167、168、246、247および254〜256の配列を含む部分であ
る、ポリペプチド。 - 【請求項65】 配列番号31、98、106、108、138〜140、
158、167、168、246、247または254〜256の配列を含む、
Chlamydia抗原の免疫原性エピトープ。 - 【請求項66】 配列番号5〜14、17〜20、26、28、30〜32
、34、39〜43、65、89〜109、138〜158、167、168、
224〜262、246、247、254〜256および292のいずれか1つ
に示される配列を含む、単離されたポリペプチド。
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