JP2010505795A - クラミジア感染症に対するワクチン - Google Patents

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Abstract

Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的には、クラミジア感染症の治療または予防に関する。特に、本発明は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法および関連態様に関する。
（発明の背景）
クラミジアは、多種多様の重大なヒトおよび動物の感染症の原因となる細胞内細菌性病原体である。
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）は、社会的もしくは性的な接触を介してヒト間で伝染する。多くのクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が存在し、血清型の同定および分類が継続して進められているが、現在までのところ少なくとも18種が報告されている。血清型A〜Cは、主に、眼トラコーマに関連し、血清型D〜Kは、眼・生殖器性疾患に関連し、そして血清型L1〜L3は、性病性リンパ肉芽腫（LGV）に関連する（Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161）。しかしながら、そのような疾患関連性は、絶対的なものではなく、たとえば、血清型Bは、生殖管単離物中に見いだされている（Caldwell, HB et al. J. Clin. Invest. 2003 111(11):1757-1769）。
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）は、性感染性疾患の最も一般的な原因の1つであり、骨盤内炎症性疾患（PID）を引き起こして結果的に卵管閉塞および不妊症を招く可能性がある。クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）はまた、男性不妊症の一因となる可能性がある。1990年において米国でのPIDの治療費は40億ドルである推定された。世界保健機関（World Health Organisation）は、1999年において性感染性クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に起因する9000万例を超える新規症例が全世界で発生していると推測した（Global Prevalence and Incidence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections, World Health Organisation, Geneva, 2001）。さらに、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）感染症のような潰瘍性の性感染性疾患は、HIV感染の主要な危険因子である（Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161; Igietseme, JU et al. Expert Rev. Vaccines 2003 2(1):129-146）。
多くの場合、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）感染症は、無症状かつ不顕性であるので、重篤かつしばしば不可逆性の合併症が生殖器感染の最初の症状として存在する可能性がある。生殖器性クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）感染を有する母親から生まれた乳児は、肺炎を発症する可能性があり、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）は、生後6ヶ月間の肺炎の最も一般的な原因因子であると考えられている（de la Maza, LM et al. Curr. Opin. Investig. Drugs 2002 3(7):980-986）。クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の眼感染症に起因するトラコーマは、世界中の予防可能な失明の主原因であり、3〜5億人が罹患していると推定される（West, SK Prog. Ret. Eye Res. 2004 23:381-401）。現在の治療は、テトラサイクリン（4〜6週間にわたり毎日）またはアジスロマイシン（単回用量）のような抗生物質の使用を含む。感染を治すのに有効であるが、一般的には、感染の風土性に起因して再感染が起こる。長年にわたり反復感染を受けると、眼瞼が瘢痕化したり、眼瞼縁が変形したり、睫毛により角膜が擦れたり（睫毛乱生）するようになる。角膜が定常的に外傷を受けると、痛みを生じるとともに角膜混濁および失明をも招く（Mabey, DCW et al. The Lancet 2003 362:223-229）。
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に暴露されたことのある者は、少なくとも同一の血清型の場合、再感染に対してある程度の自然免疫を生じることが示されているが、防御の程度は、前回の感染を受けてから経過した期間に依存する可能性がある（Katz, BP et al. Sex. Transm. Dis. 1987 14:160-164）。年齢もまた、感染の持続期間に重要であることが示されており、年齢の高い者ほど眼性クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）による感染の持続期間が短いことからも、適応免疫防御の存在が示唆される（Bailey, R et al. Epidemiol. Infect. 1999 123:479-486）。抗生物質の使用は、実際上、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）に対する自然免疫の発生を妨害することが示唆されている（Brunham, RC et al. J. Nat. Rev. Immunol. 2005 5:149-161; Atik, B et al. J.A.M.A. 2006 296(12): 1488-1497）。
したがって、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）感染症は、先進国においても発展途上国においても重要な健康問題となっている。公衆衛生上の問題および現在の治療費が多くの発展途上国で高すぎるという事実に照らして、クラミジア（Chlamydia）属の種に対するワクチンの開発が重要な研究目標になってきている。クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）のゲノム構造は比較的安定であり、しかも病原体保有動物の存在はごくわずかなので、限られた効力を有するワクチンでさえも、感染症の有病率に有意な影響を及ぼす可能性がある。
主要外膜タンパク質（Momp）は、細菌外膜のタンパク質質量の約60%を占めており、血清型特異性の決定に重要であると考えられている。そのアミノ酸配列は、外部に露出した4つの領域を含有し、その領域に配列変異の大部分が存在する。Momp配列中の約400個のアミノ酸のうち、70個までのアミノ酸は、異なる血清型のMomp間で異なる。特に驚くべきことは、アミノ酸配列同一性に基づく血清型分類が関連疾患状態（すなわち、眼性、眼・生殖器性、およびLGV性）に基づく血清型分類（Stothard, DR et al. Infect. Immun. 1998 66(8):3618-3625）に対応しないという知見である。同様に、MompをコードするompA遺伝子についてのヌクレオチド配列同一性比較は、疾患状態に対応しない（Meijer, A et al. J. Bateriol. 1999 181(15):4469-4475; Lysen, M et al. J. Clin. Microbiol. 2004 42(4):1641-1647）。Mompに対するモノクローナル抗体は、培養下では有効であるが、いくつかの動物モデルでは、防御は、限られている可能性があり、一般的には、血清型特異的である。
エキソ糖脂質抗原に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体で皮下免疫または経口免疫されたマウスは、血清型Cに対しては防御応答を示したが、依然として血清型Kによるチャレンジの影響を受けやすかった（Whittum-Hudson, JA et al. Nat. Med. 1996 2(10):1116-1121）。
これまでに開示されたタンパク質の1種は、異なる血清型間で高レベルの配列相同性を示す。すなわち、クラスI接近可能タンパク質-1（Cap1またはCt-529と呼ばれる）である。そのようなタンパク質は、2種以上の血清型に対する防御を刺激するワクチンの開発に使用できる可能性がある（Fling, SP et al. PNAS 2001 98(3):1160-1165）。しかしながら、血清型間の高レベルの配列相同性の要件に加えて、ワクチンに有用なタンパク質はまた、十分な免疫応答を誘発しなければならない。
Lyons, JM et al. BMC Infectious Diseases 2005 5:105には、マウスにおける生殖管感染後の眼・生殖器性クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に対する同型免疫および異型免疫の獲得についての記載がある。
Patel, HC et al. Genitourin. Med. 1995 71:2 94-97では、結膜および生殖管の二重クラミジア感染症を有する患者が眼感染症だけまたは生殖器感染症だけを有する患者よりも高いIgG力価を有することが見いだされた。
Ogra, PL et al. Clin. Microbiol. Rev. 2001 14(2):430-445には、粘膜免疫応答を獲得するための一般的ワクチン接種戦略が論じられている。
国際特許出願PCT/US2006/010793号（公開WO2006/104890号）には、クラミジア感染の予防および／または治療に有用なクラミジア抗原の組合せが開示されているが、眼感染症の治療におけるその使用については具体的に開示されていない。
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療および予防に有効な方法が当技術分野で依然として必要とされている。また、各種血清型から生じるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療および予防に有効な方法も依然として必要とされている。本発明は、こうした必要を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
本発明者らは、驚くべきことに、特定の免疫原性組成物の投与が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を防御する免疫応答を誘導する有効な方法であることを見いだした。
さらに、特にクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質Ct-089、Ct-858、およびCt-875が、高抗原性であるとともに、異なるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型の間で高度の配列同一性をも有することを見いだした。予測されたエピトープの領域では、特に高度に保存されている。この知見に照らせば、広範にわたるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に対して有効である（すなわち、交差防御に有用である可能性のある）クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症に対するワクチンの開発の可能性が存在する。
（発明の概要）
本発明によれば、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
この他に、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療または予防に使用するための、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物が提供される。
また、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、の使用も提供される。
本発明によれば、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
この他に、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療または予防に使用するための、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物が提供される。
また、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、の使用も提供される。
本発明のさらなる態様では、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を眼投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
また、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を非眼投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
好適には、免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のさらなる態様では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物を投与することを含む、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
また、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、の使用も提供される。
この他に、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療または予防に使用するための、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物が提供される。
好適には、免疫原性組成物は、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド（特に、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される2種以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質（たとえば、Ct-858とCt-875）、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド）を含む。特に、免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875のそれぞれに関連するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、免疫原性組成物は、製薬上許容される希釈剤または担体をさらに含む医薬組成物として製剤化可能である。
免疫原性組成物の免疫原性は、アジュバントをさらに含むワクチン組成物として製剤化することにより増強可能である。
図1は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-089と、の配列アライメントを示している。 図1は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-089と、の配列アライメントを示している。 図1は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-089と、の配列アライメントを示している。 図2aおよび2bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-858と、の配列アライメントを示している。 図2aおよび2bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-858と、の配列アライメントを示している。 図2aおよび2bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-858と、の配列アライメントを示している。 図2aおよび2bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-858と、の配列アライメントを示している。 図3aおよび3bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-875と、の配列アライメントを示している。 図3aおよび3bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-875と、の配列アライメントを示している。 図3aおよび3bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-875と、の配列アライメントを示している。 図3aおよび3bは、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875と、一連の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来するCt-875と、の配列アライメントを示している。 図4は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）基本小体による眼チャレンジを行った後の7日目に免疫化マウスから採取された眼スワブの結果を示している。 図5は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）基本小体による眼チャレンジを行った後の14日目に免疫化マウスから採取された眼スワブの結果を示している。 図6は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）基本小体による眼チャレンジを行った後の21日目に免疫化マウスから採取された眼スワブの結果を示している。
（発明の詳細な説明）
「Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド」という用語は、上述のリストから選ばれる第1のクラミジア抗原に関連する少なくとも1種の成分（すなわち、タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド）と、上述のリストから選ばれる第2のクラミジア抗原に関連する少なくとも1種の成分（すなわち、タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド）と、を含むことを意味する。「3種以上」などが言及された場合、それに応じて適宜解釈されるものとする。
本発明に係る組成物で使用可能な以上に列挙された特定の抗原に対するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を以下に規定する。
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号1は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するSwibとしても知られるCt-460のcDNA配列である（血清型LGVIIは、血清型LIIまたはL2と呼ばれることもある）。
配列番号2は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するSwibとしても知られるCt-460のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号1によりコードされる。
配列番号3は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Fに由来する主要外膜タンパク質（Momp）として知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号4は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Fに由来する主要外膜タンパク質（Momp）として知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号3によりコードされる。
配列番号5は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号6は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号5によりコードされる。
配列番号7は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号8は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号7によりコードされる。
配列番号9は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-622のcDNA配列である。
配列番号10は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-622のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号9によりコードされる。
配列番号11は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-871としても知られるPmpGのパッセンジャードメインのcDNA配列である。
配列番号12は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-871としても知られるPmpGのパッセンジャードメインのタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号11によりコードされる。
配列番号13は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-812としても知られるPmpDのパッセンジャードメインのcDNA配列である。
配列番号14は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-812としても知られるPmpDのパッセンジャードメインのタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号13によりコードされる。
配列番号15は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号16は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号15によりコードされる。
配列番号21は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号22は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号21によりコードされる。
配列番号27は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-871としても知られるPmpGのcDNA配列である。
配列番号28は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-871としても知られるPmpGのタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号27によりコードされる。
配列番号33は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号34は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号33によりコードされる。
配列番号41は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-812としても知られるPmpDのcDNA配列である。
配列番号42は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-812としても知られるPmpDのタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号41によりコードされる。パッセンジャードメインは、アミノ酸31〜1203に及ぶ。
配列番号47は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号48は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LGVIIに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号47によりコードされる。
配列番号49は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号50は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号49によりコードされる。
配列番号51は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号52は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号51によりコードされる。
配列番号53は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号54は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号53によりコードされる。
配列番号55は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のcDNA配列である。
配列番号56は、主要外膜タンパク質（Momp）として知られるとともにクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-681としても知られるクラミジア抗原のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号55によりコードされる。
配列番号57は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-622のcDNA配列である。
配列番号58は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-622のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号57によりコードされる。
配列番号63は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するSwibとしても知られるCt-460のcDNA配列である。
配列番号64は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するSwibとしても知られるCt-460のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号63によりコードされる。
配列番号71は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号72は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Dに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号71によりコードされる。
配列番号79は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号80は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号79によりコードされる。
配列番号81は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号82は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号81によりコードされる。
配列番号83は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号84は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号83によりコードされる。
配列番号85は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号86は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号85によりコードされる。
配列番号87は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号88は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号87によりコードされる。
配列番号89は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号90は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号89によりコードされる。
配列番号91は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号92は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号91によりコードされる。
配列番号93は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-089のcDNA配列である。
配列番号94は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-089のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号93によりコードされる。
配列番号95は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号96は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号95によりコードされる。
配列番号97は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号98は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号97によりコードされる。
配列番号99は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号100は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号99によりコードされる。
配列番号101は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号102は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号101によりコードされる。
配列番号103は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号104は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号103によりコードされる。
配列番号105は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号106は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号105によりコードされる。
配列番号107は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号108は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号107によりコードされる。
配列番号109は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-858のcDNA配列である。
配列番号110は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-858のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号109によりコードされる。
配列番号111は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号112は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Aに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号111によりコードされる。
配列番号113は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号114は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Bに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号113によりコードされる。
配列番号115は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号116は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Gに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号115によりコードされる。
配列番号117は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号118は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Hに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号117によりコードされる。
配列番号119は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号120は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Iに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号119によりコードされる。
配列番号121は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号122は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Jに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号121によりコードされる。
配列番号123は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号124は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Kに由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号123によりコードされる。
配列番号125は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-875のcDNA配列である。
配列番号126は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型L2に由来するCt-875のタンパク質配列であり、このタンパク質は、配列番号125によりコードされる。
いくつかの血清型に由来する以上の配列ならびに他の関連するクラミジアポリペプチドおよびクラミジアポリヌクレオチドのうちのいくつかは、当技術分野で公知でありかつ入手可能である。さらなる関連配列は、発行米国特許第6,447,779号、同第6,166,177号、同第6,565,856号、同第6,555,115号、同第6,432,916号、および同第6,448,234号に見いだされうるし、米国特許出願第10/197,220号、同第10/762,058号、および同第10/872,155号にも開示されている（それらはいずれも参照により本明細書に組み入れられるものとする）。
血清型Dに由来するCt-089の配列および抗原としてのこのタンパク質の適用可能性は、たとえば、WO02/08267（Corixa Corporation）に公開されている。血清型L2に由来するCt-089の配列は、WO99/28475（Genset）に開示された。タイプIIIタンパク質分泌系の推定輸送レギュレーターとしてのCopN（Ct-089としても知られる）の役割については、Fields, KA and Hackstadt, T Mol. Microbiol. 2000 38(5):1048-1060に論じられている。血清型Dに由来するCt-858およびCt-875の配列は、それぞれ、スイスプロット（Swiss-Prot）データベースの一次アクセッション番号O84866およびO84883から入手可能である。さらなる情報については、Stephens, RS et al. Science 1998 282:754-759を参照されたい。抗原としてのCt-858の使用については、たとえば、WO02/08267（Corixa Corporation）に開示されている。血清型Eに由来するCt-875の配列（Hisタグが組み込まれている）および抗原としてのその使用については、たとえば、US 20040137007に開示されている。しかしながら、この文献では、配列番号139をCt-875として間違って参照しているが、その場合、実際には配列番号140である。
好適には、本発明に有用な免疫原性組成物は、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される3つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、たとえば、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される3、4、5、もしくは6つのクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含むであろう。
当業者であればわかるであろうが、免疫原性組成物中の各成分は、独立して、タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドでありうる。この他に、当業者であればわかるであろうが、いくつかのタンパク質またはその免疫原性断片は、単一の融合タンパク質中に含めることが可能であり、別々に提供する必要はない（したがって、特定のタンパク質および／またはその免疫原性断片をコードするいくつかのポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド配列（たとえば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列）中に含めることが可能である）。本発明の一実施形態では、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドはすべて、ポリペプチド（たとえば、単一の融合タンパク質）として提供される。本発明の第2の実施形態では、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドはすべて、ポリヌクレオチド（たとえば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のような単一のポリヌクレオチド配列）として提供される。ポリペプチド成分（すなわち、タンパク質またはその免疫原性断片）は、追加の残基を含有するより大きいポリペプチド中に含まれうるであることはわかるであろう。同様に、タンパク質またはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチドは、より大きいポリヌクレオチド中に含まれうる。
Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドのほかに、免疫原性組成物は、任意の他のクラミジア抗原に関連する他のタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド（たとえば、1、2、もしくは3種の他のクラミジア抗原に関連するタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド）を含みうる。
多様な非近交系ヒト集団にわたり有効な免疫応答を得るために、抗原の組合せを利用することが有利である。抗原の組合せがすべて、補完的というわけではない。抗原の特定の組合せは、クラミジア感染症の病歴を有するヒト被験体により広く認識されることが本発明者らにより見いだされた。
好適には、免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。より好適には、免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される2種以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質（たとえば、Ct-089とCt-858、Ct-089とCt-875、もしくはCt-858とCt-875）、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。特定的には、免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875のそれぞれに関連するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
たとえば、免疫原性組成物は、以下の組合せのすべてがCt-858成分とCt-875成分とを含むことを条件として、次の組合せのうちの1つに関する成分を含みうる：
1．Swib、Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、およびCt-875のうちの5つ
2．PmpDpd、Ct-858、Ct-0875、Swibのうちの3つ
3．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-622、Ct-875、およびSwibのうちの5つ
4．Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、およびCt-875のうちの5つ
5．Ct-858、Ct-875、Ct-622、およびCt-089のうちの3つ
6．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089のうちの3つ
7．Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、およびCt-875のうちの4つ。
具体的な免疫原性組成物は、次の組合せ（それらはそれぞれ、Ct-858成分とCt-875成分とを含有する）のうちの1つに関する成分を含みうる：
1a．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-089
2a．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-089
3a．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-622、Ct-875、Swib、Ct-089
4a．Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、Ct-875、Ct-089
5a．Ct-858、Ct-875
6a．Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-089
7a．Momp、Ct-858、Ct-875
8a．Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、Ct-875、Ct-089
9a．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089。
代替的な免疫原性組成物は、Momp、Ct-089、Ct-858、Swib、およびPmpDpdに関する成分を含みうる。
本発明に有用な免疫原性組成物は、任意の適切なワクチン接種経路により投与可能である。本発明の一実施形態では、免疫原性組成物は眼内投与される。本発明の第2の実施形態では、免疫原性組成物は非眼内投与される。
非眼内投与経路としては、眼以外の粘膜表面を介する投与が挙げられる。本発明の一実施形態では、非眼内投与は、粘膜表面（たとえば、鼻腔内、口腔内、または膣の粘膜表面）を介する。本発明の第2の実施形態では、非眼内投与は、注射（たとえば、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、または静脈内注射、特に筋肉内注射）によるものである。
本発明のさらなる態様では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物を投与することを含む、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防する方法が提供される。
また、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、の使用も提供される。
この他に、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症の治療または予防に使用するための、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、Ct-089、Ct-858、もしくはCt-875よりなるリストから選択されるタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物が提供される。
本発明の一実施形態では、交差防御に有用な免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される1種のタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される1種のみのタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物は、好適には、少なくとも1種の追加のクラミジア抗原（たとえば、1、2、3、もしくは4種の追加の抗原）をさらに含むであろう。
本発明の第2の実施形態では、交差防御に有用な免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される2種のタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。たとえば、Ct-089とCt-858、Ct-089とCt-875、またはCt-858とCt-875。そのような組成物は、追加のクラミジア抗原（たとえば、1、2、もしくは3種の追加の抗原）をさらに含みうる。
本発明の第3の実施形態では、交差防御に有用な免疫原性組成物は、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される3種のタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む。そのような組成物はまた、追加のクラミジア抗原（たとえば、1もしくは2種の追加の抗原）をさらに含みうる。
典型的には、交差防御に有用な免疫原性組成物に有用な追加のクラミジア抗原（これは、タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドの形態をとりうる）は、Swib、Momp、Ct-622、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから、特に、Swib、Momp、およびPmpDのパッセンジャードメインから選択される。
第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、任意のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型でありうる。第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型のものを除く任意のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型でありうる。
本発明の一実施形態では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、L1、L2、およびL3よりなるリストから選択される。本発明の第2の実施形態では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼性血清型（たとえば、A、B、Ba、およびC）から選択される。本発明の他の実施形態では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼・生殖器性血清型（たとえば、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、およびK）から選択される。本発明のさらなる実施形態では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）LGV性血清型（たとえば、L1、L2、およびL3）から選択される。
本発明の一実施形態では、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、L1、L2、およびL3よりなるリストから選択される。本発明の第2の実施形態では、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼性血清型（たとえば、A、B、Ba、およびC）から選択される。本発明の他の実施形態では、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼・生殖器性血清型（たとえば、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、およびK）から選択される。本発明のさらなる実施形態では、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）LGV性血清型（たとえば、L1、L2、およびL3）から選択される。
交差防御の方法および使用の作用幅を最大化するために、他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型の大多数（たとえば、他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型の少なくとも50%、特に少なくとも70%、特定的には少なくとも80%、より特定的には少なくとも90%）との高レベルの配列同一性（たとえば少なくとも90%、特に少なくとも95%、特定的には少なくとも98%、より特定的には少なくとも99%の配列同一性）が存在するように第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型を選択することが望ましいであろう。
本発明に係る方法および使用の実用性を最大化するために、一般的なクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型（たとえば、一般的な眼性血清型、一般的な眼・生殖器性血清型、一般的なLGV性血清型、またはこれらの血清型グループの任意の2つの組合せ、たとえば、一般的な眼性血清型と一般的な眼・生殖器性血清型）の大多数（たとえば少なくとも50%、特に少なくとも70%、特定的には少なくとも80%、より特定的には少なくとも90%）との高レベルの配列同一性（たとえば少なくとも90%、特に少なくとも95%、特定的には少なくとも98%、より特定的には少なくとも99%の配列同一性）が存在するように第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型を選択することが望ましいであろう。一般的なクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼性血清型としては、AおよびBが挙げられる。一般的なクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼・生殖器性血清型としては、D、E、F、およびIが挙げられる（Lan, J et al. J. Clin. Microbiol. 1995 33(12):3194-3197; Singh, V et al. J. Clin. Microbiol. 2003 41(6):2700-2702）。一般的なクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）LGV性血清型としては、L2が挙げられる。
本発明の一実施形態では、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eである。
本発明の一実施形態では、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、およびKから選択される。
本発明の一例では、免疫原性組成物が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む場合、免疫原性組成物は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、D、G、H、I、J、K、またはL2、特定的には、A、B、D、G、H、I、またはK、特に、AまたはBに起因する感染を治療または予防する際に使用可能である。
本発明の第2の例では、免疫原性組成物が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-858タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、その免疫原性断片またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む場合、免疫原性組成物は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、D、G、H、I、J、K、またはL2、特定的にはJまたはL2に起因する感染症を治療または予防する際に使用可能である。
本発明のさらなる例では、免疫原性組成物が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-875タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、その免疫原性断片またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む場合、免疫原性組成物は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、D、G、H、I、J、K、またはL2、特定的には、A、B、D、G、H、I、またはKに起因する感染症を治療または予防する際に使用可能である。
第1および第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、同一の疾患状態に関連するものであってもよく（たとえば、それらは、両方とも眼性血清型でありうるか、もしくは両方とも眼・生殖器性血清型でありうる）、または第1および第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は、異なる疾患状態に関連するものであってもよい（たとえば、第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は眼・生殖器性血清型でありかつ第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型は眼性血清型でありうるか、もしくはその逆でありうる）。
本発明に有用な免疫原性組成物が、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される2種以上のタンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む場合、各タンパク質、その免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドは、場合により、独立して選択可能な異なる第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来しうることに留意すべきである。とはいえ、当業者であればわかるであろうが、免疫原性組成物はまた、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する追加のCt-089、Ct-858、およびCt-875タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドをも含みうる。
したがって、本発明に有用な免疫原性組成物では、配列表に規定されるポリペプチド配列もしくはその変異体、これらの免疫原性断片、またはこれらをコードするポリヌクレオチド配列（たとえば、配列表に規定されるポリヌクレオチド配列、またはポリペプチドの免疫原性断片をコードするこれらの断片でありうる）を利用することが可能である。
本明細書中に記載のタンパク質抗原は、融合タンパク質の形態をとりうる。融合タンパク質はまた、追加のポリペプチド、場合により、クラミジア起源または他の起源に由来する異種ペプチドをも含有しうる。融合配列中の抗原は、たとえば、以下に記載されるようにリンカーペプチド配列を追加することにより改変可能である。こうしたリンカーペプチドは、各融合タンパク質を構成する1種以上のポリペプチド間に挿入可能である。本明細書中に記載の抗原はまた、化学的コンジュゲートの形態をもとりうる。
自明なことであろうが、PmpDおよびPmpGのパッセンジャードメインの場合、これらは、PmpDまたはPmpGのタンパク質またはポリヌクレオチドのより大きい一部分、たとえば、全長PmpDもしくはPmpGまたはその断片（ただし、この断片はパッセンジャードメインを含むものである）として存在しうる。
特定の実施形態では、以下のとおりである。
（i）Ct-089成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるCt-089配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるCt-089配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Ct-089成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するであろう。
（ii）Ct-858成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるCt-858配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるCt-858配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Ct-858成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するであろう。
（iii）Ct-875成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるCt-875配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるCt-875配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Ct-875成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するであろう。
（iv）PmpDpd成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるPmpDpd配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるPmpDpd配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、PmpDpd成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LIIに由来するであろう。
（v）PmpGpd成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるPmpGpd配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるPmpGpd配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、PmpGpd成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LIIに由来するであろう。
（vi）Momp成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるMomp配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるMomp配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Momp成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Fに由来するであろう。
（vii）Swib成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるSwib配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるSwib配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Swib成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型LIIに由来するであろう。
（viii）Ct-622成分は、典型的には、本願の配列表に規定されるCt-622配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリペプチド、その免疫原性断片、または本願の配列表に規定されるCt-622配列に対して少なくとも90%の相同性（たとえば95%の相同性）を有するポリヌクレオチド、もしくは対応するタンパク質の免疫原性断片をコードするその断片であろう。特定的には、Ct-622成分は、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するであろう。
本発明に有用な免疫原性組成物は、抗原の抗原性を増強するようにまたは他の態様ではこうした抗原を改善するように、たとえば、抗原の一方の末端にヒスチジン残基の配列（stretch）を付加することによりこうした抗原の単離を改善するようにデザインされた他の成分をさらに含みうる。また、抗原の一方の末端にヒスチジン残基の伸長部を付加することにより発現を改善することも可能である。本発明に有用な免疫原性組成物は、クラミジア（Chlamydia）属の種に由来する追加の抗原コピーまたは追加のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含みうる。免疫原性組成物は、他の非クラミジア起源に由来する追加の異種のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをも含みうる。たとえば、本発明に係る組成物は、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（このポリペプチドは抗原の発現を増強するものである）、たとえば、インフルエンザウイルスタンパク質NS1もしくはその免疫原性部分を含みうる（たとえば、WO99/40188およびWO93/04175を参照されたい）。本発明に係る核酸は、選択に係る生物種たとえばヒトにおけるコドン選択性に基づいて工学的に作製可能である。抗原のタンパク質配列がMet残基から始まる場合、典型的には、抗原の機能性を損なうことなくこの残基を削除しうることはわかるであろう。
定義
「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」とは、直接的にまたはアミノ酸リンカーを介して共有結合された少なくとも2つのクラミジアポリペプチド（同一であっても異なっていてもよい）を有するタンパク質を意味する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、C末端がN末端に連結されるが、C末端がC末端に、N末端がN末端に、またはN末端がC末端に連結されることもある。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序で存在可能である。この用語はまた、融合タンパク質を構成する抗原の保存的改変変異体、多型変異体、アレル、突然変異体、部分配列、種間相同体、および免疫原性断片をも意味する。本発明に有用な融合タンパク質は、成分抗原またはその免疫原性断片の追加のコピーをも含みうる。
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下で少なくとも2つのヌクレオチド配列にハイブリダイズし、その各ヌクレオチド配列は、Ct-681（Momp）またはその免疫原性断片、Ct-871（PmpG）またはその免疫原性断片、Ct-812（PmpD）またはその免疫原性断片、Ct-089またはその免疫原性断片、Ct-858またはその免疫原性断片、Ct-875またはその免疫原性断片、Ct-460（Swib）またはその免疫原性断片、およびCt-622またはその免疫原性断片よりなる群から選択される抗原ポリペプチドをコードする。したがって、融合ポリペプチドの個々の抗原をコードするポリヌクレオチド配列は、Ct-681（Momp）、Ct-871（PmpG）、Ct-812（PmpD）、Ct-089、Ct-858、Ct-875、Ct-460（Swib）、およびCt-622の保存的改変変異体、多型変異体、アレル、突然変異体、部分配列、免疫原性断片、および種間相同体を含む。融合タンパク質の個々のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、任意の順序で存在可能である。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の個々のポリペプチドは、大→小の順序（N末端からC末端の方向）で存在する。大抗原は約30〜150kDのサイズであり、中抗原は約10〜30kDのサイズで、そして小抗原は約10kD未満のサイズである。
個々のポリペプチドをコードする配列は、たとえば、約8〜9個のアミノ酸をコードする個々のCTLエピトープまたはたとえばHTLエピトープもしくはB細胞エピトープのような免疫原性断片のように小さいものでありうる。断片はまた、多重エピトープをも含みうる。Tヘルパー細胞エピトープは、HLAクラスII分子に結合されてTヘルパー細胞により認識されるペプチドである。推定Tヘルパー細胞エピトープの予測は、Sturniolo et al. Nature Biotech. 1999 17:555-561に記載のTEPITOPE法を用いて実施可能である。
融合ポリペプチドは、Ct-681（Momp）またはその免疫原性断片、Ct-871（PmpG）またはその免疫原性断片（たとえばPmpGpdまたはその免疫原性断片）、Ct-812（PmpD）またはその免疫原性断片（たとえばPmpDpdまたはその免疫原性断片）、Ct-089またはその免疫原性断片、Ct-858またはその免疫原性断片、Ct-875またはその免疫原性断片、Ct-460（Swib）またはその免疫原性断片、およびCt-622またはその免疫原性断片から選択される少なくとも2つの抗原ポリペプチドに対して生成された抗体に特異的に結合する。抗体は、ポリクロナールであってもモノクローナルであってもよい。場合により、融合ポリペプチドは、抗原の融合連結部に対して生成された抗体に特異的に結合する。すなわち、それらが融合タンパク質の一部でない時には抗体は抗原に個別的に結合しない。融合ポリペプチドは、場合により、追加のポリペプチド、たとえば、3、4、5、6個、もしくはそれ以上のポリペプチド、約25個までのポリペプチド、場合により、異種ポリペプチドまたは反復同種ポリペプチドを、少なくとも2つの抗原に融合させて含む。融合タンパク質の追加のポリペプチドは、場合により、クラミジア起源さらには他の起源、たとえば、他の細菌起源、ウイルス起源、または無脊椎動物起源、脊椎動物起源、もしくは哺乳動物起源に由来する。融合タンパク質の個々のポリペプチドは、任意の順序で存在可能である。本明細書に記載されるように、追加のポリペプチドをはじめとする他の分子に融合タンパク質を連結することが可能である。本発明に有用な組成物はまた、本発明に係る融合タンパク質に連結されていない追加のポリペプチドをも含みうる。こうした追加のポリペプチドは、異種ポリペプチドであっても同種ポリペプチドであってもよい。
「融合」という用語は、融合タンパク質中の2つのポリペプチド間の共有結合を意味する。ポリペプチドは、典型的には、互いに直接的にまたはアミノ酸リンカーを介してペプチド結合により連結される。場合により、当業者に公知の非ペプチド共有結合によりペプチドを連結することが可能である。
「FL」とは、全長、すなわち、野生型ポリペプチドと同一の長さのポリペプチドを意味する。
「その免疫原性断片」という用語は、Tリンパ球、特定的には、細胞傷害性Tリンパ球、ヘルパーTリンパ球、またはB細胞により認識されるエピトープを含むポリペプチドを意味する。配列のエピトープ領域を決定する方法については、本明細書中の他の箇所で説明する。好適には、免疫原性断片は、参照配列中のアミノ酸の少なくとも30%、好適には少なくとも50%、特に少なくとも75%、特定的には少なくとも90%（たとえば95%または98%）を含むであろう。他の選択肢として、免疫原性断片は、少なくとも9個、好適には少なくとも15個（たとえば、少なくとも25個または少なくとも50個、特定的には少なくとも100個）の残基よりなる配列を含むであろう。免疫原性断片は、好適には、参照配列のエピトープ領域のすべてを含むであろう。
アジュバントとは、抗原に対する特異的免疫応答を増大させるワクチン中または治療組成物中の成分を意味する（たとえば、Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)を参照されたい）。アジュバントは、Th1型応答およびTh2型応答の免疫応答を誘導する。Th1型サイトカイン（たとえば、IFN-γ、IL-2、およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支援する傾向があり、一方、Th2型サイトカイン（たとえば、IL-4、IL-5、Il-6、IL-10、およびTNF-β）は、体液性免疫応答の誘導を支援する傾向がある。免疫応答を増強するために、さまざまなアジュバントのいずれかを本発明に係るワクチンで利用することが可能である。いくつかのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するようにデザインされた物質、たとえば、金属塩粒子（たとえば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）または鉱油、および免疫応答の特異的もしくは非特異的な刺激剤、たとえば、ボルデテラ・ペルツッシス（Bortadella pertussis）もしくはマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）の脂質Aを含有する。好適なアジュバントは、市販されており、例としては、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Difco Laboratories）ならびにメルク・アジュバント65（Merck Adjuvant 65）（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J. ）が挙げられる。他の好適なアジュバントとしては、モノホスホリルリピドA、3D-MPL、サポニン（たとえば、キルA（Quil A）、特定的には、QS21として知られるキルA（Quil A）の画分、特に、WO96/033739に記載のコレステロールのような解毒成分と併用されたもの）、SBAS1を含むリポソーム製剤、SBAS2を含む水中油型エマルジョン剤（Ling et al. Vaccine 1997 15:1562-1567）、およびCpGオリゴヌクレオチド（WO96/02555）が挙げられる。本発明に使用するのに好適なアジュバントについては、以下でさらに詳細に論述する。
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの形態のそのポリマーを意味する。この用語はまた、参照核酸と類似の結合性を有しかつ参照ヌクレオチドに類似した形で代謝される合成、天然、および非天然の既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは修飾型骨格結合を含有する核酸を包含するように拡張解釈可能である。そのような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特に指示がないかぎり、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的改変変異体（たとえば縮重コドン置換体）および相補的配列をも黙示的に包含する。特定的には、1つ以上の所定の（もしくはすべての）コドンの3番目の位置を混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することにより、縮重コドン置換を達成することが可能である（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと同義的に用いられる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書中では同義的に用いられてアミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語はまた、1つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、さらには天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成のアミノ酸さらには天然に存在するアミノ酸に類似した形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を意味する。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされたアミノ酸さらには後で修飾されたアミノ酸、たとえば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンのことである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素に結合されたα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基を有する化合物、たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。そのような類似体は、修飾型R基（たとえばノルロイシン）または修飾型ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体（mimetic）とは、アミノ酸の一般化学構造とは異なるが天然に存在するアミノ酸に類似した形で機能する構造を有する化学化合物を意味する。
アミノ酸は、本明細書中では、その一般に知られる三文字記号またはIUPAC-IUB生化学命名委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される一文字記号のいずれかにより参照されうる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている一文字コードにより参照されうる。
「変異体」または「保存的改変変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列と対比して、保存的改変変異体とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されたすべての位置で、コードされたポリペプチドを変化させることなくコドンを記載の対応するコドンのいずれかに変更することが可能である。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的改変変異の1種である。また、ポリペプチドをコードする本願の核酸配列はすべて、核酸のすべての可能なサイレント変異を記述する。当業者であればわかるであろうが、核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUGおよび通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）は、機能的に同一の分子を生成するように改変可能である。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各記載の配列中では黙示的である。
本発明に係るポリヌクレオチドは、参照配列と比較した場合、いくつかのサイレント変異を含有しうる（例としては1〜10個、たとえば1〜5個、特定的には1もしくは2個、特に1個のコドンを変更しうる）。本発明に係るポリヌクレオチドは、参照配列と比較した場合、いくつかの非サイレント保存的変異を含有しうる（例としては1〜10個、たとえば1〜5個、特定的には1もしくは2個、特に1個のコドンを変更しうる）。当業者であればわかるであろうが、特定のポリヌクレオチド配列は、サイレント変異および非サイレント保存的変異の両方を含有しうる。
アミノ酸配列に関して、当業者であればわかるであろうが、コードされた配列中の単一のアミノ酸または低パーセントのアミノ酸の変更、付加、または欠失が行われた、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対するそれぞれの置換体、欠失体、または付加体は、改変の結果として機能的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換または変異体の生物学的機能に実質的に影響を及ぼさない残基の欠失／付加を生じるのであれば、「保存的改変変異体」である。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的改変変異体は、本発明に係る多型変異体、種間相同体、およびアレルに追加されるものであり、それらを除外するものではない。
本発明に係るポリペプチドは、参照配列と比較した場合、いくつかの保存的変異を含有しうる（例としては1〜10個、たとえば1〜5個、特定的には1もしくは2個、特に1個のアミノ酸残基を変更しうる）。一般的には、そのような保存的置換は、以下に指定されたアミノ酸群の1つに包含されるであろうが、いくつかの状況下では、抗原の免疫原性に実質的な影響を及ぼすことなく他の置換が可能であろう。次の8つの群は、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リシン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（たとえば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。
好適には、アミノ酸置換は、抗原の非エピトープ領域に限定される。
また、ポリペプチド配列変異体としては、参照配列と比較して追加のアミノ酸が挿入されたものが挙げられうる。たとえば、そのような挿入は、1〜10ヶ所の位置（たとえば1〜5ヶ所の位置、好適には1もしくは2ヶ所の位置、特定的には1ヶ所の位置）で行われうる。また、各位置で50個以下のアミノ酸（たとえば20個以下、特定的には10個以下、特に5個以下）の付加を含みうる。好適には、そのような挿入は、エピトープの領域では行われず、したがって、抗原の免疫原性に有意な影響を及ぼさない。挿入の一例としては、当該抗原の発現および／または精製に役立つヒスチジン残基の短い配列（たとえば1〜6個の残基）が挙げられる。
他のポリペプチド配列変異体としては、参照配列と比較してアミノ酸が欠失したものが挙げられる。たとえば、そのような欠失は、1〜10ヶ所の位置（たとえば1〜5ヶ所の位置、好適には1もしくは2ヶ所の位置、特定的には1ヶ所の位置）で行われうる。また、各位置で50個以下のアミノ酸（たとえば20個以下、特定的には10個以下、特に5個以下）の欠失を含みうる。好適には、そのような欠失は、エピトープの領域では行われず、したがって、抗原の免疫原性に有意な影響を及ぼさない。
抗原のエピトープ領域を決定する方法については、本明細書中の他の箇所で説明および例示する。
核酸の一部分に関連して用いられるときの「異種」という用語は、天然で互いに同一の関係で見いだされない2つ以上の部分配列が核酸に含まれることを意味する。たとえば、新しい機能性核酸を作製するように配置された非関連遺伝子に由来する2つ以上の配列、たとえば、一起源に由来するプロモーターおよび他の起源に由来するコード領域、を有する核酸は、典型的には、組換えにより産生される。同様に、異種タンパク質とは、天然で互いに同一の関係で見いだされない2つ以上の部分配列がタンパク質に含まれることを意味する（たとえば融合タンパク質）。
「〜に選択的（もしくは特異的）にハイブリダイズする」という表現は、配列が複合混合物（たとえば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA）中に存在するときにストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子の結合、二本鎖化、またはハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェント条件下でハイブリダイズする」という表現は、プローブがその標的部分配列（典型的には、核酸の複合混合物中に存在する）にはハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なったものになるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見いだされる。一般的には、ストリンジェント条件は、規定のイオン強度・pHにおける特異的配列の熱融解点（Tm）よりも約5〜10℃低くなるように選択される。Tmとは、（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下で）標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズするときの温度のことである（標的配列が過剰に存在する場合、Tmにおいて、プローブの50%が平衡状態で占有される）。ストリンジェント条件とは、pH7.0〜8.3において塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオンの濃度であり（または他の塩）かつ温度が短いプローブ（たとえば10〜50ヌクレオチド）に対しては少なくとも約30℃、長いプローブ（たとえば50ヌクレオチド超）に対しては少なくとも約60℃であるときの条件のことである。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することにより達成することも可能である。選択的もしくは特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、場合によりバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、次のとおりでありうる：50%ホルムアミド、5×SSC、および1% SDS、42℃でインキュベート、または5×SSC
、1% SDS、65℃でインキュベート、65℃で0.2×SSCおよび0.1% SDSで洗浄。
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、たとえば、遺伝暗号により許容される最大コドン縮重を用いて核酸のコピーが作製される場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、37℃における40%ホルムアミド、1M NaCl、1% SDSの緩衝液中でのハイブリダイゼーションおよび45℃における1×SSC中での洗浄が挙げられる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者であれば、他の選択肢のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用して類似のストリンジェンシーの条件を提供しうることは容易にわかるであろう。
「抗体」とは、抗原に特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子に由来するフレームワーク領域またはその断片を含むポリペプチドをいう。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、これがそれぞれ、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgE免疫グロブリンクラスを規定する。
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖よりなる2つの同一の対で構成され、各対は、1本の「軽」鎖（約25kDa）と1本の「重」鎖（約50〜70kDa）とを有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識の役割を担う約100〜110アミノ酸もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を意味する。
抗体は、たとえば、インタクトな免疫グロブリンとしてまたは種々のペプチダーゼで消化することにより産生されたいくつかの十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。その場合、たとえば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合よりも下で抗体を消化して、Fabの二量体であるF(ab)'2を産生する。Fab自体は、ジスルフィド結合によりVH-CH1に連結された軽鎖である。温和な条件下でF(ab)'2を還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それにより、F(ab)'2二量体をFab'単量体に変換することが可能である。Fab'単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を有するFabである（Fundamental Immunology (Paul ed. , 3d ed. 1993を参照されたい）。インタクトな抗体の消化により種々の抗体フラグメントが規定されるが、当業者であれば、化学的にまたは組換えDNA法を用いることによりそのようなフラグメントをde novoで合成しうることはわかるであろう。したがって、抗体という用語は、本明細書中で用いられる場合、全抗体の修飾により産生された抗体フラグメント、または組換えDNA法を用いてde novoで合成されたもの（たとえば一本鎖Fv）、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定されたもの（たとえば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照されたい）をも包含する。
モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を調製するために、当技術分野で公知の任意の技術を使用されることが可能である（たとえば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)を参照されたい）。一本鎖抗体を産生するための技術（米国特許第4,946,778号）は、本発明に係るポリペプチドに対する抗体を産生するように適合化可能である。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物たとえば他の哺乳動物を用いてヒト化抗体を発現することが可能である。他の選択肢として、ファージディスプレイ技術を用いて、所定の抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックFabフラグメントを同定することが可能である（たとえば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)を参照されたい）。
抗体に「特異的（もしくは選択的）に結合する」または「〜と特異的（もしくは選択的）に免疫反応する」という表現は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生物学的物質の不均一集団中のタンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。その場合、指定のイムノアッセイ条件下で、指定の抗体は、特定のタンパク質にバックグラウンドの少なくとも2倍結合し、かつサンプル中に存在する他のタンパク質に有意量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に関して選択された抗体を必要とするであろう。たとえば、融合タンパク質とは特異的に免疫反応するが融合タンパク質の個々の成分とは特異的に免疫反応しないポリクローナル抗体のみを取得すべく、融合タンパク質に対して産生されたポリクローナル抗体を選択することが可能である。この選択は、個々の抗原と交差反応する抗体を取り除くことにより達成可能である。さまざまなイムノアッセイ方式を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することが可能である。たとえば、固相ELISAイムノアッセイを慣例に従って用いて、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択する（たとえば、特定の免疫反応性を決定するために使用可能なイムノアッセイの方式および条件の説明に関しては、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)を参照されたい）。典型的には、特異的もしくは選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍であろう。
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、個々の抗原もしくはその一部分をコードする内因性配列）を含みうるか、またはそのような配列の変異体を含みうる。ポリヌクレオチド変異体は、コードされた融合ポリペプチドの生物活性が、天然の抗原を含む融合ポリペプチドと対比して低減されないように、1つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有しうる。変異体は、天然のポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約70%の同一性、より好ましくは少なくとも約80%の同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の同一性を呈する。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して用いられる「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いてまたは手動アライメントおよび目視検査により測定した場合、比較ウィンドウまたは指定の領域にわたり比較して最大の対応が得られるようにアライメントしたときに、同一であるか、または指定のパーセントの同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、指定の領域にわたり70%の同一性、場合により、75%、80%、85%、90%、もしくは95%（たとえば98%）の同一性）を有する、2つ以上の配列または部分配列を意味する。その場合、そのような配列は、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補体にもあてはまる。場合により、同一性は、少なくとも約25〜約50アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたり、または場合により75〜100アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたり、存在する。好適には、同一性は、参照配列の全長にわたり存在する。参照配列の指定の領域（たとえば全長）にわたり、少なくとも70%の同一性、場合により75%、80%、85%、90%、もしくは95%（たとえば98%）の同一性を有する変異ポリヌクレオチド配列および変異ポリペプチド配列は、特に興味深い。
配列比較を行う場合、典型的には、1つの配列は、試験配列と比較される参照配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用可能であるか、または択一的パラメーターを指定可能である。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書中で用いられる「比較ウィンドウ」としては、25〜500、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150よりなる群から選択されるいずれか1つの連続位置数のセグメントの参照が挙げられる。ただし、このセグメント内で、2つの配列を最適にアライメントした後、配列を同一の連続位置数の参照配列と比較することが可能である。比較のための配列のアライメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適アライメントは、たとえば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズムをコンピューターで実施することにより（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アライメントおよび目視検査により（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)を参照されたい）、実施可能である。
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、関連性および配列同一性パーセントを示すために、漸進的ペアワイズアライメントを用いて一群の関連配列から多重配列アライメントを生成する。それはまた、アライメントを生成するために用いられたクラスタリング関連性を示すツリーまたはデンドグラムをプロットする。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の漸進的アライメント法を単純化したものを使用する。用いられる方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)に記載の方法に類似している。プログラムは、300個までの配列をアライメントすることが可能であり、各配列は、最大5,000ヌクレオチド長または最大5,000アミノ酸長である。多重アライメント手順は、2つの最も類似性の高い配列のペアワイズアライメントから始めて、2つのアライメントされた配列のクラスターを生成する。次に、このクラスターを次に最も関連性の高い配列またはアライメントされた配列のクラスターにアライメントする。2つの個々の配列のペアワイズアライメントを単純に拡張することにより、配列の2つのクラスターをアライメントする。最終アライメントは、一連の漸進的ペアワイズアライメントにより達成される。プログラムは、配列比較領域に対して特異的配列およびそれらのアミノ酸座標またはヌクレオチド座標を指定することによりかつプログラムパラメーターを指定することにより実行される。PILEUPを用いた場合、参照配列を他の試験配列と比較し、次のパラメーター：デフォルトギャップ加重(3.00)、デフォルトギャップ長加重(0.10)、および加重末端ギャップを用いて、配列同一性相関パーセントを決定する。PILEUPは、GCG配列解析ソフトウェアパッケージ、たとえば、バージョン7.0（Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)）から入手可能である。
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの他の例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントしたときに、なんらかの正値の閾値スコアTに一致するかまたはそれを満足する、クエリー配列中の長さWのショートワードを同定することにより、最初に、高スコア配列対（HSP）を同定することを含む。Tは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al., supra）。これらの初期の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いHSPを見いだすための検索を開始するためのシードの役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大されうるかぎり、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。ヌクレオチド配列に対しては、パラメーターM（マッチ残基対に対するリウォードスコア；常に>0）およびN（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に<0）を用いて累積スコアを計算する。アミノ酸配列に対しては、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。それぞれの方向へのワードヒットの伸長は、次の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ減少した場合；1つ以上の負スコア残基アライメントが蓄積して累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、11というワード長（W）、10という期待値（E）、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に対して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3というワード長、10という期待値（E）、および50というBLOSUM62スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい）アライメント数（B）、10という期待値（E）、M=5、N=-4、ならびに両鎖の比較を使用する。
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計解析をも行う（たとえば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は、2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標となる最小合計確率（P(N)）である。たとえば、検査核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満であるならば、核酸は、参照配列に類似しているとみなされる。
ポリヌクレオチド組成物
本明細書中で用いられる場合、「DNAセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語は、特定の種の全ゲノムDNAを含まないように単離されたDNA分子を意味する。したがって、ポリペプチドをコードするDNAセグメントとは、1つ以上のコード配列を含有するがDNAセグメントの取得源の種の全ゲノムDNAを除いて実質的に単離されたかまたはそれを含まないように精製されたDNAセグメントを意味する。「DNAセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語に包含されるのは、DNAセグメントおよびそのようなセグメントのより小さい断片、さらには組換えベクター、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどである。
当業者であればわかるであろうが、本発明に係るDNAセグメントとしては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するかまたはそれらを発現するように適合化されうる、ゲノム配列、ゲノム以外の配列、およびプラスミドにコードされた配列、ならびに工学的に作製されたより小さい遺伝子セグメントが挙げられうる。そのようなセグメントは、人の手を経て天然から単離可能または合成的に修飾可能である。
したがって、「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で見いだされたときに通常それに付随する成分を実質的もしくは本質的に含まない材料を意味する。当然ながら、これは、最初に単離されたDNAセグメントを意味するが、その後で人の手を経て組成物に添加された他の単離されたタンパク質、遺伝子、またはコード領域を除外するものではない。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する主要種のタンパク質は、実質的に精製されている。単離された核酸は、その遺伝子にフランキングしかつその遺伝子以外のタンパク質をコードする他のオープンリーディングフレームから分離されている。
当業者には当然のことであろうが、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、DNA分子（ゲノム、cDNA、もしくは合成）であってもRNA分子であってもよい。RNA分子としては、イントロンを含有してDNA分子と一対一に対応するHnRNA分子およびイントロンを含有しないmRNA分子が挙げられる。追加のコード配列または非コード配列は、本発明に係るポリヌクレオチド中に存在可能であるが、その必要があるとはかぎらず、また、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または担体材料に連結可能であるが、その必要があるとはかぎらない。
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、クラミジア抗原またはその一部分をコードする内因性配列）を含みうるか、あるいはそのような配列の変異体または生物学的機能性等価体もしくは抗原的機能性等価体を含みうる。以下でさらに説明されるように、ポリヌクレオチド変異体は、好ましくはコードされたポリペプチドの免疫原性が低減されないように、1つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有しうる。コードされたポリペプチドの免疫原性に及ぼす影響は、一般的には、本明細書に記載されるように評価可能である。「変異体」という用語はまた、異種起源の相同遺伝子をも包含する。
さらなる実施形態では、本発明は、本明細書中に開示された1つ以上の配列と同一のもしくはそれに相補的な種々の長さの一つながりの連続配列を含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを利用する。たとえば、本明細書中に開示された配列の1つ以上よりなる少なくとも約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、もしくは1000個またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含む、さらにはそれらの間のすべての中間の長さを有する、ポリヌクレオチド。ごく当然のことであろうが、これに関連して用いられる「中間の長さ」とは、見積り値の間の任意の長さを意味し、たとえば、16、17、18、19など；21、22、23など；30、31、32など；50、51、52、53など；100、101、102、103など；150、151、152、153などであり、200〜500；500〜1,000などにわたるすべての整数が包含される。
ポリヌクレオチドまたはその断片は、コード配列自体の長さにかかわらず、他のDNA配列、たとえば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどと結合可能であり、結果的に、それらの全長は著しく異なったものになりうる。したがって、ほぼ任意の長さの核酸断片を利用しうると考えられ、全長は、好ましくは、意図される組換えDNAプロトコルでの調製および使用の容易さによって決まる。たとえば、約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50塩基対長など（すべての中間の長さを包含する）の全長を有する例示的DNAセグメントは、多くの実現形態に有用であると考えられる。
さらに、当業者であればわかるであろうが、遺伝暗号の縮重の結果として、本願のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在する。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、いずれの天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小限の相同性を保有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差に起因して生じるさまざまなポリヌクレオチド、たとえば、ヒトおよび／または霊長動物のコドン選択に関して最適化されたポリヌクレオチドは、特に利用可能であると考えられる。さらに、本明細書中で規定されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子もまた有用である。対立遺伝子とは、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換のような1つ以上の突然変異の結果として改変された内在性遺伝子のことである。得られるmRNAおよびタンパク質は、改変された構造または機能を有しうるが、その必要があるとはかぎらない。対立遺伝子は、標準的技術（たとえば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を用いて同定可能である。
ポリヌクレオチドの同定および特徴付け
ポリヌクレオチドは、さまざまな十分に確立された技術のいずれかを用いて、同定、調製、および／または操作が可能である。たとえば、以下でさらに詳細に説明されるように、cDNAのマイクロアレイをスクリーニングすることにより、ポリヌクレオチドを同定することが可能である。そのようなスクリーニングは、たとえば、製造業者の使用説明書に従って（本質的には、Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619 (1996)およびHeller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155 (1997)に記載されるように）シンテニ（Synteni）マイクロアレイ（Palo Alto, CA）を用いて、実施可能である。他の選択肢として、本明細書中に記載のタンパク質を発現する細胞、たとえば、C・トラコマチス（C. trachomatis）細胞から調製されたcDNAからポリヌクレオチドを増幅することが可能である。そのようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介して増幅可能である。この手法のために、本明細書中で規定される配列に基づいて配列特異的プライマーをデザインすることが可能であり、そして購入または合成することが可能である。
ポリヌクレオチドの増幅された部分を用いて周知の技術により、好適なライブラリー（たとえば、C・トラコマチス（C. trachomatis）cDNAライブラリー）から全長遺伝子を単離することが可能である。そのような技術の範囲内で、ライブラリー（cDNAまたはゲノム）は、増幅に好適な1種以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きい分子を含むようにサイズが選択される。また、遺伝子の5'領域および上流領域を同定するために、ランダムプライムライブラリーが好ましいこともある。イントロンの取得および5'配列の伸長を行うには、ゲノムライブラリーが好ましい。
ハイブリダイゼーション技術のために、周知の技術を用いて部分配列を標識することが可能である（たとえば、32Pを用いてニックトランスレーションまたは末端標識化を行うことにより）。次に、一般的には、変性細菌コロニーを含有するフィルター（またはファージプラークを含有する細菌ローン）に標識化プローブをハイブリダイズすることにより、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーをスクリーニングする（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)を参照されたい）。ハイブリダイズ性のコロニーまたはプラークを選択して増殖し、そのDNAを単離してさらなる分析に供する。たとえば、部分配列由来のプライマーとベクター由来のプライマーとを用いるPCRにより、cDNAクローンを分析して追加の配列の量を決定することが可能である。制限地図および部分配列を生成し、1種以上のオーバーラップクローンを同定することが可能である。次に、一連の欠失クローンの生成を含みうる標準的技術を用いて全配列を決定することが可能である。次に、得られたオーバーラップ配列を単一の連続配列に組み立てることが可能である。周知の技術を用いて好適な断片をライゲートすることにより、全長cDNA分子を生成することが可能である。
他の選択肢として、部分cDNA配列から全長コード配列を取得するための多数の増幅技術が存在する。そのような技術の範囲内では、増幅は、一般的にはPCRにより行われる。さまざまな市販のキットのいずれかを用いて、増幅工程を行うことが可能である。プライマーは、たとえば、当技術分野で周知のソフトウェアを用いて、デザイン可能である。プライマーは、好ましくは、22〜30ヌクレオチド長であり、少なくとも50%のGC含有率を有し、かつ約68℃〜72℃の温度の標的配列にアニールする。増幅された領域を先に記載されるように配列決定し、オーバーラップ配列を連続配列に組み立てることが可能である。
そのような増幅技術の1つは、遺伝子の既知の領域中に断片を生成するように制限酵素を使用するインバースPCRである（Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)を参照されたい）。次に、分子内ライゲーションにより断片を環状化させ、既知の領域に由来するダイバージェント（divergent）プライマーを用いるPCR用の鋳型として使用する。代替的手法の範囲内で、リンカー配列に対するプライマーと既知の領域に特異的なプライマーとを用いて増幅を行うことにより、部分配列に隣接する配列を読み出すことが可能である。増幅された配列は、典型的には、同一のリンカープライマーと既知の領域に特異的な第2のプライマーとを用いる第2ラウンドの増幅に付される。既知の配列から両方向に伸長を開始する2種のプライマーを利用するこの手順の変法がWO 96/38591に記載されている。他のそのような技術は、「cDNA末端の迅速増幅」またはRACEとして知られる。この技術は、既知の配列の3'側および5'側にある配列を同定するために内部プライマーおよび外部プライマー（ポリA領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。そのほかの技術としては、キャプチャーPCR（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19 (1991)）およびウォーキングPCR（Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60 (1991)）が挙げられる。増幅を利用する他の方法を利用して、全長cDNA配列を取得することも可能である。
特定の場合には、発現配列タグ（EST）データベースに規定される配列、たとえば、GenBankから入手可能な配列を分析することにより、全長cDNA配列を取得することが可能である。一般的には、周知のプログラム（たとえば、NCBI BLAST検索）を用いてオーバーラップESTの検索を行うことが可能であり、そのようなESTを用いて連続した全長配列を生成することが可能である。ゲノム断片の解析により全長DNA配列を取得することも可能である。
宿主細胞内でのポリヌクレオチド発現
ポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価体をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子の形態で使用して適切な宿主細胞内でポリペプチドの発現を誘導することが可能である。遺伝暗号の固有の縮重性に基づいて、実質的に同一のもしくは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を作製することが可能であり、こうした配列を用いて所与のポリペプチドのクローニングおよび発現を行うことが可能である。
当業者であればわかるであろうが、いくつかの場合には、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利なこともある。たとえば、タンパク質発現の速度を増大させたりまたは望ましい性質（たとえば、天然に存在する配列から産生された転写産物よりも長い半減期）を有する組換えRNA転写産物を産生したりするために、特定の原核宿主または真核宿主に好適なコドンを選択することが可能である。
さらに、さまざまな理由でポリペプチドコード配列を変更すべく、たとえば、限定されるものではないが、クローニング、プロセシング、および／または遺伝子産物の発現を改変する変更を行うべく、当技術分野で広く知られる方法を用いてポリヌクレオチド配列を工学的に作製することが可能である。たとえば、遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化およびPCR再構築によるDNAシャッフリングを用いて、ヌクレオチド配列を工学的に作製することが可能である。そのほかに、部位特異的突然変異誘発を用いて、新しい制限部位を挿入したり、グリコシル化パターンを変更したり、コドン選択性を変化させたり、スプライス変異体を生成したり、または突然変異を導入したりすることなどが可能である。
天然、改変、もしくは組換えの核酸配列は、融合タンパク質をコードするように異種配列にライゲート可能である。たとえば、ポリペプチド活性の阻害剤に関してペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識可能なキメラタンパク質をコードすることが有用なこともある。また、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含有するように融合タンパク質を工学的に作製することも可能であり、その結果、ポリペプチドを切断して異種部分を除いて精製することが可能になる。
所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドまたはその機能的等価体をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター中に、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター中に挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、対象のポリペプチドをコードする配列と適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントとを含有する発現ベクターを構築することが可能である。こうした方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術については、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。
ポリヌクレオチド配列を含有しかつそれを発現させるように、さまざまな発現ベクター／宿主系を利用することが可能である。こうしたものとしては、バクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドの組換えDNA発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（たとえば、TiもしくはpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を行うように宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強度および特異性がさまざまでありうる。利用されるベクター系および宿主に依存して、任意の個数の好適な転写エレメントおよび翻訳エレメント、たとえば、構成プロモーターおよび誘導プロモーターを使用することが可能である。たとえば、細菌系でクローニングする場合、PBLUESCRIPTファージミド（Stratagene, La Jolla, Calif.）またはPSPORT1プラスミド（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）のハイブリッドlacZプロモーターなどのような誘導プロモーターを使用することが可能である。哺乳動物細胞系では、一般的には、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多重コピーを含有する細胞系を生成することが必要な場合、SV40またはEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に有利に使用することが可能である。
細菌系では、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して、多数の発現ベクターを選択することが可能である。たとえば、抗体の誘導などのために大量に必要とされる場合、精製の容易な融合タンパク質の高レベルの発現を指令するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターとしては、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、対象のポリペプチドをコードする配列を、アミノ末端Metおよびそれに続く7個のβ-ガラクトシダーゼ残基に対する配列と共に、インフレームでベクター中にライゲートすることが可能なBLUESCRIPT（Stratagene）のような多機能性E.コリ（E. coli）クローニング・発現ベクター；pINベクター（Van Heeke &Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)）；などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために、pGEXベクター（Promega, Madison, Wis.）を使用することも可能である。一般的には、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着それに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出により溶解細胞から容易に精製可能である。そのような系で作製されるタンパク質は、対象のクローン化ポリペプチドをGST部分から自在に放出できるように、ヘパリン、トロンビン、または第XA因子プロテアーゼの切断部位を含むようにデザイン可能である。
酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGHのような構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含有する多数のベクターを使用することが可能である。構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有する他のベクターとしては、GAP、PGK、GAL、およびADHが挙げられる。総説に関しては、Ausubel et al. (supra), Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)およびRomas et al. Yeast 8 423-88 (1992)を参照されたい。
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現を多数のプロモーターのいずれかにより駆動することが可能である。たとえば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターのようなウイルスプロモーターを単独でまたはTMVに由来するΩリーダー配列と組み合わせて使用することが可能である（Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)）。他の選択肢として、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することが可能である（Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984);およびWinter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)）。こうした構築物は、直接的DNA形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入可能である。そのような技術については、いくつかの一般に利用可能な総説に記載されている（たとえば、Hobbs in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology pp. 191-196 (1992)を参照されたい）。
昆虫系を用いて対象のポリペプチドを発現させることも可能である。たとえば、そのような系の1つでは、アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）をベクターとして使用してスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞内またはトリコプルシア・ラルバエ（Trichoplusia larvae）細胞内で外来遺伝子を発現させる。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域中にクローニング可能であり、かつポリヘドリンプロモーターの制御下に配置可能である。ポリペプチドコード配列がうまく挿入されれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質の欠如した組換えウイルスが生成されるであろう。次に、組換えウイルスを用いて、たとえば、対象のポリペプチドの発現が可能なS.フルギペルダ（S. frugiperda）細胞またはトリコプルシア・ラルバエ（Trichoplusia larvae）細胞に感染させることが可能である（Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)）。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系が一般的に利用可能である。たとえば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターとトリパータイトリーダー配列とよりなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲート可能である。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域中への挿入を利用して、感染宿主細胞内でポリペプチドを発現しうる生存可能なウイルスを取得することが可能である（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)）。そのほかに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞内での発現を増大させることが可能である。
特定の開始シグナルを用いて、対象のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することも可能である。そのようなシグナルとしては、ATG開始コドンおよびその隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列とその開始コドンと上流配列とを適切な発現ベクター中に挿入する場合、追加の転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列またはその一部分だけを挿入する場合、ATG開始コドンをはじめとする外因性翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらに、全インサートの翻訳を保証するために、開始コドンを適正なリーディングフレームで存在させなければならない。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然起源および合成起源の両方）でありうる。使用される特定の細胞系に適合するエンハンサー、たとえば、文献（Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)）に記載のエンハンサーを組み込むことにより、発現の効率を向上させることか可能である。
そのほかに、挿入配列の発現をモジュレートしたりまたは発現タンパク質を所望の形でプロセシングしたりする能力に関して、宿主細胞株を選択することが可能である。ポリペプチドのそのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、適正な挿入、折畳み、および／または機能を促進することも可能である。外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを保証するために、そのような翻訳後活性に適した特定の細胞機構および特徴的な機序を有するCHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38のようなさまざまな宿主細胞を選択することが可能である。
組換えタンパク質を長期間にわたり高収率で生産するために、安定な発現が一般に好ましい。たとえば、ウイルス性複製起点および／または内因性発現エレメントならびに選択性マーカー遺伝子を同一のベクター上または個別のベクター上に含有しうる発現ベクターを用いて、対象のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞系を形質転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に交換する前に富化培地で細胞を1〜2日間増殖させることが可能である。選択性マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在により、導入配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能になる。細胞タイプに適合した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させることが可能である。
形質転換された細胞系を回収するために、任意の数の選択系を使用することが可能である。こうしたものとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler et al., Cell 11:223-32 (1977)）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy et al., Cell 22:817-23 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの遺伝子は、それぞれ、tk.sup.-細胞またはaprt.sup.-細胞で利用可能である。また、抗代謝剤耐性、抗生物質耐性、または除草剤耐性を選択の基準として使用することも可能である。たとえば、メトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)）；アミノグリコシド、ネオマイシン、およびG-418に対する耐性を付与するnpt（Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)）；ならびにクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ付与するalsまたはpat（Murry, supra）。そのほかの選択可能な遺伝子が報告されている。たとえば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノール（histinol）を利用できようにするhisD（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)）。最近、観察可能なマーカーの使用が一般的になってきており、アントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質GUS、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンのようなマーカーは、トランスフォーマントを同定するためにだけでなく特定のベクター系に起因する一過的もしくは安定的なタンパク質発現の量を定量化するためにも広く使用されている（Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)）。
マーカー遺伝子発現の存在／不在により対象の遺伝子もまた存在することが示唆されるが、その存在および発現の確認が必要になることもある。たとえば、ポリペプチドをコードする配列をマーカー遺伝子配列中に挿入した場合、マーカー遺伝子機能の不在により、配列を含有する組換え細胞を同定することが可能である。他の選択肢として、マーカー遺伝子を単一のプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列とタンデムに配置することが可能である。誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、同様にタンデム遺伝子も発現されたことを示唆する。
他の選択肢として、当業者に公知のさまざまな手順により、所望のポリヌクレオチド配列を含有しかつそれを発現させる宿主細胞を同定することが可能である。こうした手順としては、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、およびタンパク質のバイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらは、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を含む。
産物に特異的なポリクロナール抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、ポリヌクレオチドにコードされた産物の発現を検出および測定するためのさまざまなプロトコルが、当技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および蛍光活性化細胞選別（FACS）が挙げられる。所与のポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースのイムノアッセイがいくつかの用途に好ましいこともあるが、競合結合アッセイもまた利用可能である。これらのおよび他のアッセイについては、特に、Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) and Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)に記載されている。
多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイで使用可能である。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプローブを産生するための手段としては、標識化ヌクレオチドを用いる、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、またはPCR増幅が挙げられる。他の選択肢として、mRNAプローブを産生するために、配列またはその任意の一部分をベクター中にクローニングすることが可能である。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、かつT7、T3、またはSP6のような適切なRNAポリメラーゼと標識化ヌクレオチドとを添加することによりin vitroでRNAプローブを合成するために使用可能である。こうした手順は、さまざまな市販のキットを用いて実施可能である。使用しうる好適なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤、さらには基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
対象のポリヌクレオチド配列を用いて形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養可能である。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、分泌されうるかまたは細胞内に含有されうる。当業者であればわかるであろうが、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介するコードされたポリペプチドの分泌を指令するシグナル配列を含有するようにデザイン可能である。対象のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結するために、他の組換え構築物を使用することが可能である。そのような精製を容易にするドメインとしては、金属キレート形成ペプチド、たとえば、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle, Wash.）で利用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。精製を容易にするために、精製ドメインとコードされたポリペプチドとの間に切断可能リンカー配列、たとえば、第XA因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Invitrogen. San Diego, Calif.）を組み込むことが利用可能である。そのような発現ベクターの1つは、対象のポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現を提供するとともに、チオレドキシンに先行する6個のヒスチジン残基またはエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を提供する。ヒスチジン残基は、Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3:263-281 (1992)に記載されるようにIMIAC（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供している。融合タンパク質を含有するベクターに関する考察は、Kroll et al., DNA Cell Biol. 12:441-453 (1993))に提供されている。
in vivoポリヌクレオチド送達技術
そのほかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物は、in vivoで細胞内に導入される。これは、さまざまなもしくは周知の手法のいずれかを用いて達成可能である。そのうちのいくつかを例示を目的として以下で概説する。
1．アデノウイルス
1つ以上の核酸配列をin vivo送達するための好ましい方法の1つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。「アデノウイルス発現ベクター」は、（a）構築物のパッケージングの支援および（b）センス配向もしくはアンチセンス配向でクローニングされたポリヌクレオチドの発現、を行うのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を包含するものとする。当然ながら、アンチセンス構築物に関しては、発現によりその遺伝子産物を合成する必要はない。
発現ベクターは、遺伝子工学処理された形態のアデノウイルスを含む。36kbの線状二本鎖DNAウイルスであるというアデノウイルスの遺伝子構成に関する知見から、アデノウイルスDNAの大きい断片を7kbまでの外来配列で置換可能である（Grunhaus & Horwitz, 1992）。レトロウイルスとは対照的に、遺伝毒性を生じる可能性のないエピソーム方式でアデノウイルスDNAを複製しうるので、宿主細胞がアデノウイルス感染を受けても染色体内組込みは起こらない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大量の増幅の後でゲノム再配列は検出されていない。アデノウイルスは、実質上すべての上皮細胞にその細胞周期段階に関係なく感染しうる。これまでのところ、アデノウイルス感染は、ヒトでは急性呼吸器疾患のような軽度の疾患にのみ関係しているように思われる。
アデノウイルスは、そのゲノムが中サイズであり、取扱いが容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広く、かつ感染性が高いので、遺伝子移入ベクターとして使用するのに特に好適である。ウイルスゲノムの両末端は、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである100〜200塩基対の逆方向反復配列（ITR）を含有する。ゲノムの初期（E）領域および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始により分けられる異なる転写ユニットを含有する。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写のレギュレーションに関与するタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現により、ウイルスDNA複製用のタンパク質の合成が引き起こされる。こうしたタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Renan, 1990）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子産物は、主要後期プロモーター（MLP）により発生された単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後でのみ発現される。MLP（16.8m.u.に位置する）は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターにより発生されたmRNAはすべて、翻訳に好ましいmRNAになるようにするトリパータイトリーダー（TPL）配列を有する。
現行システムでは、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同的組換えから生成される。2つのプロウイルスベクター間で組換えが起こりうるので、この過程から野生型アデノウイルスが生成される可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離しかつそのゲノム構造を調べることがきわめて重要である。
複製欠陥性の現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によりヒト胚腎臓細胞から形質転換されかつE1タンパク質を構成的に発現する293と称される特有のヘルパー細胞系に依存する（Graham et al., 1977）。E3領域はアデノウイルスゲノムになくてもすむので（Jones & Shenk, 1978）、293細胞の支援を受ける現行のアデノウイルスベクターは、E1領域、D3領域、またはその両方の領域に外来DNAを有しうる（Graham & Prevec, 1991）。性質上、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105%をパッケージングしうるので（Ghosh-Choudhury et al., 1987）、約2kB余分のDNAの収容能力を提供する。E1およびE3領域に置換可能な約5.5kBのDNAと組み合わせると、現行のアデノウイルスベクターの最大収容能力は、7.5kB未満すなわちベクターの全長の約15%未満である。アデノウイルスウイルスゲノムの80%超は、ベクター骨格中に残存し、ベクター媒介細胞傷害性の原因となる。また、E1欠失ウイルスの複製欠陥は不完全である。たとえば、現在入手可能なベクターを用いたときにウイルス遺伝子発現の漏出が高い感染多重度（MOI）で観測されている（Mulligan, 1993）。
ヘルパー細胞系は、ヒト胚性の腎臓細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胚性の間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞に由来しうる。他の選択肢として、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来しうる。そのような細胞としては、たとえば、ベロ細胞または他のサル胚性の間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。以上に述べたように、現時点で好ましいヘルパー細胞系は293である。
最近、Racher et al. (1995)には、293細胞の培養およびアデノウイルスの増殖を行うための改良された方法が開示された。一方式では、100〜200mlの培地の入った1リットルのシリコン処理スピンナーフラスコ（Techne, Cambridge, UK）中に個々の細胞を接種することにより、天然細胞集合体を増殖させる。40rpmで攪拌した後、トリパンブルーを用いて細胞生存能を推定する。他の方式では、フィブラ-セル（Fibra-Cel）マイクロ担体（Bibby Sterlin, Stone, UK）（5g/l）を次のように利用する。5mlの培地中に再懸濁された細胞接種物を250mlエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコ中の担体（50ml）に添加し、ときどき攪拌して1〜4時間静置する。次に、培地を50mlの新しい培地と交換し、振盪を開始する。ウイルス生産のために、細胞を約80%の集密度になるまで増殖させ、その後、培地を交換し（最終体積の25%まで）、そして0.05のMOIでアデノウイルスを添加する。培養物を一晩静置し、その後、体積を100%まで増大させて、さらに72時間にわたり振盪を行う。
アデノウイルスベクターが複製欠陥性もしくは少なくとも条件付き欠損性であるという要件以外は、アデノウイルスベクターの性質は、本発明をうまく実施するうえでそれほど重要であるとは考えられない。アデノウイルスは、42種の異なる既知の血清型またはサブグループ（A〜F）のいずれであってもよい。5型アデノウイルスは、非常に多くの生化学的および遺伝学的な情報が知られているヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして利用するほとんどの構築物に以前から使用されているので、サブグループCの5型アデノウイルスは、本発明で使用するための条件付き複製欠陥アデノウイルスベクターを得るために好ましい出発原料である。
以上に述べたように、本発明に係る典型的なベクターは、複製欠陥性であり、アデノウイルスE1領域を有していないであろう。したがって、対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドをE1コード配列が除去された位置に導入するのが最も便利であろう。しかしながら、アデノウイルス配列中の構築物の挿入位置は、本発明にそれほど重要ではない。対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、Karlsson et al. (1986)に記載されるようにE3置換ベクター中の欠失E3領域の代わりに挿入したりまたはヘルパー細胞系もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補完する場合にはE4領域中に挿入したりすることも可能である。
アデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、in vitroおよびin vivoで広い宿主域を呈する。このグループのウイルスは、高い力価で、たとえば、1mlあたり109〜1011プラーク形成単位で取得可能であり、かつきわめて感染性が高い。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノム中への組込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子は、エピソーム性であり、したがって、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の試験で副作用は報告されていないことから（Couch et al., 1963; Top et al., 1971）、in vivo遺伝子移入ベクターとしてのその安全および治療的可能性が実証される。
アデノウイルスベクターは、真核遺伝子発現（Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992）およびワクチン開発（Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992）に使用されてきた。最近、動物試験により、組換えアデノウイルスが遺伝子療法に使用可能であることが示唆された（Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993）。さまざまな組織に組換えアデノウイルスを投与する試験としては、気管点滴注入（Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992）、筋肉注射（Ragot et al., 1993）、末梢静脈内注射（Herz & Gerard, 1993）、および脳内への定位接種（Le Gal La Salle et al., 1993）が挙げられる。
2．レトロウイルス
レトロウイルスは、そのRNAを感染細胞内で逆転写過程により二本鎖DNAに変換する能力により特徴付けられる一群の一本鎖RNAウイルスである（Coffin, 1990）。次に、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体中に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。組込みにより、ウイルス遺伝子配列はレシピエント細胞内およびその子孫細胞内に保持される。レトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3つの遺伝子gag、pol、およびenvを含有する。gag遺伝子の上流に見いだされた配列は、ビリオン中へのゲノムのパッケージングのシグナルを含有する。2つの長末端反復配列（LTR）配列がウイルスゲノムの5'末端および3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノム中への組込みに必要とされる（Coffin, 1990）。
レトロウイルスベクターを構築するために、対象の1つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、複製欠陥性のウイルスを産生するように特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入される。ビリオンを生成するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含有するがLTR成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系を構築する（Mann et al., 1983）。レトロウイルスのLTR配列およびパッケージング配列と一緒にcDNAを含有する組換えプラスミドをこの細胞系に導入した場合（たとえば、リン酸カルシウム沈殿により）、パッケージング配列により組換えプラスミドのRNA転写産物がウイルス粒子中にパッケージングされ、次に、ウイルス粒子が培地中に分泌される（Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983）。次に、組換えレトロウイルスを含有する培地を集め、場合により濃縮し、そして遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、広範にわたるさまざまな細胞タイプに感染可能である。しかしながら、組込みおよび安定な発現を行うには、宿主細胞（Paskind et al., 1975）の分裂が必要である。
ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするようにデザインされた新規な手法が最近開発された。この修飾により、シアロ糖タンパク質レセプターを介する肝細胞への特異的感染が可能になった。
組換えレトロウイルスのターゲッティングを行う手法がデザインされた。この手法では、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特異的細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。抗体は、ストレプトアビジン（Roux et al., 1989）を用いてビオチン成分を介して結合された。彼らは、主要組織適合複合体のクラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を用いて、そうした表面抗原を有するさまざまなヒト細胞にエコトロピックウイルスがin vitroで感染することを実証した（Roux et al., 1989）。
3．アデノ随伴ウイルス
AAV（Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984）は、アデノウイルスストックの汚染物として見いだされたパルボウイルス（parovirus）である。それは、いかなる疾患にも関係しない遍在性ウイルス（抗体は米国の人口の85%に存在する）である。また、それは、その複製がアデノウイルスのようなヘルパーウイルスの存在に依存性するのでディペンドウイルスに分類される。5つの血清型が単離されており、そのうちAAV-2が最もよく特徴付けられている。AAVは、キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3中にキャプシド被包されて直径20〜24nmの正二十面体ビリオンを形成する一本鎖線状DNAを有する（Muzyczka & McLaughlin, 1988）。
AAV DNAは、約4.7キロ塩基長である。それは、2つのオープンリーディングフレームを含有し、2つのITRによりフランキングされる。AAVゲノム中には2つの主働遺伝子：repおよびcapが存在する。rep遺伝子は、ウイルスの複製に関与するタンパク質をコードし、一方、capは、キャプシドタンパク質VP1〜3をコードする。各ITRは、T形ヘアピン構造を形成する。これらの末端反復は、染色体内組込みに関してのみAAVの必須シス成分であるにすぎない。したがって、すべてのウイルスコード配列を除去して送達用の遺伝子のカセットと交換した状態でAAVをベクターとして使用することが可能である。3つのウイルスプロモーターが同定され、それらの地図位置に従ってp5、p19、およびp40と命名されている。p5およびp19に基づく転写によりrepタンパク質が産生され、p40に基づく転写によりキャプシドタンパク質が産生される（Hermonat & Muzyczka, 1984）。
発現ベクターとしてrAAVを使用できる可能性を調べるように研究者に拍車をかけたいくつかの要因が存在する。その1つは、宿主染色体中に組み込むように遺伝子を送達するのに必要な要件が驚くほどわずかであるということである。AAVゲノムのわずか6%にすぎない145bp ITRを有することが必要とされる。このため、4.5kb DNA挿入断片を集合する余地がベクター中に残る。この運搬能ではAAVによる大きい遺伝子の送達はできない可能性があるが、アンチセンス構築物を送達するには十分適している。
AAVはまた、その安全性から考えて送達媒体の良好な選択肢である。比較的複雑なレスキュー機序が存在し、野生型アデノウイルス遺伝子だけでなくAAV遺伝子もまた、rAAVを動員するのに必要とされる。さらに、AAVは、病原性がなく、いかなる疾患にも関係しない。ウイルスコード配列の除去によりウイルス遺伝子発現に対する免疫反応が最小限に抑えられるので、rAAVは炎症反応を引き起こさない。
4．発現構築物としての他のウイルスベクター
オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を宿主細胞に送達するために、他のウイルスベクターを発現構築物として本発明で利用することが可能である。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを利用することが可能である。鶏痘由来のベクターのような他のポックスウイルス由来のベクターもまた、有用であると予想されうる。それらは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990）。
欠損B型肝炎ウイルスが最近確認されたことに伴って、さまざまなウイルス配列の構造機能相関に関する新しい知見が得られた。このウイルスは、そのゲノムの80%まで欠失しているにもかかわらず、ヘルパー依存性のパッケージングおよび逆転写の能力を保持しうることが、in vitro試験から明らかにされた（Horwich et al., 1990）。このことから、ゲノムの大部分を外来遺伝物質と交換しうることが示唆された。向肝性および残留性（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入に特に魅力的な性質であった。Chang et al. (1991)では、ポリメラーゼ、表面、および前駆表面のコード配列の代わりにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子がアヒルB型肝炎ウイルスゲノム中に導入された。それは、野生型ウイルスを用いてトリ肝癌細胞系内に共トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含有する培地を用いて初代培養雛アヒル肝細胞に感染させた。安定なCAT遺伝子発現がトランスフェクション後の少なくとも24日間にわたり検出された（Chang et al., 1991）。
そのほかの「ウイルス」ベクターとしては、ウイルス様粒子（VLP）およびファージが挙げられる。
5．非ウイルスベクター
オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現を行うために、発現構築物を細胞内に送達しなければならない。この送達は、細胞系を形質転換する実験手順の場合にはin vitroで、または特定の疾患状態を治療する場合にはin vivoもしくはex vivoで、達成可能である。以上に記載したように、送達に好ましい一機序は、ウイルス感染を介するものであり、この場合、発現構築物は、感染性ウイルス粒子中にカプセル化される。
発現構築物が細胞内に送達された後、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、さまざまな部位に局在し発現されうる。特定の実施形態では、構築物をコードする核酸を細胞のゲノム中に安定に組み込むことが可能である。この組込みは、相同的組換えを介して特定の位置および配向で行われうるか(遺伝子置換)、またはランダムな不特定位置で組込みが行われうる(遺伝子増大)。さらに他の実施形態では、核酸は、DNAの個別のエピソームセグメントとして細胞内に安定に保持可能である。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期に依存せずにまたはそれと同期して維持および複製を行えるようにするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達されるかおよび細胞内のどこに核酸が保持されるかは、利用される発現構築物のタイプに依存する。
特定の実施形態では、1つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単純に裸の組換えDNAまたは裸の組換えプラスミドよりなりうる。構築物の移入は、細胞膜を物理的もしくは化学的に透過性にする以上で述べた方法のいずれかにより実施可能である。これは、in vitroでの移入に特に適用可能であるが、in vivoでの使用にも適用可能である。Dubensky et al. (1984)では、成体マウスおよび新生マウスの肝臓および脾臓にリン酸カルシウム沈殿の形態でうまく注射されたポリオーマウイルスDNAを用いて活性ウイルス複製および急性感染が実証された。Benvenisty & Reshef (1986)でもまた、リン酸カルシウム沈殿プラスミドを直接腹腔内注射することによりトランスフェクト遺伝子の発現を生じることが実証された。対象の遺伝子をコードするDNAを同様にin vivoで移入して遺伝子産物を発現することも可能性であると考えられる。
裸のDNA発現構築物を細胞内に移入するための本発明の他の実施形態は、粒子照射を含みうる。この方法は、DNA被覆微粒子弾を高速度に加速することにより死滅させることなく細胞膜を貫通して細胞に入る能力に依存する（Klein et al., 1987）。小粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の1つは、高電圧放電により電流を発生させて推進力を得ることに基づく（Yang et al., 1990）。使用される微粒子弾は、タングステンビーズや金ビーズのような生物学的に不活性な物質よりなりうる。
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋組織をはじめとする所定の器官にin vivoで照射が行われた（Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991）。これは、銃と標的器官との間に介在するいかなる組織をも排除するために、組織または細胞を外科的に露出させる処理、すなわち、ex vivo処理を必要とすることもある。また、特定の遺伝子をコードするDNAをこの方法を介して送達し、さらに組込みも行うことが可能である。
ポリペプチド組成物
一般的には、ポリペプチド組成物は、単離されたポリペプチドまたはその免疫原性断片の組合せであろう。他の選択肢として、本発明に係る組成物中のポリペプチド抗原の一部もしくは全部は、融合タンパク質中に存在しうる。たとえば、3つの抗原を含む本発明に係る組成物では、（i）3つの単離されたポリペプチドの形態で抗原を提供しうるか、（ii）3つのポリペプチド抗原をすべて、単一の融合タンパク質中に提供しうるか、（iii）抗原のうちの2つを融合タンパク質中に提供し、3つ目を単離された形態で提供しうる。組合せのタンパク質／ポリペプチドは、本明細書中に開示された1つもしくは複数のポリヌクレオチド配列または本明細書中に開示された1つもしくは複数のポリヌクレオチド配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする1つもしくは複数の配列によりコードされうる。他の選択肢として、タンパク質／ポリペプチドは、本明細書中に開示されたアミノ酸配列に由来する連続したアミノ酸配列（すなわち、本明細書中に開示された配列の免疫原性断片）を含むポリペプチドとしてそれぞれ規定されうるか、またはこのタンパク質／ポリペプチドは、それぞれ、本明細書中に開示された全アミノ酸配列を含む。
免疫原性部分は、一般的には、Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (1993)およびそこに引用されている参考文献にまとめられているような周知の技術を用いて同定可能である。そのような技術としては、抗原特異的な抗体、抗血清、および／またはT細胞系もしくはT細胞クローンと反応する能力に関してポリペプチドをスクリーニングすることが挙げられる。本明細書中で用いられる場合、抗血清および抗体は、抗原に特異的に結合するのであれば（すなわち、ELISAまたは他のイムノアッセイにおいてそのタンパク質と反応しかつ非関連タンパク質とは検出可能に反応しないのであれば）「抗原特異的」である。そのような抗血清および抗体は、本明細書に記載されるようにおよび周知の技術を用いて調製可能である。クラミジア（Chlamydia）属の種のタンパク質の免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルでそのような抗血清および／またはT細胞と反応する部分である（たとえば、ELISAおよび／またはT細胞反応性アッセイにおいて）。そのような免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性に類似したもしくはそれよりも高いレベルでそのようなアッセイにおいて反応しうる。そのようなスクリーニングは、一般的には、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)に記載されるような当業者に周知の方法を用いて実施可能である。たとえば、ポリペプチドを固体担体上に固定して、患者血清に接触させることにより、血清中の抗体を固定化ポリペプチドに結合させることが可能である。次に、未結合血清を除去し、そしてたとえば125Iで標識されたプロテインAを用いて結合抗体を検出することが可能である。
ポリペプチドは、さまざまな周知の技術のいずれかを用いて調製可能である。以上に記載したようなDNA配列によりコードされた組換えポリペプチドは、当業者に公知のさまざまな発現ベクターのいずれかを用いてDNA配列から容易に調製可能である。発現は、組換えポリペプチドをコードするDNA分子を含有する発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞内で達成可能である。好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、および高等真核生物の細胞、たとえば、哺乳動物細胞および植物細胞が挙げられる。好ましくは、利用される宿主細胞は、E.コリ（E. coli）、酵母、または哺乳動物の細胞系、たとえば、COSもしくはCHOである。最初に、市販のフィルターを用いて、組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培地中に分泌する好適な宿主／ベクター系に由来する上清を濃縮することが可能である。濃縮後、アフィニティーマトリックスやイオン交換樹脂のような好適な精製マトリックスに濃縮物を適用することが可能である。最後に、1回以上の逆相HPLC工程を利用して組換えポリペプチドをさらに精製することが可能である。
ポリペプチド、その免疫原性断片（たとえば、約100個未満のアミノ酸または約50個未満のアミノ酸を有しうる）は、当業者に周知の技術を用いて合成手段により生成可能である。たとえば、そのようなポリペプチドは、アミノ酸が伸長アミノ酸鎖に逐次的に付加されるメリフィールド（Merrifield）固相合成法などのような市販の固相技術のいずれかを用いて合成可能である。Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146 (1963)を参照されたい。ポリペプチドの自動合成用の装置は、Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA)のような供給業者から市販品として入手可能であり、製造業者の使用説明書に従って操作可能である。
ある特定の実施形態の範囲内では、ポリペプチドは、本明細書に記載されるような複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載されるような少なくとも1つのポリペプチドと既知のタンパク質のような非関連配列とを含む、融合タンパク質でありうる。そのような融合パートナーは、たとえば、Tヘルパーエピトープ、好ましくはヒトにより認識されるTヘルパーエピトープを提供するのを支援しうるか（免疫学的融合パートナー）、または天然の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現するのを支援しうる（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増大させるようにまたはタンパク質が所望の細胞内区画にターゲッティングされるように選択可能である。他のさらなる融合パートナーとしては、タンパク質の精製を容易にするアフィニティータグが挙げられる。
融合タンパク質は、一般的には、化学的コンジュゲーションをはじめとする標準的技術を用いて調製可能である。その際、融合タンパク質を組換えタンパク質として発現することが可能であり、それにより、発現系において非融合タンパク質に対して増大されたレベルの産生が可能になる。簡潔に述べると、ポリペプチド成分をコードするDNA配列を個別に集合させて、適切な発現ベクター中にライゲートすることが可能である。1つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3'末端を、第2のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5'末端に、配列のリーディングフレームが一致するように、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずにライゲートする。これにより、両方の成分ポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳が可能になる。典型的には、2つ以上の抗原を含む融合タンパク質では、第2の抗原および後続の抗原に由来する開始コドン（Met）を省略することが可能である。
各ポリペプチドがその二次構造および三次構造に折り畳まれるのを保証するのに十分な距離だけ第1および第2のポリペプチド成分を分離するために、ペプチドリンカー配列を利用することが可能である。そのようなペプチドリンカー配列は、当技術分野で周知の標準的技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、次の因子に基づいて選択可能である。（1）可撓性伸長コンフォメーションをとりうること、（2）第1および第2のポリペプチド上の機能性エピトープと相互作用可能な二次構造をとりえないこと、および（3）ポリペプチド機能性エピトープと反応する可能性のある疎水性残基や荷電残基を含まないこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly、Asn、およびSerの残基を含有する。ThrやAlaのような他のほぼ中性のアミノ酸もまた、リンカー配列に使用可能である。リンカーとして有効に利用しうるアミノ酸配列としては、Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); U.S. Patent No. 4,935,233 および U.S. Patent No. 4,751,180に開示されるものが挙げられる。リンカー配列は、一般的には、1〜約50アミノ酸長でありうる。第1および第2のポリペプチドが、機能性ドメインを分離しかつ立体障害を防止するように使用可能な非必須N末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は必要でない。
ライゲートされたDNA配列は、好適な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに機能しうる形で連結される。DNAの発現に関与する調節エレメントは、第1のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側にのみ配置される。同様に、翻訳および転写を終了するのに必要とされる停止コドンすなわち終止シグナルは、第2のポリペプチドをコードするDNA配列の3'側にのみ存在する。
したがって、本発明に係る組成物は、1つ以上の融合タンパク質を含みうる。そのようなタンパク質は、本明細書に記載されるような組成物のポリペプチド成分を非関連免疫原性タンパク質と一緒に含む。免疫原性タンパク質は、たとえば、再応答を引き起こしうるであろう。そのようなタンパク質の例としては、破傷風、結核、および肝炎のタンパク質が挙げられる（たとえば、Stoute et al., New Engl. J. Med. 336:86-91 (1997)を参照されたい）。
特定の実施形態の範囲内では、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌ヘモフィラス・インフルエンザB（Haemophilus influenza B）の表面タンパク質であるプロテインDに由来する（WO 91/18926）。プロテインD誘導体は、タンパク質の最初の約1/3（たとえば、N末端の最初の100〜110個のアミノ酸）を含みうる。また、プロテインD誘導体は、脂質化されていてもよい。特定の実施形態の範囲内では、リポプロテインD融合パートナーの最初の109個の残基は、追加の外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するために、およびE.コリ（E. coli）中での発現レベルを増大させるために（したがって、発現エンハンサーとして機能させるために）、N末端に付加される。脂質テールは、抗原提示細胞に対して抗原の最適提示を保証する。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルスに由来する非構造タンパク質NS1（赤血球凝集素）が挙げられる。典型的には、N末端の81個のアミノ酸が使用されるが、T-ヘルパーエピトープを含むさまざまな断片が使用可能である。
他の実施形態では、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質またはその一部分（好ましくはC末端部分）である。LYTAは、アミダーゼLYTA（LytA遺伝子によりコードされる；Gene 43:265-292 (1986)）として知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成するストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンに対する親和性またはDEAEのようないくつかのコリン類似体に対する親和性に関与する。この性質は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するE.コリ（E. coli）C-LYTAの開発に活用されてきた。アミノ末端にC-LYTA断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製が報告されている（Biotechnology 10:795-798 (1992)を参照されたい）。好ましい実施形態の範囲内では、LYTAの反復部分を融合タンパク質中に組み込むことが可能である。反復部分は、残基178から始まるC末端領域中に見いだされる。特に好ましい反復部分は、残基188〜305を含む。
一般的には、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を包含する）およびポリヌクレオチドは、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その元の環境から取り出されたもののことである。たとえば、天然に存在するタンパク質は、自然界で共存する物質の一部もしくは全部から分離されていれば、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドは、少なくとも約90%の純度、より好ましくは少なくとも約95%の純度、最も好ましくは少なくとも約99%の純度である。ポリヌクレオチドは、たとえば、自然環境の一部でないベクター中にクローニングされていれば、単離されているとみなされる。
T細胞
免疫療法組成物は、追加としてもしくは他の選択肢として、クラミジア抗原に特異的なT細胞を含みうる。そのような細胞は、一般的には、標準的手順を用いてin vitroもしくはex vivoで調製可能である。たとえば、T細胞は、ネクセル・セラピューティクス（Nexell Therapeutics）社（Irvine, CA; U.S. Patent No. 5,240,856; U.S. Patent No. 5,215,926; WO 89/06280; WO 91/16116 および WO 92/07243も参照されたい）から入手可能なアイソレックスTMシステム（IsolexTM System）のような市販の細胞分離システムを用いて、患者の骨髄もしくは末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分から単離可能である。他の選択肢として、T細胞は、関連または非関連のヒトまたは非ヒト哺乳動物の細胞系または細胞培養物に由来しうる。
T細胞は、ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（APC）を用いて刺激可能である。そのような刺激は、ポリペプチドに特異的なT細胞の生成を可能にするのに十分な条件下でかつ十分な時間をかけて行われる。好ましくは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特異的T細胞の生成を容易にするためにマイクロスフェアのような送達媒体中に存在する。
T細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはポリペプチドで被覆された標的細胞もしくはポリペプチドをコードする遺伝子を発現させる標的細胞を死滅させるのであれば、T細胞は、ポリペプチドに特異的であるとみなされる。T細胞の特異性は、さまざまな標準的技術のいずれかを用いて評価可能である。たとえば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイの範囲内では、陰性対照と比較して溶解および／または増殖に関して2倍超に増加した刺激指数は、T細胞の特異性の指標となる。そのようなアッセイは、たとえば、Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)に記載されるように実施可能である。他の選択肢として、T細胞の増殖の検出は、さまざまな公知の技術により達成可能である。たとえば、T細胞増殖は、DNA合成速度の増加を測定することにより（たとえば、T細胞の培養物をトリチウム化チミジンでパルス標識してDNA中に組み込まれたトリチウム化チミジンの量の測定することにより）、検出可能である。3〜7日間にわたりポリペプチド（100ng/ml〜100μg/ml、好ましくは200ng/ml〜25μg/ml）に接触させれば、T細胞の増殖が少なくとも2倍に増加するはずである。2〜3時間にわたり以上に記載したように接触させれば、T細胞が活性化されるはずであり、標準的サイトカインアッセイを用いて測定した場合、2倍に増加したサイトカイン放出（たとえば、TNFまたはIFN-γ）レベルは、T細胞活性化の指標となる（Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)を参照されたい）。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド発現APCに応答して活性化されたT細胞は、CD4+および／またはCD8+でありうる。タンパク質特異的T細胞は、標準的技術を用いて増殖可能である。好ましい実施形態の範囲内では、T細胞は、患者、関連ドナー、または非関連ドナーに由来し、刺激および増殖の後で患者に投与される。
治療の目的では、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはAPC、に応答して増殖するCD4+もしくはCD8+のT細胞は、in vitroもしくはin vivoのいずれかで数を増加させることが可能である。そのようなT細胞のin vitro増殖は、さまざまな方法で達成可能である。たとえば、インターロイキン2のようなT細胞増殖因子、および／またはポリペプチドを合成する刺激細胞、の添加を行ってまたは行わずに、ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに、T細胞を再暴露することが可能である。他の選択肢として、タンパク質の存在下で増殖する1つ以上のT細胞は、クローニングにより数を増加させることが可能である。細胞のクローニング方法は、当技術分野で周知であり、例としては、限界希釈法が挙げられる。
医薬組成物
そのほかの実施形態では、本明細書中に開示されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、T細胞、および／または抗体の組成物は、単独または1つ以上の他の治療方式との組合せのいずれかで細胞または動物に投与するために、製薬上許容されるかもしくは生理学上許容される溶液中に製剤化されるであろう。
また、当然のことであろうが、所望により、本明細書中に開示されるようなポリペプチドの組成物を発現する核酸セグメント（RNA、DNA、またはPNA）組成物は、他の作用剤、たとえば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の医薬活性剤などと組み合わせて投与することも可能である。事実上、標的細胞または宿主組織に接触させたときに追加の作用剤が有意な有害作用を引き起こさないのであれば、一緒に組込み可能な他の成分に対する制限は、実質的にまったく存在しない。したがって、特定の場合には、必要に応じて、種々の他の作用剤と共に組成物を送達することが可能である。そのような組成物は、宿主細胞もしくは他の生物起源から精製可能であるか、または他の選択肢として本明細書に記載されるように化学合成可能である。同様に、そのような組成物は、置換または誘導体化されたRNAまたはDNAの組成物をさらに含みうる。
製薬上許容される賦形剤および担体溶液の製剤化が当業者に周知であるのと同様に、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与ならびにその製剤などを含むさまざまな治療レジメンで本明細書中に記載の特定の組成物を使用するのに好適な投与レジメンおよび治療レジメンの開発も、当業者に周知である。他の投与経路としては、粘膜表面を介するもの、たとえば膣内投与が挙げられる。
1．経口送達
特定の用途では、本明細書中に開示された医薬組成物は、経口投与により動物に送達可能である。したがって、こうした組成物は、不活性希釈剤を用いてもしくは同化性可食担体を用いて製剤化可能であるか、または硬質シェルもしくは軟質シェルのゼラチンカプセル内に包封可能であるか、または錠剤の形態に圧縮可能であるか、または食事の食品中に直接組込み可能である。
活性化合物でさえも、賦形剤と共に組み込んで、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤（buccal tables）、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤などの形態で使用可能である（Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; U. S. Patent 5,641,515; U. S. Patent 5,580,579 and U. S. Patent 5,792,451（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、次のものをも含有しうる。結合剤、たとえば、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチン；賦形剤、たとえば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、たとえば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；滑沢剤、たとえば、マグネシウムステアレート；および甘味剤、たとえば、スクロース、ラクトース、もしくはサッカリンを添加可能、または風味剤、たとえば、ペパーミント、ウィンターグリーンオイル、もしくはチェリーフレーバー。投与ユニット製剤がカプセル剤である場合、以上のタイプの材料のほかに、液体担体を含有しうる。コーティングとして、またはそのほかの形で投与ユニットの物理的形態を改変するために、種々の他の材料を存在させることが可能である。たとえば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはその両方でコーティング可能である。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物と、甘味剤としてスクロースと、保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベンと、染料と、風味剤、たとえば、チェリーフレーバーまたはオレンジフレーバーと、を含有しうる。当然ながら、いかなる投与ユニット製剤の場合にもその調製に使用される材料はいずれも、製薬上純粋かつ利用量で実質的に非毒性であることが望ましい。そのほかに、活性化合物は、持続放出性の調製物および製剤に組込み可能である。
典型的には、こうした製剤は、少なくとも約0.1%の活性化合物またはそれ以上を含有しうるが、活性成分のパーセントは、当然ながら、さまざまでありうるし、適宜、全製剤の重量または体積の約1もしくは2%と約60%もしくは70%またはそれ以上との間でありうる。当然のことながら、それぞれの治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物の任意の所与のユニット用量で好適な投与量が得られるように準備しうる。溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命、さらには他の薬理学的要件のような因子は、そのような医薬製剤の調製技術分野の当業者であれば、予測しうるであろう。したがって、さまざまな投与量および治療レジメンが望まれる可能性がある。
経口投与に供する場合、本発明に係る組成物は、他の選択肢として、洗口剤、歯磨剤、バッカル錠剤、経口スプレー剤、または舌下経口投与製剤の形態で1種以上の賦形剤と共に組込み可能である。たとえば、洗口剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル（Dobell）液）のような適切な溶媒中に必要量の活性成分を組み込んで調製可能である。他の選択肢として、活性成分は、ホウ酸ナトリウムとグリセリンと重炭酸カリウムとを含有するような経口溶液剤中に組込み可能であるか、または歯磨剤中に分散可能であるか、または水と結合剤と研磨剤と風味剤と発泡剤と保湿剤とを含みうる組成物に治療上有効な量で添加可能である。他の選択肢として、組成物は、舌下に配置可能であるかさもなければ口腔内で溶解可能である錠剤または溶液製剤の形態に作製可能である。
2．注射送達
特定の状況下では、米国特許第5,543,158号、米国特許第5,641,515号、および米国特許第5,399,363号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする）に記載されるように、本明細書中に開示された医薬組成物を、非経口的、静脈内、筋肉内、さらには腹腔内に送達することが望ましいであろう。通常の保存条件下および使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。
注射に使用するのに好適な医薬製剤としては、滅菌された注射用の溶液または分散液を即時調製するための滅菌された水性の溶液剤または分散剤および滅菌された粉末剤が挙げられる（米国特許第5,466,468号（その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））。いずれの場合も、製剤は、滅菌されていなければならず、かつ容易なシリンジ注入が可能な程度に流動性でなければならない。それは、製造条件下および保存条件下で安定でなければならず、かつ細菌や菌類のような微生物の汚染作用を受けないように保存されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、たとえば、レシチンなどのようなコーティング剤を用いることにより、分散液の場合には所要の粒子サイズを保持することにより、および界面活性剤を用いることにより、保持可能である。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗菌類剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより促進可能である。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖または塩化ナトリウムを組み込むことが好ましいであろう。吸収を遅らせる作用剤、たとえば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物で使用することにより、注射用組成物を長期間にわたり吸収させるようにすることが可能である。
たとえば水溶液の状態で非経口投与に供する場合、必要であれば、溶液を適切に緩衝化し、かつ十分な生理食塩水またはグルコースを用いて液体希釈液を等張化することが望ましい。こうした特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内の投与に特に好適である。これに関連して、利用可能な滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者であればわかるであろう。たとえば、1回の投与量を1mlの等張NaCl溶液中に溶解させて、1000mlの皮下注入液に添加するかまたは提案された注入部位に注射することが可能である（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。治療される被験体の病態に依存して投与量のいくらかの変更を生じることは避けられないであろう。いずれにせよ、投与の責任者が個々の被験体に対して適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトに投与する場合、調製物は、FDA生物製剤局（FDA Office of Biologics）基準に規定された、無菌性、発熱原性、ならびに一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。
滅菌注射用溶液は、必要量の活性成分を、所要により、以上に列挙したさまざまな他方の成分と共に適切な溶媒中に組み込んでから、濾過滅菌を行うことにより、調製可能である。一般的には、分散剤は、基剤としての分散媒と以上に列挙したものから選ばれる所要の他の成分とを含有する滅菌媒体中に種々の滅菌された活性成分を組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とよりなる粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
本明細書中に開示された組成物は、中性または塩形態で製剤化可能である。製薬上許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられる。これは、たとえば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて、形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩もまた、たとえば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは第二鉄の水酸化物のような無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から、誘導可能である。製剤化後、溶液剤は、投与処方に適合しうる形でかつ治療上有効な量で投与されるであろう。製剤は、注射用溶液剤、薬剤放出カプセル剤などのようなさまざまな剤形で容易に投与される。
本明細書中で用いられる場合、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗菌類剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質用のそのような媒体および作用剤の使用は、当技術分野で周知である。いかなるの従来の媒体または作用剤の場合にもそれが活性成分と不適合でないかぎり、治療組成物でのその使用が可能であると考えられる。補助的活性成分もまた、組成物中に組込み可能である。
「製薬上許容される」という表現は、ヒトに投与するときにアレルギー性もしくはそれに類似の有害反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当技術分野で周知である。典型的には、そのような組成物は、液体溶液剤または懸濁剤のいずれかの注射剤として調製され、注射前に液体中に溶解または懸濁させるのに好適な固体製剤もまた、調製可能である。調製物はまた、乳化されたものでありうる。
3．粘膜送達
（i）鼻送達
特定の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達媒体により送達可能である。鼻エアロゾルスプレーを介して、遺伝子、核酸、およびペプチドの組成物を肺に直接送達する方法は、たとえば、米国特許第5,756,353号および米国特許第5,804,212号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする）に記載されている。同様に、鼻腔内マイクロ粒子樹脂（Takenaga et al., 1998）およびリゾホスファチジル-グリセロール化合物（米国特許第5,725,871号（その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））を用いる薬剤の送達もまた、製薬技術分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（polytetrafluoroetheylene）支持マトリックスの形態の経粘膜薬剤送達については、米国特許第5,780,045号（その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする）に記載されている。
（ii）膣内送達
本発明の他の実施形態では、医薬組成物は、膣内送達に供すべく製剤化可能である。そのような製剤は、液剤、半固体剤、または固体剤（たとえば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤などを包含する）として調製可能であるか、またはペッサリー、スポンジ、腟リング、もしくは腟フィルムのような物理的送達系内に収容可能である。
（iii）眼送達
本発明のさらなる実施形態では、医薬組成物は、眼送達に供すべく製剤化可能である。そのような製剤は、望ましくは、無色透明であろう。
（iv）直腸送達
本発明のそのほかの実施形態では、医薬組成物は、直腸送達に供すべく製剤化可能である。
5．リポソーム、ナノカプセル、およびマイクロ粒子により媒介される送達
特定の実施形態では、本発明者らは、本発明に係る組成物を好適な宿主細胞内に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどの使用が可能であると考える。特定的には、本発明に係る組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達すべく製剤化可能である。
そのような製剤化は、本明細書中に開示された核酸または構築物の製薬上許容される製剤を導入するのに好ましいであろう。リポソームの形成および使用については、当業者に広く知られている（たとえば、細胞内細菌感染および細胞内細菌疾患に対する標的化抗生物質療法におけるリポソームおよびナノカプセルの使用が記載されているCouvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998を参照されたい）。最近、改善された血清中安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; U. S. Patent 5,741,516（その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））。さらに、薬剤担体になりうるリポソームおよびリポソーム様物質の種々の調製方法がレビューされている（Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; U. S. Patent 5,567,434; U. S. Patent 5,552,157; U. S. Patent 5,565,213; U. S. Patent 5,738,868 and U. S. Patent 5,795,587（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））。
他の手順によるトランスフェクションに対しては一般に耐性を有するいくつかの細胞タイプ、たとえば、T細胞懸濁液、初代肝細胞培養物、およびPC12細胞で、リポソームが使用され好結果が得られている（Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990）。そのほかに、リポソームは、ウイルスに基づく送達系に特有なDNA長の制限を免れる。リポソームは、遺伝子、薬剤（Heath & Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta & Puglisi, 1996）、放射線療法剤（Pikul et al., 1987）、酵素（Imaizumi et al., 1990a; Imaizumi et al., 1990b）、ウイルス（Faller & Baltimore, 1984）、転写因子、およびアロステリックエフェクター（Nicolau & Gersonde, 1979）を、さまざまな培養細胞系および動物に導入するために、効果的に使用されてきた。そのほかに、リポソーム媒介薬剤送達の有効性を調べるいくつかの満足すべき臨床追跡が達成されている（Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988）。さらに、リポソームの使用は、全身送達後、自己免疫応答、毒性、性腺局在のいずれにも関連しないことがいくつかの研究から示唆される（Mori & Fukatsu, 1992）。
リポソームは、水性媒体中に分散されて自発的にマルチラメラ同心二重層ベシクル（マルチラメラベシクル（MLV）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から生成される。MLVは、一般的には、25nm〜4μmの直径を有する。MLVを超音波処理すると、コア中に水溶液を含有する200〜500Åの範囲内の直径を有するスモールユニラメラベシクル（SUV）が形成される。
リポソームは、細胞膜との類似性を有し、ペプチド組成物用の担体として本発明に関連した使用が可能であると考えられる。水溶性および脂溶性の両方の物質が閉じ込められるので、すなわち、それぞれ、水性空間内および二重層自体内に閉じ込められるので、それは広く適合する。リポソーム製剤を選択的に改変することにより、活性剤の部位特異的送達に対してさえも、薬剤担持リポソームを利用できる可能性がある。
Couvreur et al. (1977; 1988)の教示のほかに、次の情報がリポソーム製剤の作製に利用可能である。リン脂質は、水中に分散した場合、脂質対水のモル比に依存してリポソーム以外のさまざまな構造を形成しうる。小さい比では、リポソームは好ましい構造である。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性および極性の物質に対して低透過性を示す可能性があるが、昇温するとその透過性を著しく変化させる相転移を起こす。相転移は、ゲル状態として知られる密に充填された秩序構造から流体状態として知られる粗に充填された低秩序構造への変化を伴う。これは、特性相転移温度で起こり、イオン、糖、および薬剤に対する透過性の増大を引き起こす。
温度のほかに、タンパク質への暴露により、リポソームの透過性を変化させることが可能である。シトクロムcのような特定の可溶性タンパク質は、二重層に結合し、それを変形させ、そしてそれに浸透することにより、透過性の変化を引き起こす。コレステロールは、見掛け上、リン脂質をより密に詰め込むことにより、タンパク質のこの浸透を阻害する。抗生物質および阻害剤の送達に最も有用なリポソーム形成は、コレステロールを含有するであろうと考えられる。
溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソーム間で変化する。たとえば、MLVは、溶質のトラップに関して中程度に効率的であるが、SUVは、きわめて非効率的である。しかしながら、SUVは、均一性およびサイズ分布の再現性の利点を有し、サイズとトラップ効率との妥協点は、ラージユニラメラベシクル（LUV）により提供される。これは、エーテル蒸発により調製され、溶質閉込めに関してMLVの3〜4倍の効率である。
リポソーム特性のほかに、化合物を閉じ込めるのに重要な決定要因は、化合物自体の物理化学的性質である。極性化合物は、水性空間内にトラップされ、非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透を介してもしくは二重層が破壊されたときに放出されるが、非極性化合物は、温度もしくはリポタンパク質への暴露により破壊されないかぎり二重層に一体化された状態を保持する。いずれのタイプも、相転移温度で最大流出速度を示す。
リポソームは、4つの異なる機序を介して、すなわち、マクロファージや好中球のような細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシスと、非特異的な弱い疎水力もしくは静電力によるまたは細胞表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着と、細胞質中へのリポソーム内容物の同時放出を伴う、形質膜中へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合と、リポソーム内容物がなんら関係しない、細胞膜もしくは細胞内の膜へのリポソーム脂質の移入またはその逆の移入と、により、細胞と相互作用する。多くの場合、どの機序が機能するかを決定することは困難であり、2つ以上が同時に機能する可能性がある。
静脈内注射されたリポソームの運命および動態は、その物理的性質、たとえば、サイズ、流動性、および表面電荷に依存する。それは、その組成に依存して何時間もしくは何日間にわたり組織内に存続する可能性があり、血中半減期は、何分間〜数時間の範囲内である。MLVやLUVのようなより大きいリポソームは、細網内皮系の食細胞により迅速に取り込まれるが、循環系の生理機能は、ほとんどの部位でそのような大きい種の流出を抑制する。それらは、大きい開口または細孔が毛細血管内皮に存在する場所でのみ、たとえば、肝臓や脾臓の類洞で、流出されうる。したがって、これらの器官は、取込みの主要部位である。一方、SUVは、より広い組織内分布を示すが、それでもなお肝臓中および脾臓中に高度に隔離される。一般的には、このin vivo挙動により、リポソームのターゲッティングの可能性は、その大きいサイズを利用しうる器官および組織に限定される。こうしたものとしては、血液、肝臓、脾臓、骨髄、およびリンパ器官が挙げられる。
ターゲッティングは、一般的には、本発明による限定要件ではない。しかしながら、特異的ターゲッティングが望まれるのであれば、これを達成するための方法を利用しうる。リポソーム表面に結合するように抗体を使用し、抗体およびその薬剤内容物を特定の細胞タイプ表面上に位置する特異的抗原レセプターに送ることが可能である。また、炭水化物決定基（細胞間認識、細胞間相互作用、および細胞間接着に関与する細胞表面成分である糖タンパク質または糖脂質）は、リポソームを特定の細胞タイプに送る能力を有するので、認識部位として使用可能である。多くの場合、リポソーム調製物の静脈内注射が使用されるであろうと予想されるが、他の投与経路も考えられる。
他の選択肢として、本発明は、本発明に係る組成物の製薬上許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルは、一般的には、安定かつ再現可能に化合物を閉じ込めることが可能である（Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987）。細胞内への高分子の過充填に基づく副作用を回避するために、そのような超微粒子（約0.1μmのサイズ）は、in vivoで分解可能なポリマーを用いてデザインすることが望ましい。こうした要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、本発明での使用が可能であると考えられる。そのような粒子は、報告に従って容易に製造可能であるかまたは容易に製造される（Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 and U. S. Patent 5,145,684（その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるものとする））。
ワクチン
本発明の特定の好ましい実施形態では、ワクチンが提供される。ワクチンは、一般的には、免疫刺激剤と組み合わせて以上で述べたような1種以上の医薬組成物を含むであろう。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答（抗体媒介性および／または細胞媒介性のものを包含する）を増強または可能にする任意の物質でありうる。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性マイクロスフェア（たとえば、ポリ乳酸ガラクチド）、およびリポソーム（その中に化合物が組み込まれる；たとえば、Fullerton, U.S. Patent No. 4,235,877を参照されたい）が挙げられる。ワクチン調製物については、たとえば、Powell & Newman, eds., Vaccine Design（サブユニット+アジュバント法）(1995)に概説されている。本発明の範囲内にある医薬組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性であっても不活性であってもよい他の化合物を含有しうる。たとえば、他の抗原の1つ以上の免疫原性部分が、融合ポリペプチド中に組み込まれた状態でまたは個別の化合物として、組成物中またはワクチン中に存在しうる。
例示的ワクチンは、ポリペプチドがin situで生成されるように、以上に記載したようなポリペプチドの2つ以上をコードするDNAを含有しうる。以上で述べたように、DNAは、核酸発現系、細菌発現系、およびウイルス発現系を含む当業者に公知のさまざまな送達系のいずれかに存在しうる。多数の遺伝子送達技術が当技術分野で周知であり、たとえば、Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198 (1998)およびそこに引用されている参考文献に記載のものが挙げられる。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なDNA配列（たとえば、好適なプロモーターおよび終止シグナル）を含有する。細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する細菌（たとえば、カルメット・ゲラン（Calmette-Guerrin）桿菌）の投与を含む。好ましい実施形態では、DNAは、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含みうるウイルス発現系（たとえば、ワクシニアウイルスもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて導入可能である。好適な系は、たとえば、Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321 (1989); Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8:17-21 (1990); U.S. Patent Nos. 4,603,112, 4,769,330, および 5,017,487; WO 89/01973; U.S. Patent No. 4,777,127; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:2838-2848 (1993); ならびに Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207 (1993)に開示されている。そのような発現系にDNAを組み込むための技術は、当業者に周知である。DNAはまた、たとえば、Ulmer et al., Science 259:1745-1749 (1993)に記載され、Cohen, Science 259:1691-1692 (1993)にレビューされているように、「裸」でありうる。裸のDNAの取込みは、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にDNAをコーティングすることにより増大可能である。ワクチンがポリヌクレオチド成分およびポリペプチド成分の両方を含みうることはあきらかであろう。そのようなワクチンは、増強された免疫応答を提供しうる。
ワクチンは、本明細書中で規定されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製薬上許容される塩を含有しうることは明らかであろう。そのような塩は、有機塩基（たとえば、第一級、第二級、および第三級のアミンならびに塩基性アミノ酸の塩）、さらには無機塩基（たとえば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、およびマグネシウムの塩）を包含する、製薬上許容される非毒性塩基から調製可能である。
当業者に公知である任意の好適な担体を本発明に係るワクチン組成物で利用しうるが、担体のタイプは、投与形態に依存して異なるであろう。本発明に係る組成物は、たとえば、局所投与、経口投与、鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与をはじめとする任意の適切な投与方式に合わせて製剤化可能である。皮下注射のような非経口投与に供する場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝剤を含む。経口投与に供する場合、以上の担体、またはマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムのような固体担体のうちのいずれかを利用することが可能である。生分解性マイクロスフェア（たとえば、ポリラクテートポリグリコレート）もまた、本発明に係る医薬組成物用の担体として利用可能である。好適な生分解性マイクロスフェアは、たとえば、米国特許第4,897,268号、同第5,075,109号、同第5,928,647号、同第5,811,128号、同第5,820,883号、同第5,853,763号、同第5,814,344号、および同第5,942,252号に開示されている。また、宿主内でクラスI拘束性細胞傷害性Tリンパ球応答を誘導しうる米国特許第5,928,647号に記載の微粒子-タンパク質複合体を含む担体を利用することも可能である。
そのような組成物はまた、緩衝剤（たとえば、中性の緩衝生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（たとえば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（たとえば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤（たとえば、EDTAもしくはグルタチオン）、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、溶質（製剤がレシピエントの血液に対して等張、低張、もしくはやや高張になるようにする）、懸濁化剤、粘稠化剤、および／あるいは保存剤をも含みうる。他の選択肢として、本発明に係る組成物は、凍結乾燥物として製剤化可能である。化合物はまた、周知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化可能である。
さまざまな免疫刺激剤のいずれかを本発明に係るワクチンで利用することが可能である。たとえば、アジュバントを組み込むことが可能である。ほとんどのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するようにデザインされた物質、たとえば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および免疫応答の刺激剤、たとえば、リピドA（ボルデテラ・ペルツッシス（Bortadella pertussis）もしくはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属の種）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）由来タンパク質を含有する。たとえば、脱脂質化・脱糖脂質化M.バッカエ（M. vaccae）（「pVac」）を使用することが可能である。他の実施形態では、BCGがアジュバントとして使用される。そのほかに、BCGに既に暴露されている被験体にワクチンを投与することが可能である。好適なアジュバントは、たとえば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, MI）；メルク・アジュバント65（Merck Adjuvant 65）（Merck and Company, Inc., Rahway, NJ）；CWS、TDM、Leif、アルミニウム塩、たとえば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン誘導体化ポリサッカリドまたはアニオン誘導体化ポリサッカリド；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドAおよびキルAとして市販されている。サイトカイン、たとえば、GM-CSFまたはインターロイキン2、7、もしくは12をアジュバントとして使用することも可能である。
本明細書中で規定されるワクチンの範囲内では、主にTh1型の免疫応答を誘導するように、アジュバント組成物をデザインすることが可能である。高レベルのTh1型サイトカイン（たとえば、IFN-γ、TNF-α、IL-2、およびIL-12）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を支援する傾向がある。これとは対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン（たとえば、IL-4、IL-5、IL-6、およびIL-10）は、体液性免疫応答の誘導を支援する傾向がある。本明細書中で規定されるようなワクチンの適用後、患者は、Th1型およびTh2型の応答を含む免疫応答を維持するであろう。応答が主にTh1型である一実施形態の範囲内では、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルを超える領域まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを用いて容易に評価可能である。サイトカインのファミリーの総説に関しては、Mosmann & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989)を参照されたい。
主にTh1型応答の誘導に使用するのに好適なアジュバントとしては、たとえば、モノホスホリルリピドA、たとえば、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）と、アルミニウム塩と、の組合せが挙げられる。MPLアジュバントは、コリクサ（Corixa）社から入手可能である（現在、グラクソスミスクライン（GlaxoSmithKline）社の一部門；米国特許第4,436,727号、同第号4,877,611、同第号4,866,034、および同第号4,912,094を参照されたい）。CpG含有オリゴヌクレオチド（CpGジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、主にTh1応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、たとえば、WO 96/02555、WO 99/33488、ならびに米国特許第6,008,200号および同第5,856,462号に記載されている。免疫刺激性DNA配列はまた、たとえば、Sato et al., Science 273:352 (1996)にも記載されている。他の好適なアジュバントとしては、サポニン、たとえば、キルA（Quil A）もしくはその誘導体、たとえばQS21およびQS7（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）；エスシン；ジギトニン；またはジプソフィラ(Gypsophila)サポニンもしくはケノポディウム・キノア（Chenopodium quinoa）サポニンが挙げられる。他の好適な製剤は、本発明に係るアジュバントの組合せ中に2種以上のサポニン、たとえば、次のQS21、QS7、キルA（Quil A）、β-エスシン、またはジギトニンを含む群に属する少なくとも2種の組合せを含む。
他の選択肢として、サポニン製剤は、キトサンまたは他のポリカチオン性ポリマーで構成されるワクチン媒体、ポリラクチド粒子およびポリラクチド-co-グリコリド粒子、ポリ-N-アセチルグルコサミン系ポリマーマトリックス、ポリサッカリドまたは化学修飾ポリサッカリドで構成される粒子、リポソームおよび脂質系粒子、グリセロールモノエステルで構成される粒子などと組合せ可能である。また、リポソームやISCOMのような微粒子状構造体を形成するために、コレステロールの存在下でサポニンを製剤化することも可能である。さらに、非微粒子状の溶液もしくは懸濁液または小ラメラリポソームもしくはISCOMのような微粒子状の構造体のいずれかの形態で、ポリオキシエチレンのエーテルまたはエステルと共にサポニンを製剤化することが可能である。また、粘度を増大させるためにカルボポール（Carbopol）Rのような賦形剤と共にサポニンを製剤化することが可能であるか、またはラクトースのような粉末賦形剤と共に乾燥粉末形態で製剤化することが可能である。
一実施形態では、アジュバント系は、モノホスホリルリピドAとサポニン誘導体との組合せ、たとえば、WO 94/00153に記載されるようなQS21と3D-MPL（登録商標）アジュバントとの組合せ、またはWO 96/33739に記載されるようにQS21がコレステロール含有リポソームでクエンチされているより低反応原性の組成物を含む。他の好適な製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中でQS21、3D-MPL（登録商標）アジュバント、およびトコフェロールを利用する他の好適なアジュバント製剤については、WO 95/17210に記載されている。
他の増強されたアジュバント系は、CpG含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せ、特定的には、WO 00/09159に開示されるようなCpGとQS21との組合せを含む。好適には、製剤は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを追加的に含む。
他の好適なアジュバントとしては、モンタニドISA720（Montanide ISA 720）（Seppic, France）、SAF（Chiron, California, United States）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、SBASシリーズのアジュバント（SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium）、デトックス（Detox）（Corixa）、RC-529（Corixa）、および他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート（AGP）、たとえば、係属中の米国特許出願第08/853,826号および同第09/074,720号（それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする）に記載のもの、ならびにポリオキシエチレンエーテルアジュバント、たとえば、WO 99/52549A1に記載のものが挙げられる。スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）社およびコリクサ（Corixa）社は、現在、グラクソスミスクライン（GlaxoSmithKline）社の一部門である。
他の好適なアジュバントとしては、一般式(I)：
HO(CH2CH2O)n-A-R
〔式中、nは1〜50であり、Aは結合または-C(O)-であり、RはC1〜50アルキルまたはフェニルC1〜50アルキルである〕
で示されるアジュバント分子が挙げられる。
対象となるさらなるアジュバントは、たとえば、WO2005/112991に記載されるように使用される志賀毒素b鎖である。
本発明の一実施形態は、一般式（I）〔式中、nは、1〜50、好ましくは4〜24、最も好ましくは9であり、R成分は、C1〜50アルキル、好ましくはC4〜C20アルキル、最も好ましくはC12アルキルであり、かつAは結合である〕で示されるポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン製剤よりなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、0.1〜20%の範囲内、好ましくは0.1〜10%、最も好ましくは0.1〜1%の範囲内であることが望ましい。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群：ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-9-ステアリル（steoryl）エーテル、ポリオキシエチレン-8-ステアリル（steoryl）エーテル、ポリオキシエチレン-4-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-35-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-23-ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルについては、Merck index (12th edition: entry 7717)に記載されている。これらのアジュバント分子については、WO 99/52549に記載されている。
本明細書中に規定されるワクチンはいずれも、抗原、免疫応答増強剤、および好適な担体または賦形剤との組合せを生じる周知の方法を用いて調製可能である。本明細書中に記載の組成物は、持続放出製剤（すなわち、投与後に化合物の徐放を行うカプセル剤、スポンジ剤、またはゲル剤（たとえば、ポリサッカリドで構成される）のような製剤）の一部分として投与可能である。そのような製剤は、一般的には、周知の技術（たとえば、Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438 (1996)を参照されたい）を用いて調製可能であり、たとえば、経口、経直腸、もしくは皮下埋植により、または所望の標的部位での埋植により投与可能である。持続放出製剤は、担体マトリックス中に分散された状態および／または速度制御膜に包囲されたリザーバー内に収容された状態で、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体を含有しうる。
そのような製剤内での使用に供される担体は、生体適合性であり、かつ生分解性であってもよく、好ましくは、製剤は、比較的一定したレベルの活性成分放出を提供する。そのような担体としては、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどのマイクロ粒子が挙げられる。他の遅延放出性担体としては、非液状親水性コア（たとえば、架橋型のポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）と、場合により、リン脂質のような両親媒性化合物を含む外層と、を含む超分子バイオベクターが挙げられる（たとえば、米国特許第5,151,254号ならびにPCT出願WO 94/20078、WO/94/23701、およびWO 96/06638を参照されたい）。持続放出製剤内に含まれる活性化合物の量は、埋植部位、放出速度、および期待される放出持続期間、ならびに治療または予防される病態の性質に依存する。
腫瘍細胞を標的にする抗原特異的免疫応答の生成を容易にするために、さまざまな送達媒体のいずれかを医薬組成物およびワクチンに利用することが可能である。送達媒体は、抗原提示細胞（APC）、たとえば、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球、および効率的なAPCになるように工学的に作製可能な他の細胞を含む。そのような細胞は、抗原を提示する能力を増大させるために、T細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するために、それ自体に抗腫瘍作用をもたせるために、ならびに／またはレシーバーと免疫学的に適合させるために（すなわち、HLAハプロタイプを一致させるために）、遺伝子改変が可能であるが、その必要があるとはかぎらない。APCは、一般的には、さまざまな生体液および器官、たとえば、腫瘍および腫瘍周囲組織のいずれかから単離可能であり、自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞でありうる。
本発明の特定の実施形態では、抗原提示細胞として樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、きわめて強力なAPCであり（Banchereau & Steinman, Nature 392:245-251 (1998)）、予防的もしくは治療的な抗腫瘍免疫を誘導する生理学的アジュバントとして有効であることが明らかにされている（Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529 (1999)を参照されたい）。一般的には、樹状細胞は、その典型的な形状（in situでは星形であり、in vitroで観察可能な顕著な細胞質突起（樹状突起）を有する）、高効率で抗原の取込み、プロセシング、および提示を行うその能力、ならびにナイーブT細胞応答を活性化させるその能力に基づいて、同定可能である。当然ながら、in vivoもしくはex vivoで樹状細胞上に一般に見いだされない特異的細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように、樹状細胞を工学的に操作することが可能であり、そのような改変樹状細胞は、本発明により利用可能であると考えられる。樹状細胞の他の選択肢として、分泌小胞抗原担持樹状細胞（エキソソームと呼ばれる）をワクチン内で使用することが可能である（Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600 (1998)を参照されたい）。
樹状細胞およびその前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の好適な組織もしくは体液から取得可能である。たとえば、GM-CSF、IL-4、IL-13、および／またはTNFαのようなサイトカインの組合せを末梢血から採取された単球の培養物に添加することにより、ex vivoで樹状細胞の分化を行うことが可能である。他の選択肢として、GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンド、ならびに／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組合せを培地に添加することにより、末梢血、臍帯血、または骨髄から採取されたCD34陽性細胞を樹状細胞に分化させることが可能である。
樹状細胞は、便宜上、「未成熟」細胞および「成熟」細胞に分類される。これにより、2つの十分に特徴付けられた表現型を簡単に区別することが可能である。しかしながら、この命名は、分化のすべての可能な中間期を除外するものとみなされるべきでものない。未成熟樹状細胞は、抗原の取込みおよびプロセシングに関して高い能力を有するAPCとして特徴付けられ、この能力は、Fcγレセプターおよびマンノースレセプターの高い発現と相関する。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーのより低い発現により特徴付けられるが、ただし、T細胞の活性化に関与する細胞表面分子、たとえば、クラスIおよびクラスIIのMHC、接着分子（たとえば、CD54およびCD11）、ならびに共刺激性分子（たとえば、CD40、CD80、CD86、および4-1BB）の高い発現により特徴付けられる。
APCは、一般的には、ポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現されるように、タンパク質（またはその一部分もしくは他の変異体）をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクト可能である。そのようなトランスフェクションは、ex vivoで実施可能であり、次に、そのようなトランスフェクト細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書に記載されるように治療目的に使用可能である。他の選択肢として、樹枝細胞または他の抗原提示細胞を標的にする遺伝子送達媒体を投与して、in vivoでトランスフェクションを引き起こすことが可能である。一般的には、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて、たとえば、WO 97/24447に記載のものまたはMahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997)に記載の遺伝子銃法を用いて、in vivoおよびex vivoで樹状細胞のトランスフェクションを行うことが可能である。樹状細胞の抗原担持は、ポリペプチド、DNA（裸のもしくはプラスミドベクター中）、またはRNAと共に、あるいは抗原を発現する組換え細菌または組換えウイルス（たとえば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、またはレンチウイルのスベクター）と共に、樹状細胞またはその前駆細胞をインキュベートすることにより達成可能である。担持前、T細胞支援を提供する免疫学的パートナー（たとえば、担体分子）にポリペプチドを共有結合でコンジュゲートすることが可能である。他の選択肢として、個別にまたはポリペプチドの存在下で樹状細胞を非コンジュゲート化免疫学的パートナーでパルスすることが可能である。
ワクチンおよび医薬組成物は、密封されたアンプルまたはバイアルのようなユニット用量またはマルチ用量の容器に入れて提供可能である。そのような容器は、好ましくは、使用時まで製剤の無菌性を維持するために気密に密封される。一般的には、製剤は、油性もしくは水性の媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンとして保存可能である。他の選択肢として、ワクチンまたは医薬組成物は、使用直前に滅菌液体担体の添加だけを必要とする凍結乾燥状態で保存可能である。
以下の実施例は、例示として提供されているにすぎず、本発明の範囲を限定する役割を有するものではない。当業者であればわかるであろうが、類似の結果が得られるように適合化されうるさまざまな決定的ではないパラメーターが記載されている。
実施例1：Ct-089、Ct-858、およびCt-875の配列比較
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eは、一般的な眼・生殖器性血清型であり、他の配列と比較される基準として選択された。
比較のためのアミノ酸配列の多重アライメントは、レーザージーン（Lasergene）ソフトウェアパッケージのバージョン5.0（DNASTAR, Inc., Madison, WIにより販売されている）中で入手可能なクラスタルW（CLUSTAL W）プログラムを用いて行われた。基本的多重アライメントアルゴリズムは、三工程の手順を含む。すなわち、各配列対の分岐を与える距離行列を計算するために、すべての配列対を個別にアライメントし、次に、距離行列からガイドツリーを計算し、最後に、ガイドツリーに従って配列を漸進的にアライメントする。クラスタルW（CLUSTAL W）アルゴリズムについては、Thompson et al., Nuc. Acids Res. 22: 4673-4680 (1994)に記載されている。図1、2a／2b、および3a／3bにアライメントを示す。
Tヘルパー細胞エピトープは、HLAクラスII分子に結合されてTヘルパー細胞により認識されるペプチドである。血清型Eに由来するCt-089、Ct-858、およびCt-875クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）ポリペプチド上に存在する推定Tヘルパー細胞エピトープの予測は、Sturniolo et al., Nature Biotech. 17:555-561 (1999)に記載のテピトープ（TEPITOPE）法に基づくものであった。可能性のある良好なT細胞エピトープを含むペプチドは、図1、2a／2b、および3a／3bにおいて強調表示されている（灰色の囲み）。
実施例2：マウスにおけるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼感染症に対する防御免疫応答の誘導
実験の概要
アジュバント中に製剤化された血清型Eに由来するCt-089、Ct-858、およびCt-875タンパク質の組合せを用いて、雌のC57BL/6およびC3Hマウスにワクチン接種（2つの異なる投与量レベルで2もしくは3回の筋肉内免疫化）を行った。アジュバント中の血清型AまたはKに由来するUV弱毒化基本小体を用いて、陽性対照群にワクチン接種を行った。アジュバントだけを用いて、陰性対照群にワクチン接種を行った。
眼性血清型A、B、または眼・生殖器性血清型Kを用いた1回の眼チャレンジにより、マウスに感染させた。眼スワブを行うことにより、感染の経過を監視した。
方法
被験体
240匹の6週齢の雌マウス（144匹のC3Hマウスおよび96匹のC57BL/6マウスよりなる）をチャールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）社（Wilmington, Massachusetts）から入手した。動物を各8匹のマウスよりなる30群（C3Hマウスよりなる18群およびC57BL/6マウスよりなる12群）に分けた。血清型A、B、またはKのそれぞれでのチャレンジに、C3Hマウスよりなる6実験群を使用した。血清型AまたはKのそれぞれでのチャレンジに、C57BL/6マウスよりなる6実験群を使用した。
本発明に従って各部分集合中の4群のマウスを免疫した（低投与量もしくは高投与量で2もしくは3回の免疫化）。アジュバント中のUVEBを用いてまたはアジュバント単独で各部分集合中の残りの2群を対照に使用した。
各群のマウスを1匹ずつ籠に入れて、暗所12時間／明所12時間のサイクルで飼育した。
細菌調製物
生きている基本小体(EB)
米国微生物株保存機関（American Type Culture Collection）（ATCC）からクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、およびKを取得し、増殖させた後、マウスのチャレンジに使用した。最初のストックの力価は、血清型Kでは1.2×107 IFU/ml、血清型Bでは1.4×107 IFU/ml、血清型Aでは1.92×109 IFU/mlであった。
75cm2培養フラスコ内のMcCoy細胞中でストックの血清型を増殖させた。培養フラスコ内の集密細胞単層にそれぞれの血清型を接種し、2000rpmで1時間遠心し、そして10%ウシ胎仔血清、1mMナトリウムピルベート、1×MEM NEA酸、50μM Bme β-メルカプトエタノール、10mg/Lのマイコスタチン、および10mg/Lのバンコマイシンが追加されたRPMI1640中で、5% CO2を用いて37℃で48時間インキュベートした。1μg/mlのシクロヘキサミドを添加してから感染させた（シクロヘキサミドは、感染を確立するようにクラミジア複製を支援するタンパク質合成阻害剤である）。感染後、5mmのガラスビーズを用いて細胞単層を破壊することによりクラミジア基本小体（EB）を採取し、SPG中、-80℃で凍結させた。高い力価を得るために、培養フラスコ内のMcCoy細胞単層上で血清型を少なくとも4サイクルにわたり培養した。光学顕微鏡法で検査したときに各培養フラスコ内の細胞の90〜100%に感染した場合を除き、半精製を行わなかった。
最初に30%ハイパック（Hypaque）勾配上、2番目に52%、44%、および40%ハイパック（Hypaque）勾配上で、該勾配に対して超遠心を用いて、少なくとも20個の75cm2感染培養フラスコから得られた生存能力のある基本小体を半精製した。2回洗浄後の最終ペレットをクライオバイアル内のSPG（75gスクロース、0.52gリン酸カリウム、2.3gリン酸二ナトリウム七水和物、および0.72gグルタミン酸、pH7.5、滅菌）中に再懸濁させ、後で使用するために-80℃で凍結させた。
UV弱毒化基本小体（UVEB）
対照免疫化を目的として、精製された血清型AおよびKの基本小体をUV光下で不活性化させた。光源から1インチ離したUV灯（サンヨー（Sanyo）社製の殺菌灯）の真下の6ウェルプレート中にEB懸濁液の薄層を1時間にわたって置いた。BCAタンパク質アッセイにより決定されたタンパク質含有量に従ってUVEBを標準化し、アリコートに分け、そして凍結させた。ストックUVEBの濃度は、血清型Aでは249.3μg/mlであり、血清型Kでは5145μg/mlであった。
UVEBの生存能力試験をMcCoy細胞単層で行った。
ワクチン調製物
アジュバント対照
利用されたアジュバントは、3D-MPLとQS21とコレステロールとを含有するリポソーム製剤に基づくものであった。アジュバント溶液の最終組成は、以下のとおりであった。
3D-MPL 100μg/ml
QS21 100μg/ml
DOPC 2mg/ml（DOPC=ジオレオイルホスファチジルコリン）
コレステロール 0.5mg/ml
9mM Na2HPO4、48mM KH2PO4、および100mM NaClからpH6.1のリン酸緩衝生理食塩水を調製した。
脂質とコレステロールと3D-MPLとの混合物を有機溶媒中に調製し、次に、これを真空下で乾燥させた。次に、PBSを添加し、懸濁液が形成されるまで容器を攪拌した。次に、約100nmのリポソームサイズが得られるまで、この懸濁液をマイクロ流動化した（スモールユニラメラベシクルまたはSUVと呼ばれる）。続いて、0.2μmフィルターに通すことによりSUVを滅菌した。
所望の最終濃度が得られるようにリン酸緩衝生理食塩水を添加して、滅菌されたSUVを適正量の水性QS21（2mg/mlの濃度）と混合した。次に、必要に応じて水酸化ナトリウムまたは塩酸を用いて、pHを6.1（±0.1）に調整した。
アジュバント中のUVEB
50μlの所要のUVEB（すなわち、20μg/μlに調整されたストックUVEB濃度）と50μlの2倍濃度のアジュバントとを混合することにより、10μgのUVEBを100μlの体積で調剤した。
アジュバント中のCt-089、Ct-858、およびCt-875タンパク質
従来の手段を用いてタンパク質抗原を調製した。簡潔に述べると、コンピテントE.コリ（E. coli）株BL21 plys E、Tuner (DE3)、およびBL21 plys Sを、Ct-089、Ct-858、およびCt-875発現プラスミドのそれぞれで形質転換し、適切な抗生物質選択培地上で増殖させた。得られた発現クローンをミニ誘導プロトコルで使用し、タンパク質収量をSDS-PAGEにより分析した。このプロセス中に細胞が十分に増殖し、クーマシー（Coomassie）ブルー染色SDSゲル上で検出されるのに十分な量でタンパク質がイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）により誘導された場合、クローンを大規模誘導実験（IPTG、1mM）に使用した。CHAPS溶液での細胞の溶解および遠心分離の後、可溶性画分およびペレット画分のアリコートをSDS-PAGEにより分析して、対象のタンパク質の大部分がペレット画分中または可溶性画分中に存在するかどうかを判定した。各抗原の大部分を含有する画分をNi-NTAカラム精製に付した（タンパク質の適切な可溶化の後）。Ni-NTA結合前の材料、カラム素通り画分、カラム洗浄画分、およびカラム溶出画分を含む調製物のアリコートをSDS-PAGEにより分析した。溶出されたタンパク質を含有する画分を合わせ、10mM Tris pH8またはpH10に対して透析し、濾過滅菌し、そして濃縮した。濃縮Ctタンパク質画分に対してBCAタンパク質アッセイを使用し、SDS-PAGEにより純度を評価した。
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型Eに由来するCt-089、Ct-858、およびCt-875をアジュバント（先に記載のもの）と共に含有する2つの組成物を調製した。第1のもの（低用量（lose dose））は、100μlの組成物中に1.25μgの各タンパク質抗原を有し、第2のもの（高用量）は、100μlの組成物中に5μgの各タンパク質を有する。
免疫化およびチャレンジ
麻酔剤
免疫化の前に、注射用麻酔剤(ケタジェクト-キシラジェクト（Ketaject-Xylaject）1:1用量）をマウス1匹あたり30μlで腹腔内投与することにより、マウスを麻酔した。
眼チャレンジおよび眼スワブの前に、注射用麻酔剤（ケタジェクト-キシラジェクト（Ketaject-Xylaject）1:1用量）をマウス1匹あたり30μlで腹腔内投与しかつ20μlで各大腿に筋肉内投与することにより、マウスを麻酔した。
免疫化
0、21、および42日目の1、2、または3回（必要に応じて）で免疫化を行った。マウス1匹あたり100μlの全体積を用い、50μlの製剤を各大腿中に注射することにより、マウスに筋肉内注射を行った。
3種のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質の代表的な組合せワクチン（Ct-089、Ct-858、およびCt-875を、低用量の場合にはそれぞれ1.25μg、高用量の場合にはそれぞれ5μg）を含む100μlアジュバント製剤を用いて、本発明に係る治療を受けるマウス群を筋肉内免疫した。治療マウスを、0日目、21日目、さらには3回の投与を受ける場合には42日目の、2回または3回のいずれかで免疫した。
0日目、さらには3回の投与を受ける場合には21日目および42日目の1回または3回のいずれかで免疫化を行って、10μgのUVEBを含む100μlアジュバント製剤を用いて、マウスの陽性対照群を筋肉内免疫した。0、21、および42日目の3回の免疫化を行って、陰性対照群を100μlアジュバント製剤で筋肉内免疫した。
チャレンジ
血清型A、B、またはKに由来する新たに解凍されたクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）EBアリコートを、それぞれ、5μl中5×103 IFUの最終濃度になるように冷SPG緩衝液中に個別に希釈した。接種時、接種物を氷上に保持した。それぞれの眼に対して新しい滅菌されたピペットチップを用いてマイクロピペットにより上結膜円蓋に局所適用することにより、深麻酔されたマウスを片眼あたり5μl中5×103 IFUの適切な血清型で70日目にチャレンジした。
感染の監視
チャレンジ後の7、14、および21日目に眼スワブを行い、そしてIFUの存在に基づいてスワブを分析することにより、眼暴露後の感染の経過を監視した。
実験終了時、深麻酔下で心臓穿刺により最終採血を行った（各マウスからそれぞれ1mlまでの血液を取得する）。サンプルを即座に処理して、-20°で保存した。次に、CO2を用いてマウスを安楽死させた。
スワブ
スワブ（滅菌されたポリエステルチップ付きアプリケーター）をそのそれぞれのクライオバイアル内の1ml SPG中であらかじめ湿潤させた。各マウスが深麻酔状態にあるうちに、各スワブを結膜および眼瞼のそれぞれの領域で30回ずつ回転させた。次に、スワブをそれぞれのクライオバイアル内に入れてドライアイス中に配置した。スワブの入ったクライオバイアルを-80℃で保存した。
シクロヘキサミド（1μg/ml）を含む培地中のMcCoy細胞の集密単層の入った24ウェルプレートを用いて、スワブの力価測定を行った。解凍後、スワブの入ったクライオバイアルをガラスビーズの存在下で5分間ボルテックスした。スワブの入ったクライオバイアルのそれぞれからの100μlを、シクロヘキサミドを含む1ml培地中のMcCoy細胞単層の入った二つ組の24ウェルプレート上の1つのウェルに接種した。2000rpmで1時間遠心分離した後、37℃および5% CO2でプレートをインキュベートした。感染の48時間後にメタノール中で単層を固定し、エバンスブルー（Evans Blue）およびFITCコンジュゲート化抗クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）抗体により染色した。
倒立蛍光顕微鏡法により封入に関して単層を検査した。スワブ1つあたりのIFU数を計算するために使用した方法は、蛍光顕微鏡下でウェル全体を計数し、次いでそれに希釈係数10を掛けることからなるものであった。封入体が観測されなかった場合、検出限界10未満の任意の値（通常は7）を用いてIFU/スワブの数値を表した。
ELISA
酵素結合免疫吸着アッセイを血清サンプルについて行った。0.1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS） KPLコーティング濃縮溶液（KPL Coating Solution Concentrate）（pH7.2〜7.4）中に個別に希釈された全A EBまたは全K EBは、抗原（約106 FU/ウェル）として機能した。PBS-0.05%トゥイーン（Tween）、1% BSAでブロックした後、血清の連続希釈（1:2）を行い、続いて、PBS-0.05%トゥイーン（Tween）中で逐次洗浄し、そしてアルカリホスファターゼコンジュゲート化二次抗体IgG+IgM+IgA（Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD）をウェルに添加した。ジエタノールアミン基質緩衝液中のニトロフェニルリン酸（KPL p-NPPマイクロウェル基質系）で反応液を発色させ、30〜60分後に各ウェル中の吸光度(OD405)を測定した。
Figure 2010505795
Figure 2010505795
結果
図4〜6は、チャレンジ後の7、14、および21日目にそれぞれ取得した眼スワブ上に存在するIFUの数値を示している。
データの統計解析から以下のような主要な観測結果が得られる。
陰性対照（アジュバントのみ）群と陽性対照（アジュバント中のUVEB）群との比較
対応のないt検定の結果は、UVEB A免疫化は、血清型Aでチャレンジした後の7、14、および21日目、C3Hマウスにおいて、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（p<0.0001）。
対応のないt検定の結果は、UVEB A免疫化は、血清型Aでチャレンジした後の7、14、および21日目、C57BL/6マウスにおいて、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（7日目ではp=0.0019、14日目および21日目ではp<0.0001）。
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、C3H群およびC57BL/6群のいずれにおいてもUVEB A免疫化は、血清型Aでチャレンジした後、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（p<0.01）。
対応のないt検定の結果は、UVEB K免疫化は、血清型Kでチャレンジした後の7、14、および21日目、C3Hマウスにおいて、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（p<0.0001）。
対応のないt検定の結果は、UVEB K免疫化は、血清型Kでチャレンジした後の7、14、および21日目、C57BL/6マウスにおいて、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（p<0.0001）。
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、C3H群およびC57BL/6群のいずれにおいてもUVEB K免疫化は、血清型Kでチャレンジした後、アジュバントのみと比較して統計学的に有意な防御を提供することを示している（p<0.01）。
陰性対照群と処置群（すなわち、高用量で3回免疫化）との比較
陰性対照（すなわち、アジュバントのみ）と、Ct-089、Ct-858、およびCt-875タンパク質の組合せを用いた本発明に係る免疫化とを比較する、対応のないt検定の結果は、7、14、および21日目、C3HおよびC57BL/6のいずれのマウスにおいても、血清型Aまたは血清型Kでチャレンジした後に付与された防御において有意差を生じることを示している（p<0.0001）。
陰性対照（すなわち、アジュバントのみ）と、Ct-089、Ct-858、およびCt-875タンパク質の組合せを用いた本発明に係る免疫化とを比較する、Anova-テューキー（Tukey）検定の結果は、7、14、および21日目、C3Hマウスにおいて、血清型Bでチャレンジした後に付与された防御において有意差を生じることを示している（p<0.001）。
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、血清型Aでチャレンジした後、C3HおよびC57BL/6のいずれのマウスにおいても、組合せ処置と比較して陰性対照により付与された防御において統計的有意差を生じることを示している（p<0.01）。
陽性対照群と3回免疫化高用量処置群との比較
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、血清型Aでチャレンジした後、C3HマウスおよびC57BL/6マウスにおいて、陽性対照（すなわち、UVEB免疫化）と、対応する組合せ処置との間で統計的有意差が存在しないことを示している（p>0.05）。
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、血清型Kでチャレンジした後、C3HマウスおよびC57BL/6マウスにおいて、陽性対照（すなわち、UVEB免疫化）と、対応する組合せ処置との間で統計的有意差が存在しないことを示している（p>0.05）。
7、14、および21日目、Anova-ダネット（Dunnett）の多重比較検定の結果は、血清型Bでチャレンジした後、C3Hマウスにおいて、陽性対照（すなわち、UVEB免疫化）と、対応する組合せ処置との間で統計的有意差が存在しないことを示している（p>0.05）。
結論
アジュバント単独（陰性対照）では、眼感染症に対する防御を付与することは不可能である。
血清型AまたはKに由来するアジュバント中のUVEB（陽性対照）は、すべての時点で両方のマウス系統において血清型AおよびKのそれぞれによる眼感染症に対する防御を付与する。
本発明に係る免疫原性組成物（いずれの場合も血清型Eに由来するもの）で処置すると、3回の高用量免疫化を行った場合、すべての時点でいずれのマウス系統においても血清型Aまたは血清型Kのいずれによる眼感染に対しても統計学的に有意な防御がもたらされる。C3Hマウスにおいて血清型Bのチャレンジに関して類似の防御レベルが観測されるが、この結果の有意性を確認するための統計解析は行われていない。
2回の高用量免疫化は、3回の低用量免疫化と比較していずれの場合も改善された防御を提供する。
本発明に係る処置が、眼感染に対する相当の防御（UVEBと等価）を提供し、免疫原性組成物の由来源以外の血清型に対する防御（すなわち、眼感染からの交差血清型防御）を誘導しうることが、上記結果から示される。さらに、そのような防御は、非眼経路を介する投与により達成可能である。
特許および特許出願をはじめとする本出願で参照されるすべての参考文献は、参照により最大可能範囲内で本明細書に組み入れられるものとする。
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上特に必要とされないかぎり、「comprise」という単語および「comprises」や「comprising」のようなその変化形は、指定の整数、工程、整数の群、または工程の群を包含することを示唆するものとみなされるものとするが、任意の他の整数、工程、整数の群、または工程の群を除外することを示唆するものとみなされるものではない。
本明細書および本特許請求の範囲が一部を構成する本出願は、いずれの後続出願に関してもその優先権の基礎として使用可能である。そのような後続出願の特許請求の範囲は、本明細書中に記載のいずれの特徴または特徴の組合せにも関連しうる。それらは、製品、組成物、方法、または使用の請求項の形態をとりうる。例としては、以下の請求項が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

Claims (48)

  1. Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む安全かつ有効な量の免疫原性組成物を投与することによりクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の眼感染症を治療または予防する方法。
  2. クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の眼感染症の治療または予防に使用するための、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、を含む免疫原性組成物。
  3. クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される1つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチド、の使用。
  4. 前記免疫原性組成物が、Swib、Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-622、Ct-089、PmpGのパッセンジャードメイン（PmpGpd）、およびPmpDのパッセンジャードメイン（PmpDpd）よりなるリストから選択される2つ以上のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）タンパク質、その免疫原性断片、または該タンパク質もしくは該断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  5. 前記免疫原性組成物が眼に投与される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  6. 前記免疫原性組成物が眼以外に投与される、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  7. 前記免疫原性組成物がCt-089を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  8. 前記免疫原性組成物がCt-858を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  9. 前記免疫原性組成物がCt-875を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  10. 前記免疫原性組成物がCt-858およびCt-875を含む、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  11. 前記免疫原性組成物が、Ct-089、Ct-858、およびCt-875を含む、請求項１０に記載の方法、組成物、または使用。
  12. 前記免疫原性組成物が、製薬上許容される希釈剤または担体をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  13. 前記免疫原性組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  14. 前記アジュバントがTh1応答の選択的刺激剤である、請求項１３に記載の方法、組成物、または使用。
  15. 前記アジュバントが、3D-MPL、QS21、または3D-MPLとQS21との組合せを含む、請求項１４に記載の方法、組成物、または使用。
  16. 前記アジュバントが水中油型エマルジョンをさらに含む、請求項１５に記載の方法、組成物、または使用。
  17. 前記アジュバントがリポソームをさらに含む、請求項１５に記載の方法、組成物、または使用。
  18. 2つ以上の前記タンパク質もしくは前記免疫原性断片が、融合タンパク質を形成するように連結されているか、または前記タンパク質もしくは前記免疫原性断片をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドが2つ以上の前記タンパク質もしくは前記免疫原性断片よりなる融合体をコードする、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  19. 前記免疫原性組成物が、クラミジアポリペプチドもしくはその免疫原性断片の以下の組合せの1つまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ただし、該組合せがすべて、Ct-858成分およびCt-875成分を含むものとする、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
    1．Swib、Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、およびCt-875のうちの5つ
    2．PmpDpd、Ct-858、Ct-0875、Swibのうちの3つ
    3．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-622、Ct-875、およびSwibのうちの5つ
    4．Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、およびCt-875のうちの5つ
    5．Ct-858、Ct-875、Ct-622、およびCt-089のうちの3つ
    6．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089のうちの3つ
    7．Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、およびCt-875のうちの4つ
  20. 前記免疫原性組成物が、クラミジアポリペプチドもしくはその免疫原性断片の以下の組合せの1つまたはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
    1a．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-089
    2a．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Swib、Ct-089
    3a．Momp、PmpDpd、Ct-858、Ct-622、Ct-875、Swib、Ct-089
    4a．Momp、PmpDpd、Ct-858、PmpGpd、Ct-622、Ct-875、Ct-089
    5a．Ct-858、Ct-875
    6a．Momp、Ct-858、Ct-875、Ct-089
    7a．Momp、Ct-858、Ct-875
    8a．Momp、PmpD、Ct-858、PmpGpd、Ct-875、Ct-089
    9a．PmpDpd、Ct-858、Ct-875、Ct-089
  21. 前記免疫原性組成物が、Momp、Ct-089、Ct-858、Swib、およびPmpDpdポリペプチドもしくはそれらの免疫原性断片またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の方法、組成物、または使用。
  22. 第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア眼感染症を治療または予防するための免疫原性組成物の製造における、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択されかつ第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、1つ以上のクラミジアタンパク質、その免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用。
  23. Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択されかつ第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型に由来する、1つ以上のクラミジアタンパク質、その免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を投与することを含む、第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型によるクラミジア眼感染症を治療または予防する方法。
  24. 前記免疫原性組成物が、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される1つのタンパク質、その免疫原性断片、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２および２３のいずれかに記載の使用または方法。
  25. 前記免疫原性組成物が、Ct-089、Ct-858、およびCt-875よりなるリストから選択される2つのタンパク質、それらの免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜２４のいずれか1項に記載の使用または方法。
  26. 前記免疫原性組成物が、Ct-089およびCt-858、それらの免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の使用または方法。
  27. 前記免疫原性組成物が、Ct-089およびCt-875、それらの免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の使用または方法。
  28. 前記免疫原性組成物が、Ct-858およびCt-875、それらの免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の使用または方法。
  29. 前記免疫原性組成物が、Ct-089、Ct-858、およびCt-875、それらの免疫原性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２〜２８のいずれか1項に記載の使用または方法。
  30. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、K、L1、L2、およびL3よりなるリストから選択される、請求項２２〜２９のいずれか1項に記載の使用または方法。
  31. 前記クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型がクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼性血清型から選択される、請求項２２〜３０のいずれか1項に記載の使用または方法。
  32. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼性血清型A、B、Ba、およびCから選択される、請求項３１に記載の使用または方法。
  33. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼・生殖器性血清型から選択される、請求項２２〜３０のいずれか1項に記載の使用または方法。
  34. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）眼・生殖器性血清型D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、Ja、およびKから選択される、請求項３３に記載の使用または方法。
  35. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型がクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）LGV血清型から選択される、請求項２２〜３０のいずれか1項に記載の使用または方法。
  36. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）LGV血清型L1、L2、およびL3から選択される、請求項３５に記載の使用または方法。
  37. 前記第1のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、大多数の他のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型と高レベルの配列同一性を有するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型であるように選択される、請求項２２〜３６のいずれか1項に記載の使用または方法。
  38. 前記クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、大多数の一般的なクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型と高レベルの配列同一性を有するクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型であるように選択される、請求項２２〜３７のいずれか1項に記載の使用または方法。
  39. 前記第1および第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、同一の疾患状態と関連付けられるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型である、請求項２２〜３８のいずれか1項に記載の使用または方法。
  40. 前記第1および第2のクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型が、異なる疾患状態と関連付けられるクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）血清型である、請求項２２〜３８のいずれか1項に記載の使用または方法。
  41. 前記免疫原性組成物が1つ以上の追加の抗原を含む、請求項２２〜４０のいずれか1項に記載の使用または方法。
  42. 前記1つ以上の追加の抗原がクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）抗原である、請求項４１に記載の使用または方法。
  43. 前記1つ以上の追加の抗原が、Momp、Ct-622、PmpGpd、およびPmpDpdよりなるリストから選択される、請求項４１または４２のいずれかに記載の使用または方法。
  44. 前記免疫原性組成物がアジュバントをさらに含む、請求項２２〜４３のいずれか1項に記載の使用または方法。
  45. 前記アジュバントがTh1応答の選択的刺激剤である、請求項４４に記載の使用または方法。
  46. 前記アジュバントが、3D-MPL、QS21、または3D-MPLとQS21との組合せを含む、請求項４５に記載の使用または方法。
  47. 前記アジュバントが水中油型エマルジョンをさらに含む、請求項４６に記載の使用または方法。
  48. 前記アジュバントがリポソームをさらに含む、請求項４６に記載の使用または方法。
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