CN111735967B

CN111735967B - 一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法

Info

Publication number: CN111735967B
Application number: CN202010764860.8A
Authority: CN
Inventors: 魏文进; 高辉; 褚晓明
Original assignee: Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co ltd
Current assignee: LIAONING MAOKANGYUAN BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.; Tianjin Zhongyi Anjian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-08-03
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-08-03
Also published as: CN111735967A

Abstract

本发明公开了一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括预包被RBD抗体至检测板，得包被板；封闭包被板，孵育，得封闭酶标板；将参考品梯度稀释；将供试品解析附并制备解吸附稀释液和未解吸附上清液；将各个浓度的参考品、供试品解吸附稀释液和供试品未解吸附上清液分别加入到板孔中，以样品稀释液作为阴性对照，孵育；加入酶标记二抗，孵育；加底物显色液，避光显色；终止显色并读数，统计读取吸光度值。本发明可用于重组新型冠状病毒疫苗半成品吸附完全性检测及相关研究工作，使实验结果准确可靠。

Description

一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法。

背景技术

新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。多数患者预后良好，少数患者病情危重。老年人和有慢性基础疾病者预后较差。儿童病例症状相对较轻。

研制疫苗是预防与控制此疾病的重要方式。

但是，由于现有此疾病的疫苗均在实验中，如何验证检测其吸附完全性，鲜有报道，吸附完全性检测对于进一步研究疫苗功效、质量把控具有参考价值。

因此，如何提供一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，包括下列步骤：

（1）预包被RBD抗体至检测板中，得包被板；

（2）封闭包被板，孵育，得封闭酶标板；

（3）将工作参考品以0.9%氯化钠溶液稀释至80 ug/ml，加等量供试品/参考品处理液，再以样品稀释液倍比稀释，得梯度浓度的工作参考品备用；

（4）将供试品与供试品/参考品处理液混合，在20～28℃条件下解吸附30～35分钟得到供试品解吸附处理液，再离心，取上清液，得到供试品解吸附上清，用样品稀释液稀释为1000～500 ng/ml浓度的供试品解吸附稀释液备用；

（5）将供试品离心，取上清，得到供试品未解吸附上清液；

（6）将步骤（2）封闭酶标板洗板后，将梯度浓度的工作参考品、供试品解吸附稀释液和供试品未解吸附上清液分别加入到板孔中，以样品稀释液作为阴性对照，孵育；

（7）待步骤（6）孵育结束，去除板内孵育液后洗板，加入稀释的酶标记二抗，孵育；

（8）待步骤（7）孵育结束，去除板内孵育液后洗板，加底物显色液，避光显色；

（9）终止显色；

（10）读数：统计读取吸光度值。

其中，稀释优选为2000 ng/ml～31.26 ng/ml，7个点。

优选的：步骤1）中RBD抗体的包被浓度为5 μg/ml，RBD抗体的包被量100 μl/孔；预包被的温度为2~8℃，预包被的时间为15~20小时。

有益效果在于：RBD抗体浓度过高或过低，会使检测OD值偏高或偏低。

优选的：步骤2）中封闭用封闭液：称取牛血清白蛋白2.0 g，以100 ml PBS溶液溶解；封闭液的体积为300 μl/孔。

有益效果在于：封闭液的体积用量不当，封闭不完全会造成假阳性。

优选的：步骤（6）中供试品解吸附稀释液、供试品未解吸附上清液或样品稀释液的添加体积均为100 μl/孔；样品稀释液为含0.05% Tween-20的PBS。

优选的：步骤（6）还包括通过梯度浓度的工作参考品来绘制标准曲线；

根据标准曲线拟合得到的标准曲线方程如式c所示：

y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D 式c；

式中，A=2.00742；B=-0.82100；C= 314.08530；D=-0.09311；

步骤（6）还包括添加高浓度和低浓度的质控品来统计回收率；

高浓度的质控品是由40 μg/ml参考品稀释液稀释至800 ng/ml得到；低浓度的质控品是由40 μg/ml参考品稀释液稀释至200 ng/ml得到。

优选的:步骤（7）酶标记二抗的添加体积为100 μl/孔，酶标记二抗的稀释度为1:8000～10000。

有益效果在于：酶标记二抗浓度过高或过低，会使检测OD值偏高或偏低。

优选的：步骤（8）底物显色液的添加体积为100 μl/孔。

优选的：步骤（2）、步骤（6）和步骤（7）中孵育的温度为37±1℃，孵育的时间为90分钟；步骤（2）、步骤（6）~（8）中还包括洗板，每次洗板洗涤液的体积为300 μl/孔，洗涤液为0.05% Tween-20 的PBS。

优选的：步骤（10）具体为：将终止反应后的酶标板放入酶标仪，在450 nm/620 nm波长下读取吸光度值。

本发明还提供了一种重组新型冠状病毒疫苗的检测试剂盒，包括包被RBD抗体的酶标板、酶标二抗、参考品、样品稀释液和洗涤液。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其优势在于可用于重组新型冠状病毒疫苗半成品吸附完全性检测及相关研究工作，使实验结果准确可靠。

具体实施方式

下面将结合实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法。实施例中涉及的重组新型冠状病毒疫苗（供试品和参考品）制备工艺参见专利文件：CN111333704A新型冠状病毒COVID-19疫苗、制备方法及其应用。

实施例中涉及的主要设备的名称、生产厂家和型号/规格如下表1：

表1

主要试剂及材料的名称、厂家和级别/规格如下表2：

表2

对上述原料并非限定其购买途径和品牌只要能满足实验需求均可，未提及的实验方法均为常规实验方法，在此不再赘述。

实施例1

溶液配制：

包被液：称取2.93 g NaHCO₃，1.59 g Na₂CO₃ 溶于800 ml中，用1M的 NaOH调pH至9.5～9.6之间，定容至1000 ml。

封闭液：称取牛血清白蛋白2.0 g，以100 ml PBS溶液溶解,混匀备用。

终止液：量取42 ml浓硫酸，缓慢加至400 ml水中，边加入边搅拌，冷却后定容至750 ml。

样品稀释液/洗液：含0.05% Tween-20的PBS。

供试品/参考品处理液：量取20%二乙醇胺1.25ml和10% Triton X-100 0.20 ml，加PBS 8.55 ml，混匀备用。

参考品及供试品处理：

供试品解吸附：分别精密量取同批次供试品1、供试品2和供试品3 0.2 ml置于三个1.5ml EP管，分别加入0.2 ml的供试品/参考品处理液，加盖混匀，20～28℃，30～35分钟，得到供试品解吸附处理液。

将供试品解吸附处理液和未解吸附的供试品上清均于6500 g离心5分钟，取上清液，得到供试品解吸附及未解吸附上清；用样品稀释液从预稀释20倍开始进行2次独立2倍稀释，得到浓度约为1000 ng/ml、500 ng/ml的供试品解吸附稀释液，供试品未解吸附上清分别稀释2倍、4倍得供试品未解吸附上清液。

参考品处理：根据参考品（0.48mg/ml）标示抗原含量，具体以150 mmol/L氯化钠溶液稀释至80 μg/ml，再加等量供试品/参考品处理液稀释至40 μg/ml，得已处理的参考品稀释液，取已处理的参考品稀释液，在EP管内用样品稀释液将其稀释至4000 ng/ml，然后进行2倍稀释7个点（浓度2000、1000、500、250、125、62.5和31.25ng/ml）。

质控品稀释

取已处理的参考品稀释液，在EP管内用样品稀释液将其稀释为4000 ng/ml，然后稀释至800 ng/ml 做为高浓度质控点（QCH）；稀释至200 ng/ml 作为低浓度质控点（QCL）。

实施例2

包被：将浓度2.1 mg/ml的RBD抗体稀释至5 μg/ml后，预包被至96孔酶标板中，包被量为100 μl/孔，放置于6℃，15小时。

封闭：将包被板从2～8℃取出后，洗板4次，每次洗液体积为300 μl/孔，在吸水纸上拍干，加入封闭液，300 μl/孔，盖封板膜，温度37±1℃孵育90分钟。

加样：取出封闭的酶标板，加洗涤液300 μl/孔，轻轻震荡约30s，弃掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；将实施例1中配制的稀释好的各个浓度的工作参考品、质控品及供试品解吸附稀释液、供试品未解吸附上清液分别加入到不同板孔中，100 μl/孔，平行2个复孔；加入100 μl/孔样品稀释液作为阴性对照，平行2孔；盖上封板膜，温度37±1℃孵育60分钟。

加酶标记二抗：弃去孔内液体，用洗涤液洗板4次，在吸水纸上拍干；加入稀释的酶标记二抗，100 μl/孔，盖封板膜，温度37±1℃，孵育60分钟。

显色：弃去孔内液体，洗板4次，在吸水纸上拍干；加TMB显色液，100 μl/孔，温度37±1℃避光显色15分钟。

终止：显色结束后立即加终止液100 μl/孔，轻微震荡混匀。

读数：加终止液后，立即将酶标板放入酶标仪，在450 nm/620 nm 波长下读取吸光度值。

实施例3

数据处理：

1）标准曲线绘制：以参考品的浓度值为横坐标（ng/ml），相应的扣除阴性对照吸光度（OD）值后的平均OD值为纵坐标，进行四参数拟合，生成S曲线及四参数方程，标准曲线和质控品数据满足系统适用性判定标准，则拟合通过；

拟合曲线R²小于0.990，应重新进行实验。

得到的标准曲线方程如下:

y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D 式c；

式中，A= 2.00742；B = -0.82100；C= 314.08530；D= -0.09311。

R²为0.99981，符合要求。

2）质控品回收率计算：将QCH和QCL的吸光度值扣除阴性对照OD值后分别代入标准曲线，计算抗原含量，通过以下公式a计算回收率：

回收率（%）= A/B×100% 式a；

其中A：质控品的测定值；B：质控品的理论值。

不同浓度质控品的回收率均应在80%～120%之间。

经计算，质控品回收率：800ng/ml回收率为105%，200ng/ml回收率88%，均符合要求。

3）供试品吸附率计算：将供试品解吸附及未解吸附上清的吸光度值扣除阴性对照OD值后分别代入标准曲线，计算稀释液的抗原含量，再乘以稀释倍数，取平均值后得到供试品及其上清的相对抗原量。按下式b计算供试品吸附率，吸附率应不低于95%。

P(%)＝(1- Cs/ Ct)×100% 式b；

其中，P为吸附率（%）； Cs为供试品未解吸附上清液的抗原含量，μg/ml；Ct为供试品解吸附的抗原含量，μg/ml。

试验结果：取同批次供试品，进行重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测，结果参见表3。

表3

结果表明：本发明提供的检测方法适合重组新型冠状病毒疫苗半成品吸附完全性检测及相关研究工作。

实施例4

一种重组新型冠状病毒疫苗的检测试剂盒，包括包被RBD抗体的酶标板、酶标二抗、参考品、样品稀释液和洗涤液。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)预包被RBD抗体至检测板中，得包被板；

(2)封闭所述包被板，孵育，得封闭酶标板；

(3)将工作参考品以0.9％氯化钠溶液稀释至80ug/ml，加等量供试品/参考品处理液，再以样品稀释液倍比稀释，得梯度浓度的工作参考品备用；

(4)将供试品与供试品/参考品处理液混合，在20～28℃条件下解吸附30～35分钟得到供试品解吸附处理液，再离心，取上清液，得到供试品解吸附上清，用样品稀释液稀释为1000～500ng/ml浓度的供试品解吸附稀释液备用；

(5)将供试品离心，取上清，得到供试品未解吸附上清液；

(6)将步骤(2)所述封闭酶标板洗板后，将所述梯度浓度的工作参考品、供试品解吸附稀释液和供试品未解吸附上清液分别加入到板孔中，以样品稀释液作为阴性对照，孵育；

(7)待步骤(6)孵育结束，去除板内孵育液后洗板，加入稀释的酶标记二抗，孵育；

(8)待步骤(7)孵育结束，去除板内孵育液后洗板，加底物显色液，避光显色；

(9)终止显色；

(10)读数：统计读取吸光度值；

所述样品稀释液/洗液：含0.05％Tween-20的PBS；

所述供试品/参考品处理液：量取20％二乙醇胺1.25ml和10％TritonX-1000.20ml，加PBS 8.55ml，混匀备用。

2.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述RBD抗体的包被浓度为5μg/ml，所述RBD抗体的包被量100μl/孔；所述预包被的温度为2～8℃，所述预包被的时间为15～20小时。

3.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(2)中封闭用封闭液：称取牛血清白蛋白2.0g，以100mlPBS溶液溶解；所述封闭液的体积为300μl/孔。

4.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(6)中所述供试品解吸附稀释液、供试品未解吸附上清液或样品稀释液的添加体积均为100μl/孔；所述样品稀释液为含0.05％Tween-20的PBS。

5.如权利要求4所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(6)还包括通过梯度浓度的工作参考品来绘制标准曲线；

根据所述标准曲线拟合得到的标准曲线方程如式c所示：

y＝(A-D)/[1+(x/C)^B]+D 式c；

式中，A＝2.00742；B＝-0.82100；C＝314.08530；D＝-0.09311；

步骤(6)还包括添加高浓度和低浓度的质控品来统计回收率；

高浓度的质控品是由40μg/ml所述工作参考品稀释液稀释至800ng/ml得到；低浓度的质控品是由40μg/ml所述工作参考品稀释液稀释至200ng/ml得到。

6.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，所述步骤(7)所述酶标记二抗的添加体积为100μl/孔，所述酶标记二抗的稀释度为1:8000～10000。

7.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，所述步骤(8)所述底物显色液的添加体积为100μl/孔。

8.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(2)、步骤(6)和步骤(7)中所述孵育的温度为37±1℃，所述孵育的时间为90分钟；步骤(2)、步骤(6)～(8)中还包括洗板，每次洗板洗涤液的体积为300μl/孔，所述洗涤液为0.05％Tween-20的PBS。

9.如权利要求1所述的一种重组新型冠状病毒疫苗吸附完全性检测方法，其特征在于，步骤(10)具体为：将终止反应后的酶标板放入酶标仪，在450nm/620nm波长下读取吸光度值。