WO2021232714A1 - 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 - Google Patents

一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 Download PDF

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WO2021232714A1
WO2021232714A1 PCT/CN2020/129718 CN2020129718W WO2021232714A1 WO 2021232714 A1 WO2021232714 A1 WO 2021232714A1 CN 2020129718 W CN2020129718 W CN 2020129718W WO 2021232714 A1 WO2021232714 A1 WO 2021232714A1
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novel coronavirus
enzyme
labeled
fitc
antigen
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PCT/CN2020/129718
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刘萍
栾大伟
张振斌
张丽辉
王程飞
刘汉昆
寇悦
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博奥赛斯（天津）生物科技有限公司
重庆医科大学
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    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of immunoassay detection, and particularly relates to an enzyme-linked immunoassay detection kit for a novel coronavirus IgM antibody.
  • Coronaviruses are single-stranded positive-stranded RNA viruses.
  • the new coronavirus (2019-nCoV) belongs to the seventh category.
  • coronavirus pneumonia is an acute infectious pneumonia, and its pathogen is a new type of coronavirus that has not been previously found in humans, that is, the 2019 new type of coronavirus.
  • Spread through respiratory droplets and close contact are the main routes of transmission, and it is possible to spread through aerosols when exposed to high concentrations of aerosols for a long time in a relatively closed environment.
  • the initial symptoms of the patients were mostly fever, fatigue and dry cough, and gradually developed severe symptoms such as dyspnea. Most patients have a good prognosis, and some severe cases can develop acute respiratory distress syndrome or septic shock, or even die.
  • nucleic acid testing must be carried out in qualified and qualified laboratories.
  • There are shortcomings such as long testing time, high sample collection requirements, multiple steps, high site and equipment requirements, and it is difficult to carry out large-scale testing.
  • the use of immunoassay for antibody detection can be used to screen high-risk populations.
  • IgM can be used for clinical auxiliary diagnosis or epidemiological monitoring of primary infection of novel coronavirus pneumonia in the middle and late stages. How to achieve this clinical auxiliary diagnosis has become an urgent need to solve The problem.
  • the present invention aims to provide an enzyme-linked immunosorbent assay kit for the new type of coronavirus IgM antibody, which has simple operation, fast speed, low cost, and low laboratory requirements compared with the existing nucleic acid detection kits.
  • An enzyme-linked immunosorbent assay kit for a novel coronavirus IgM antibody including an anti-FITC antibody enzyme-labeled plate, FITC-labeled novel coronavirus antigen, and horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody.
  • the novel coronavirus antigen in the FITC-labeled novel coronavirus antigen includes four synthetic polypeptides as shown in Table 1 or a recombinant antigen that includes the amino acid sequences of the four synthetic polypeptides as shown in Table 1.
  • novel coronavirus antigen in the FITC-labeled novel coronavirus antigen may have an amino acid sequence as shown in Table 2:
  • the mass ratio of the 4 synthetic polypeptides is (0.5-2): (0.5-2): (0.5-2): (0.5-2); preferably, 1 :1:1:1.
  • the preparation of the FITC-labeled novel coronavirus antigen includes the following steps:
  • step 2) Dialysis the labeling solution completed in step 2) above with 0.01-0.05M PBS at 2-8°C for 24 hours, add an equal volume of glycerol, and store at -20°C.
  • the stop solution is one of concentrated sulfuric acid, hydrochloric acid, and sodium hydroxide.
  • it also includes a diluent; MES 2-5g/L; NaCl 2-10g/; BSA 5-20g/L; Dextran 2000 1-5g/L; Tween-20 1-5mL/L; ProClin TM 300 1-5mL/L; pH 8.0 ⁇ 0.20.
  • MES 2-5g/L NaCl 2-10g/
  • BSA 5-20g/L Dextran 2000 1-5g/L
  • ProClin TM 300 1-5mL/L
  • pH 8.0 ⁇ 0.20 a diluent
  • the working concentrations of FITC-labeled novel coronavirus antigen and horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody are both 0.01-0.5 ⁇ g/mL.
  • the preparation of the anti-FITC antibody ELISA plate includes the following steps: dilute the anti-FITC antibody with 0.02-0.05M phosphate buffer to 1-5 ⁇ g/mL, and add it to the transparent plastic ELISA plate at 2-8°C. Coating for 16-24 hours; discard the liquid in the well, wash the plate with pH 7.4 PBS buffer, and then add a phosphate buffer containing 0.5-2% BSA and 1-5% trehalose to seal the microwell plate. Seal at 2-8°C for 16-24 hours; discard the liquid in the hole, spin dry and dry at 37°C for 4-12 hours; put it into an aluminum foil bag, add desiccant, seal, label, and store at 2-8°C.
  • the preparation method of horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody is as follows:
  • HRP Horseradish peroxidase
  • step 1) Mix the solution prepared in step 1) and step 2) at a volume ratio of 1:1, and react at 2-8°C in the dark for 0.5-2h;
  • the anti-FITC antibody ELISA plate, the solid phase carrier of the ELISA plate is a 96-well or 48-well transparent microtiter plate, and the average variation between wells is not higher than 10%.
  • Functionality Matching with other qualified components can ensure the compliance rate of the negative reference product, the compliance rate of the positive reference product, the lowest detection limit, precision and stability of the 2019-nCoV IgM antibody determination. Store at 2 ⁇ 8°C.
  • FITC labeling the new coronavirus antigen must meet (1) Appearance: clear, orange-yellow, without turbid precipitation. (2) Functionality: Matching with other qualified components can ensure the compliance rate of negative reference products, positive reference product compliance rate, minimum detection limit, precision and stability of the 2019-nCoV IgM antibody determination. Store at 2 ⁇ 8°C.
  • Horseradish peroxidase labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody must meet (1) Appearance: clear and transparent, without turbid precipitation. (2) Functionality: Matching with other qualified components can ensure the compliance rate of negative reference products, positive reference product compliance rate, minimum detection limit, precision and stability of the 2019-nCoV IgM antibody determination. Store at 2 ⁇ 8°C.
  • Enterprise reference products can be provided as needed, including negative reference products, positive reference products, minimum detection limit reference products, and precision reference products.
  • Negative reference products 20 corporate negative reference products (N1-N20) shall be tested without false positives, and the compliance rate of negative reference products is 20/20.
  • Preparation select 20 new coronavirus IgM antibody negative serum samples, which contain positive interference samples such as influenza A virus, influenza B virus, and Mycoplasma pneumoniae. After inactivation and dilution by a certain multiple, each aliquot is 0.5mL , Store at -20°C.
  • test 10 corporate positive reference products (P1-P10) without false negatives, and the compliance rate of positive reference products is 10/10.
  • P1-P10 corporate positive reference products
  • the compliance rate of positive reference products is 10/10.
  • the lowest detection limit reference product the company detection limit reference product L1-L4 should be tested, L1 and L2 should be tested as positive, L3 can be tested as positive or negative, and L4 should be tested as negative.
  • L1-L4 The lowest detection limit reference product, the company detection limit reference product L1-L4 should be tested, L1 and L2 should be tested as positive, L3 can be tested as positive or negative, and L4 should be tested as negative.
  • the kit should also include a negative control and a positive control reagent.
  • the negative control is prepared by adding a buffer containing bovine serum albumin to ProClin TM 300 with a volume concentration of 1%. Divide, label, and store at 2 ⁇ 8°C.
  • the formula of the buffer solution is: 5-15g/L BSA, 0.01-0.02mol/L PBS (pH value: 7-8, validity period: 14 months)
  • Positive control, preparation method mix 5 positive human serums, heat-inactivate them at 56°C for 45 minutes, dilute them with a buffer containing bovine serum albumin to a suitable working concentration, add 1-5% ProClin TM 300 by volume, Divide, label, and store at 2 ⁇ 8°C.
  • the formula of the buffer solution is: 5-15g/L BSA, 0.01-0.02mol/L PBS (PH value: 7-8, validity period: 14 months).
  • a new type of coronavirus (2019-nCoV) IgM antibody detection kit (enzyme-linked immunoassay) of the present invention uses an enzyme-linked immunoassay (ELISA) measurement system, which consists of an immune response system and a microplate reader measurement system.
  • ELISA enzyme-linked immunoassay
  • microplate reader Use a microplate reader to read the OD value produced by the immunoreaction product and the chromogenic reagent to indicate the presence or absence of the immunoreactant and its content, so as to achieve the detection of the antigen or antibody substance content. It has the advantages of high sensitivity and strong specificity.
  • This product uses the principle of indirect method to detect the new coronavirus IgM antibody in human serum. Add the FITC-labeled novel coronavirus recombinant antigen or synthetic peptide and sample to the reaction well of the ELISA plate. If the sample contains the novel coronavirus IgM antibody, it will form a complex with the synthetic polypeptide or recombinant antigen in the above reagents and bind to the package. On the quilt, wash away free components.
  • horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody to the reaction tube, horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody is used as the secondary antibody, which binds to the IgM antibody in the sample to form horseradish Peroxidase labels the antibody-IgM antibody-complex to wash away free components.
  • Chromogenic Solution A and Chromogenic Solution B and react at 37 ⁇ 1°C.
  • Add stop solution select the microplate reader 450nm to detect the OD value.
  • the novel coronavirus IgM enzyme immunoassay kit of the present invention has the following advantages:
  • Figure 1 is a ROC curve analysis diagram of the embodiment
  • test reagents used in the following examples are all conventional biochemical reagents; the experimental methods, unless otherwise specified, are all conventional methods.
  • An enzyme-linked immunosorbent assay kit for novel coronavirus IgM antibody including anti-FITC antibody enzyme-labeled plate, FITC-labeled novel coronavirus antigen, horseradish peroxidase-labeled mouse anti-human IgM monoclonal antibody, corporate reference materials, negative Control, positive control, substrate solution, concentrated lotion, physiological saline, reaction tube.
  • the preparation method of the anti-FITC antibody ELISA plate is as follows: dilute the anti-FITC antibody to 1 ⁇ 5 ⁇ g/mL with 0.02M phosphate buffer solution, and add it to the 96-well transparent plastic ELISA plate at the same time, and coat at 2-8°C for 16- 24 hours; discard the liquid in the well, wash the plate with pH 7.4 PBS buffer, then add 0.5-5% BSA, 2-5% trehalose-containing phosphate buffer to block the microwell plate, and block at 2-8°C 16 -24 hours; discard the liquid in the hole, dry it and dry it at 37°C for 20-24 hours; put it into an aluminum foil bag, add desiccant, seal, label, and store at 2-8°C.
  • the novel coronavirus antigen is 4 kinds of synthetic peptides mixed at the same mass ratio; the amino acid sequences of the 4 kinds of synthetic peptides are shown below,
  • FITC-labeled novel coronavirus synthetic polypeptide used in this application can be synthesized by the above method, or can be synthesized by other existing conventional methods, as long as it can achieve the connection of FITC and the novel coronavirus synthetic polypeptide.
  • the 20-fold concentrated lotion includes 58g/L disodium hydrogen phosphate, 5.92g/L sodium dihydrogen phosphate, 180g/L NaCl, 10 mL/L Tween-20 and 2% Proclin300 by mass concentration.
  • Negative control and positive control reagents including the negative control, the preparation method: add the buffer containing bovine serum albumin to 1% volume concentration of ProClin TM 300. Divide, label, and store at 2 ⁇ 8°C.
  • the formula of the buffer solution is: 10g/L BSA, 0.02mol/L PBS (pH value: 7-8, validity period: 14 months)
  • Positive control preparation method: mix 5 positive human serum, heat-inactivate at 56°C for 45 minutes, dilute to working concentration with buffer containing bovine serum albumin, add ProClinTM 300, subpackage, label, and store at 2 ⁇ 8°C.
  • the formula of the buffer solution is: 10g/L BSA, 0.02mol/L PBS (pH value: 7-8, validity period: 14 months).
  • the preparation of the diluent includes the following steps. In 1.7L process water, add 7.96g MES, 9g NaCl, and stir until completely dissolved; then add 20g BSA, 5g dextran 2000 and stir overnight until completely dissolved; then add 2.0mLTween-20, 4.0mL ProClinTM300, stirring for 30 minutes. Dilute the volume to 2L with purified water, measure the pH value with a pH meter, and adjust the pH value within the range of 8.0 ⁇ 0.20 with 6M HCl or 2M NaOH.
  • the steps of the modified sodium periodate oxidation method include:
  • HRP Horseradish peroxidase
  • step 4) Dialysis the labeling solution completed in step 3) above with 0.01M PBS at 2-8°C for 24 hours, add an equal volume of glycerol, and store at -20°C.
  • Liquid preparation Dilute the 20-fold concentrated lotion 1:20 with purified water (475mL purified water plus 25mL concentrated lotion). If there are crystals in the concentrated lotion, place the concentrated lotion at room temperature or 37°C for the crystals to dissolve before diluting.
  • Sample processing Take 1mL of physiological saline, add 20 ⁇ L of sample, mix well, mix well with a vortex mixer for 5 seconds, and start the experiment after standing still for 15 minutes.
  • microplate reader model HBS-1101
  • manufacturer Nanjing Detie Experimental Equipment Co., Ltd.
  • Test method Take out the kit after storing it at 37°C for 7 days, and test the enterprise reference product.
  • the S/CO value is the OD value/cutoff value of the test sample.
  • the ROC curve is used to determine the sensitivity and specificity of the kit under different cutoff values, and the optimal cutoff value is screened out, with a value of 0.1.
  • the ROC curve analysis result shows that the area under the curve is 0.959, indicating that the kit of the present invention has high accuracy in clinical diagnosis.

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Abstract

一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体，通过抗原抗体的免疫学特异性反应测定样本中是否存在新型冠状病毒IgM抗体，该试剂盒操作简便，高通量，高灵敏度，速度快，成本低。

Description

一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒 技术领域
本发明属于免疫分析检测技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒。
背景技术
冠状病毒属于单股正链RNA病毒，既往已知感染人的冠状病毒有6种，即HCoV-229E、HCoV-OC43、SARSr-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1和MERSr-CoV。新型冠状病毒(2019-nCoV)属于第7种。
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，即2019新型冠状病毒。经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况中存在经气溶胶传播的可能。患者初始症状多为发热，乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。
目前临床实验室的检测方法主要依靠核酸检测，但核酸检测要在有条件和资质的实验室进行，存在检测时间长、样本采集要求高、步骤多、场地和设备要求高等不足，难以大规模开展。而用免疫测定进行抗体检测则可用于对高危人群的筛检，IgM可用于新型冠状病毒感染肺炎原发感染中后期临床辅助诊断或者流行病学监测，如何实现这一临床辅助诊断，成为亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，与现有核酸检测试剂盒相比具有操作简便，速度快，成本低，对实验室要求低等特点。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括如表1所示的4种合成多肽或包括如表1所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，
表1 合成多肽的氨基酸序列
Figure PCTCN2020129718-appb-000001
Figure PCTCN2020129718-appb-000002
FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原可以为具有如表2所示氨基酸序列：
表2 重组抗原的氨基酸系列信息
Figure PCTCN2020129718-appb-000003
优选的，新型冠状病毒抗原包括4种合成多肽时，4种合成多肽的质量比为(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)；优选的，1:1:1:1。
优选的，所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1)将新型冠状病毒抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析1-2h，当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；
2)当新型冠状病毒抗原为重组抗原时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比(2-4):1进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
当使用新型冠状病毒合成多肽时，将FITC与合成多肽按摩尔比1:(1-3)进行混合，避光37℃反应6-12h。
3)将上述步骤2)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
优选的，还包括TMB显色剂A液和B液、以及终止液；所述终止液为浓硫酸，盐酸，氢氧化钠中的一种。
优选的，还包括稀释液；MES 2-5g/L；NaCl 2-10g/；BSA 5-20g/L；葡聚糖2000 1-5g/L；Tween-20 1-5mL/L；ProClin TM300 1-5mL/L；pH 8.0±0.20。
优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
优选的，抗FITC抗体酶标板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含质量浓度0.5-2％BSA，1-5％的海藻糖的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4-12小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
优选的，辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配置5-10mg/mL HRP溶液；
2)配置10-20mg/mL过碘酸钠NaIO 4溶液；
3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应0.5-2h；
4)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应10-30min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:(1:4)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
3)配置浓度为2-5mg/mL的NaBH 4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH 4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存
抗FITC抗体酶标板，酶标板的固相载体为96孔或48孔的透明微孔板，孔间平均变异不高于10％。功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
FITC标记新型冠状病毒抗原，需满足(1)外观：澄清，呈橙黄色，无混浊沉淀。(2)功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低 检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体，需满足(1)外观：澄清透明，无混浊沉淀。(2)功能性：配对其他合格组分，能确保2019-nCoV IgM抗体测定的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度和稳定性。储存于2～8℃。
可以根据需要提供企业参考品，包括阴性参考品，阳性参考品，最低检出限参考品，精密度参考品。
阴性参考品，对20份企业阴性参考品(N1-N20)进行检测，不得出现假阳性，阴性参考品符合率20/20。制备，选取20份新型冠状病毒IgM抗体阴性血清样本，其中包含甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体等阳性干扰样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
阳性参考品，对10份企业阳性参考品(P1-P10)进行检测，不得出现假阴性，阳性参考品符合率10/10。制备，选取10份不同发病时间、发病程度及抗体不同反应强度的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后经一定倍数稀释后，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
最低检出限参考品，对企业检出限参考品L1-L4进行检测，L1和L2应检为阳性，L3可检为阳性或阴性，L4应检出阴性。制备，选取5份不同发病时间的新型冠状病毒IgM抗体阳性血清样本，灭活后混合，按照一定比例稀释，分别得到L1-L4，每份分装量为0.5mL，-20℃保存。
精密度参考品，检测应满足以下精密度，(1)批内精密度：检测企业精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据阳性质控品测定结果(S/CO)的平均值
Figure PCTCN2020129718-appb-000004
与标准差(SD)，根据公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合以下要求①阴性质控品：阴性检出率应为100％(n＝20)；②弱阳性质控品：阳性检出率应≥90％(n＝20)；③阳性质控品：阳性检出率为100％，且CV≤10％(n＝20)。变异系数(CV％)＝SD/平均值×100％…………公式(1)
(2)批间精密度：计算，用三批试剂盒检测企业参考品中精密度阳性质控品，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差(SD)，根据公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合以下要求：检测企业参考品中精密度阳性质控品，阳性检出率应为100％，且CV≤15％。
试剂盒中还应包括阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入体积浓度1％的ProClin  TM 300。分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/L BSA，0.01-0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至适合的工作浓度，加入体积浓度1-5％ProClin TM 300，分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：5-15g/L BSA，0.01-0.02mol/L PBS(PH值：7-8，有效期：14个月)。
本发明一种新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)采用的是酶联免疫 分析(ELISA)测定系统，该系统由免疫反应系统和酶标仪测定系统组成，用酶标仪读取免疫反应后的产物与显色剂所产生OD值来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低，以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。具有灵敏度高、特异性强等优点。
本产品采用间接法原理检测人血清中的新型冠状病毒IgM抗体。将FITC标记新型冠状病毒重组抗原或合成多肽和样本加入到酶标板反应孔中，若样本中含有新型冠状病毒IgM抗体，则与以上试剂中的合成多肽或重组抗原形成复合物，结合到包被板上，洗掉游离成分。将辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体加入反应管中，辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体作为二抗，与样本中的IgM抗体结合，并形成辣根过氧化物酶标记抗体-IgM抗体-复合物，洗掉游离成分。加入显色液A、显色液B，在37±1℃条件下反应。加入终止液，选择酶标仪450nm检测OD值。
相对于现有技术，本发明所述的一种新型冠状病毒IgM的酶免检测试剂盒，具有以下优势：
Figure PCTCN2020129718-appb-000005
附图说明
图1为实施例的ROC曲线分析图；
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体、企业参考品，阴性对照，阳性对照，底物液，浓缩洗液，生理盐水，反应管。
抗FITC抗体酶标板的制备方法为：将抗FITC抗体用0.02M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同 时加入到96孔透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH7.4PBS缓冲液洗板，然后加入含0.5-5％BSA，2-5％的海藻糖的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干20-24小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
1)将FITC与新型冠状病毒合成多肽按摩尔比1:1进行混合，避光37℃反应12h。
2)将上述步骤1)完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
其中，新型冠状病毒抗原为4种合成多肽按相同质量比混合；4种合成多肽的氨基酸序列如下所示，
表1 合成多肽的氨基酸序列
Figure PCTCN2020129718-appb-000006
需要说明的是，本申请使用的FITC标记的新型冠状病毒合成多肽可为以上方法合成，也可以通过其他现有的常规方式合成，只要能够达到将FITC与新型冠状病毒合成多肽连接就可以。
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和质量浓度2％Proclin300。
阴性对照以及阳性对照试剂，其中阴性对照，制备方法：将含牛血清白蛋白的缓冲液加入1％体积浓度的ProClin  TM 300。分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：10g/L BSA，0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)
阳性对照，制备方法：取5份阳性人血清混合，经56℃热灭活45分钟，用含牛血清白蛋白的缓冲液稀释至工作浓度，加入ProClinTM 300，分装，贴标签，储存于2～8℃。其中缓冲液的配方为：10g/L BSA，0.02mol/L PBS(pH值：7-8，有效期：14个月)。
稀释液的制备包括如下步骤，在1.7L工艺用水中，加入7.96gMES、9g NaCl，搅拌至完全溶解；再加入20g BSA、5g葡聚糖2000搅拌过夜至完全溶解；再加入2.0mLTween-20、4.0mL ProClinTM300，搅拌30分钟。用纯化水定容至2L，用pH计测定其pH值，用6M HCl或2M NaOH调整pH值在8.0±0.20范围内的要求。
采用改良高碘酸钠氧化法将鼠抗人IgM单克隆抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度0.01～0.5μg/mL，并加入10％酶稳定剂，储存于2～8℃；
改良过碘酸钠氧化法步骤包括：
A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
1)配置10mg/mL HRP溶液；
2)配置12.8mg/mL过碘酸钠NaIO 4溶液；
3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1：1混匀，2-8℃避光反应30min；
4)配置浓度为20μL/mL的乙二醇水溶液，与上述溶液3)以相同体积混合，常温避光反应20min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
1)将待标记原料装入透析袋中，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，透析30min；
2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:3进行混合，之后用0.05M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析24h(期间换液2-3次)；
3)配置浓度为2mg/mL的NaBH 4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应2h；
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
本发明试剂盒的反应步骤：
1、将试剂盒各组分在室温(18～25℃)下平衡30分钟。
2、配液：用纯化水将20倍浓缩洗液按1:20稀释(475mL纯化水加25mL浓缩洗液)。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。
样品分析过程：
1、样本处理：取1mL生理盐水，加入20μL样本，混匀，用漩涡混匀仪混匀5秒，静止15分钟后开始实验。
2、根据实验需要取出适量的包被板条。设置阳性对照、阴性对照各2孔，空白孔1孔，其余为待检样本孔。每孔先加入50μL FITC标记新型冠状病毒抗原(合成多肽)，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
3、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗一次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
4、加入50μL处理后样本或阴性、阳性对照、预留空白对照。
5、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应30分钟。
6、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
7、加入50μL辣根过氧化酶标记鼠抗人IgG单克隆抗体。
8、手工或机器轻轻振荡10秒混匀，用盖板膜将板孔盖好，在37℃下反应15分钟。
9、揭去盖板膜，吸出或倒出反应液后，加入洗液洗五次，洗液量每次每孔不少于300μL，浸泡时间10秒，吸出或倒出洗液后拍干。也可用洗板机洗涤。
10、每孔加入显色液A、显色液B各50μL，在37±1℃条件下反应15分钟。
11、每孔加入50μL终止液，选择酶标仪450nm检测OD值。
该产品临床试验以《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》明确的疾病确诊/排除标准为对比，选取684例病例，其中确诊病例282例，排除病例402例。
该实施例制备的试剂盒检测效果评价如下：
以下检测使用的仪器是：酶标仪型号：HBS-1101；生产厂家：南京德铁实验设备有限公司。
1、稳定性
1.1设计要求：试剂盒37±1℃放置7天，外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、最低检出限、精密度检测结果均应符合设计要求。
1.2试验方法：将试剂盒在37℃存放7天后取出，检测企业参考品。
1.3试验结果
表3
Figure PCTCN2020129718-appb-000007
表4 检测数据
Figure PCTCN2020129718-appb-000008
Figure PCTCN2020129718-appb-000009
Figure PCTCN2020129718-appb-000010
Figure PCTCN2020129718-appb-000011
2.精密度
2.1设计要求
2.1.1批内精密度：检测企业参考品中3个不同水平精密度参考品，应符合以下要求
2.1.1.1精密度参考品N：阴性检出率应为100％(n＝20)；
2.1.1.2精密度参考品L：阳性检出率应≥90％(n＝20)；
2.1.1.3精密度参考品CV：阳性检出率为100％，且CV≤10％(n＝20)。
2.1.2批间精密度：检测企业参考品中精密度参考品CV，阳性检出率应为100％，且CV≤15％。
2.2试验方法
2.2.1批内精密度：检测企业精密度参考品，每个水平重复检测20次，计算阴性检出率、阳性检出率。依据测定结果(S/CO)的平均值
Figure PCTCN2020129718-appb-000012
与标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合2.1.1要求。
变异系数(CV％)＝SD/平均值×100％…………公式(2)
2.2.2批间精密度：用三批试剂盒检测企业参考品中精密度参考品CV，每批次测试20管，计算阳性检出率。同时计算60次检测结果的平均值和标准差(SD)，根据公式(2)计算变异系数(CV)，结果应符合2.1.2要求。
2.3企业精密度参考品测定结果
表5
Figure PCTCN2020129718-appb-000013
Figure PCTCN2020129718-appb-000014
Figure PCTCN2020129718-appb-000015
3、灵敏度以及特异性
表6 排除2019-nCoV感染的部分检测结果
样本编号 性别 年龄 诊断 OD S/CO IgM判断 核酸
EM-0031 女 40 排除 0.0476 0.48 - -
EM-0034 女 48 排除 0.0173 0.17 - -
EM-0059 女 17 排除 0.0090 0.09 - -
EM-0060 男 54 排除 0.0361 0.36 - -
EM-0072 男 33 排除 0.0280 0.28 - -
EM-0073 男 33 排除 0.0171 0.17 - -
EM-0132 女 29 排除 0.0826 0.83 - -
EM-0133 女 25 排除 0.0566 0.57 - -
EM-0193 女 5 排除 0.0999 1.00 - -
EM-0194 男 43 排除 0.0372 0.37 - -
EM-0215 女 3 排除 0.0922 0.92 - -
EM-0216 女 60 排除 0.0121 0.12 - -
EM-0228 男 76 排除 0.0228 0.23 - -
EM-0230 女 13 排除 0.0910 0.91 - -
EM-0293 女 27 排除 0.0184 0.18 - -
EM-0294 女 1 排除 0.0304 0.30 - -
EM-0324 男 65 排除 0.0609 0.61 - -
表7 确诊2019-nCoV感染的部分检测结果
样本编号 性别 年龄 诊断 发光值 S/CO IgM判断 核酸
EM-0005 男 31 确诊 0.8223 8.22 + +
EM-0006 男 30 确诊 0.6666 6.67 + +
EM-0033 女 57 确诊 1.8572 18.57 + +
EM-0035 女 58 确诊 1.6255 16.26 + +
EM-0235 男 48 确诊 0.8928 8.93 + +
EM-0236 女 34 确诊 1.5510 15.51 + +
EM-0244 女 53 确诊 1.5025 15.03 + +
EM-0246 女 60 确诊 0.3227 3.23 + +
EM-0369 男 33 确诊 1.0774 10.77 + +
EM-0371 女 32 确诊 1.9214 19.21 + +
EM-0408 男 72 确诊 0.4456 4.46 + +
EM-0410 女 43 确诊 0.4289 4.29 + +
EM-0586 男 37 确诊 0.9151 9.15 + +
EM-0656 女 60 确诊 0.4388 4.39 + +
根据检验结果使用SPSS软件进行ROC曲线分析，具体结果如下表所示，ROC曲线分析图如图1所示。
表8
Figure PCTCN2020129718-appb-000016
样本S/CO≥1，检测结果判为阳性；样本S/CO<1，检测结果判为阴性。其中S/CO值为检测样本的OD值/cutoff值。通过ROC曲线确定试剂盒在不同cutoff值的情况下，试剂盒灵敏度及特异性的表现，筛选出最优的cutoff值，其值为0.1。
ROC曲线分析结果显示曲线下面积为0.959，表明本发明所述试剂盒在临床诊断中的准确性较高。
上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

  1. 一种新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体酶标板、FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体。
  2. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原包括如下所示的4种合成多肽或包括如下所示的4种合成多肽的氨基酸序列的重组抗原，
    Figure PCTCN2020129718-appb-100001
  3. 根据权利要求2所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：新型冠状病毒抗原包括4种合成多肽时，4种合成多肽的质量比为(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)：(0.5-2)。
  4. 根据权利要求1～3任一项所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：所述FITC标记新型冠状病毒抗原的制备包括以下步骤，
    1)将新型冠状病毒抗原装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析1-2h，当新型冠状病毒抗原为合成多肽时，省略该步骤；
    2)当新型冠状病毒抗原为重组抗原时，将FITC与新型冠状病毒抗原按摩尔比(2-4):1进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
    当使用新型冠状病毒合成多肽时，将FITC与合成多肽按摩尔比1:(1-3)进行混合，避光37℃反应6-12h；
    3)将上述步骤2)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
  5. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：还包括TMB显色剂A液和B液、以及终止液；所述终止液为浓硫酸，盐酸，氢氧化钠中的一种。
  6. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释液；MES 2-5g/L；NaCl 2-10g/L；BSA 5-20g/L；葡聚糖2000 1-5g/L；Tween-20 1-5mL/L；ProClin TM300 1-5mL/L；pH 8.0±0.20。
  7. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的工作浓度均为0.01～0.5μg/mL。
  8. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：抗FITC抗体酶标板的制备包括如下步骤，将抗FITC抗体用0.02-0.05M磷酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，同时加入到透明塑料酶标板中，2-8℃包被16-24小时；弃去孔内液体，用pH 7.4PBS缓冲液洗板，然 后加入含质量浓度0.5-2％BSA，1-5％的海藻糖的的磷酸盐缓冲液封闭微孔板，2-8℃封闭16-24小时；弃去孔内液体，甩干后于37℃烘干4-12小时；装入铝箔袋，加入干燥剂，封口，贴标签，储存于2～8℃。
  9. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgM抗体的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：辣根过氧化酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体的制备方法如下，
    A：辣根过氧化物酶(HRP)活化
    1)配置5-10mg/mL HRP溶液；
    2)配置10-20mg/mL过碘酸钠NaIO 4溶液；
    3)将步骤1)和步骤2)配制溶液按体积比1：(1-3)混匀，2-8℃避光反应0.5-2h；
    4)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤3)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应10-30min，活化即完成，放-20℃保存(保存时间不超过3个月)；
    B、辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgM单克隆抗体
    1)将待标记原料装入透析袋中，用0.02-0.1M pH8.5-10的碳酸盐缓冲液，透析0.5-2h；
    2)将标记原料与活化的HRP按质量比1:(1-5)进行混合，之后用0.02-0.1M碳酸盐缓冲液于2-8℃透析20-24h，期间换液2-3次；
    3)配置浓度为2-5mg/mL的NaBH 4水溶液，按1mgHRP加80μL配制好的NaBH 4水溶液的比例进行混合，并于2-8℃避光反应1-2h；
    4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01-0.05M PBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
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