CN102914645A - 用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法 - Google Patents

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齐兵玉
李学斌
朱峰胜
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Abstract

本发明涉及一种用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法，其特征在于按以下步骤进行：在固相载体上预先包被抗FITC的抗体，在4-6℃反应8-12小时；然后封闭固相载体上未反应位点，在34-37℃反应1-2小时；再加入FITC标记的抗体，在34-37℃反应1-2小时或4-6℃反应8-12小时，完成对固相载体的包被过程，本发明解决了现有包被抗体浓度高，灵明度低，特异性差的问题。通过在固相载体上预先形成一层包被层，再来固定抗体。本发明方法具有方法简单，成本低，适用性强，范围广等优点。

Description

用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法
技术领域
本发明涉及一种用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法。 
背景技术
在免疫吸附反应过程中的首要条件是，将目的抗体固定到反应载体上。传统的方法是抗体通过物理吸附的方法固定到载体上，即抗体通过物理力被动地吸附于疏水性固相载体的表面，然后使用惰性蛋白将酶联免疫反应载体的其他吸附位点封闭。由于物理性吸附的过程较简单，随机性强，与载体结合位点多样化；且抗体被封闭在惰性蛋白的下方,使检测过程中抗原-抗体结合反应存在一定的空间位阻,影响免疫检测试剂的灵敏度。并且抗体是不均一分布，本与抗原结合的位点部位却与固相载体结合，这部分抗体就失去其功能，从而浪费抗体，同时占有载体的空间而使灵明度降低。 
发明内容
本发明的目的为了克服上述现有技术存在的问题，而提供一种简单有效而且实用的免疫分析反应过程中用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法，有效地提高酶联免疫吸附试验的敏感性、 特异性。 
异硫氰酸荧光素（FITC）是一种具有抗原性的银光素分子，极易与抗体结合形成稳定的结合物，并且不影响抗体结合抗原的活性。一个抗体蛋白可结合2～8个分子的FITC，FITC与抗体蛋白反应式： 
本发明的技术方案为： 
用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法，其特征在于按以下步骤进行：在固相载体上预先包被抗FITC的抗体，在4-6℃反应8-12小时；然后封闭固相载体上未反应位点，在34-37℃反应1-2小时；再加入FITC标记的抗体，在34-37℃反应2小时或4-6℃反应8-12小时，完成对载体的包被过程。 
所述待包被蛋白为抗体或抗原，所述的抗原为小分子抗原，小分子抗原难于固定在固相载体上，如果利用本发明的方法FITC-抗FITC系统，同 样可以间接地、稳定地固定到载体表面。 
在免疫吸附反应中常常使用的固相载体为聚苯乙烯、聚氯乙烯、PVDF膜、纤维素、凝胶或免疫磁珠。因而此方法具有广泛应用的优点，不拘泥材料的限制。 
本发明的抗体均匀地涂布在固定在载体上，反应位点完全暴露出来，形成平滑的包被层。 
用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法具体按以下步骤进行： 
1）， 选择多孔固相载体一块； 
2）， 预包被：用摩尔浓度为0.05mol/L、pH=9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液为包被液将兔抗FITC抗体稀释成1.0 μg/mL，每孔加入100μ.L，4℃反应8－12小时； 
3）， 封闭：倾去包被液，然后每孔加入以质量浓度为1%牛血清白蛋白BSA溶液作为封闭液，250μL/孔，37℃反应1小时； 
4）， 包被目的抗体：用摩尔浓度为0.01mol/L、pH=7.2的三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）-醋酸（TBS）洗涤液稀释FITC标记的目的抗体，浓度为0.05ug/mL，每孔加入100μ.L，4℃反应10小时或者37℃反应2小时； 
5）， 洗板：以摩尔浓度为0.01mol/L、 pH=7.2的Tris碱-醋酸（TBS）洗涤液洗板2－5次，完成对固相载体的包被过程。 
本发明所依据的原理是FITC-抗 FITC放大系统。抗FITC抗体通过通过物理吸附的方法固定到反应载体上，然后使用惰性蛋白将反应载体的其他吸附位点封闭，此过程与传统的方法相同，之后再加入FITC标记的抗体。一个待固定抗体可以结合2－8个FITC分子，只要任意一个FITC分子间接地吸附到载体上，抗体就可以固定在载体上，增加了吸附效率。并且，FITC和抗体结合，通过抗体上的赖氨酸的r氨基，使抗体结合抗原的位点完全暴露出来，平滑的铺在载体上，完全消除了空间位阻效应。 
经试验证实，采用本方法，可以减少预包被抗体10-15倍，明显降低了生产成本。 
本发明先将抗FITC抗体通过物理吸附的方式固定到酶链免疫反应板上，然后使用惰性蛋白将反应载体的其他吸附位点封闭，再将FITC标记的目的抗体与FITC结合，间接的固定到反应载体上，以减小目的抗体与抗原结合反应空间位阻，抗体的免疫位点整齐的排列在载体表面，提高免疫检测试剂的灵敏度，同时减少目的抗体的固相化浓度，极大的降低生产成本。 
附图说明
图1a为本发明的方法固定抗体的示意图；图1b为传统方法固定抗体的示意图； 
图1 a中：
Figure BDA0000239093342
图1b中：
Figure BDA0000239093343
图2是用ELISA法测人再生基因蛋白IV(REG-4)曲线图，其中A为本发明方法结果；B为传统方法结果。 
具体实施方式
本方法因固相载体选择不同，最后选择的实验步骤不同，下面以固相载体为聚苯乙烯酶标板为例来详细说明本发明方法。 
1. 材料与试剂： 
1）抗原与抗体 
抗体：兔抗FITC抗体，FITC-羊抗人REG-4, HRP-羊抗人REG-4 
抗原：人REG-4标准品 
2）固相载体：96孔聚苯乙烯酶标板 
3）试剂 
包被液：摩尔浓度为0.05mol/L 、pH=9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液(CBS)，摩尔浓度为0.05mol/L、 pH=9.5碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液配制将1.59g碳酸钠和2.93g碳酸氢钠用双蒸水溶解至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节pH=9.5。 
封闭液：质量浓度为1%牛血清白蛋白BSA 
洗涤液：摩尔浓度为0.01mol/L、 pH=7.2的三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）-醋酸（TBS） 
配制将1.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）和0.5g氯化钠用双蒸水溶解至1000 mL，用醋酸调节pH=7.2。 
终止液：当量浓度为1N HCl 
显色液：  
a液：100mg3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)加入50 mL无水乙醇中混合均匀，4℃避光保存。 
b液： 
75mg过氧化氢脲加入10 mL三蒸水中混合均匀，4℃避光保存。 
c底物缓冲液：将4.91g的柠檬酸.H2O和19.38g 的Na2HPO4.12H2O溶于1000 mL三蒸水中。 
TMB工作液：取c底物缓冲液9.5 mL，加入32 μL a液和0.5 mL b液混匀即可，现配现用。 
2. 实验过程 
1）， 选择96孔聚苯乙烯酶标板一块； 
2）， 预包被：用摩尔浓度为0.05mol/L、pH=9.5的 CBS为包被液将兔抗FITC抗体稀释成1.0 μg/mL，每孔加入100μ.L， 4℃反应8小时； 
3）， 封闭：倾去包被液，然后每孔加入以质量浓度为1%BSA溶液作为封闭液，250μL/孔，37℃反应1小时； 
4）， 包被目的抗体：用摩尔浓度为0.01mol/L、pH=7.2的TBS洗涤液稀释FITC标记的目的抗体，浓度为0.05ug/mL，每孔加入100μ.L，4℃反应10小时或者37℃反应2小时； 
5）， 洗板：以摩尔浓度为0.01mol/L、pH=7.2的TBS洗涤液洗板3次，完成聚苯乙烯酶标板的包被过程。 
之后，以检测人再生基因蛋白IV(REG-4)为例，进行后继的实验步骤。 
6）， 加样：在包被有抗体的聚苯乙烯酶标板中加入样品，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，在聚苯乙烯酶标板加上盖，37℃反应120分钟。加样时样品加于聚苯乙烯酶标板孔底部，注意不要有气泡，尽量不触及孔壁。 
7）， 弃去液体，洗板3次，加入HRP-羊抗人REG-4, 100ul/孔，轻轻混匀，在聚苯乙烯酶标板加上盖，37℃反应1小时； 
8）， 弃去液体，洗板5次， 
9）， 显色：加入TMB工作液90ul/孔，37℃避光反应30分钟； 
10），比色： 依次每孔加入当量浓度为1N HCl 50ul作为终止溶液，用酶联免疫反应仪450nm波长测量各个孔的光密度（OD450）。 
采用传统的方法，检测人再生基因蛋白IV(REG-4)， 
1）， 包被：用摩尔浓度为0.05 mol/L CBS、pH=9.5为包被液将人的REG-4抗体稀释成1.6 μg/mL，每孔加入100μL， 4℃反应10小时； 
2）， 封闭：倾去包被液，然后每孔加入以质量浓度为1%BSA溶液作为封闭液，250μL/孔，37℃反应1小时。 
之后的步骤与本发明上述的以检测人再生基因蛋白IV(REG-4)的实验步骤6—10完全相同。 
对检测结果进行比较： 
表1.两种方法的OD450比较 
Figure BDA0000239093344
Figure 20121045064561000021
与传统方法相比，其包被抗体浓度是1.6ug/ml，其标准品最高浓度OD450仅有1.793，而本发明方法所需要的抗体浓度为0.1ug/ml，其标准品最高浓度OD450为2.979，因此可节约大量的成本10-20倍。 
表2.两种方法检测结果比较 
Figure BDA0000239093345
从表2数据可以看出，本发明方法的精密度（CV%）在10%以下，回收率在89—105%之间，准确度高。 
同样选用聚氯乙烯、PVDF膜、纤维素、凝胶、免疫磁珠中任意一种固相载体，都可以采用上述相同的方法来做，这里就不一一再述。 

Claims (3)

1.用于免疫吸附反应过程中抗体在固相载体上固定的方法，其特征在于按以下步骤进行：在固相载体上预先包被抗FITC的抗体，在4-6℃反应8-12小时；然后封闭固相载体上未反应位点，在34-37℃反应1-2小时；再加入FITC标记的抗体，在34-37℃反应1-2小时或4-6℃反应8-12小时，完成对固相载体的包被过程。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于：所述的固相载体材料为聚苯乙烯、聚氯乙烯、PVDF膜、纤维素、凝胶或免疫磁珠。
3.根据权利要求书1或2所述的方法，其特征在于按以下步骤进行：1），选择多孔固相载体一块；
2）， 预包被：用摩尔浓度为0.05mol/L、pH=9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液为包被液将兔抗FITC抗体稀释成1.0 μg/mL，每孔加入100μ.L，4-6℃反应8－12小时；
3）， 封闭：倾去包被液，然后每孔加入以质量浓度为1%牛血清白蛋白BSA溶液作为封闭液，250μL/孔，34-37℃反应1小时；
4）， 包被目的抗体：用摩尔浓度为0.01mol/L 、pH=7.2的三羟甲基氨基甲烷-醋酸洗涤液稀释FITC标记的目的抗体，浓度为0.05ug/mL，每孔加入100μL，4-6℃反应10小时或者34-37℃反应2小时；
5）， 洗板：以摩尔浓度为0.01mol/L、pH=7.2 的三羟甲基氨基甲烷-醋酸洗涤液洗板2－5次，完成对固相载体的包被过程。
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