CN114076823A - 固相组分的制备方法及所制备的固相组分 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相组分的制备方法,包括:使用表面活性剂对包被物和/或固相载体进行预处理;将所述包被物包被至所述固相载体上;以及对经包被固相载体进行封闭。该方法能够提高包被物的活性。此外,本发明还涉及由此制备的固相组分,以及表面活性剂的用途。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域;具体涉及在偶联前对固相载体进行预处理。
背景技术
免疫学检测借助抗原和抗体在体外特异性结合后出现的各种现象,对样本中的待测物进行检测,是例如用于诊断肿瘤标志物、甲状腺功能等的有效方法。
常见的免疫学检测方法包括免疫荧光技术、酶联免疫分析法和放射免疫分析法等。无论采用哪种具体检测方法,包被有用于检测待测物的捕获抗原或抗体的固相载体均是免疫学检测试剂的重要组成部分。固相载体为实现检测的自动化,提高检测效率提供有力支持。因此,带有包被物的固相载体的质量对免疫学试剂的性能(如检测灵敏度、特异性等)有至关重要的影响。
将包被物包被至固相载体表面的方法主要包括物理吸附、化学键偶联等。将抗原抗体等生物活性分子连接到固相载体表面实现良好的试剂性能,是整个免疫试剂制造和研发的重点和难点。其中,由于一些包被物存在疏水性强,易沉淀的问题,且活性受环境影响比较大、稳定性差,因此在与固相载体的包被过程中,活性容易丧失,从而导致试剂盒的检测灵敏度和特异性受到影响。如何使包被物在与固相载体包被过程中保持活性,是免疫学检测试剂领域最具挑战性的工作之一。
针对上述问题,目前已进行了一些研究尝试对包被物进行化学修饰,以改善或维持包被物的活性。然而,在化学修饰时,一方面需要将修饰位点避开免疫反应位点;另一方面需要复杂步骤和较为苛刻工艺条件,由此存在操作不便及成本高的缺点。
据此,在免疫学检测领域,存在着简单、低成本地提高包被物在固相载体上的活性的强烈需求。
发明内容
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
为了解决包被物在固相载体上活性以丧失的问题,发明人对包被前的处理过程进行了研究,从而完成了本发明。
有鉴于此,在第一方面,本发明提供了一种固相组分的制备方法,包括:
将所述包被物在存在表面活性剂的条件下进行预处理;
将经预处理的包被物包被至固相载体上;以及
封闭所述固相载体上未包被的位点。
在本发明的一个变型中,提供了一种固相组分的制备方法,包括:
将固相载体在存在表面活性剂的条件下进行预处理;
将所述包被物包被至经预处理的固相载体上;以及
封闭所述固相载体上未包被的位点。
在本发明的又一个变型中,提供了一种固相组分的制备方法,包括:
将包被物和固相载体在存在表面活性剂的条件下分别进行预处理;
将预处理后的包被物包被至经预处理的固相载体上;以及
封闭所述固相载体上未包被的位点。
在本发明中,所制备的固相组分可用于免疫学检测。
图1示例性地示出了本发明的预处理步骤及其与包被步骤的顺序关系。其中,下侧部分显示了对包被物进行预处理的情形,首先将包被物与表面活性剂预处理一段时间,随后将经处理的包被物通过常规的包被过程与固相载体连接;上侧部分显示了对固相载体进行预处理的情形,首先将固相载体与表面活性剂预处理一段时间,随后将包被物通过常规的包被过程与经处理的固相载体连接。此外,图1的中间部分显示了常规的包被流程,其中固相载体与包被物未经表面活性剂预处理,通过常规的包被方式(如物理吸附或化学偶联)连接在一起,形成可用于免疫学检测的固相组分。
通过在包被前使用表面活性剂对包被物和/或固相载体进行预处理,使得包被时的分散性更好,包被物所呈现的位点更多且无非均匀沉积,由此得到固相组分用于制备免疫检测试剂能够改善检测的灵敏度和特异性。
不希望受到理论的束缚,在使用表面活性剂对包被物和/或固相载体进行预处理后,最终包被的状态分散性更好,有利于包被物呈现更多的位点,同时避免了非均匀沉积,从而改善了检测时的灵敏度和特异性。
在一些实施方式中,本发明的表面活性剂可选自由阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂及其组合所组成的组;例如,可选自由季铵盐类表面活性剂、磺酸盐类表面活性剂、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类表面活性剂、聚乙二醇辛基苯基醚类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、甜菜碱型及其组合所组成的组;又例如,可选自由十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠(SDS)、吐温系列、Triton系列、Brij系列、Chaps及其组合所组成的组。
在优选的实施方式中,本发明的表面活性剂为非离子型表面活性剂;例如可选自由吐温系列、Triton系列、Brij系列及其组合所组成的组;具体地,例如可选自由吐温-20、Triton X-100、Brji L23及其及其组合所组成的组;更具体地为Triton系列(如Triton X-100)。
通过选择非离子型表面活性剂来进行预处理,本发明所制备的固相组分在用于免疫学检测时进一步改善了检测的灵敏度和特异性。
本发明的表面活性剂在预处理时可以直接加入或以存在于溶液形式加入。对于溶液的具体类型没有特别的限制,其可以是常规的缓冲溶液,如MES等。
本发明的表面活性剂在加入至包被物和/或固相载体后可以0.05%至1%的体积分数存在;例如,以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%的体积分数存在。在示例性的实施方式中,表面活性剂在加入至包被物和/或固相载体后可以0.2%至1%的体积分数存在。
在使用本发明的表面活性剂进行预处理时,处理时长可以是至少5min,例如,5min至1h,又例如,10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min。在示例性的实施方式中,表面活性剂进行预处理时,处理时长可以是15min至25min。
在使用本发明的表面活性剂进行预处理时,处理温度可以在2℃至26℃的范围内。一个具体的实施方式中,处理温度可以是室温。在示例性的实施方式中,处理温度可以是2℃至8℃。
在本发明中,“固相载体”可与“固相支持物”、“固体支持物”和“固体载体”互换使用,其是指可以结合包被物且适于例如通过物理方式与样本分离的任何合适的固体表面。在一些实施方式中,固相载体是经操作(例如,通过磁力吸附、离心、过滤、分子筛等)可移动地与样本分离的固体表面。示例性的固相载体可以是磁珠(如羧基磁珠)、乳胶珠、琼脂糖珠或玻璃珠,但本发明不限于此。
在发明中,“包被物”是指能包被在固相载体上形成固相组分的物质,其中固相组分可例如与含有可检测的信号标记物的检测组分一起用于免疫学检测,从而检测样本中分析物的存在。
在具体的实施方式中,包被物可以是蛋白和/或多肽,如链抗原和/或抗体,又例如链霉亲和素或亲和素。在本发明中,抗原可以是天然存在或重组产生的,其还包括抗原肽。在本发明中,抗体可以是天然存在或重组产生的,其还包括具有结合活性的抗体片段。
将包被物包被至固相载体上的方法是本领域技术所熟知的,例如,包被可以可使用物理吸附法、化学偶联法(如羧基偶联、氨基偶联)来进行。
其中,物理吸附法的一个具体示例可以是:
磁珠使用PBS缓冲液洗涤三次后磁分离,加入PBS缓冲液,将磁珠重悬;向磁珠溶液中加入抗原或抗体溶液,37℃条件下置于旋转摇床上反应6~8h;反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入TBS溶液37℃条件下置于旋转摇床上封闭2~3h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入TBS溶液重悬。
在本发明中,化学偶联是指对固相载体进行改性或化学修饰,引入小分子(如小于1KDa)活性基团,在通过合适的化学反应将包被物通过化学键与固相载体的表面相连。
可以理解,经包被的固相载体可以作为固相组分,应用于基于不同探测体系的免疫学分析方法中。探测体系是可以基于荧光标记的反应体系、基于酶标记的反应体系、生物发光体系或化学发光体系等。在一个示例性的实施方式中,固相载体包被有抗原,其与酶标记的抗原构成免疫学分析试剂盒,在对样本进行检测的情况下,通过形成固相载体-抗原-抗体-酶标记的抗原的夹心复合物,检测样本中相应抗体的存在。不难理解,本发明的方法所提供的固相组分可适用于任何使用固相组分的免疫学检测方法/试剂盒。
此外,本发明的方法可以包括除了具体提到的步骤之外的步骤。例如,可以在包被前包括对固相载体进行洗涤的步骤,又例如,可以在包被后包括将经包被的固相载体溶解于合适的溶液中的步骤。
洗涤步骤是为了去除不需要/未结合的组分而进行的步骤,可以使用任何常规的洗涤缓冲液,如PBS、TBST等。需要强调的是,通常的洗涤过程中,洗涤缓冲液与待洗涤物的接触时间通常较短,即混合后立即进行吸弃操作,洗涤过程<1min。
另一方面,本发明提供了表面活性剂在固相载体包被抗原和/或抗体中的用途,其中,在包被前,使用所述表面活性对所述固相载体进行预处理和/或对抗原和/或抗体进行预处理。。
本发明的固相组分的制备方法中特征和/或限定同样适用于该用途。
再一方面,本发明提供了一种用于免疫学分析的固相组分,其中,所述固相组分通过本发明的方法所制备。
附图说明
图1示出了本发明的固相载体制备方法的流程与常规的制备方法的流程。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式中的附图,对本发明实施方式中的技术方式进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式,而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式,都属于本发明保护的范围。
试剂配制
第一组分Ra:
使用移液器或量筒量取V1/D1(mL)体积的“磁珠包被物”加入至一个磁珠包被管中置换上清,即将其磁分离后吸走上清然后加入等体积的磁珠包被物稀释液,并混合均匀;将磁珠混匀后加入到盛有(V1-V1/D1)(mL)体积的磁珠包被物稀释液的配液瓶中,即最终总体积为V1(mL);搅拌直至磁珠悬浮液完全混匀,制得第一组分Ra;其中D1为“磁珠包被物”的稀释度;磁珠包被物稀释液为具有缓冲能力的常规稀释液,且含有蛋白及表面活性剂。
第二组分Rb:
使用合适的量筒量取(V2-V2/D2)(mL)体积的酶标结合物稀释液加入到配液瓶中,用移液器或量筒量取V2/D2(mL)体积的“酶标结合物”,加入到酶标结合物稀释液中,即最终总体积为V2(mL);用搅拌器搅拌溶液,使其充分溶解、混匀;将溶液封口后,放置在22℃条件下,静置平衡23小时~25小时;平衡结束时,使用合适的0.22μm孔径过滤器将配制好的溶液进行过滤,收集过滤液,制得第二组分Rb;其中D2为“酶标结合物”的稀释度;酶标结合物稀释液为具有缓冲能力的常规稀释液,且含有蛋白及表面活性剂。
第三组分Rc:
具有缓冲能力的稀释液,且含有封闭剂,例如,所述封闭剂选自由以下项组成的组中的一种或更多种:脱脂奶粉、BSA、明胶、血清、酪蛋白、卵清蛋白、动物IgG、表面活性剂。
第四组分Rd:
具有缓冲能力的稀释液,且含有封闭剂,例如,所述封闭剂选自由以下项组成的组中的一种或更多种:脱脂奶粉、BSA、明胶、血清、酪蛋白、卵清蛋白、动物IgG、表面活性剂。第四组分Rd与第三组分Rc可以使用相同的或不同的封闭剂。
检测方法
第一步:将样本、第三组分Rc和第一组分Ra加入反应管中,在37℃孵育10分钟,使得磁珠包被物与样本中的待检测物充分结合;孵育完成后,磁珠固相置于磁场内被吸住,结合在磁珠固相上的物质被保留,而其他未结合的物质被清洗除去。
第二步:将第四试剂Rd和第二试剂Rb添加到反应管;在37℃孵育10分钟,酶标结合物上的抗原或抗体与磁珠上被捕获抗体或抗原结合,形成夹心复合物。在反应管内孵育完成后,该复合物被磁场吸住,而其他未结合的物质被清洗除去。
第三步:将化学发光底物添加到反应管内,产生化学发光。再通过光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量,以得到样本的发光值。
实施例1:TP抗体检测试剂盒的制备
1、经预处理的磁珠包被物制备过程:
①磁珠预处理:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入含有0.3%浓度Brij L23(表面活性剂,购自sigma)的MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL,18~26℃条件下置于旋转摇床上处理15min待用;此时磁珠溶液体积为1mL;
②磁珠活化:
将预处理完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.9mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.1mL TP抗原溶液(购自Meridian,浓度3mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:29,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
④磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),18~26℃条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,命名为磁珠包被物1-1。
2、对照组磁珠包被物的制备过程(无预处理步骤)
①磁珠洗涤步骤:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入1mL MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL待用;
②磁珠活化:
将洗涤完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.9mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.1mL TP抗原溶液(购自Meridian,浓度3mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:29,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
④磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),18~26℃条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,命名为磁珠包被物1-2。
3、根据下表1及上文中“试剂配制”部分的记载制备本实施例中所使用的试剂盒。
表1
4、按照上文“检测方法”部分的记载,分别使用试剂盒1-1和1-2对500例阴性样本、200例阳性样本进行测试,以对比包被前预处理对试剂盒检测性能的影响,结果如下表2所示。
表2
由表2可知,使用经预处理的磁珠包被物的试剂盒1-1提高了检测的阴性符合率和阳性符合率均为100%;与使用未经预处理的磁珠包被物的试剂盒1-2的情况相比,其阴性符合率和阳性符合率均有提升。
实施例2:HIV抗原抗体检测试剂盒的制备
1、经预处理的磁珠包被物制备过程:
①磁珠洗涤:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入1mL MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL待用;
②磁珠活化:
将洗涤完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原预处理:
将HIV抗原(购自Meridian)使用含有0.5%浓度Triton X-100(表面活性剂,购自sigma)的MES(pH 6.0)缓冲液稀释至1mg/mL,按下表3条件置于旋转摇床上反应;
表3
④抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.7mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.3mL HIV抗原溶液(步骤③中预处理完成,浓度1mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:9,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
⑤磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),18~26℃条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,对应于表3中的条件,将制得的磁珠包被物分别命名为磁珠包被物2-1A、磁珠包被物2-1B和磁珠包被物2-1C。
2、对照组磁珠包被物的制备过程(无抗原预处理步骤)
①磁珠洗涤:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入1mL MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL待用;
②磁珠活化:
将洗涤完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原稀释:
将HIV抗原(购自Meridian)使用MES(pH 6.0)缓冲液稀释至1mg/mL;
④抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.7mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.3mL HIV抗原溶液(步骤③中稀释,浓度1mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:9,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
⑤磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),18~26℃条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,命名为磁珠包被物2-2。
3、根据下表4及上文“试剂配制”部分的记载制备本实施例中所使用的试剂盒。
表4
4、按照上文“检测方法”部分的记载,分别使用试剂盒2-1A、2-1B、2-1C和2-2对500例阴性样本、200例阳性样本进行测试,以对比预处理条件对试剂盒检测性能的影响,结果如下表5所示。
表5
由表5可知,使用未经预处理的磁珠包被物的试剂盒2-2的情况下,阴性符合率为98.0%,阳性符合率为98.5%。对于经过预处理的情况而言,对应预处理条件为2~8℃、20min的试剂盒2-1A提升了阴性符合率和阳性符合率,且均为100%;对应预处理条件为2~8℃、<1min的试剂盒2-1B阴性符合率为98.8%,阳性符合率为98.5%;而对应预处理条件为35℃、20min的试剂盒2-1C阴性符合率为98.6%,阳性符合率为99.0%。
实施例3:HCV抗体检测试剂盒的制备
1、经预处理的磁珠包被物制备过程:
①磁珠洗涤:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入1mL MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL待用;
②磁珠活化:
将洗涤完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原预处理:
将HCV抗原(购自Meridian)分别使用含有0.5%浓度的不同种类表面活性剂(如下表6所示,均购自sigma)的MES(pH 6.0)缓冲液稀释至1mg/mL,2~8℃条件下置于旋转摇床上反应20min;
表6
④抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.7mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.3mL HCV抗原溶液(步骤③中预处理完成,浓度1mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:9,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
⑤磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),18~26℃条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,对应于表6中的条件,将制得的磁珠包被物分别命名为磁珠包被物3-1A、磁珠包被物3-1B、磁珠包被物3-1C和磁珠包被物3-1D。
2、对照组磁珠包被物的制备过程(无抗原预处理步骤)
①磁珠洗涤:
选择表面基团为羧基,粒径1μm的磁珠(购自Merck),使用PBS(pH 7.4)缓冲液洗涤三次后磁分离,加入1mL MES(pH 6.0)缓冲液,将磁珠浓度稀释到30mg/mL待用;
②磁珠活化:
将洗涤完成的磁珠混匀,加入等体积(1mL)的EDC的MES溶液(pH 6.0)和等体积(1mL)NHS的MES溶液(pH 6.0),其中EDC(购自sigma)的浓度为0.3mg/mL,NHS(购自sigma)的浓度为0.45mg/mL,即活化反应步骤的磁珠浓度为10mg/mL,EDC浓度0.1mg/mL,NHS浓度0.15mg/mL;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应30min;整个活化体系的体积为3mL;
③抗原稀释:
将HCV抗原(购自Meridian)使用MES(pH 6.0)缓冲液稀释至1mg/mL;
④抗原偶联:
将活化完成的磁珠磁分离,吸走上清,加入2.7mL MES溶液(pH 6.0),混匀,再加入0.3mL HCV抗原溶液(步骤③中稀释,浓度1mg/mL),即抗原溶液与磁珠的偶联比例为1:9,抗原包被浓度为10μg/mg;18~26℃条件下置于旋转摇床上反应2~3h;整个偶联反应体系的体积为3mL;
⑤磁珠封闭及洗涤
偶联反应完成后,将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20),室温(18~26℃)条件下置于旋转摇床上反应0.5~1h;然后将磁珠溶液磁分离,吸走上清,加入3mL TBS溶液(pH 7.4,含0.5%BSA及0.05%吐温20)重悬;最终制得磁珠包被物浓度为10mg/mL,命名为磁珠包被物3-2。
3、根据下表7及上文“试剂配制”部分的记载制备本实施例中所使用的试剂盒。
表7
4、按照上文“检测方法”部分的记载,分别使用试剂盒3-1A、3-1B、3-1C、3-1D和3-2对500例阴性样本、200例阳性样本进行测试,以表面活性剂种类对试剂盒检测性能的影响,结果如下表8所示。
表8
由表8可知,使用未经预处理的磁珠包被物的试剂盒3-2的情况下,阴性符合率为98.0%,阳性符合率为97.5%。对于经过预处理的情况而言,对应于非离子型表面活性剂Triton X-100的试剂盒3-1A的阴性符合率为99.8%和,阳性符合率为100%,提升效果最为显著;对应于阴离子型表面活性剂SDS的试剂盒3-1B阴性符合率为98.8%,阳性符合率为99.5%;对应于阳离子型表面活性剂CTAB的试剂盒3-1C阴性符合率为99.6%,阳性符合率为99.5%;而对应于两性离子型表面活性剂chaps的试剂盒3-1D阴性符合率为100%,阳性符合率为99.5%。
Claims (16)
1.一种固相组分的制备方法,包括:
使用表面活性剂对包被物和/或固相载体进行预处理;
将所述包被物包被至所述固相载体上;以及
对经包被固相载体进行封闭。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,使用所述表面活性剂对所述包被物进行预处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述表面活性剂选自由CTAB、SDS、吐温系列、Triton系列、Brij系列、Chaps及其组合所组成的组。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述非离子型表面活性剂选自由吐温系列、Triton系列、Brij系列及其组合所组成的组,例如为Triton X-100。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,在预处理的过程中所述表面活性剂的体积浓度为0.05%至1%,例如为0.2%至1%。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述预处理在2℃至26℃的温度下进行,优选在2℃至8℃的温度下进行。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述预处理持续至少5min,例如5min至1h,又例如持续15min至25min。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述包被物为抗原和/或抗体。
10.表面活性剂在固相载体包被抗原和/或抗体中的用途,其中,在包被前,使用所述表面活性对所述固相载体和/或对抗原和/或抗体进行预处理。
11.根据权利要求10所述的用途,其中,使用所述表面活性剂对所述抗原和/或抗体进行预处理。
12.根据权利要求10或11所述的用途,其中,所述表面活性剂选自由CTAB、SDS、吐温系列、Triton系列、Brij系列、Chaps及其组合所组成的组。
13.根据权利要求10或11所述的用途,其中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
14.根据权利要求13所述的用途,其中,所述非离子型表面活性剂选自由吐温系列、Triton系列、Brij系列及其组合所组成的组,例如为Triton X-100。
15.根据权利要求10或11所述的用途,其中,在预处理的过程中所述表面活性剂的体积浓度为0.05%至1%,例如为0.2%至1%。
16.一种用于免疫学检测的固相组分,所述固相组分由权利要求1-9中任一项所述的方法所制备。
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