CN110672837A - 一种磁珠包被蛋白的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法，属于磁珠包被蛋白的工艺技术领域。该方法是先进行抗原/抗体置换，得到置换后待包被物；将磁珠清洗；取清洗后重悬磁珠瓶，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，将磁珠与置换后待包被物进行预混，所述的磁珠浓度为5mg/mL；在预混后的磁珠中加入EDC与NHS，置于360混匀仪上进行活化，所述的EDC与磁珠质量比为1：10；加入封闭液，集磁去上清，清洗，得到磁珠包被蛋白。该工艺方法能提高蛋白的包被效率，且对应试剂盒的测试性能提高。
Description
技术领域
本发明属于磁珠包被蛋白的工艺技术领域，具体涉及一种磁珠包被蛋白的工艺方法。
背景技术
化学发光免疫分析(CLIA)是将免疫反应与化学发光反应相结合，用于检测样本中微量抗原/抗体的一种高灵敏度、高效、可重复性高的领先的分析技术。该技术中最常见的模式为选取一对可与待测样本结合的抗体/抗原，其中一株抗体/抗原包被在固相载体上，另一株被发光物质标记，检查过程中，二者同时结合样本中的抗原/抗体，形成夹心结构(成为夹心法)；与此同时，CLIA的方法学还包括竞争法、间接法和捕获法。
上述方法中，均会涉及一种将抗体/抗原包被在固相载体上并制备成固相试剂的工艺方法。传统固相载体为聚苯乙烯/聚氯乙烯制成的微孔板，随着科学研究的不断深入，超顺磁珠应运而生。超顺磁珠是由核心的磁性材质、中间的高分子保护层、最外的免疫配基三部分组成的粒径较小的均匀球形物，因其表现出的超顺磁性特质而得名，即在外加磁场下具有磁响应性，撤离磁场后磁性消失。相较于聚乙烯板，超顺磁珠在作为固相载体时，具有制备过程不受容器限制、清洗灵活、可做成液体试剂方便运输与测试等优点，得到了广泛应用，在市场上占有主导地位。
整个磁珠包被蛋白工艺过程，环节因素较多，各环节因素的改变均会导致不同的包被效果，从而直接影响了CLIA试剂的整体性能。因此，根据实际应用情况，设计出最优工艺环节参数，对试剂性能的保证、改善起着至关重要的作用。现今常用的磁珠包被工艺阐述及分析如表1所示：
表1常用磁珠包被工艺阐述及分析
结合实际应用结果，Tosyl磁珠一般能得到较高的包被率，但由于官能团相对疏水，易出现凝集；相比之下，羧基磁珠具有低空白、较优分散态的优点，但现有工艺在相同条件下包被率及功能测试线性高值略低于Tosyl磁珠的问题，限制了相关工艺的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法，该工艺方法能提高蛋白的包被效率，且对应试剂盒的测试性能提高。
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法，包括：
步骤一：进行抗原/抗体置换，得到置换后待包被物；
步骤二：将磁珠清洗；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，将磁珠与置换后待包被物进行预混，所述的磁珠浓度为5mg/mL；
步骤四：在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS，置于360混匀仪上进行活化，所述的EDC与磁珠质量比为1：10；
步骤五：加入封闭液，集磁去上清，清洗，得到磁珠包被蛋白。
优选的是，所述步骤一具体为：将抗原/抗体加入超滤离心管中，离心机2～8℃，5000～7500g正置离心3次，每次补足包被缓冲液倒置离心，回收置换后的待标记物，并用磁珠包被缓冲液定浓。
优选的是，所述的包被缓冲液为pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl。
优选的是，所述的抗体为TSH抗体、AFP抗体，抗原为TG抗原。
优选的是，所述步骤二的磁珠为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm。
优选的是，所述步骤三的水平摆动混匀方式为：选择模式--，振幅8，speed50。
优选的是，所述的预混温度为25±1℃，时间为0.5h。
优选的是，所述步骤四中EDC与NHS的摩尔比为1：2。
优选的是，所述步骤四的活化温度为25±1℃，时间为4h。
优选的是，所述的步骤五的封闭液为赖氨酸。
本发明的有益效果
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法，该工艺方法是以羧基磁珠为固相载体，采用预混包被、水平摆动摇匀的方式，与传统包被工艺相比，首先通过在活化前加入抗原/抗体与磁珠进行预混，可通过非特异性吸附的方式让二者进行充分接触，接着再加入适量活化剂，充分活化羧基官能团，保证了产物获得较高的包被率；同时，相较于常规包被的旋转混匀(8字形、180°、360°)，采用水平摆动混匀方式，可针对不同的体积选择不同的振幅，避免了小体积包被过程粘盖/粘壁损失，提高了整体工艺的回收率；本发明的产物在配成试剂进行功能测试时，具有CV小、线性光量值空白低且高值高、稳定性好的优点。
附图说明
图1为不同预混包被方式包被率示意图；
图2为TSH项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图；
图3为aTG项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图；
图4为AFP项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图；
图5为不同混匀方式包被率示意图；
图6为TSH包被物磁珠分散态显微镜照片；
图7为aTG包被物磁珠分散态显微镜照片；
图8为AFP包被物磁珠分散态显微镜照片。
具体实施方式
为本发明的上述目的、特征及优点能够更加明显易懂，结合具体实施例对本发明做进一步阐述。但是本发明能够以很多不同于此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法，包括：
步骤一：进行抗原/抗体置换，得到置换后待包被物；
步骤二：将磁珠清洗；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，将磁珠与置换后待包被物进行预混，所述的磁珠浓度为5mg/mL；
步骤四：在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS，置于360混匀仪上进行活化，所述的EDC与磁珠质量比为1：10；
步骤五：加入封闭液，集磁去上清，清洗，得到磁珠包被蛋白。
按照本发明，所述步骤一具体为：将抗原/抗体加入超滤离心管中，离心机2～8℃，5000～7500g正置离心3次，每次补足包被缓冲液倒置离心，回收置换后的待标记物，并用磁珠包被缓冲液定浓，所述的包被缓冲液优选为pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl；所述的抗体优选为TSH抗体、AFP抗体，抗原为TG抗原。
本发明采用包被前抗原/抗体进行缓冲液置换，可去除原保存缓冲液中干扰包被反应的物质，且置换的同时可对抗原/抗体浓度进行控制，间接降低了磁珠包被母液的批间差异。
按照本发明，所述的磁珠清洗具体为：取磁珠加入玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；所述的磁珠为羧基磁珠，优选为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm。所述的羧基官能团相对亲水，可保证磁珠良好的分散态，又可通过减少非特异性吸附而降低试剂空白，为试剂功能测试时获得较高的信噪比提供一定帮助；
按照本发明，所述步骤三的水平摆动混匀方式为：选择模式--，振幅8，speed50；所述的预混温度优选为25±1℃，时间优选为0.5h。本发明采用在活化前首先加入抗原/抗体与磁珠进行预混，可通过非特异性吸附的方式让二者进行充分接触，接着再加入适量活化剂，充分活化羧基官能团，保证了产物获得较高的包被率。同时采用水平摆动混匀方式，相较于常规包被的旋转混匀(8字形、180°、360°)，采用水平摆动混匀方式，可针对不同的体积选择不同的振幅，避免了小体积包被过程粘盖/粘壁损失，提高了整体工艺的回收率。
按照本发明，对预混后的磁珠进行活化，活化温度优选为25±1℃，时间优选为4h，加入EDC与NHS，所述的EDC与NHS摩尔比优选为1：2，360混匀仪模式不变，选择模式--，振幅8，speed50，25±1℃条件下包被4h。本发明的EDC、NHS采用一步法的方式加入，可保证在二者活性失效前完成羧基磁珠的活化，且桥连NHS的羧基官能团相对更加稳定，能在后续包被反应中长时间的保持结合抗原/抗体NH2基的能力，整体促进包被率。
按照本发明，向活化后的磁珠中加入封闭液，所述的封闭液为20％赖氨酸，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入羧基磁珠清洗缓冲液，以5mg/mL浓度清洗3次，2～8℃条件密封保存。
将上述得到的磁珠包被蛋白采用TBST缓冲液重悬至20mg/mL，取样进行母液分散态、包被率检验，并配制成固相试剂，以吖啶酯标记试剂、辅助相缓冲液作为验证配套试剂，以全自动化学发光分析仪作为检测媒介，以“蛋白包被率”、“试剂分散态”、“功能测试CV值”、“功能测试空白值”、“试剂稳定性”作为判断指标，验证得到上述优化的最佳包被工艺。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，选择模式“--”，振幅“8”，speed“50”，按照预混时磁珠浓度为5mg/mL(采用缓冲液)计算V总为3mL，加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL)，在25℃下进行预混0.5h，并补足1.5mL的羧基磁珠包被缓冲液；
步骤四：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，使其终浓度分别为20mg/mL和40mg/mL，然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL，EDC与NHS摩尔比为1：2，360混匀仪模式不变，选择模式--，振幅8，speed50，25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h，EDC与磁珠质量比为1：10；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为YHZ-4工艺组。
对比例1
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，按EDC与NHS摩尔比为1：2，EDC与磁珠质量比为1：10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL，置于360混匀仪上，选择模式“--”，振幅“8”，speed“50”，25℃条件下活化0.5h；
步骤四：集磁去除上清，加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液，涡旋混匀仪混匀后，1000rpm低速悬混的状态下，缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后，360混匀仪模式“--”，振幅“8”，speed“50”，25℃条件下包被4h；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为YHZ-1非预混工艺组和摆动混匀组。
对比例2
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，选择模式“--”，振幅“8”，speed“50”，按照预混时磁珠浓度为5mg/mL(采用缓冲液)计算V总为3mL，加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL)，在25℃下进行预混0.5h，并补足1.5mL的羧基磁珠包被缓冲液；
步骤四：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.015mL、NHS缓冲液0.015mL，EDC与NHS摩尔比为1：2，360混匀仪模式不变，选择模式--，振幅8，speed50，25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h，EDC与磁珠质量比为1：50；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为YHZ-2工艺组。
对比例3
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，选择模式“--”，振幅“8”，speed“50”，按照预混时磁珠浓度为20mg/mL(采用缓冲液)计算V总为0.75mL，加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL)，在25℃下进行预混0.5h，并补足0.45mL的羧基磁珠包被缓冲液；
步骤四：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.015mL、NHS缓冲液0.015mL，EDC与NHS摩尔比为1：2，360混匀仪模式不变，选择模式--，振幅8，speed50，25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h，EDC与磁珠质量比为1：50；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为YHZ-3工艺组。
将实施例1、对比例1-3方法得到的包被样品进行验证各方法的母液分散态、包被率差异，并采用促甲状腺激素-夹心法项目(TSH)、抗甲状腺球蛋白抗体-间接法项目(aTG)、甲胎蛋白-夹心法项目(AFP)功能测试各校准点光量值差异，具体结果如下所示。
1、不同预混包被方式包被率对比评估，如图1和表2所示：
表2各项目不同预混包被方式包被率对比
图1为不同预混包被方式包被率示意图，图1说明，预混体系磁珠浓度、活化剂加量比均会对包被率产生影响，其中，1：10活化比优于1：50，5mg/mL的预混体系磁珠浓度优于20mg/mL。结合包被母液显微镜检验结果，20mg/mL浓度预混包被后，母液显著凝集，推测其可能为降低包被率的原因。综合分析，YHZ-4工艺组各项目包被率得到显著提高(20％～26％的提高)，为最优工艺组。
2、不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比评估
如图2-4所示：图2为TSH项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图，其中图a代表YHZ-1非预混工艺组，图b代表YHZ-2，5mg/mL磁浓1：50活化，图c代表YHZ-3，20mg/mL磁浓1：50活化，图d代表YHZ-4，5mg/mL磁珠浓度1：10活化；
图3为aTG项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图，其中图a代表YHZ-1非预混工艺组，图b代表YHZ-2，5mg/mL磁浓1：50活化，图c代表YHZ-3，20mg/mL磁浓1：50活化，图d代表YHZ-4，5mg/mL磁珠浓度1：10活化；
图4为AFP项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图，其中图a代表YHZ-1非预混工艺组，图b代表YHZ-2，5mg/mL磁浓1：50活化，图c代表YHZ-3，20mg/mL磁浓1：50活化，图d代表YHZ-4，5mg/mL磁珠浓度1：10活化；从图2-4可以看出，非预混组磁珠分散态最好，YHZ-4工艺组磁珠分散态也合格，但存在聚团趋势。由对比结果分析可知，预混体系磁珠浓度、活化剂加量比均会对磁珠分散态产生显著影响，当将活化比增加至1：50时，磁珠出现凝集，当活化时磁珠浓度增加至50mg/mL时，母液凝集严重。综合分析，YHZ-1分散态最好，YHZ-4分散态合格，两个工艺组均可采用。
3、不同预混包被方式功能测试结果对比评估，如表3所示：
表3各项目不同预混包被方式功能测试结果对比
如表3所示，从低空白、高值高、各点倍比、线性相关性、各点测值CV分析，混体系磁珠浓度5mg/mL、1：10活化比工艺组均为各项目的最优条件组。
综上所述，采用摆动混匀方式，在包被前预混，预混体系磁珠浓度5mg/mL、1：10活化比，可以提高磁珠包被母液包被率，并能保证功能测试结果空白低、高值高、各点倍比好、线性相关性好、各点测值CV小。
对比例4
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，按EDC与NHS摩尔比为1：2，EDC与磁珠质量比为1：10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL，置于360混匀仪上，选择模式“F2”，振幅“0”，speed“20”，25℃条件下活化0.5h；
步骤四：集磁去除上清，加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液，涡旋混匀仪混匀后，1000rpm低速悬混的状态下，缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后，360混匀仪选择模式“F2”，振幅“0”，speed“20”，25℃条件下活化4h；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为XHZ-1 360°翻转混匀组。
对比例5
步骤一：置换：分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中，离心机5℃，6000g正置离心3次，每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl)，35000g倒置离心，回收置换后的待标记物，并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL；
步骤二：磁珠清洗：取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶，采用TBST缓冲液，集磁清洗3次，最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL，备用；
步骤三：采用羧基磁珠包被缓冲液，分别溶解EDC、NHS，然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠)，按EDC与NHS摩尔比为1：2，EDC与磁珠质量比为1：10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL，置于血液混匀仪上，中速档，25℃条件下活化0.5h；
步骤四：集磁去除上清，加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液，涡旋混匀仪混匀后，1000rpm低速悬混的状态下，缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后，血液混匀仪上中速档，25℃条件下活化4h；
步骤五：向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20％赖氨酸封闭液，360度混匀仪继续混匀1h；集磁去上清，加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液，含抑菌剂、表面活性剂)，以5mg/mL浓度清洗3次，得到磁珠包被蛋白，记为XHZ-2 360°滚动混匀组。
上述对比例1、4、5混匀方式优化验证实验中，采用TSH抗体、TG抗原、AFP抗体作为包被样本验证各方法的母液分散态、包被率差异，并采用促甲状腺激素-夹心法项目(TSH)、抗甲状腺球蛋白抗体-间接法项目(aTG)、甲胎蛋白-夹心法项目(AFP)功能测试各校准点光量值差异，具体结果如下所示。
(1)不同混匀方式包被率对比评估
表4各项目不同混匀方式包被率对比
| 项目 | 360°翻转混匀组 | 360°滚动混匀组 | 摆动混匀组 |
| TSH抗体 | 9.04％ | 9.33％ | 13.12％ |
| TG抗原 | 8.68％ | 9.25％ | 13.14％ |
| AFP抗体 | 10.51％ | 11.02％ | 15.37％ |
如表4和图5所示，360°翻转与滚动混匀对各项目的包被率影响基本相同，但当混匀方式改为摆动时，各项目包被率整体提高了4％～5％，推测可能与摆动避免了磁珠粘盖损失，使包被反应充分进行所致。此外，TG抗原的包被率低于其它两个包被抗体项目，推测为TG抗原分子量较大增加了包被难度导致。
(2)不同混匀方式包被母液磁珠分散态对比评估
显微镜观察不同混匀方式制备的包被母液，分散态相同，均无凝集，具体情况如图6-8所示，其中图6为TSH包被物磁珠分散态显微镜照片，图7为TG包被物磁珠分散态显微镜照片，图8为AFG包被物磁珠分散态显微镜照片，说明三种不同混匀方式对包被母液分散态均无影响，其中TG包被母液磁珠聚团倾向略强于其它两项包被母液，推测TG抗原分子量较大增加了包被母液疏水性使其具有一定的聚团趋势。
(3)不同混匀方式功能测试结果对比评估，如表5
表5各项目不同混匀方式功能测试结果对比
如表5所示，从低空白、高值高、各点倍比、线性相关性分析，摆动混匀组均为各项目的最优条件组，其中，TSH、aTG项目各指标优势明显，AFP项目线性相关性各混匀组相同，但空白、高值、各点倍比方面摆动混匀组最佳。
Claims (10)
1.一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，包括：
步骤一：进行抗原/抗体置换，得到置换后待包被物；
步骤二：将磁珠清洗；
步骤三：取清洗后重悬磁珠瓶，置于360混匀仪上，采用水平摆动混匀方式，将磁珠与置换后待包被物进行预混，所述的磁珠浓度为5mg/mL；
步骤四：在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS，置于360混匀仪上进行活化，所述的EDC与磁珠质量比为1：10；
步骤五：加入封闭液，集磁去上清，清洗，得到磁珠包被蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述步骤一具体为：将抗原/抗体加入超滤离心管中，离心机2～8℃，5000～7500g正置离心3次，每次补足包被缓冲液倒置离心，回收置换后的待标记物，并用磁珠包被缓冲液定浓。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述的包被缓冲液为pH6.5、15mM的MES，含50mM NaCl。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述的抗体为TSH抗体、AFP抗体，抗原为TG抗原。
5.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述步骤二的磁珠为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠，磁珠粒径为2.8μm。
6.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述步骤三的水平摆动混匀方式为：选择模式--，振幅8，speed50。
7.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述的预混温度为25±1℃，时间为0.5h。
8.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述步骤四中EDC与NHS的摩尔比为1：2。
9.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述步骤四的活化温度为25±1℃，时间为4h。
10.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法，其特征在于，所述的步骤五的封闭液为赖氨酸。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113687063A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-23 | 南昌大学 | 一种基于苯硼酸交联剂的糖蛋白动态光散射免疫方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308698A (zh) * | 2013-06-17 | 2013-09-18 | 北京北检·新创源生物技术有限公司 | 一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法 |
-
2019
- 2019-10-30 CN CN201911042413.5A patent/CN110672837A/zh active Pending
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