CN110672837A - 一种磁珠包被蛋白的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法,属于磁珠包被蛋白的工艺技术领域。该方法是先进行抗原/抗体置换,得到置换后待包被物;将磁珠清洗;取清洗后重悬磁珠瓶,置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,将磁珠与置换后待包被物进行预混,所述的磁珠浓度为5mg/mL;在预混后的磁珠中加入EDC与NHS,置于360混匀仪上进行活化,所述的EDC与磁珠质量比为1:10;加入封闭液,集磁去上清,清洗,得到磁珠包被蛋白。该工艺方法能提高蛋白的包被效率,且对应试剂盒的测试性能提高。
Description
技术领域
本发明属于磁珠包被蛋白的工艺技术领域,具体涉及一种磁珠包被蛋白的工艺方法。
背景技术
化学发光免疫分析(CLIA)是将免疫反应与化学发光反应相结合,用于检测样本中微量抗原/抗体的一种高灵敏度、高效、可重复性高的领先的分析技术。该技术中最常见的模式为选取一对可与待测样本结合的抗体/抗原,其中一株抗体/抗原包被在固相载体上,另一株被发光物质标记,检查过程中,二者同时结合样本中的抗原/抗体,形成夹心结构(成为夹心法);与此同时,CLIA的方法学还包括竞争法、间接法和捕获法。
上述方法中,均会涉及一种将抗体/抗原包被在固相载体上并制备成固相试剂的工艺方法。传统固相载体为聚苯乙烯/聚氯乙烯制成的微孔板,随着科学研究的不断深入,超顺磁珠应运而生。超顺磁珠是由核心的磁性材质、中间的高分子保护层、最外的免疫配基三部分组成的粒径较小的均匀球形物,因其表现出的超顺磁性特质而得名,即在外加磁场下具有磁响应性,撤离磁场后磁性消失。相较于聚乙烯板,超顺磁珠在作为固相载体时,具有制备过程不受容器限制、清洗灵活、可做成液体试剂方便运输与测试等优点,得到了广泛应用,在市场上占有主导地位。
整个磁珠包被蛋白工艺过程,环节因素较多,各环节因素的改变均会导致不同的包被效果,从而直接影响了CLIA试剂的整体性能。因此,根据实际应用情况,设计出最优工艺环节参数,对试剂性能的保证、改善起着至关重要的作用。现今常用的磁珠包被工艺阐述及分析如表1所示:
表1常用磁珠包被工艺阐述及分析
结合实际应用结果,Tosyl磁珠一般能得到较高的包被率,但由于官能团相对疏水,易出现凝集;相比之下,羧基磁珠具有低空白、较优分散态的优点,但现有工艺在相同条件下包被率及功能测试线性高值略低于Tosyl磁珠的问题,限制了相关工艺的广泛应用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法,该工艺方法能提高蛋白的包被效率,且对应试剂盒的测试性能提高。
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法,包括:
步骤一:进行抗原/抗体置换,得到置换后待包被物;
步骤二:将磁珠清洗;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶,置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,将磁珠与置换后待包被物进行预混,所述的磁珠浓度为5mg/mL;
步骤四:在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS,置于360混匀仪上进行活化,所述的EDC与磁珠质量比为1:10;
步骤五:加入封闭液,集磁去上清,清洗,得到磁珠包被蛋白。
优选的是,所述步骤一具体为:将抗原/抗体加入超滤离心管中,离心机2~8℃,5000~7500g正置离心3次,每次补足包被缓冲液倒置离心,回收置换后的待标记物,并用磁珠包被缓冲液定浓。
优选的是,所述的包被缓冲液为pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl。
优选的是,所述的抗体为TSH抗体、AFP抗体,抗原为TG抗原。
优选的是,所述步骤二的磁珠为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm。
优选的是,所述步骤三的水平摆动混匀方式为:选择模式--,振幅8,speed50。
优选的是,所述的预混温度为25±1℃,时间为0.5h。
优选的是,所述步骤四中EDC与NHS的摩尔比为1:2。
优选的是,所述步骤四的活化温度为25±1℃,时间为4h。
优选的是,所述的步骤五的封闭液为赖氨酸。
本发明的有益效果
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法,该工艺方法是以羧基磁珠为固相载体,采用预混包被、水平摆动摇匀的方式,与传统包被工艺相比,首先通过在活化前加入抗原/抗体与磁珠进行预混,可通过非特异性吸附的方式让二者进行充分接触,接着再加入适量活化剂,充分活化羧基官能团,保证了产物获得较高的包被率;同时,相较于常规包被的旋转混匀(8字形、180°、360°),采用水平摆动混匀方式,可针对不同的体积选择不同的振幅,避免了小体积包被过程粘盖/粘壁损失,提高了整体工艺的回收率;本发明的产物在配成试剂进行功能测试时,具有CV小、线性光量值空白低且高值高、稳定性好的优点。
附图说明
图1为不同预混包被方式包被率示意图;
图2为TSH项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图;
图3为aTG项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图;
图4为AFP项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图;
图5为不同混匀方式包被率示意图;
图6为TSH包被物磁珠分散态显微镜照片;
图7为aTG包被物磁珠分散态显微镜照片;
图8为AFP包被物磁珠分散态显微镜照片。
具体实施方式
为本发明的上述目的、特征及优点能够更加明显易懂,结合具体实施例对本发明做进一步阐述。但是本发明能够以很多不同于此描述的其他方式来实施,本领域技术人员可以不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明提供一种磁珠包被蛋白的工艺方法,包括:
步骤一:进行抗原/抗体置换,得到置换后待包被物;
步骤二:将磁珠清洗;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶,置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,将磁珠与置换后待包被物进行预混,所述的磁珠浓度为5mg/mL;
步骤四:在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS,置于360混匀仪上进行活化,所述的EDC与磁珠质量比为1:10;
步骤五:加入封闭液,集磁去上清,清洗,得到磁珠包被蛋白。
按照本发明,所述步骤一具体为:将抗原/抗体加入超滤离心管中,离心机2~8℃,5000~7500g正置离心3次,每次补足包被缓冲液倒置离心,回收置换后的待标记物,并用磁珠包被缓冲液定浓,所述的包被缓冲液优选为pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl;所述的抗体优选为TSH抗体、AFP抗体,抗原为TG抗原。
本发明采用包被前抗原/抗体进行缓冲液置换,可去除原保存缓冲液中干扰包被反应的物质,且置换的同时可对抗原/抗体浓度进行控制,间接降低了磁珠包被母液的批间差异。
按照本发明,所述的磁珠清洗具体为:取磁珠加入玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;所述的磁珠为羧基磁珠,优选为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm。所述的羧基官能团相对亲水,可保证磁珠良好的分散态,又可通过减少非特异性吸附而降低试剂空白,为试剂功能测试时获得较高的信噪比提供一定帮助;
按照本发明,所述步骤三的水平摆动混匀方式为:选择模式--,振幅8,speed50;所述的预混温度优选为25±1℃,时间优选为0.5h。本发明采用在活化前首先加入抗原/抗体与磁珠进行预混,可通过非特异性吸附的方式让二者进行充分接触,接着再加入适量活化剂,充分活化羧基官能团,保证了产物获得较高的包被率。同时采用水平摆动混匀方式,相较于常规包被的旋转混匀(8字形、180°、360°),采用水平摆动混匀方式,可针对不同的体积选择不同的振幅,避免了小体积包被过程粘盖/粘壁损失,提高了整体工艺的回收率。
按照本发明,对预混后的磁珠进行活化,活化温度优选为25±1℃,时间优选为4h,加入EDC与NHS,所述的EDC与NHS摩尔比优选为1:2,360混匀仪模式不变,选择模式--,振幅8,speed50,25±1℃条件下包被4h。本发明的EDC、NHS采用一步法的方式加入,可保证在二者活性失效前完成羧基磁珠的活化,且桥连NHS的羧基官能团相对更加稳定,能在后续包被反应中长时间的保持结合抗原/抗体NH2基的能力,整体促进包被率。
按照本发明,向活化后的磁珠中加入封闭液,所述的封闭液为20%赖氨酸,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入羧基磁珠清洗缓冲液,以5mg/mL浓度清洗3次,2~8℃条件密封保存。
将上述得到的磁珠包被蛋白采用TBST缓冲液重悬至20mg/mL,取样进行母液分散态、包被率检验,并配制成固相试剂,以吖啶酯标记试剂、辅助相缓冲液作为验证配套试剂,以全自动化学发光分析仪作为检测媒介,以“蛋白包被率”、“试剂分散态”、“功能测试CV值”、“功能测试空白值”、“试剂稳定性”作为判断指标,验证得到上述优化的最佳包被工艺。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明,实施例中涉及到的原料均为商购获得。
实施例1
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,选择模式“--”,振幅“8”,speed“50”,按照预混时磁珠浓度为5mg/mL(采用缓冲液)计算V总为3mL,加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL),在25℃下进行预混0.5h,并补足1.5mL的羧基磁珠包被缓冲液;
步骤四:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,使其终浓度分别为20mg/mL和40mg/mL,然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL,EDC与NHS摩尔比为1:2,360混匀仪模式不变,选择模式--,振幅8,speed50,25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h,EDC与磁珠质量比为1:10;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为YHZ-4工艺组。
对比例1
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),按EDC与NHS摩尔比为1:2,EDC与磁珠质量比为1:10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL,置于360混匀仪上,选择模式“--”,振幅“8”,speed“50”,25℃条件下活化0.5h;
步骤四:集磁去除上清,加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液,涡旋混匀仪混匀后,1000rpm低速悬混的状态下,缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后,360混匀仪模式“--”,振幅“8”,speed“50”,25℃条件下包被4h;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为YHZ-1非预混工艺组和摆动混匀组。
对比例2
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,选择模式“--”,振幅“8”,speed“50”,按照预混时磁珠浓度为5mg/mL(采用缓冲液)计算V总为3mL,加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL),在25℃下进行预混0.5h,并补足1.5mL的羧基磁珠包被缓冲液;
步骤四:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.015mL、NHS缓冲液0.015mL,EDC与NHS摩尔比为1:2,360混匀仪模式不变,选择模式--,振幅8,speed50,25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h,EDC与磁珠质量比为1:50;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为YHZ-2工艺组。
对比例3
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,选择模式“--”,振幅“8”,speed“50”,按照预混时磁珠浓度为20mg/mL(采用缓冲液)计算V总为0.75mL,加入300ug的置换后待包被物(体积为0.3mL),在25℃下进行预混0.5h,并补足0.45mL的羧基磁珠包被缓冲液;
步骤四:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,然后在磁珠瓶内加入EDC缓冲液0.015mL、NHS缓冲液0.015mL,EDC与NHS摩尔比为1:2,360混匀仪模式不变,选择模式--,振幅8,speed50,25℃条件下对预混后的磁珠进行活化4h,EDC与磁珠质量比为1:50;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为YHZ-3工艺组。
将实施例1、对比例1-3方法得到的包被样品进行验证各方法的母液分散态、包被率差异,并采用促甲状腺激素-夹心法项目(TSH)、抗甲状腺球蛋白抗体-间接法项目(aTG)、甲胎蛋白-夹心法项目(AFP)功能测试各校准点光量值差异,具体结果如下所示。
1、不同预混包被方式包被率对比评估,如图1和表2所示:
表2各项目不同预混包被方式包被率对比
图1为不同预混包被方式包被率示意图,图1说明,预混体系磁珠浓度、活化剂加量比均会对包被率产生影响,其中,1:10活化比优于1:50,5mg/mL的预混体系磁珠浓度优于20mg/mL。结合包被母液显微镜检验结果,20mg/mL浓度预混包被后,母液显著凝集,推测其可能为降低包被率的原因。综合分析,YHZ-4工艺组各项目包被率得到显著提高(20%~26%的提高),为最优工艺组。
2、不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比评估
如图2-4所示:图2为TSH项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图,其中图a代表YHZ-1非预混工艺组,图b代表YHZ-2,5mg/mL磁浓1:50活化,图c代表YHZ-3,20mg/mL磁浓1:50活化,图d代表YHZ-4,5mg/mL磁珠浓度1:10活化;
图3为aTG项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图,其中图a代表YHZ-1非预混工艺组,图b代表YHZ-2,5mg/mL磁浓1:50活化,图c代表YHZ-3,20mg/mL磁浓1:50活化,图d代表YHZ-4,5mg/mL磁珠浓度1:10活化;
图4为AFP项目中不同预混包被方式包被母液磁珠分散态对比图,其中图a代表YHZ-1非预混工艺组,图b代表YHZ-2,5mg/mL磁浓1:50活化,图c代表YHZ-3,20mg/mL磁浓1:50活化,图d代表YHZ-4,5mg/mL磁珠浓度1:10活化;从图2-4可以看出,非预混组磁珠分散态最好,YHZ-4工艺组磁珠分散态也合格,但存在聚团趋势。由对比结果分析可知,预混体系磁珠浓度、活化剂加量比均会对磁珠分散态产生显著影响,当将活化比增加至1:50时,磁珠出现凝集,当活化时磁珠浓度增加至50mg/mL时,母液凝集严重。综合分析,YHZ-1分散态最好,YHZ-4分散态合格,两个工艺组均可采用。
3、不同预混包被方式功能测试结果对比评估,如表3所示:
表3各项目不同预混包被方式功能测试结果对比
如表3所示,从低空白、高值高、各点倍比、线性相关性、各点测值CV分析,混体系磁珠浓度5mg/mL、1:10活化比工艺组均为各项目的最优条件组。
综上所述,采用摆动混匀方式,在包被前预混,预混体系磁珠浓度5mg/mL、1:10活化比,可以提高磁珠包被母液包被率,并能保证功能测试结果空白低、高值高、各点倍比好、线性相关性好、各点测值CV小。
对比例4
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),按EDC与NHS摩尔比为1:2,EDC与磁珠质量比为1:10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL,置于360混匀仪上,选择模式“F2”,振幅“0”,speed“20”,25℃条件下活化0.5h;
步骤四:集磁去除上清,加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液,涡旋混匀仪混匀后,1000rpm低速悬混的状态下,缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后,360混匀仪选择模式“F2”,振幅“0”,speed“20”,25℃条件下活化4h;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为XHZ-1 360°翻转混匀组。
对比例5
步骤一:置换:分别将2.5mg抗体/抗原加入超滤离心管中,离心机5℃,6000g正置离心3次,每次补足羧基磁珠包被缓冲液(pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl),35000g倒置离心,回收置换后的待标记物,并用羧基磁珠包被缓冲液定浓至1mg/mL;
步骤二:磁珠清洗:取210mg磁珠(Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm)加入40mL玻璃瓶,采用TBST缓冲液,集磁清洗3次,最后一次弃除上清后用羧基磁珠包被缓冲液重悬至10mg/mL,备用;
步骤三:采用羧基磁珠包被缓冲液,分别溶解EDC、NHS,然后取清洗后重悬磁珠瓶(含15mg磁珠),按EDC与NHS摩尔比为1:2,EDC与磁珠质量比为1:10加入上述配制的EDC缓冲液0.075mL、NHS缓冲液0.075mL,置于血液混匀仪上,中速档,25℃条件下活化0.5h;
步骤四:集磁去除上清,加入1.2mL羧基磁珠包被缓冲液,涡旋混匀仪混匀后,1000rpm低速悬混的状态下,缓慢加入300ug置换后待包被物(体积为0.3mL)后,血液混匀仪上中速档,25℃条件下活化4h;
步骤五:向上述工艺瓶中加入中加入75uL的20%赖氨酸封闭液,360度混匀仪继续混匀1h;集磁去上清,加入3mL羧基磁珠清洗缓冲液(TBST缓冲液,含抑菌剂、表面活性剂),以5mg/mL浓度清洗3次,得到磁珠包被蛋白,记为XHZ-2 360°滚动混匀组。
上述对比例1、4、5混匀方式优化验证实验中,采用TSH抗体、TG抗原、AFP抗体作为包被样本验证各方法的母液分散态、包被率差异,并采用促甲状腺激素-夹心法项目(TSH)、抗甲状腺球蛋白抗体-间接法项目(aTG)、甲胎蛋白-夹心法项目(AFP)功能测试各校准点光量值差异,具体结果如下所示。
(1)不同混匀方式包被率对比评估
表4各项目不同混匀方式包被率对比
项目 | 360°翻转混匀组 | 360°滚动混匀组 | 摆动混匀组 |
TSH抗体 | 9.04% | 9.33% | 13.12% |
TG抗原 | 8.68% | 9.25% | 13.14% |
AFP抗体 | 10.51% | 11.02% | 15.37% |
如表4和图5所示,360°翻转与滚动混匀对各项目的包被率影响基本相同,但当混匀方式改为摆动时,各项目包被率整体提高了4%~5%,推测可能与摆动避免了磁珠粘盖损失,使包被反应充分进行所致。此外,TG抗原的包被率低于其它两个包被抗体项目,推测为TG抗原分子量较大增加了包被难度导致。
(2)不同混匀方式包被母液磁珠分散态对比评估
显微镜观察不同混匀方式制备的包被母液,分散态相同,均无凝集,具体情况如图6-8所示,其中图6为TSH包被物磁珠分散态显微镜照片,图7为TG包被物磁珠分散态显微镜照片,图8为AFG包被物磁珠分散态显微镜照片,说明三种不同混匀方式对包被母液分散态均无影响,其中TG包被母液磁珠聚团倾向略强于其它两项包被母液,推测TG抗原分子量较大增加了包被母液疏水性使其具有一定的聚团趋势。
(3)不同混匀方式功能测试结果对比评估,如表5
表5各项目不同混匀方式功能测试结果对比
如表5所示,从低空白、高值高、各点倍比、线性相关性分析,摆动混匀组均为各项目的最优条件组,其中,TSH、aTG项目各指标优势明显,AFP项目线性相关性各混匀组相同,但空白、高值、各点倍比方面摆动混匀组最佳。
Claims (10)
1.一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,包括:
步骤一:进行抗原/抗体置换,得到置换后待包被物;
步骤二:将磁珠清洗;
步骤三:取清洗后重悬磁珠瓶,置于360混匀仪上,采用水平摆动混匀方式,将磁珠与置换后待包被物进行预混,所述的磁珠浓度为5mg/mL;
步骤四:在步骤三预混后的磁珠中加入EDC与NHS,置于360混匀仪上进行活化,所述的EDC与磁珠质量比为1:10;
步骤五:加入封闭液,集磁去上清,清洗,得到磁珠包被蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述步骤一具体为:将抗原/抗体加入超滤离心管中,离心机2~8℃,5000~7500g正置离心3次,每次补足包被缓冲液倒置离心,回收置换后的待标记物,并用磁珠包被缓冲液定浓。
3.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述的包被缓冲液为pH6.5、15mM的MES,含50mM NaCl。
4.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述的抗体为TSH抗体、AFP抗体,抗原为TG抗原。
5.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述步骤二的磁珠为Dynal公司提供的M-270Carboxylic Acid超顺磁珠,磁珠粒径为2.8μm。
6.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述步骤三的水平摆动混匀方式为:选择模式--,振幅8,speed50。
7.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述的预混温度为25±1℃,时间为0.5h。
8.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述步骤四中EDC与NHS的摩尔比为1:2。
9.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述步骤四的活化温度为25±1℃,时间为4h。
10.根据权利要求1所述的一种磁珠包被蛋白的工艺方法,其特征在于,所述的步骤五的封闭液为赖氨酸。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103308698A (zh) * | 2013-06-17 | 2013-09-18 | 北京北检·新创源生物技术有限公司 | 一种将含氨基的分子共价偶联至微球上的偶联方法 |
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- 2019-10-30 CN CN201911042413.5A patent/CN110672837A/zh active Pending
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