CN111983221A - 表面修饰磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面修饰磁珠及其制备方法和应用，包括以下步骤：将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂，得到修饰剂；将所述修饰剂与羧基活化剂混合，反应得到活化修饰剂；将表面具有氨基基团的磁珠与所述活化修饰剂混合，反应得到表面修饰磁珠。本发明克服了部分天然抗原常用基团含量少，普通方案无法结合到磁微粒表面或结合效率低下的技术性难题，采用了一种高效的间接结合方式，能专一地针对膜蛋白结构，抗原中的其他杂蛋白或甘氨酸等保存体系对其无干扰，从而显著提升了纳米磁珠包被物的性能。
Description
技术领域
本发明涉及免疫技术领域，特别是涉及一种表面修饰磁珠及其制备方法和应用。
背景技术
化学发光平台的免疫检测和免疫诊断所使用的方法是使抗原或抗体通过物理吸附或者化学交联的方式结合到纳米磁珠表面，并保持其免疫学活性。在测定时受检标本(测定其中的抗原或者抗体)按不同的步骤与磁珠表面的抗原或者抗体进行免疫反应，再与标记了示踪物(一般为吖啶酯或酶)的抗原或抗体形成复合物，根据发光进行定量或者定性研究。
纳米磁珠包被物(即抗原或者抗体包被于纳米磁珠表面)作为发光免疫试剂的重要成分，对免疫试剂的性能影响巨大，为了抗原或抗体能稳定结合在磁微粒表面，一般会选择以化学交联的方式对抗原或抗体进行偶联，偶联的目的基团一般为氨基(-NH2)。在各种包被物中，抗体的结构稳定，有足够的氨基可供磁珠结合使用，可以通过比较简单的方式完成结合物的制备。而抗原的结构相对复杂，尤其是一些含有膜蛋白结构的抗原，或氨基含量少，或氨基被包埋在抗原内侧，或氨基基团在免疫位点附近，交联结合对后续的免疫反应有比较大的影响。
发明内容
基于此，有必要提供一种可高效结合含有膜蛋白结构抗原的表面修饰磁珠的制备方法。
一种表面修饰磁珠的制备方法，包括以下步骤：
将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂，得到修饰剂；
将所述修饰剂与羧基活化剂混合，反应得到活化修饰剂；
将表面具有氨基基团的磁珠与所述活化修饰剂混合，反应得到表面修饰磁珠。
本发明的制备方法采用不饱和脂肪酸作为磁珠的修饰剂，不饱和脂肪酸的末端含有羧基，通过活化其羧基基团，可以与表面含氨基基团的磁微粒偶联，从而达到用不饱和脂肪酸修饰磁微粒表面的目的，经过修饰的纳米磁珠具有直接结合含膜蛋白结构的抗原的能力。本发明克服了部分天然抗原常用基团含量少，普通方案无法结合到磁微粒表面或结合效率低下的技术性难题，采用了一种高效的间接结合方式，能专一地针对膜蛋白结构，抗原中的其他杂蛋白或甘氨酸等保存体系对其无干扰，从而显著提升了纳米磁珠包被物的性能。同时，采用不饱和脂肪酸修饰磁微粒的修饰效率高，副产物极少，修饰试剂由小分子组成，不因修饰而导致假阳问题，经修饰后的磁珠可直接与含膜蛋白结构抗原结合，不依赖氨基或巯基基团，无须采用其他交联剂，反应稳定可控，批间差异小，是对目前常用偶联方案缺陷的有力补充。与物理吸附类型的磁微粒相比，本发明的表面修饰磁珠与抗原结合稳定，抗原不容易在溶液体系中因长期保存、振荡等而脱落。
在其中一个实施例中，所述不饱和脂肪酸的碳原子数为18～22。
在其中一个实施例中，所述不饱和脂肪酸包括亚油酸和亚麻酸中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述羧基活化剂中含有碳二亚胺类化合物和N-羟基琥珀酰亚胺类化合物。
在其中一个实施例中，所述羧基活化剂中还含有溶剂，所述羧基活化剂的pH值为6～7。
在其中一个实施例中，所述修饰剂中，所述不饱和脂肪酸的浓度为0.5mg/mL～10mg/mL。
本发明还提供了一种磁珠修饰试剂盒，包括修饰剂和羧基活化剂，所述修饰剂中含有不饱和脂肪酸。
本发明还提供了一种表面修饰磁珠，其制备原料包括不饱和脂肪酸和表面具有氨基的磁珠，所述不饱和脂肪酸的羧基与所述磁珠表面的氨基形成酰胺键。
本发明还提供了一种抗原磁珠包被物，包括抗原和所述表面修饰磁珠或所述制备方法制得的表面修饰磁珠，所述抗原与所述表面修饰磁珠结合。
本发明还提供了一种不饱和脂肪酸在制备用于修饰磁珠的修饰剂中的应用。
附图说明
图1为羧基活化剂的作用机理示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语解释
磁珠(磁微粒)是指可均匀分散于一定基液中的胶态复合材料，其具有超顺磁性、较高的比表面积、可修饰功能基团等特性，因此可将抗原、抗体、酶、核酸/寡核苷酸、小分子药物等固定在其表面。磁珠将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。
氨基磁珠即为表面修饰有氨基官能团且具有超顺磁性的磁性微粒，是一种被广泛应用的功能性生物磁珠，主要用于免疫磁珠的制备。在一定条件下，氨基磁珠通过交联试剂(如戊二醛等)的介导，可与蛋白配体(如抗原、抗体等)、寡核苷酸探针等生物分子共价偶联，这类偶联有生物配体的氨基磁珠即为免疫磁珠。
根据表面包覆材料的不同，氨基磁珠包括：
琼脂糖氨基磁珠：氨基活化琼脂糖磁珠(Magarose-NH2)是一种6％交联的磁性琼脂糖微球，磁珠在长间隔臂的末端含有反应性伯氨基，含有羧基(-COOH)的分子共价偶联，用于亲和纯化。凝胶对于固定肽而言是理想的，用于抗体或其他结合配偶体的亲和纯化。
二氧化硅氨基磁珠：PuriMag Si-NH2为单分散硅基磁珠，颗粒尺寸均一，分散性能异常优异；与传统的多核磁珠相比，PuriMag Si-NH2为单核磁珠，硅层厚度约为磁珠尺寸的1/20，因此磁珠的磁含量大于95％，其具有更快的磁响应性同时保持微球良好的分散性、极低的非特异性吸附和更丰富的结合位点等特性。
聚合物氨基磁珠：PuriMag G-NH2氨基磁珠是具有-NH2表面官能团的超顺磁微球，由Fe3O4核和GMA涂层组成。通过GMA的化学修饰，-NH2基团通过短的亲水性连接臂连接到珠子上。亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性和易操作性。具有表面反应性胺基的磁珠允许配体如蛋白质、肽、碳水化合物或其它特异性分子的固定。配体的固定可以通过醛或酮的还原胺化而不预先活化珠表面，或者，EDC交联剂可用于羧基将配体与胺偶联。最后，胺反应性双功能交联剂可用于引入其他官能团以偶联配体。
共价结合是原子以有机化合物分子基本的、共同的结构特征，在有机化合物分子中，主要的、典型的化学键是共价键。共价键是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构，像这样由几个相邻原子通过共用电子并与共用电子之间形成的一种强烈作用叫做共价键。其本质是原子轨道重叠后，高概率地出现在两个原子核之间的电子与两个原子核之间的电性作用。在共价键的形成过程中，因为每个原子所能提供的未成对电子数是一定的，一个原子的一个未成对电子与其他原子的未成对电子配对后，就不能再与其它电子配对，即，每个原子能形成的共价键总数是一定的。
疏水作用力简称疏水力，生化过程包括生物大分子的构象变化、蛋白折叠、酶与底物的结合、几条支链结合形成多支链的酶、生物大分子高度凝聚形成的生物膜等，这些过程的发生主要是在疏水作用力驱动下进行的，疏水作用力是与范德华力有关但又不完全相同的一种作用力。疏水相互作用是通过疏水物的疏水基与水相互排斥作用而发生的，疏水基一般是非极性基。这种作用使疏水基相互靠拢，同时使水相互集中并更大程度地结构化。
抗原(antigen，缩写Ag)是指能引起抗体生成的物质，是任何可诱发免疫反应的物质。外来分子可经过B细胞上免疫球蛋白的辨识或经抗原呈现细胞的处理并与主要组织相容性复合体结合成复合物再活化T细胞，引发连续的免疫反应。
生物膜所含的蛋白叫膜蛋白，是生物膜功能的主要承担者。膜蛋白包括糖蛋白、载体蛋白和酶等。通常在膜蛋白外会连接着一些糖类，这些糖相当于会通过糖本身分子结构变化将信号传到细胞内。
本发明一实施例的表面修饰磁珠的制备方法，包括以下步骤S1～S3：
S1、将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂，得到修饰剂。
S2、将修饰剂与羧基活化剂混合，反应得到活化修饰剂。
S3、将表面具有氨基基团的磁珠与活化修饰剂混合，反应得到表面修饰磁珠。
研究发现，常用的天然抗原中，有一部分含有膜蛋白结构，其中，脂锚定蛋白可与脂肪酸形成共价结合，外周附着蛋白可以疏水间作用力结合脂类物质(亲脂性)。而本发明的制备方法采用不饱和脂肪酸作为磁珠的修饰剂，不饱和脂肪酸的末端含有羧基，通过活化其羧基基团，可以与表面含氨基基团的磁微粒偶联，从而达到用不饱和脂肪酸修饰磁微粒表面的目的，经过修饰的纳米磁珠具有直接结合含膜蛋白结构的抗原的能力。本发明克服了部分天然抗原常用基团含量少，普通方案无法结合到磁微粒表面或结合效率低下的技术性难题，采用了一种高效的间接结合方式，能专一地针对膜蛋白结构，抗原中的其他杂蛋白或甘氨酸等保存体系对其无干扰，从而显著提升了纳米磁珠包被物的性能。同时，采用不饱和脂肪酸修饰磁微粒的修饰效率高，副产物极少，修饰试剂由小分子组成，不因修饰而引入假阳，经修饰后的磁珠可直接与含膜蛋白结构抗原结合，不依赖氨基或巯基基团，无须采用其他交联剂，反应稳定可控，批间差异小，是对目前常用偶联方案缺陷的有力补充。与物理吸附类型的磁微粒相比，本发明的表面修饰磁珠与抗原结合稳定，抗原不容易在溶液体系中因长期保存、振荡等而脱落。
在一个具体示例中，不饱和脂肪酸的碳原子数为18～22。
在一个具体示例中，不饱和脂肪酸包括亚油酸和亚麻酸中的一种或多种，亚麻酸和亚油酸的结构式如下所示。根据抗原的不同，可以选择单一的一种不饱和脂肪酸，也可以联合使用多种不饱和脂肪酸。
亚麻酸
亚油酸
在一个具体示例中，羧基活化剂中含有碳二亚胺类化合物和N-羟基琥珀酰亚胺类化合物。碳二亚胺类化合物是一类常用的失水剂，主要用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成，其常用的有EDC、CMC、DCC等，反应中常加入N-羟基苯并三氮唑或N-羟基琥珀酰亚胺及其衍生物等，可以提高产率，减少副反应的发生。如图1所示，羧酸(Carboxylic Acid)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)反应生成O-酰基脲活性中间体(O-Acylisourea Active Intermediate)，然后与N-羟基琥珀酰亚胺反应生成磺化NHS酯中间体(Sulfo-NHS Ester Intermediate)，再与含有伯氨基的分子(Primary Amine-Containing Molecule)反应形成酰胺键。
在一个具体示例中，羧基活化剂中还含有溶剂，羧基活化剂的pH值为6～7，活化效果较好。可选地，羧基活化剂的溶剂为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，但不限于此。
在一个具体示例中，修饰剂中不饱和脂肪酸的浓度为0.5mg/mL～10mg/mL。
在一个具体示例中，磁珠与活化修饰剂混合时，活化修饰剂中对应的不饱和脂肪酸(即制备活化修饰剂所使用的不饱和脂肪酸)与磁珠的质量比≥1:10，确保不饱和脂肪酸相对于磁珠是足量的。
在一个具体示例中，有机溶剂选自DMSO和DMF中的一种或多种。可以理解，不限于此，可根据需要选择其他常用有机溶剂。
在一个具体示例中，羧基活化剂中碳二亚胺类化合物和N-羟基琥珀酰亚胺类化合物的浓度均为15mg/mL～25mg/mL。
在一个具体示例中，修饰剂和羧基活化剂混合后在20℃～30℃反应10min～20min。
在一个具体示例中，磁珠与活化修饰剂混合后在20℃～30℃反应1～3小时。
本发明一实施例的磁珠修饰试剂盒，包括修饰剂和羧基活化剂，修饰剂中含有不饱和脂肪酸。
本发明一实施例的表面修饰磁珠，其制备原料包括不饱和脂肪酸和表面具有氨基的磁珠，所述不饱和脂肪酸的羧基与所述磁珠表面的氨基形成酰胺键。
本发明一实施例的抗原磁珠包被物，包括上述表面修饰磁珠和抗原，抗原与表面修饰磁珠共价结合或以疏水作用力结合。
本发明一实施例的抗原磁珠包被物的制备方法，包括以下步骤：将上述表面修饰磁珠和抗原混合，反应2～4小时得到抗原磁珠包被物。
在一个具体示例中，还包括以下步骤：收集抗原磁珠包被物，加入含有BSA的缓冲液封闭1～3小时，然后磁分离，用含BSA的缓冲液定容，浓度为5mg/mL～15mg/mL。
以下为具体实施例。
实施例1
本实施例中的修饰剂为：5.0mg亚麻酸，溶解于1mL DMSO中。
(1)磁珠修饰：
A、取0.2mL修饰剂；
B、加入0.05mL EDC溶液和0.05mL Sulfo-NHS溶液(EDC和Sulfo-NHS用pH6.0 25mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MSE buffer)溶解，浓度均为20mg/mL)；
C、置于25℃，反应15分钟；
D、取10mg表面具有氨基基团的磁珠，磁分离，弃去上清，加入完成步骤C的溶液，重悬磁珠，置于25℃中混悬反应2小时；
E、用磷酸盐缓冲液清洗完成反应的磁珠，备用。
(2)抗原磁珠包被物制备
A、取10mg完成修饰的磁珠；
B、加入CMV(巨细胞病毒)天然抗原0.2mg，混匀，将磁珠置于37℃中，混合反应3小时；
C、反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的PBS缓冲液，37℃混合封闭2小时；
D、封闭完后，磁分离，用0.5％BSA的PBS缓冲液定容，浓度为10mg/mL。
对比例1
A、取10mg表面含有羧基基团的磁珠；
B、加入0.05mL EDC溶液和0.05mL Sulfo-NHS溶液(EDC和Sulfo-NHS用pH6.0 25mM的MSE buffer溶解，浓度均为20mg/mL)，置于25℃，反应30分钟；
C、磁分离，弃去上清，加入pH7.4的磷酸盐缓冲液1.0mL，加入CMV天然抗原0.2mg，混匀，将磁珠置于25℃中，混合反应3小时；
D、反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，37℃混合封闭2小时。
E、封闭完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，浓度为10mg/mL。
将实施例1和对比例1的抗原磁珠包被物稀释至工作浓度0.15mg/mL，收集8例测试样本进行测试，与样本反应后再与标记了鼠抗人IgG的吖啶酯形成复合物，测定其吖啶酯发光值，测试样本3～8为挑选的梯度有值样本。测试结果如下表1所示。
表1
根据表1可知，采用直接包被方案的对比例1，对于有值样本的测试值偏低，实施例1的信噪比明显高于对比例1，且高值样本的测试上限有明显改善。
实施例2
本实施例中的修饰剂为：5.0mg亚油酸，溶解于1mL DMSO中。
(1)磁珠修饰：
A、取0.2mL修饰剂；
B、加入0.05mL EDC溶液和0.05mL Sulfo-NHS溶液(EDC和Sulfo-NHS用pH6.0 25mM的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(MSE buffer)溶解，浓度均为20mg/mL)；
C、置于25℃，反应15分钟；
D、取10mg表面具有氨基基团的磁珠，磁分离，弃去上清，加入完成步骤C的溶液，重悬磁珠，置于25℃中混悬反应2小时；
E、用磷酸盐缓冲液清洗完成反应的磁珠，备用。
(2)抗原磁珠包被物制备
A、取10mg完成修饰的磁珠；
B、加入CMV(巨细胞病毒)天然抗原0.2mg，混匀，将磁珠置于37℃中，混合反应3小时；
C、反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的PBS缓冲液，37℃混合封闭2小时；
D、封闭完后，磁分离，用0.5％BSA的PBS缓冲液定容，浓度为10mg/mL。
将实施例2的抗原磁珠包被物稀释至工作浓度0.15mg/mL，按实施例1的测试条件进行测试，并将结果与实施例1的数据进行对比，如下表2所示。
表2
在本次实验中，实施例2本底水平偏高，中低值信号值与实施例1相当，但高值偏低较多，从信噪比上分析，其差于实施例1，但仍优于对比例1。由此可知，针对本实施例的目标抗原，其最优的修饰方式为实施例1。
实施例3
本实施例中的修饰剂分别为：
3-1 5.0mg亚麻酸，溶解于1mL DMSO中；
3-2 5.0mg亚油酸，溶解于1mL DMSO中。
3-3 2.5mg亚油酸，2.5mg亚麻酸，溶解于1mL DMSO中。
(1)磁珠修饰：
A、分别从三个修饰剂中各取0.2mL；
B、分别加入0.05mL EDC溶液和0.05mL Sulfo-NHS溶液(EDC和Sulfo-NHS用pH6.025mM的MSE buffer溶解，浓度均为20mg/mL)；
C、置于25℃，反应15分钟；
D、分别取10mg表面具有氨基基团的磁珠，磁分离，弃去上清，加入完成步骤C的溶液，重悬磁珠，置于25℃中反应2小时；
E、用磷酸盐缓冲液清洗完成反应的磁珠，备用。
(2)抗原磁珠包被物制备
A、分别取上述各10mg完成修饰的磁珠；
B、加入肺炎衣原体抗原0.2mg，混匀，将磁珠置于37℃中，混合反应3小时；
C、反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，37℃混合封闭2小时；
D、封闭完后，磁分离，用含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液定容，浓度为10mg/mL。
对比例2
A、取10mg表面疏水性强，具有物理吸附能力的纳米磁珠；
B、加入pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)1.0mL，加入肺炎衣原体抗原0.2mg，混匀，将磁珠置于25℃中，混合反应3小时；
C、反应完成后，磁分离，加入含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，37℃混合封闭2小时。
D、封闭完后，磁分离，含有0.5％BSA的PBS缓冲液定容，浓度为10mg/mL。
将实施例3-1、3-2、3-3和对比例2的抗原磁珠包被物稀释至工作浓度0.15mg/mL，收集7例测试样本进行测试，与样本反应后再与标记了鼠抗人IgG的吖啶酯形成复合物，测定其吖啶酯发光值，测试样本3～7为挑选的梯度有值样本。测试结果如下表3所示。
表3
选择实施例3-3，与对比例同时加入37℃保存7天的加速实验，加速结果与表3结果进行对比，结果如下表4所示。
表4
从数据可知，针对该目的抗原，对比例和实施例之间的信噪比在相当的水平，但综合考虑背景与结合效率等因素，其最优的修饰方案为实施例3-3。
将实施例3-3与对比例2同时验证其热稳定性，对比例2为物理吸附方案，在溶液体系中，包被在磁珠表面的抗原有脱落的风险，从37℃的测试结果可知，对比例2稳定性差，而实施例3-3既有较优的包被物的信号，也能有明显优于对比例的热稳定性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种表面修饰磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将不饱和脂肪酸溶于有机溶剂，得到修饰剂；
将所述修饰剂与羧基活化剂混合，反应得到活化修饰剂；
将表面具有氨基基团的磁珠与所述活化修饰剂混合，反应得到表面修饰磁珠。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述不饱和脂肪酸的碳原子数为18～22。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述不饱和脂肪酸包括亚油酸和亚麻酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化剂中含有碳二亚胺类化合物和N-羟基琥珀酰亚胺类化合物。
5.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述羧基活化剂中还含有溶剂，所述羧基活化剂的pH值为6～7。
6.根据权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述修饰剂中，所述不饱和脂肪酸的浓度为0.5mg/mL～10mg/mL。
7.一种磁珠修饰试剂盒，其特征在于，包括修饰剂和羧基活化剂，所述修饰剂中含有不饱和脂肪酸。
8.一种表面修饰磁珠，其特征在于，其制备原料包括不饱和脂肪酸和表面具有氨基的磁珠，所述不饱和脂肪酸的羧基与所述磁珠表面的氨基形成酰胺键。
9.一种抗原磁珠包被物，其特征在于，包括抗原和权利要求1～6任一项所述制备方法制得的表面修饰磁珠或权利要求8所述的表面修饰磁珠，所述抗原与所述表面修饰磁珠结合。
10.一种不饱和脂肪酸在制备用于修饰磁珠的修饰剂中的应用。
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