CN117031031A - 一种定量定向标记抗体的免疫探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种定量定向标记抗体的免疫探针及其制备方法，所述定量定向标记抗体的免疫探针包括DNA四面体、胶体金粒子、连接蛋白以及单克隆抗体，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接；其中，所述连接蛋白特异性识别单克隆抗体的可结晶片段，以实现单克隆抗体的定向标记。本发明通过采用共价键结合将DNA四面体的三个点通过共价键偶联在固相载体上，另外一个点偶联连接蛋白，通过DNA四面体可以控制连接蛋白的个数，进一步利用连接蛋白实现抗体定量定向标记。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种定量定向标记抗体的免疫探针及其制备方法。
背景技术
胶体金颗粒具有独特的物理化学性质以及良好的生物相容性，近年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域备受关注，已成功应用于蛋白质、DNA、脂质体等生物大分子的检测与分析，并在癌细胞识别、细胞核标记等领域获得了初步的成功。
目前，构建应用于免疫分析的胶体金探针方法多种多样，根据胶体金与抗体之间的成键类型，偶联的可分为共价方法和非共价方法。其中，吸附标记法是典型的采用非共价方法进行偶联的，吸附标记法通常指抗体通过疏水作用、静电作用力、氢键和范德华力等直接结合于固相载体表面，该方法操作简单、但具有一定的局限性：随机的取向可能屏蔽抗体的活性位点；抗体和纳米粒子相互作用力较弱，后续实验过程可能会导致抗体脱落，对检测结果造成影响。共价偶联法是通过在固相载体表面引入功能基团或对抗体进行化学修饰等方式实现抗体的标记，相比于吸附标记法，共价偶联法对抗体的结合力更强。但由于在抗体表面进行共价偶联反应的基团是随机的，共价偶联法仍具有抗体随机标记、掩蔽抗原结合位点的问题。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种定量定向标记抗体的免疫探针及其制备方法，旨在解决现有的抗体随机标记、掩蔽抗原结合位点，免疫探针无法控制抗体标记密度及抗体空间取向，抗体有效标记低的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种定量定向标记抗体的免疫探针，所述定量定向标记抗体的免疫探针，包括：
DNA四面体；
胶体金粒子，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；
连接蛋白，所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；以及，
单克隆抗体，所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接；
其中，所述连接蛋白特异性识别单克隆抗体的可结晶片段，以实现单克隆抗体的定向标记。
可选地，所述连接蛋白为重组蛋白，所述重组蛋白包括重组蛋白A或重组蛋白G。
可选地，所述DNA四面体为纳米结构的DNA四面体。
本发明还提出一种如上所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，包括以下步骤：
S10、合成DNA四面体，在胶体金溶液中加入DNA四面体，搅拌后，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，离心处理后获得第一沉淀；
S20、将所述第一沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体复合物；
S30、向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，离心处理后获得第二沉淀；
S40、将所述第二沉淀溶解在硼酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物；
S50、向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，离心处理后获得第三沉淀；
S60、将所述第三沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得定量定向标记抗体的免疫探针，即胶体金-DNA四面体-连接蛋白-单克隆抗体复合物。
可选地，在步骤S10中，所述胶体金溶液中的胶体金粒子和DNA四面体的摩尔比为1:(10～50)。
可选地，步骤S10包括：合成DNA四面体，在胶体金溶液中加入DNA四面体，搅拌后，反应12～18h，再加入质量浓度(m/v)为0.45～0.55％的BSA溶液，反应40～120min，在9000～15000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理3～8次后获得第一沉淀。
可选地，步骤S30包括：向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，反应40～120min，再在9000～14000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第二沉淀。
可选地，在步骤S30中，所述胶体金-DNA四面体复合物中的胶体金粒子和连接蛋白的摩尔比为1：(20～50)。
可选地，步骤S50包括：向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，在室温的条件下反应40～120min，再在8000～13000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第三沉淀。
可选地，在步骤S50中，所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中的胶体金粒子和单克隆抗体的摩尔比为1：(5～90)。
本发明提供的技术方案中，所述DNA四面体作为所述胶体金粒子和所述连接蛋白的连接中介，该所述DNA四面体，可控制连接蛋白的标记密度，从而控制抗体的标记密度。本发明采用定量定向标记抗体的胶体金免疫探针，能够实现快速、有效、灵敏且高效的检测，检测成本低，可有效的控制所述单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的空间取向与密度，提高有效标记，该所述连接蛋白，可特异性识别单克隆抗体上的Fc片段，从而保证所述单克隆抗体的抗原结合位点能够充分的暴露出来，促进所述单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的有效标记，提高免疫探针的生物活性，并在一定程度上减少所述单克隆抗体的使用量，降低检测成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的定量定向标记抗体的免疫探针定向标记的原理示意图；
图2为本发明提供的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法的一实施例流程示意图；
图3本发明提供的实施例4中胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物和抗体定向标记胶体金免疫探针的表征图；
图4本发明提供的实施例5中抗体定向标记抗体加入量与抗体标记密度。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，构建应用于免疫分析的胶体金探针方法多种多样，根据胶体金与抗体之间的成键类型，偶联的可分为共价方法和非共价方法。其中，吸附标记法通常指抗体通过疏水作用、静电作用力、氢键和范德华力等直接结合于固相载体表面，该方法操作简单、但具有一定的局限性：随机的取向可能屏蔽抗体的活性位点；抗体和纳米粒子相互作用力较弱，后续实验过程可能会导致抗体脱落，对检测结果造成影响。共价偶联法是通过在固相载体表面引入功能基团或对抗体进行化学修饰等方式实现抗体的标记，相比于吸附标记法，共价偶联法对抗体的结合力更强。但由于在抗体表面进行共价偶联反应的基团是随机的，共价偶联法仍具有抗体随机标记、掩蔽抗原结合位点的问题。
鉴于此，本发明提出一种定量定向标记抗体的免疫探针，旨在提供一种可以定量定向标记免疫抗体，并进一步控制抗体标记密度和抗体空间取向的定量定向标记抗体的免疫探针。请参照图1，图1为本发明提供的定量定向标记抗体的免疫探针定向标记的原理示意图，下面结合附图对本发明提供的定量定向标记抗体的免疫探针进行阐述。
本发明提出一种定量定向标记抗体的免疫探针，请参阅图1，所述定量定向标记抗体的免疫探针包括DNA四面体、胶体金粒子、连接蛋白以及单克隆抗体，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接；其中，所述连接蛋白特异性识别单克隆抗体的可结晶片段，以实现单克隆抗体的定向标记。
本发明提供的技术方案中，所述DNA四面体作为所述胶体金粒子和所述连接蛋白的连接中介，该所述DNA四面体，可控制连接蛋白的标记密度，从而控制抗体的标记密度。本发明采用定量定向标记抗体的胶体金免疫探针，能够实现快速、有效、灵敏且高效的检测，检测成本低，可有效的控制所述单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的空间取向与密度，提高有效标记，该所述连接蛋白，可特异性识别单克隆抗体上的Fc片段，从而保证所述单克隆抗体的抗原结合位点能够充分的暴露出来，促进所述单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的有效标记，提高免疫探针的生物活性，并在一定程度上减少所述单克隆抗体的使用量，降低检测成本。
进一步地，所述连接蛋白为重组蛋白，所述重组蛋白包括重组蛋白A或重组蛋白G，重组蛋白A是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白，具有与抗体特异性结合的能力；重组蛋白G与许多类型的免疫球蛋白G的Fc区结合。本实施例中选择重组蛋白A或重组蛋白G作为连接蛋白，可以特异性识别单克隆抗体上的Fc片段。
优选地，所述DNA四面体为纳米结构的DNA四面体，DNA四面体是一种新型的DNA纳米材料，目前在生物医学领域具有广泛的应用前景。DNA四面体具有优异的机械刚度、结构稳定性、良好的密度和方向控制等优点，采用DNA四面体作为检测支架，为生物识别过程提供了优越的环境，可以很好地控制抗体偶联的密度和方向。
本发明还提出一种如上所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，请参照图2，图2为本发明提供的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法的一实施例流程示意图，包括以下步骤：
S10、合成DNA四面体，在胶体金溶液中加入DNA四面体，搅拌后，再加入BSA溶液，离心处理后获得第一沉淀；
于本步骤中，首先合成DNA四面体，DNA四面体纳米结构的设计是根据碱基互补配对，将形成四面体纳米结构的五条单链等比例混合在tris-硫酸镁缓冲液(TM buffer)，加入三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)用来保护巯基，配成终浓度为1μM的四面体纳米结构溶液，混匀。然后将配好的样品放入PCR仪中95℃持续10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃中持续10～30min，即可得到DNA四面体纳米结构。
取0.06mL～0.1mL DNA四面体溶液在1mL胶体金溶液中，搅拌后，反应12～18h，再加入质量浓度(m/v)为0.45～0.55％的BSA溶液，反应40～120min，在9000～15000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理1次，得到胶体金-DNA四面体复合物。
向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入点击反应液叠氮-PEG4-NHS酯(AEPS)，使胶体金-DNA四面体重悬在点击反应液AEPS中，在室温的条件下反应2h～5h，使DNA四面体上的二苯并环辛炔基团(DBCO)与AEPS上的叠氮基团通过点击化学偶联，反应完后在9000～15000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理3～8次，获得第一沉淀，其中，多次离心处理的目的是能够保证游离的所述DNA四面体和所述BSA与所述第一沉淀能够充分的分离，节省后续步骤中所述连接蛋白的浪费，节约制造成本，并除去多余DNA、BSA和AEPS，所述胶体金溶液中的胶体金粒子和DNA四面体的摩尔比为1:(10～50)，优选为1:(20～45)，在该配比范围内，所述胶体金粒子可以和所述DNA四面体充分连接。
S20、将所述第一沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体复合物；
所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.005～0.02mol/L，优选为0.01mol/L，本步骤通过将所述第一沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，除去沉淀表面的杂质，从而获得纯净的胶体金-DNA四面体复合物。
S30、向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，离心处理后获得第二沉淀；
本步骤具体包括向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，使连接蛋白上的氨基与AEPS上的N-羟基琥珀酰亚胺基团(NHS)反应使连接蛋白与DNA四面体偶联，反应40～120min，再在9000～14000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第二沉淀，其中，所述胶体金-DNA四面体复合物中的胶体金粒子和连接蛋白的摩尔比为1：(20～50)，通过控制所述胶体金-DNA四面体复合物中的胶体金粒子和连接蛋白的摩尔比范围，使得所述胶体金粒子和连接蛋白充分连接。
S40、将所述第二沉淀溶解在硼酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物；
于本步骤中，通过将所述第二沉淀溶解在硼酸盐缓冲液中，除去所述第二沉淀上的杂质，以得到无杂质的胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物，所述硼酸盐缓冲液的浓度为0.03～0.1mol/L，优选为0.05mol/L。
S50、向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，离心处理后获得第三沉淀；
本步骤具体包括向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，在室温的条件下反应40～120min，再在8000～13000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第三沉淀，其中，所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中的胶体金粒子和单克隆抗体的摩尔比为1：(5～90)，可以理解的是，上述步骤S50中的反应条件可以择一满足也可以同时满足，当条件同时满足时，制备得到的第三沉淀效果更好。
S60、将所述第三沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得定量定向标记抗体的免疫探针，即胶体金-DNA四面体-连接蛋白-单克隆抗体复合物。
本发明提供的制备方法可根据具体应用情况，选择对应的抗体来满足不同对象的检测，本发明制备的免疫探针，具有较高的特异性、稳定性和选择性，本发明通过DNA四面体和连接蛋白来控制抗体标记数量及取向，减小空间位阻的影响，提高免疫探针的生物活性。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种定量定向标记抗体的免疫探针，包括DNA四面体、胶体金粒子、连接蛋白以及单克隆抗体，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接。
实施例2
一种定量定向标记抗体的免疫探针，包括DNA四面体、胶体金粒子、连接蛋白以及单克隆抗体，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接，所述连接蛋白为重组蛋白A。
实施例3
一种定量定向标记抗体的免疫探针，包括DNA四面体、胶体金粒子、连接蛋白以及单克隆抗体，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接，所述连接蛋白为重组蛋白G。
实施例4
(1)DNA四面体的合成：将形成DNA四面体的五条单链等比例混合在TM buffer，加入TCEP，配成终浓度为1μM的四面体纳米结构溶液，混匀。然后将配好的样品放入PCR仪中95℃持续10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃中持续30min，即可得到DNA四面体纳米结构。
(2)胶体金-DNA四面体复合物制备：取0.1mLDNA四面体溶液在1mL胶体金溶液中在室温的条件下反应过夜。反应完后加入0.5％的BSA在室温的条件下反应120min，再在14000r/min的转速下离心处理13min，离心处理1次，得到沉淀，将所述沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L，所述纳米粒子和所述DNA四面体的摩尔比为1:(10～50)。
(3)向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入点击反应液AEPS，在室温的条件下反应3h，反应完后在14000r/min的转速下离心处理13min，离心处理3次，获得第一沉淀。
(4)将所述第一沉淀溶解在0.05mol/L硼酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体复合物，向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入重组蛋白A，在室温的条件下反应60min，再在13000r/min的转速下离心处理12min，离心处理2次，获得第二沉淀，将所述第二沉淀溶解在0.01M磷酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物，所述纳米粒子和所述连接蛋白的摩尔比为1:(20～50)。
(5)抗体偶联：向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，在室温的条件下反应120min，再在11000r/min的转速下离心处理10min，离心处理2次，获得第三沉淀，将所述第三沉淀溶解在0.01M磷酸盐缓冲液中(磷酸盐缓冲液的用量为沉淀第三沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针，所述胶体金和所述单克隆抗体的摩尔比为1:(5～90)，得图3。
(6)抗体标记密度：为了控制免疫探针的抗体标记密度，在1mL的胶体金-DNA四面体-连接蛋白偶联物中加入不同摩尔比(单克隆抗体:胶体金＝6、12、18、24、36、48、60)的单克隆抗体，室温下反应120min后，用考马斯亮蓝法计算出不同条件下的抗体标记密度，探索抗体加入量与抗体标记密度之间的关系。
实施例5
(1)DNA四面体的合成：将形成DNA四面体的五条单链等比例混合在TM buffer，加入TCEP，配成终浓度为1μM的四面体纳米结构溶液，混匀。然后将配好的样品放入PCR仪中95℃持续10min，然后迅速降温到4℃，并在4℃中持续30min，即可得到DNA四面体纳米结构。
(2)胶体金-DNA四面体复合物制备：取0.1mLDNA四面体溶液在1mL胶体金溶液中在室温的条件下反应过夜。反应完后加入0.5％的BSA在室温的条件下反应120min，再在14000r/min的转速下离心处理13min，离心处理1次。将所述沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L。
(3)向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入点击反应液AEPS，在室温的条件下反应3h，反应完后在14000r/min的转速下离心处理13min，离心处理3次，获得第一沉淀。
(4)将所述第一沉淀溶解在0.05mol/L硼酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体复合物，向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入重组蛋白G，在室温的条件下反应60min，再在12000r/min的转速下离心处理10min，离心处理2次，获得第二沉淀，将所述第二沉淀溶解在0.01M磷酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物。
(5)抗体偶联：向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，在室温的条件下反应150min，再在10000r/min的转速下离心处理10min，离心处理2次，获得第三沉淀，将所述第三沉淀溶解在0.01M磷酸盐缓冲液中(磷酸盐缓冲液的用量为沉淀第三沉淀和上清液体积总和的10％)中，获得抗体定向标记胶体金免疫探针。
(6)抗体标记密度：为了控制免疫探针的抗体标记密度，在1mL的胶体金-DNA四面体-连接蛋白偶联物中加入不同摩尔比(单克隆抗体:胶体金＝6、12、18、24、36、48、60)的单克隆抗体，室温下反应150min后，用考马斯亮蓝法计算出不同条件下的抗体标记密度，探索抗体加入量与抗体标记密度之间的关系，得图4。
测试结论
由图3可知，其中，图3AuNP为胶体金粒子；TDN为DNA四面体；PrA为连接蛋白；mAb为单克隆抗体，随着DNA四面体、重组蛋白A、抗体依次偶联到胶体金上，胶体金尺寸不断增大，证明免疫探针制备成功。其中，PDI小于0.3，表示免疫探针尺寸的均一性良好。
由图4可知，抗体标记密度与抗体的加入量成线性关系，因此本发明的免疫探针可以控制抗体的标记密度。
综上所述，本发明通过采用共价键结合将DNA四面体通过共价键偶联在固相载体上，另外一个点偶联连接蛋白，通过DNA四面体可以控制连接蛋白的个数，进一步利用连接蛋白实现抗体定向标记，采用定量定向标记抗体的胶体金免疫探针，能够实现快速、有效、灵敏且高效的检测，检测成本低，可有效的控制所述单克隆抗体在所述胶体金粒子表面的空间取向与密度，提高抗体的有效标记。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种定量定向标记抗体的免疫探针，其特征在于，包括：
DNA四面体；
胶体金粒子，所述胶体金粒子与所述DNA四面体的三个角点相连接；
连接蛋白，所述连接蛋白的一端与所述DNA四面体的第四个角点相连接；以及，
单克隆抗体，所述单克隆抗体与所述连接蛋白的另一端相连接；
其中，所述连接蛋白特异性识别单克隆抗体的可结晶片段，以实现单克隆抗体的定向标记。
2.如权利要求1所述的定量定向标记抗体的免疫探针，其特征在于，所述连接蛋白为重组蛋白，所述重组蛋白包括重组蛋白A或重组蛋白G。
3.如权利要求1所述的定量定向标记抗体的免疫探针，其特征在于，所述DNA四面体为纳米结构的DNA四面体。
4.一种如权利要求1所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、合成DNA四面体，在胶体金溶液中加入DNA四面体，搅拌后，再加入牛血清白蛋白(BSA)溶液，离心处理后获得第一沉淀；
S20、将所述第一沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体复合物；
S30、向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，离心处理后获得第二沉淀；
S40、将所述第二沉淀溶解在硼酸盐缓冲液中，获得胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物；
S50、向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，离心处理后获得第三沉淀；
S60、将所述第三沉淀溶解在磷酸盐缓冲液中，获得定量定向标记抗体的免疫探针，即胶体金-DNA四面体-连接蛋白-单克隆抗体复合物。
5.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，在步骤S10中，所述胶体金溶液中的胶体金粒子和DNA四面体的摩尔比为1：(10～50)。
6.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤S10包括：合成DNA四面体，在胶体金溶液中加入DNA四面体，搅拌后，反应12～18h，再加入质量浓度(m/v)为0.45～0.55％的BSA溶液，反应40～120min，在9000～15000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理3～8次后获得第一沉淀。
7.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤S30包括：向所述胶体金-DNA四面体复合物中加入连接蛋白，反应40～120min，再在9000～14000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第二沉淀。
8.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，在步骤S30中，所述胶体金-DNA四面体复合物中的胶体金粒子和连接蛋白的摩尔比为1：(20～50)。
9.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，步骤S50包括：向所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中加入单克隆抗体，在室温的条件下反应40～120min，再在8000～13000r/min的转速下离心处理5～15min，离心处理2～7次，获得第三沉淀。
10.如权利要求4所述的定量定向标记抗体的免疫探针的制备方法，其特征在于，在步骤S50中，所述胶体金-DNA四面体-连接蛋白复合物中的胶体金粒子和单克隆抗体的摩尔比为1：(5～90)。
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