JP2003508073A

JP2003508073A - 磁性細胞分離カラムにおける選択された細胞の改変方法

Info

Publication number: JP2003508073A
Application number: JP2001521467A
Authority: JP
Inventors: シュテファンミルテニー，; マリオアッセンマッヒャー，; ユルゲンシュミット，
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2003-03-04
Anticipated expiration: 2020-09-01
Also published as: WO2001017687A2; CA2383791C; DE60026729T2; EP1207961A2; AU1294801A; US6468432B1; ES2260063T3; DE60026729D1; JP4612982B2; EP1207961B1; WO2001017687A3; CA2383791A1; AU778569B2; ATE320314T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、高勾配磁性細胞分離カラム（ＨＧＭＳ）に保持された細胞を改変するための方法を提供する。異種混合物中の選択された細胞を、磁性粒子を含み、そして選択された細胞に対して特定的な標識で標識化する。標識化された選択された細胞を、その選択された細胞を保持する磁性細胞分離カラムに適用する。次いで、その選択された細胞をカラムに保持されている間に改変し、次いで磁場を除去することによりもとの懸濁物または精製された異種懸濁物へ除去する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、選択された細胞を改変するプロセスにおける高勾配磁性細胞分離（
ＨＧＭＳ）技術の使用に関する。

【０００２】（背景技術）先行技術は、体外で細胞を改変する種々の方法および技術を扱う。蛍光部分に
結合された抗体の連結による細胞の表面染色は、ひとつのよくある改変である。
固定後の細胞内染色もまた、一般的である。κおよびλ軽鎖は、このような染色
によって標的化され、そしてモノクローナル腫瘍細胞集団をアッセイするため使
用され得る。この種類の染色は、しばしば特異的であるが、細胞は、無数の非特
異的方法（薬学的因子または化学的因子への曝露、ホルモンまたは細胞性活性を
媒介することが公知の他の化合物、あるいは組換え産物を引き起こす遺伝子によ
るトランスフェクションなどによって）において改変され得る。従って、細胞改
変技術は、研究指向の可能性および処置指向の可能性の両方を有する。

【０００３】先行技術において、染色のような改変は、懸濁物中の細胞を用いてか、または
異なる表面（顕微鏡スライドなど）に固定化された細胞の単層を用いてかのいず
れかで行われ、改変因子が全ての細胞に等しく近づくことを可能にする。これら
の様式で、細胞を染色する方法または別の改変する方法は、当該分野で公知であ
る。単層改変における最近の進歩は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ＥｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄＧｅｎｅＴｒａｎ
ｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｕｔｉｃｓＵ
ｓｉｎｇＰｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅＩｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙＤｅｖｉ
ｃｅｓ、ＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄら、編（１９９８）および米国特許
第５，９１２，１７７号に例示される。しかし、これらの方法は、時間がかかり
得、そしてしばしば多数の洗浄工程を必要とし得、細胞損失の潜在的な危険を引
き起こす。これらの方法は、少ない数の細胞が含まれる場合、特に問題がある。

【０００４】先行技術において、凝集形態（遠心分離後に形成されたペレットなど）の細胞
を改変することは、推奨されない。細胞を不可逆的な凝集を防ぐため互いから分
離する必要がある場合、ホルムアルデヒドなどの架橋因子は、同様の問題を示す
。

【０００５】非常にしばしば、実施者は、異種混合物または懸濁物（リンパまたは血液など
）の中で１つの細胞型を改変することを望む。なぜなら、改変の後に、その特異
的細胞型が、研究され、または処置もしくは試験レジメントの一部として患者へ
戻されるためである。そのような状況において、標的化されたクラス以外の細胞
の改変は、悪影響を有し得る。細胞分離の種々の方法は、これらの必要性に応じ
るために開発された。

【０００６】当該分野において最近の細胞分離技術の概説は、ＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉ
ｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｒｅｃｋｔｅｎｗ
ａｌｄら、編（１９９８）によって提供される。使用される１つの細胞分離技術
は、磁性細胞分離を含み、それにより標的細胞は、磁性マーカーで標識化され得
、そして次いで選択的に磁場に対して曝露されるチャンバまたはカラムに維持さ
れ得る。Ｋａｎｔｏｒら（１９９８、ＭａｇｎｅｔｉｃＣｅｌｌＳｏｒｔｉ
ｎｇｗｉｔｈＣｏｌｌｏｉｄａｌＳｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ＆
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｇｅｅ（１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉ
ｃＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＵｓｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａ
ｎｄＳｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｃｅ
ｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ＆Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
）；およびＭｉｌｔｅｎｙｉ，Ｓ．、米国特許第５，４１１，８６３号は、磁性
細胞分離技術を開示する。高勾配磁性分離について、代表的には、磁性マーカー
に結合された選択された細胞を含む異種懸濁物を、カラムを通過させ、選択され
た細胞を磁気的にカラムに付着させ得るか、またはカラム中の強磁性のマトリッ
クスに付着し得る。残りの懸濁物は、選択され磁化された細胞をカラムに結合さ
せたまま溶出される。磁場が、取り除かれる場合、その選択された細胞は、溶出
され得る。

【０００７】非磁性細胞分離プロセスは、細胞改変を容易にするため使用され得る。これら
の方法は、免疫アフィニティー細胞分離技術を含み、その方法はしばしば磁性細
胞分離方法よりも好ましくない。なぜなら、免疫アフィニティー細胞分離技術は
、しばしば細胞損失の増加ならびに試薬の使用および塩濃度の増加を生じ、溶出
液の透析を必要とし得るためである。Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９９８、Ｉｓｏ
ｌａｔｉｏｎＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ａｎｄＧｅｎｅ
ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌ−ＢａｓｅｄＴｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓＵｓｉｎｇＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＩｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔ
ｙＤｅｖｉｃｅｓ、ＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎ
ｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）は、方法を開示し、それによって末梢血単核細
胞（ＰＢＭＣ）の選択されたクラスは、免疫アフィニティープロセスによって明
確に選択され得、そこで選択された細胞は、ポリスチレン構造に共有結合的に結
合されるモノクローナル抗体またはレクチンによって固定化され、そして次いで
、固定化されている間に培養され、活性化され、または遺伝子改変される。幹細
胞を改変する同様の方法は、米国特許第５，９１２，１７７号に開示される。し
かし、これらの方法の主な不都合は、選択された細胞を平坦な表面または別の二
次元の表面に結合し、選択されるべき細胞の数に関する相当な表面面積を必要と
することである。細胞は、図１に例示されるように単層を形成しなければならな
い。さらに、選択のために使用される抗体は、装置自体に加えられ、そしてその
ような技術は、各所望される標的に対して特殊な装置または構造を必要とする。
さらに、選択された細胞をそれらの構造から開放し、そして再懸濁することは、
時間がかかるプロセスであり得る。

【０００８】磁性細胞分離技術は、米国特許第５，６２２，８３１号および米国特許第５，
８７６，５９３号において記載されるように、細胞を固定化するため使用されて
きた。米国特許第５，６２２，８３１号は、固定化された細胞を開放しそして再
懸濁するために複雑な転換メカニズムを必要とし、そして米国特許第５，８７６
，５９３号は、カラムを使用しないが、その代わり実質的に一次元の単層として
細胞を固定化することを必要とする。

【０００９】ＨＧＭＳカラムにおいて選択された細胞を改変することは、有利であり、ＨＧ
ＭＳカラムは、免疫アフィニティー系に対する磁性系のさらなる利点（固定化さ
れた細胞、増加した細胞濃度、減少した試薬の使用、およびより有効な濃度の改
変試薬の単純な再懸濁など）を運ぶ。

【００１０】（発明の開示）本発明は、選択された細胞を改変する方法を提供し、その方法は、高勾配磁性
分離（ＨＧＭＳ）カラムに保持され、磁気的に標識化された選択された細胞を改
変し、それによって改変された選択された細胞を生成する工程を包含する。本発
明はまた、選択された細胞を改変する方法を提供する。その方法は、細胞集団を
ＨＧＭＳカラムに適用する工程であって、この細胞集団が、磁気的に標識化され
た選択された細胞を含み、そしてこの磁気的に標識化された選択された細胞が、
このカラムに保持される工程；およびこのカラムに保持された選択された細胞を
改変し、それによって改変された選択された細胞を生成する工程を包含する。他
の局面において、この方法はさらに、カラムから改変された選択された細胞を除
去する工程を包含する。さらなる局面において、本発明は、取り除かれた選択さ
れた細胞を第２の高勾配磁性細胞分離カラムに適用して、その結果この選択され
た細胞がこの第２カラムによって保持される、追加の工程；およびこの第２のカ
ラムによって保持され選択された細胞を改変する工程を包含する。

【００１１】他の実施形態において、高勾配磁性細胞分離カラムは、カラムの全容量に対し
て高容量のマトリックスを含む。さらなる実施形態において、このマトリックス
は、カラムの全容量の５０％より大きく、そしてその上さらなる実施形態におい
て、このマトリックスが、カラムの全容量の６０％より大きい。その上さらなる
実施形態において、マトリックスは、強磁性球体を含む。他の実施形態において
、除去は、この磁場の除去による。

【００１２】いくつかの実施形態において、改変工程は、選択された細胞を細胞内染色する
工程；選択された細胞を透過させる工程；磁気的に標識化された選択された細胞
を第２の標識で標識化する工程；生物学的反応性化合物を選択された細胞に結合
する工程；選択された細胞を目的の遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェク
トする工程；酵素を選択された細胞に適用する工程；薬学的因子を選択された細
胞に適用する工程；生物学的因子または化学的因子を選択された細胞に適用する
工程；あるいは多数の改変因子を適用する工程を包含する。いくつかの実施形態
において、生物学的反応性化合物として、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチ
ド、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、レクチン、脂質または酵素
が挙げられる。

【００１３】（発明の実施のための最良の形態）本発明は、高勾配磁性細胞分離（ＨＧＭＳ）カラム中に保持された選択された
細胞を改変することにより、選択された細胞を改変するためのプロセスを提供す
る。本発明は、陽性選択、すなわち、直接的な選択にかけられた特定の細胞集団
の改変に関する。選択された細胞を含む細胞の集団（例えば、全血）に対してこ
の方法を実施することにより、この選択された細胞集団は、富化され得る。本発
明は、従来技術と比較して、必要な工程の数を実質的に減少し、ここで富化プロ
セスおよび改変プロセスは別々に行われる。

【００１４】本発明は、選択された細胞または標識化された選択された細胞に対する特異性
を可能にすることを意図されるＨＧＭＳカラムデバイスまたは方法論を使用する
。本発明の１つの特定の利点は、ＨＧＭＳシステムで使用され得る増加した細胞
濃度およびこの方法における工程の数の減少である。例えば、本発明のいくつか
の局面において、サンプル（例えば、全血）は直接生物体から得られ、細胞は例
えば全血における磁性標識化により選択され、この全血はＨＧＭＳに適用され、
このカラムに保持された選択された細胞は改変され、そしてこの改変された選択
された細胞は溶出され、そして間に起こる遠心分離工程なしで分析に移され、そ
れにより自動化の機会を提供し、そして細胞損失の潜在性を減少させる。

【００１５】本発明の別の利点は、プロセスの間の温度制御をする機会である。ＨＧＭＳは
、インキュベーターもしくは冷蔵庫で、および／または所望の温度で緩衝液を使
用して進められ得る。熱伝導性マトリックス（例えば、スチールボール、スチー
ルウールまたは他の球体）を含むＨＧＭＳマトリックスの使用は、プロセスの間
に温度を制御する機会を提供する。

【００１６】本発明の別の利点は、磁場を変化させて磁場のオンとオフとを切り換えること
により、細胞をＨＧＭＳ上の相から相へ（すなわち、移動相から固定相へ、また
は固定相から移動相へ）迅速に移動し得ることである。好ましい実施形態におい
て、磁場は、カラムを磁石に対して移動することにより、またあるいは電磁石を
変化させることにより、調整され得る。

【００１７】（定義）本明細書中で使用される場合、「選択された細胞」は、実施者が改変を所望す
る細胞である。代表的には、細胞は、いくつかの特徴を有しており、この特徴が
不均一系懸濁物においてこれらの細胞を他の細胞と区別させ、そしてこの特徴に
より細胞を標識化および分離することが可能となる。本発明に従って、選択され
た細胞は、ＨＧＭＳカラム上に保持され、カラム上に保持される間に改変され、
次いで溶出される。

【００１８】選択された細胞の「保持」は、選択された細胞が、不要な細胞が除去される間
カラム中に残ることを確実にする。代表的には、選択された細胞の保持は、固定
化による。

【００１９】本明細書中で使用される場合、磁性細胞分離カラムにおける選択された細胞の
「固定化」は、連続的な固定位置におけるカラム中の細胞の保持をいう。

【００２０】磁性細胞分離カラムからの選択された細胞の「除去」は、保持または固定化に
続いて選択された細胞を溶出することを含む。高純度の選択された細胞が所望さ
れる状況において、この選択された細胞は、除去されて適切な緩衝液中に再懸濁
され得る。あるいは、選択された細胞は、本明細書中に記載されるようにカラム
中での選択された細胞の改変後に、除去されてそして元々の懸濁物に戻され得る
。

【００２１】本明細書中で使用される場合、「標識化」は、細胞にマーカーを付着するプロ
セスであり、これにより、さらなる処理の後のある時点に、これらの細胞が不均
一系懸濁物から分離され、および／もしくは検出され、分析され、または計数さ
れることが可能になる。標識は、特異的に、選択された細胞に標的化され得るが
、標的化される必要はない。このようなマーカーまたは標識としては、以下が挙
げられるが、これらに限定されない：着色、放射性、蛍光性、または磁性の、抗
体に結合体化した分子もしくは粒子、または細胞もしくは細胞成分に結合するこ
とが既知である他の生物学的分子もしくは粒子。抗体は、それらの特定の細胞型
を標的にする能力のために、標識成分としてしばしば使用される。抗体の代替と
して役立ち得る他の生物学的に反応性の標識成分としては、以下が挙げられるが
これらに限定されない：遺伝的プローブ、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖
、ポリヌクレオチド、酵素、補酵素、補因子、抗生物質、ステロイド、ホルモン
またはビタミン。

【００２２】本明細書中で使用される場合、細胞の「磁気的標識化」は、磁性標識を細胞に
付着することを意味し、このような標識化は、磁性特性を有する粒子または分子
をこの細胞に付着することにより達成される。１つの実施形態において、磁性標
識は、磁性粒子に結合体化した抗体を含む。磁性粒子に結合体化された抗体を含
む磁性標識は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃ
ｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｈＧｌａｄｂ
ａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販される。このような標識は、必要に応じて
蛍光性粒子または放射性の標識または成分も含む。

【００２３】本明細書中で使用される場合、「磁性細胞分離カラム」は、高勾配磁性細胞（
ＨＧＭＳ）カラムである。ＨＧＭＳカラムは、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ
ＭａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒＩｍｐｒｏｖｅｄＨｉｇｈＧｒａｄｉｅｎ
ｔＭａｇｎｅｔｉｃＳｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｍａｔｅｒｉａｌｓと題するＭｉｌｔｅｎｙｉ，Ｓ．の米国特許第５，４１１，
８６３号に記載され、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ（Ｆｒｉｅｄ
ｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｈＧｌ
ａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販される。

【００２４】本明細書中で使用される場合、「高勾配磁性細胞分離」は、磁場中に配置され
たチャンバまたはカラムにおいて磁性材料を選択的に保持するための手順であり
、この方法はまた、磁性粒子で選択的に標識化された非磁性標的に適用され得る
。チャンバにわたって与えられる磁性勾配の存在下で、磁気的に標識化された標
的は、チャンバに保持される。チャンバがマトリックスを含有する場合、磁気的
に標識化された標的は、マトリックスと結合するようになる。磁性標識を有さな
い物質はチャンバを通過する。次いで、保持された物質は、磁場の強度を変化さ
せることにより、または磁場を消去することにより、溶出（除去）され得る。磁
気的に標識化された標的については、酵素切断部位をさらに含む磁性ビーズを用
いるような他の手段によっても放出が可能であり、ここで酵素切断（カラムの内
側または外側のいずれかで）磁性標的を放出する。あるいは、保持された物質は
、例えば、ｐＨ変化またはイオン強度の変化により放出され得る。選択された細
胞の保持および放出のプロセスは、図３Ａ〜３Ｂに示される。磁場は、永久磁石
または電磁石のいずれかにより供給され得る。所望の標的物質の選択性は、磁性
粒子に結合する特異的結合パートナーにより与えられる。磁場が印加されるチャ
ンバは、しばしば適切な磁化率の物質のマトリックスを備え、マトリックスの表
面に近い体積においてチャンバ中に局所的に高磁場勾配を誘導する。これにより
、かなり弱い磁化粒子の保持が可能となる。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｓ．、米国特許
第５，４１１，８６３号を参照のこと。

【００２５】好ましくは、磁性細胞分離カラムは、高体積のマトリックスを含むカラムを使
用する。マトリックスは、強い局所磁場勾配を与えるように供給され、そしてし
ばしばポリマー被覆スチールウールのような強磁性物質である。好ましくは、生
体適合性ポリマーで被覆された強磁性球の密充填マトリックスが使用される。Ｋ
ａｎｔｏｒら、ＭａｇｎｅｔｉｃＣｅｌｌＳｏｒｔｉｎｇｗｉｔｈＣｏ
ｌｌｏｉｄａｌＳｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃＰａｒｔｉｃｌｅｓ
ｉｎＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）を参照のこと。マトリックス体積は、好ましくは全
カラム体積の５０％より多く、そして好ましくは全カラム体積の６０％より多い
。鉄球マトリックスを含有する、市販のＭＳ＋カラムまたはＶＳ＋カラム（Ｍｉ
ｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ（ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳ
ｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｇｉｓｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）は、表１に詳述されるように、低い自由カラム体積で高い結合細胞の容量
を提供する。

【００２６】

【表１】カラム内で固定化されて、選択された細胞は、保持されている間に、実施者によ
り改変され得る。

【００２７】本明細書中で使用される場合、細胞を「改変する」とは、選択された細胞を、
その以前の状態から物理的、生物学的または化学的に変更する任意のプロセスを
いう。本発明の範囲内の改変の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定さ
れない：抗体または蛍光マーカーもしくは放射性マーカーまたは生物学的リガン
ドおよび生物学的基質のような標識で）細胞を標識化すること、細胞内染色、表
面染色、固定、浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、遺伝的組換え、
活性化、トランスフェクション、感染および酵素、生物学的改変異因子、または
薬理学的因子または化学的因子の適用により引き起こされる他の細胞変化。

【００２８】本明細書中で使用される場合、「改変因子」は、広義に、改変を起こし得る任
意の因子をいう。このような改変因子としては、以下が挙げられ得るが、これら
に限定されない：抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド、レクチン、脂質、生物学的改変因子、固定因子、薬
理学的因子、化学的因子、浸透化因子、細胞内染料、表面染料、発現ベクター、
および酵素。

【００２９】本明細書中で使用される場合、「固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）」または「固定化
（ｆｉｘｉｎｇ）」は、例えば、その元のサイズを維持するか、細胞物質の最小
限の損失を受けるか、またはその細胞内成分の反応性を保持することにより、細
胞の特定の状態を保存し、好ましくはインビボでの細胞の構造の正確な提示の維
持をもたらすように作用する任意のプロセスをいう。好ましい固定化因子として
は、ホルムアルデヒド溶液、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよび他の因子が
挙げられる。ホルムアルデヒド固定化は、好ましくはインキュベーション工程を
含み、ここでホルムアルデヒド溶液は、最適な温度で細胞に浸透する時間を与え
られる。ホルムアルデヒド固定は、細胞が細胞分離カラムに保持される間に達成
され得るが、好ましくはカラムに加えられる前の細胞で達成される。固定は、磁
性標識化の前または後に行われ得る。固定工程およびインキュベーション工程の
後、細胞は、分離およびさらなるカラム上での改変のために細胞分離カラムに直
接加えられ得る。これにより、カラムに固定化された細胞に対して固定が行われ
る場合に起こり得る凝集体の形成が減少する。

【００３０】本明細書中で使用される場合、「細胞内染色」とは、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない細胞内分子、成分または構造への標識の結合のプロセスをいう
：タンパク質、酵素、ヌクレオチド、染色体、免疫グロブリンもしくは免疫グロ
ブリン成分、または膜。代表的には、細胞は、細胞内染色の前に浸透化される。

【００３１】本明細書中で使用される場合、細胞の「浸透化」とは、細胞の細胞質または細
胞内分子、成分もしくは構造へのアクセスを促進する任意のプロセスをいう。浸
透化は、ホルムアルデヒド、エタノールまたは界面活性剤への曝露を含むがこれ
らに限定されない当該分野で公知の任意の方法により行われ得る。緩衝液中のサ
ポニンは、本発明に従って首尾よく使用された。

【００３２】本明細書中で使用される場合、「トランスフェクション」は、培養細胞のＤＮ
Ａの取り込みによる遺伝的改変であり、これは、通常、目的の遺伝子を含む、プ
ラスミドまたは他の型のＤＮＡベクターの形式で適用される。トランスフェクシ
ョンは、当該分野において公知の任意の方法によるものであり得、この方法とし
ては、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションまたはＤＥＡ−デキストラン
媒介トランスフェクション、リポフェクション、あるいは、アデノウイルスベク
ターまたはレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターの使用を通じて、
が挙げられるが、これらに限定されない。

【００３３】本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、小さなキャリアＤＮＡ分子で
あり、この中に、ＤＮＡ配列が、複製および／または発現される宿主細胞へ導入
されるために挿入され得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、あ
るいは植物ウイルスまたは動物ウイルスから誘導され得る。

【００３４】本明細書中で使用される場合、「生物学的修飾因子」は、生存細胞の活動に、
反応または変化をもたらし得る、任意の生物学的化合物である。このような修飾
因子は、細胞活動を加速または減速し得、有糸分裂を刺激または遅延し得、特定
の遺伝子を活性化または不活性化し得、細胞の受容性または透過性を増加または
減少し得、あるいは他の変化をもたらし得る。生物学的修飾因子の例としては、
薬理学的因子、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、増殖因子、および
他の細胞間シグナルまたは細胞内シグナルが挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００３５】本明細書中で使用される場合、「薬理学的因子」は、疾患または機能不全の処
置のために利用可能な多くの物質のいずれかである。

【００３６】本明細書中で使用される場合、「化学的因子」は、細胞との化学反応をもたら
す多くの物質のいずれかである。化学的因子の例としては、酸、塩基、染料、お
よび溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。

【００３７】（選択された細胞のＨＧＭＳおよび改変）本発明は、好ましくは、まず、磁性粒子（典型的には、直径２０〜１００ｍｍ
）を含む標識で、選択された細胞を標識化することによって達成される。このよ
うなミクロビーズは、種々のモノクローナル抗体に共有結合される磁性ミクロビ
ーズをして、市販され（例えば、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ、
ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８、Ｄ−５１４２９Ｂｅｒｇｉ
ｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、ＧｅｒｍａｎｙからのＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）そし
てこの標識化は、当該分野において公知の手法で達成され得る。選択された細胞
の蛍光標識化も、この段階で行われ得る。可能ならば、細胞は、好ましくは、こ
の工程で洗浄され、そして適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡ）
中に懸濁される。

【００３８】磁気的に標識化され選択された細胞は、次いで、高勾配磁性細胞分離（ＨＧＭ
Ｓ）カラムに適用される。ＨＧＭＳカラムは、米国特許第５，４１１，８６３号
に記載され、そしてＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離カラムとして、Ｍ
ｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ（ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔ
Ｓｔｒ．６８、Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）から市販される。しかし、当該分野において周知の任意の高勾配磁性
細胞分離が、本発明に従って使用され得る。

【００３９】磁性細胞分離カラムは、非標識化細胞（およびほかの不要な物質）を流通させ
つつ、選択された細胞をカラムに保持する。典型的に、カラムは、強磁性マトリ
ックスを含み、そして強い外部磁場内に置かれ、そして標識化され、選択された
細胞は、磁気的にカラム内のマトリックスに固定される。好ましくは、カラムは
、細胞が固定されている間に洗浄され、保持される細胞集団の同質性を増す。

【００４０】カラムに選択的に保持されるが、この選択された細胞は、比較的同質である。
このことは、これらの細胞の選択的改変のための最適な設定を提供する。なぜな
ら、改変の効率を最大にしつつも、改変因子濃度が最小にされ得るからである。
さらに、連続改変または複数の改変が、本発明に従って達成され得る。例えば、
固定された細胞が改変され、リンスされ、次いで、染色され、カラムから溶出さ
れ得る。あるいは、固定された細胞は、改変され、リンスされ、そして除去され
、カラムの外で操作され、次いでカラムに再適用され、固定され、そして染色さ
れ、次いで、もう一度取り除かれ得る。改変は、固定および／または透過化処理
（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を含み、これに続いて、細胞内染色のよ
うな、さらなる改変が行われ得る。他の改変としては、上記および以下の実施例
に記載されるような表面染色が挙げられる。このプロセスを記載するフローチャ
ートは、図２に提供される。

【００４１】改変の範囲は、分析プロトコルまたは染色プロトコルに限定されず；むしろ、
当該分野において公知の任意の細胞改変が、本発明に従って適合され得る。従っ
て、例えば、カラム内に保持される細胞に対する、任意の改変因子（生物学的修
飾因子、薬理学的因子、化学的因子、または酵素）の適用による改変は、本発明
の範囲内である。以下の実施例は、本発明の範囲を説明するために提供されるが
、本発明の範囲を限定しない。

【００４２】（実施例）（実施例１：ＣＤ−１３８陽性末梢血単核細胞の固定および細胞内および表面
の組み合わせ染色）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＣＤ１３８を発現するＵ２６６ミエローマ細
胞株の細胞と、２００：１の比で混合した（すなわち、結果として、ＰＢＭＣ中
に０．５％のＵ２６６細胞、となる）。５×１０⁷の細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ／
ＥＤＴＡ（緩衝液）１０００μｌ中で、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙ
ｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ、ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８
、Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に
結合したマウス抗ＣＤ−１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４を用いて、８℃で１５分間標識
化した。フィコエリトリンと結合体化したマウス抗ＣＤ−１３８ｍＡｂＢ−Ｂ
４（ＣＤ１３８．ＰＥ）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ（Ｆｒｉ
ｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８、Ｄ−５１４２９Ｂｅｒｇｉｓｃｈ
Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ））を、さらに１５分間８℃で加えた。こ
の細胞を洗浄し、そして緩衝液５００μｌ中に再懸濁した。

【００４３】ＣＤ１３８陽性細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）磁性細胞分離システム（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ、ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔ
ｒ．６８、Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）で富化した。磁気的に標識化された細胞懸濁物を、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離
ユニット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ
ＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８、Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａ
ｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内の分離カラムの上部でピペッティングした。この細胞
懸濁物を、通過させ、そしてカラムを緩衝液５００μｌで３回洗浄した。この流
出液を、陰性画分として集めた。カラムを分離器から取り外し、そして適切な管
上に配置した。２％のホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）を含むＰＢＳ／ＥＤＴＡ
０．５ｍｌを、カラムの上部でピペッティングし、そして磁気的に標識化された
細胞を、プランジャーを用いて流し出した。溶出された細胞を、室温（ＲＴ）で
２０分間インキュベートし、そしてＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニット内の第２分離
カラムの上部に直接適用した。細胞懸濁物を通過させ、そしてカラムを０．５％
のサポニンを含む緩衝液（Ｓｅｒｖａ（Ｃａｒｌ−Ｂｅｎｚ−Ｓｔｒ．７、６９
１１５Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からのサポニン緩衝液）５０
０μｌで２回洗浄した。流出液を陰性画分として集めた。次いで、１０μｇ／ｍ
ｌのヤギ抗ヒトλＦＩＴＣ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＳＢＡ）１６０ＡＯｘｍｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ
、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ３５２０９、ＵＳＡ）および２μｇ
／ｍｌのフィコエリトリンと結合体化したマウス抗ＣＤ−１３８ｍＡｂＢ−Ｂ
２（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ、ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅ
ｒｔＳｔｒ．６８、Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、
Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むサポニン緩衝液１００μｌをカラムに適用し、そして室
温で１０分間インキュベートした。このカラムを、サポニン緩衝液５００μｌで
１回洗浄した。カラムを分離器から取り外し、そして適切な容器内に置き、溶出
液を受けた。０．５ｍｌの緩衝液を、カラムの上部でピペッティングし、そして
磁気的に標識化された細胞を、プランジャーを使用して流し出した。

【００４４】並行して、ＣＤ１３８陽性細胞を、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離を２回繰り返すこと
によって富化し、分離効率を比較した。

【００４５】もとの細胞（すなわち、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離前の細胞）
、（第１および第２のＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の）陰性細胞画
分、ならびにＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の陽性細胞画分を、フロ
ーサイトメトリーによって分析した。ＦＡＣＳｃａｎおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ
リサーチソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を、フローサイトメトリー分析のために使用した。死細胞お
よび細胞片を、それらの散乱性質、および、生細胞に対するヨウ化プロピジウム
（ＰＩ；０．３μｇ／ｍｌ）による染色に従って除外した。

【００４６】その結果を、図４Ａ〜図４Ｃに示す。図４Ａは、ＣＤ１３８．ＰＥ染色対
ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離前の細胞のＰＩ染色を示す。コントロ
ール分離の間に、ＣＤ１３８陽性細胞は、（生細胞の９８％の純度に対応して、
）すべての（ゲートされない）細胞の間で５２％の純度にまで富化され、ＣＤ１
３８陽性細胞は、固定および細胞内染色を含む分離の際に、すべての（ゲートさ
れない）細胞の間で６４％の純度にまで富化された。図４Ｂは、ＣＤ１３８．Ｐ
Ｅ染色対ＣＤ１３８陽性細胞に対してゲートすることを伴う第２のＭＡＣＳ
（登録商標）高勾配磁性細胞分離後の、固定された陽性細胞画分のＦＬ３自己蛍
光を示す。フローサイトメトメーターのＦＬ３チャネルは、６５０ｎｍ以上の蛍
光を集光する。図４Ｃは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の細胞内染色対ゲート
された細胞上のＣＤ１３８．ＰＥ染色を示す。ほとんど全てのＣＤ１３８陽性細
胞が、Ｕ２６６細胞に対して報告されたように、細胞内λ軽鎖を発現する。陽性
画分におけるＣＤ１３８＋細胞の回収も、両方の分離において、大変類似してい
た（それぞれ、８１％および９１％）。従って、分離効率は、両方の場合に対し
て同じであった。

【００４７】（実施例２：白血球搬出サンプルの分画および細胞内染色）複数の骨髄腫患者の白血球搬出サンプルを、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡ（緩衝
液）中でマウス抗ＣＤ１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４と結合体化したＭｉｃｒｏＢｅ
ａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥ
ｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃ
ｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と８℃で１５分間標識化した。フィコエリトリンと結合体
化したマウス抗ＣＤ１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４（ＣＤ１３８．ＰＥ）（Ｍｉｌｔ
ｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ
．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を８℃でさらに５分間にわたり加えた。細胞を洗浄し、そして２ｍｌ緩衝液
に再懸濁した。ＣＤ１３８は正常形質細胞および悪性形質細胞において発現する
。

【００４８】ＣＤ１３８陽性細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離を用いて富
化した。磁性標識化された細胞懸濁物を、ＭｉｄｉＭＡＣＳ分離ユニット（Ｍｉ
ｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳ
ｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）中のＶＳ＋分離カラムの上部においてピペッティングし、細胞懸濁物を
通過させ、そしてそのカラムを３×３ｍｌの緩衝液で洗浄した。排出液を陰性画
分として収集した。カラムを分離器から取り外し、そして適切なチューブ上に配
置した。５ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡをカラムの上部においてピペッティングし、
磁性標識化された細胞をプランジャを用いて排出させた。細胞の一部を２回目の
ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離に直接適用した。その細胞の他方の部分（５×１０⁵細胞
／ｍｌ）に、同じ容量の、４％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）を含む緩衝液を
加え、そして２０分間室温でインキュベートした。次いで、この細胞を２つのサ
ンプルにわけ、そして２つのＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニット中の２つの分離カラ
ムの上部に直接適用した。その細胞懸濁物をそのカラムに通し、そしてそのカラ
ムを２×５００μｌの、０．５％サポニンを含む緩衝液（サポニン緩衝液、Ｓｅ
ｒｖａ，Ｃａｒｌ−Ｂｅｎｚ−Ｓｔｒ．７，６９１１５Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した。この排出液を陰性画分として収集した。次いで
、１００μｌの、２μｇ／ｍｌのＣＤ１３８．ＰＥおよび１０μｇ／ｍｌヤギ抗
ヒトλ．ＦＩＴＣ（ＳＢＡ，１６０ＡＯｘｍｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂ
ｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ３５２０９，ＵＳＡ）を含むサポニン緩
衝液を一方のカラムに適用し、そして１００μｌの、２μｇ／ｍｌＣＤ１３８
．ＰＥおよび１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトκ．ＦＩＴＣ（ＳＢＡ，１６０ＡＯｘ
ｍｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ３５
２０９，ＵＳＡ）を含むサポニン緩衝液を他方のカラムに適用した。両方のカラ
ムを室温で１０分間インキュベートした。それらのカラムを、１×５００μｌの
サポニン緩衝液およびそして１×５００μｌ緩衝液で洗浄した。それらのカラム
を分離器から取り外し、そして適切なチューブに配置した。０．５ｍｌの緩衝液
を各々のカラムの上部でピペッティングし、そして磁性標識化された細胞をプラ
ンジャを用いて排出させた。

【００４９】もとの細胞（すなわち、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の前）、（
第一および第二のＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の）陰性細胞画分、
およびＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の陽性細胞画分をフローサイト
メトリーで分析した。ＦＡＣＳｃａｎおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ研究ソフトウェ
ア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）
をフローサイトメトリー分析のために用いた。死んだ細胞および細胞砕片を散乱
特性および生きている細胞についてのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；０．３μｇ／
ｍｌ）での染色に従って、排除した。

【００５０】その結果を図５Ａ〜図５Ｄおよび図６Ａ〜図６Ｄにおいて示す。図５Ａおよび
図５Ｂは、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の前および後の生きている
細胞のＣＤ１３８．ＰＥ染色を示す。図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＤ１３８陽性細
胞におけるゲーティングを伴う第二のＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離
の後の、固定された細胞の陽性画分のＣＤ１３８．ＰＥ染色対ＦＬ３自己蛍光を
示す。ドットプロットである６Ｃおよび６Ｄは、ゲーティングされた細胞におけ
る、ヒト免疫グロブリンλ（６Ｃ）またはκ軽鎖（６Ｄ）対ＣＤ１３８．ＰＥ染
色の細胞内染色を示す。約９６％のＣＤ１３８陽性細胞は、細胞内κ軽鎖を発現
し、他方、対応して４％のＣＤ１３８陽性細胞は、細胞内λ軽鎖を発現する。こ
のことは、モノクローナル腫瘍細胞集団の存在を示す。

【００５１】（実施例３：異種懸濁物からのＵ２６６細胞の選択的細胞内染色）癌細胞株ＳＬＢＲ３の細胞を、骨髄腫細胞株Ｕ２６６の細胞と、１：１の比率
で混合した。２×１０⁶の細胞を、１００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤＴＡ（緩
衝液）中のマウス抗ＣＤ１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４と結合体化されたＭｉｃｒｏ
Ｂｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ
ＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂ
ａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびマウス抗ヒト上皮抗原（ＨＥＡ）Ｍｉｃｒｏ
Ｂｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ
ＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂ
ａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、８℃で１５分間標識化した。これらの細胞を洗浄
し、そして１ｍｌ緩衝液中に再懸濁した。次いで、４％ホルムアルデヒド（Ｍｅ
ｒｃｋ）を含有する緩衝液を１ｍｌ加え、そして室温で２０分間インキュベート
した。

【００５２】磁性標識化しそして固定した細胞懸濁物を、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニット中
で分離カラムの上部において直接ピペッティングした。この細胞懸濁物をそのカ
ラムに通し、そしてそのカラムを２×５００μｌの０．５％サポニンを含む緩衝
液（サポニン緩衝液、Ｓｅｒｖａ、Ｃａｒｌ−Ｂｅｎｚ−Ｓｔｒ．７，６９１１
５Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した。排出液を陰性画分と
して収集した。次いで、１０μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトλ．ＦＩＴＣ（ＳＢＡ，１６
０ＡＯｘｍｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａ
ｍａ３５２０９，ＵＳＡ）を含むサポニン緩衝液を１００μｌそのカラムに適
用し、そして室温で１０分間インキュベートした。このカラムを分離器から取り
外し、そして溶離液を収集するために適切な容器に配置した。０．５ｍｌの緩衝
液を、そのカラムの上部でピペッティングし、そして磁性標識化された細胞を、
プランジャを用いて排出させた。

【００５３】並行して、２×１０⁶の細胞を２％ホルムアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）を含む緩
衝液中で室温で２０分間固定した。この細胞を、サポニン緩衝液で洗浄し、１５
μｌの、１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトλ．ＦＩＴＣ（ＳＢＡ，１６０ＡＯｘｍ
ｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ３５２
０９，ＵＳＡ）を含むサポニン緩衝液中に再懸濁し、そして室温で１０分間イン
キュベートした。この細胞をサポニン緩衝液で洗浄し、そして緩衝液中に再懸濁
した。

【００５４】ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離からのコントロールサンプルおよび
陽性細胞画分をフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳｃａｎおよびＣ
ＥＬＬＱｕｅｓｔ研究ソフトウェア（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏ
ｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）をフローサイトメトリー分析のために使用した
。

【００５５】結果を図７Ａ〜図７Ｂ、および以下の表２に示す。図７Ａおよび図７Ｂは、カ
ラム上で（７Ａ）またはカラムの外側（７Ｂ）で染色された細胞のヤギ抗ヒトλ
．ＦＩＴＣ染色を示す。両方のサンプルにおいて、約５０％の細胞は、Ｕ２６６
細胞について報告されるように非常に類似する染色強度を伴って、細胞内κ軽鎖
を発現する（表２）。従って、そのカラムにおける細胞の染色は、懸濁物におけ
る染色と、少なくとも同程度の効率である。

【００５６】

【表２】（実施例４：ストレプトアビジン／ビオチン結合を含む、ＣＤ１３８細胞にお
ける異なるＩｇクラスの表面染色）４×１０⁸の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、２ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ／ＥＤ
ＴＡ（緩衝液）中のマウス抗ＣＤ１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４と結合体化したＭｉ
ｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｄｒ
ｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧ
ｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、８℃で３０分間標識化した。この細胞を
洗浄し、そして２ｍｌの緩衝液中に再懸濁した。

【００５７】ＣＤ１３８陽性細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）磁性細胞分離システム（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔ
ｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を用いて富化した。磁性標識化された細胞懸濁物を、ＭｉｎｉＭＡＣＳ分
離ユニット中の分離カラムの上部においてピペッティングし、細胞懸濁物を通過
させ、そしてそのカラムを３×５００μｌの緩衝液で洗浄した。排出液を陰性画
分として収集した。そのカラムを、その分離器から取り外し、そして溶離液を収
集するために適切な容器上に配置した。１．５ｍｌの緩衝液をそのカラムの上部
においてピペッティングし、そして磁性標識化された細胞をプランジャを用いて
排出させた。溶出した細胞を分け、そしてＭｉｎｉＭＡＣＳ分離ユニットにおけ
る３つの異なる分離カラム（ａ、ｂおよびｃ）の上部に直接適用した。その細胞
懸濁物をそのカラムに通し、そして各々のカラムを２×５００μｌ緩衝液で洗浄
した。その排出液を陰性画分として収集した。次いで、フィコエリトリンと結合
体化したマウス抗ＣＤ１３８ｍＡｂＢ−Ｂ４（ＣＤ１３８．ＰＥ）（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔＳｔ
ｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）、マウス抗ＣＤ１９．Ｃｙ５および（ａ）５μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩ
ｇＡ．ビオチン、（ｂ）５μｇ／ｍｌマウス抗ヒトＩｇＭ．ＦＩＴＣまたは（ｃ
）２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＧ．ＦＩＴＣを含む１００μｌの緩衝液（す
べてＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，
ＳＢＡ１６０ＡＯｘｍｏｏｒＢｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ
，Ａｌａｂａｍａ３５２０９，ＵＳＡから入手した）を、異なるカラムにそれ
ぞれ適用し、そして室温で１０分間インキュベートした。各々のカラムを５００
μｌ緩衝液で洗浄した。（ａ）について、さらに１００μｌの、２μｇ／ｍｌス
トレプトアビジン．ＦＩＴＣを含む緩衝液を適用し、続いて室温で１０分間イン
キュベートし、そして５００μｌの緩衝液での洗浄工程を行った。これらのカラ
ムを分離器から取り外し、そして溶離液を収集するために適切な容器上に配置し
た。０．５ｍｌの緩衝液を、各々のカラムの上部においてピペッティングし、そ
して磁性標識化された細胞をプランジャを用いて各々から排出させた。

【００５８】もとの細胞（すなわち、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離）およびＭ
ＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の陽性細胞画分をフローサイトメトリー
で分析した。ＦＡＣＳｃａｎおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ研究ソフトウェア（Ｂｅ
ｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を、サイ
トメトリー分析のために使用した。死んだ細胞および細胞砕片を、散乱特性、お
よびヨウ化プロピジウム（ＰＩ；０．３μｇ／ｍｌ）での染色に従って、排除し
た。

【００５９】正常ＰＢＭＣ由来のＣＤ１３８＋細胞の過半数（約５０％）は、表面ＩｇＡを
発現するが、他方、約３２％は、表面ＩｇＭを発現し、そして約３％は、表面Ｉ
ｇＧを発現する。

【００６０】（実施例５：全血からのＣＤ４５直接単離の際の、ＣＤ１９リンパ球対ＣＤ４
リンパ球の表面染色）１ｍｌのヘパリン処理したヒト血液を、２０μｌのヒトＣＤ４５ＭｉｃｒｏＢ
ｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ
ＥｂｅｒｔＳｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａ
ｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、室温で３０分間標識化した。次いで、１ｍｌのＰＢ
Ｓ／ＥＤＴＡを加えた。

【００６１】次いで、ＣＤ４５陽性細胞を、ＭＡＣＳ（登録商標）磁性細胞分離システム（
ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＥｂｅｒｔ
Ｓｔｒ．６８，Ｄ−５１４２９ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）を用いて富化した。磁性標識化された細胞懸濁物を、ＭｉｎｉＭＡ
ＣＳ分離ユニットにおける分離カラムの上部においてピペッティングした。この
細胞懸濁物をそのカラムに通し、そしてそのカラムを２×５００μｌの緩衝液で
洗浄した。この排出液を、陰性画分として収集した。次いで、フィコエリトリン
と結合体化したＣＤ１９ｍＡｂ（ＣＤ１９．ＰＥ）およびＦＩＴＣと結合体化
したＣＤ４ｍＡｂ（ＣＤ４．ＦＩＴＣ）を含む１００μｌの緩衝液をそのカラ
ムに適用し、そして室温で１０分間インキュベートした。このカラムを５００μ
ｌの緩衝液で洗浄した。そのカラムを分離器から取り外し、そして溶離液を収集
するために適切な容器に配置した。０．５ｍｌの緩衝液を、各々のカラムの上部
においてピペッティングし、そして磁性標識化された細胞を、プランジャを用い
て排出させた。

【００６２】ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離の陽性画分を、フローサイトメトリ
ーで分析した。、ＦＡＣＳｃａｎおよびＣＥＬＬＱｕｅｓｔ研究ソフトウェア（
ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）をフ
ローサイトメトリー分析のために使用した。死んだ細胞、核のない細胞および細
胞砕片を、散乱特性（Ｒ１ゲーティング）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、０
．３μｇ／ｍｌ）およびＬＤＳ７５１（１μｇ／ｍｌ）（Ｒ２ゲーティング）に
従って排除した。

【００６３】図９Ｃに示されるように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＋＋Ｔ細胞およびＣＤ４
ｄｉｍ単球は、陽性画分において明らかに識別され得る。有意な数の二重陽性細
胞は存在しない。これは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球のように異なるサブタイプ
のＣＤ４５＋リンパ球がＣＤ４５ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離お
よびそのカラムにおける染色の際に安定な凝集物を形成する場合に予想されたこ
とである。

【００６４】図１０は、マトリクスに付着した磁性標識化されたＣＤ８＋細胞を伴うＭＳ＋
カラムの鉄球マトリクスのラスター電子顕微鏡写真である。図１０は、細胞がマ
トリクス表面全体にわたって均質には配分されていないが、異なる領域には濃縮
していることを示す。細胞は、単層としては固定されていない。その代わり、し
ばしば多くの細胞は、非常に緊密に近寄っている。

【００６５】上記発明を、明確さおよび理解の目的のために例示および例を挙げるために詳
細に記載したが、当業者には、特定の変化および改変が実施され得ることは明白
である。したがって、説明および実施例は、本発明の範囲を限定するものと理解
されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって記載され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉらの先行技術教示下で固定化された細胞を示す。

【図２】図２は、本発明に従う代表的な改変プロセスのフローチャートである。

【図３】図３Ａ〜３Ｂは、一連の代表図である。図３Ａは、カラムにおいて標識化され
ていない細胞の溶出および標識化された細胞の保持を可能にする磁性細胞分離カ
ラム手段（北磁場および南磁場を示す）に適用された標識化された細胞と標識化
されていない細胞の混合物を示す。図３Ｂは、磁場の除去および分離懸濁物への
標識化された細胞の溶出を示す。

【図４】図４Ａ〜４Ｃは、末梢単核血球にスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）単離された
骨髄腫細胞（Ｕ２６６）におけるλ軽鎖の細胞内染色を示す実施例１の結果に関
する一連のＦＡＣＳドットプロットである。図４Ａは、ＣＤ１３８．ＰＥ対ＭＡ
ＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離による分離前のＵ２６６骨髄腫細胞でスパ
イクされたＰＭＢＣのＰＩ染色を示し；図４Ｂは、ＣＤ１３８．ＰＥ染色対ＣＤ
１３８陽性細胞上のゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）を用いたＭＡＣＳ（登録商標
）高勾配磁性細胞分離による第２の分離後の固定された陽性細胞画分のＦＬ３（
フローサイトメーターのＦＬ３チャンネルは６５０ｎｍ以上の蛍光を収集する）
を示し；そして４Ｃは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の細胞内染色対ゲートされた
細胞上のＣＤ１３８．ＰＥ染色を示す。

【図５】図５Ａ〜５Ｄは、骨髄腫患者の白血球搬出からのＣＤ１３８＋形質細胞の単離
を示す実施例２の結果に関する一連のＦＡＣＳドットプロットである。図５Ａは
、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離による分離前の生白血球のＣＤ１３
８．ＰＥ染色対ＦＬ１−Ｈ（フローサイトメーターのＦＬ１−Ｈチャンネルは、
５２５ｎｍ〜５４５ｎｍ間の蛍光を収集する）を示し；図５Ｂは、ＭＡＣＳ（登
録商標）高勾配磁性細胞分離による分離後の生白血球のＣＤ１３８．ＰＥ染色対
ＦＬ１−Ｈを示し；図５Ｃは、前方散乱（ＦｏｒｗａｒｄＳｃａｔｔｅｒ）（
ＦＳＣ）対分離前の白血球の側方散乱（ＳｉｄｅｗａｒｄＳｃａｔｔｅｒ）（
ＳＳＣ）シグナルを示し；そして図５Ｄは、陽性細胞画分のＦＳＣ／ＳＳＣシグ
ナルを示す。

【図６】図６Ａ〜６Ｄは、骨髄腫患者から単離された形質細胞におけるκ／λ軽鎖の細
胞内染色を示す実施例２の結果に関する一連のＦＡＣＳドットプロットである。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＤ１３８．ＰＥ染色対ＣＤ１３８陽性細胞上のゲーテ
ィング（Ｒ１に従う）を用いるＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離による
第２の分離後の固定された細胞の陽性画分のＦＬ３自己蛍光を示し；図６Ｃは、
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖の細胞内染色対ゲートされた（ｇａｔｅｄ）細胞上の
ＣＤ１３８．ＰＥ染色を示し；そして図６Ｄは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖の細
胞内染色対ゲートされた細胞上のＣＤ１３８．ＰＥ染色を示す。

【図７】図７Ａ〜７Ｂは、実施例３の結果に関する一連のドットプロットである。図７
Ａは、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離カラム上で染色された細胞のヤ
ギ抗ヒトλ．ＦＩＴＣ染色を示し；そして図７Ｂは、ＭＡＣＳ（登録商標）高勾
配磁性細胞分離カラム外で染色された細胞のヤギ抗ヒトλ．ＦＩＴＣ染色を示す
。

【図８】図８Ａ〜８Ｅは、ＣＤ１３８ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離にお
ける表面Ｉｇの染色を示す実施例４の結果に関する一連のＦＡＣＳドットプロッ
トである。図８Ａは、ＣＤ１９．Ｃｙ５^TMの染色対ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配
磁性細胞分離前のＣＤ１３８．ＰＥを示し；図８Ｂは、ＣＤ１９．Ｃｙ５^TMの染
色対ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞分離後の陽性細胞画分のＣＤ１３８．
ＰＥを示し；図８Ｃは、表面ＩｇＡ．ＦＩＴＣ染色対ＣＤ１３８陽性細胞上にゲ
ートされた陽性細胞画分のＣＤ１３８．ＰＥを示し；図８Ｄは、表面ＩｇＭ．Ｆ
ＩＴＣ染色対ＣＤ１３８陽性細胞上にゲートされた陽性細胞画分のＣＤ１３８．
ＰＥを示し；そして図８Ｅは、表面ＩｇＧ．ＦＩＴＣ染色対ＣＤ１３８陽性細胞
上にゲートされた陽性細胞画分のＣＤ１３８．ＰＥを示す。

【図９】図９Ａ〜９Ｃは、全血からのＣＤ４５ＭＡＣＳ（登録商標）高勾配磁性細胞
分離におけるリンパ球の免疫表現型を示す実施例５の結果に関する一連のＦＡＣ
Ｓドットプロットである。図９Ａは、リンパ球上のゲーティングを用いる陽性細
胞画分のＦＳＣ／ＳＳＣシグナルを示し；図９Ｂは、ＣＤ１９．ＰＥの染色対有
核細胞上のＬＤＳゲートを用いる陽性細胞画分のＬＤＳを示し；そして、図９Ｃ
は、ＣＤ４．ＦＩＴＣの染色対Ｒ１およびＲ２によってゲートされた陽性細胞の
ＣＤ１９．ＰＥを示す。図１０は、鉄球マトリックスに付着された磁気的に標識化されたＣＤ８＋細胞
を有するＭＳ＋カラムの鉄球マトリックスのラスター電子顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ミルテニー，シュテファンドイツ国 51429 ベルギッシュグラドバッハ，フリードリッヒ−エベルト−シュトラーセ 68 (72)発明者アッセンマッヒャー，マリオドイツ国 51429 ベルギッシュグラドバッハ，フェルディナンド−シュトゥッカー−シュトラーセアー２ (72)発明者シュミット，ユルゲンドイツ国 50126 ベルクハイム，ヨゼフ−テュナー−シュトラーセ 34 Ｆターム(参考） 4B065 AA87 BC41 BD04 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】選択された細胞を改変する方法であって、該方法は、高勾配
磁性分離カラムに保持される磁気的に標識化され、選択された細胞を改変し、そ
れによって改変された選択された細胞を生成する工程を包含する、方法。
【請求項２】選択された細胞を改変する方法であって、該方法は、以下の
工程（ａ）細胞集団を高勾配磁性分離カラムに適用する工程であって、ここで該細胞
集団が、磁気的に標識化され、選択された細胞を含む、そしてここで該磁気的に
標識化され、選択された細胞が、該カラムによって保持される、工程；そして（
ｂ）該カラムによって保持された該選択された細胞を改変し、それによって改変
された選択された細胞を生成する工程を包含する、方法。
【請求項３】前記カラムから前記改変され、選択された細胞を除去する工
程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記カラムから前記改変され、選択された細胞を除去する工
程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記高勾配磁性細胞分離カラムが、該カラムの全容量に対し
て高い容量のマトリックスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記マトリックスの容量が、前記カラムの全容量の５０％よ
り大きい、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記マトリックスの容量が、前記カラムの全容量の６０％よ
り大きい、請求項５に記載の方法。
【請求項８】前記マトリックスが強磁性球を含む、請求項５に記載の方法
。
【請求項９】前記除去する工程が前記磁場を除去することによる、請求項
３に記載の方法。
【請求項１０】前記改変する工程が、前記選択された細胞の細胞内染色を
含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記改変する工程が、前記選択された細胞を透過させる工
程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記改変する工程が、前記選択された細胞の第２の標識化
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】前記改変する工程が、生物学的反応性化合物を前記選択さ
れた細胞に結合する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、ここで前記生物学的反
応性化合物として、抗体、リガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、ポリヌクレ
オチド、オリゴヌクレオチド、レクチン、脂質または酵素が挙げられる、方法。
【請求項１５】前記改変する工程が、発現ベクターを用いて前記選択され
た細胞をトランスフェクトする工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記改変する工程が、酵素を前記選択された細胞に適用す
る工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】前記改変する工程が、薬理学的因子を前記選択された細胞
に適用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記改変する工程が、生物学的改変因子を前記選択された
細胞に適用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】前記改変する工程が、化学的因子を前記選択された細胞に
適用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】前記改変する工程が、第１の改変因子および第２の改変因
子を前記選択された細胞に適用する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】請求項３に記載の方法であって、該方法が、前記取り除か
れた選択された細胞が、第２の高勾配磁性細胞分離カラムに保持されるように、
該選択された細胞を該第２のカラムに適用する工程；および該第２のカラムによ
って保持された該選択された細胞を改変する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２２】さらに前記第２のカラムから前記選択された細胞を除去す
る工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記強磁性球が、生体適合性ポリマーによってコートされ
ている、請求項８に記載の方法。