ES2260063T3 - Proceso de modificacion de celulas seleccionadas en una columna de separacion magnetica de celulas. - Google Patents

Proceso de modificacion de celulas seleccionadas en una columna de separacion magnetica de celulas.

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ES2260063T3
ES2260063T3 ES00974736T ES00974736T ES2260063T3 ES 2260063 T3 ES2260063 T3 ES 2260063T3 ES 00974736 T ES00974736 T ES 00974736T ES 00974736 T ES00974736 T ES 00974736T ES 2260063 T3 ES2260063 T3 ES 2260063T3
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Abstract

Un método para modificar células seleccio nadas, comprendiendo el método las etapas de: (a) la aplicación de una población de células a una columna de separación magnética de alto gradiente, donde dicha columna contiene una matriz que es más del 50% del volumen total de la columna, donde dicha pobla ción de células comprende células seleccionadas marcadas magnéticamente; (b) la retención de dichas células selecciona das marcadas magnéticamente en dicha columna a la vez que se permite el paso de las células no marcadas a través de la columna; (c) el lavado de dichas células seleccionadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna y (d) la modificación de dichas células seleccio nadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna; en el que la etapa (c) es opcional.

Description

Proceso de modificación de células seleccionadas en una columna de separación magnética de células.
Campo técnico
La presente invención se refiere a la utilización de técnicas de separación celular magnética de alto gradiente (HGMS) en el proceso de modificación de células seleccionadas.
Antecedentes
La técnica anterior se dirige a varios métodos y técnicas para modificar células fuera del organismo. La tinción superficial de las células mediante la fijación de anticuerpos unidos a restos fluorescentes es una modificación frecuente. La tinción intracelular después de la fijación es también común. Las cadenas ligeras kappa y lambda pueden ser la diana de tales colorantes y utilizarse con el fin de analizar poblaciones de células tumorales monoclonales. Aunque los colorantes de este tipo son frecuentemente específicos, las células pueden ser modificadas en una miriada de formas no específicas, tal como mediante exposición a un agente farmacológico o químico, el tratamiento con una hormona o con otro compuesto que se sepa que media la actividad celular, o la transfección con genes para dar lugar a un producto recombinante. Las técnicas de modificación celular tienen por tanto un potencial orientado a la investigación y un potencial orientado al tratamiento.
En la técnica anterior, modificaciones tales como la tinción se realizan con células en suspensión o con monocapas de células inmovilizadas en diferentes superficies (tal como un portaobjetos del microscopio), para permitir que el agente modificador acceda a todas las células por igual. La tinción o la modificación de las células de otro modo de esta manera son conocidas en la técnica. Avances recientes en la modificación de monocapas están ejemplificados por Lebkowski y col., Isolation, Activation, Expansion and Gene Transduction of Cell Based Therapeutics Using Polystyrene Immunoaffinity Devices, en Cell Separation Methods and Applications, Recktenwald, y col., eds. (1998) y en la Patente de EE.UU. Nº 5.912.177. Sin embargo, estos métodos pueden requerir mucho tiempo y a menudo implican múltiples etapas de lavado, creando un riesgo potencial de pérdida celular. Estos métodos son especialmente problemáticos cuando está implicado un número pequeño de células.
En la técnica anterior, no se recomendaba modificar células en formas agregadas (tal como el aglutinado formado después de centrifugación). Los agentes de entrecruzamiento tales como el formaldehído poseen problemas similares, ya que las células necesitan ser separadas entre sí para impedir la agregación irreversible.
Muy frecuentemente, el técnico deseará modificar un tipo celular dentro de una mezcla o suspensión heterogénea, tal como linfa o sangre, debido a que después de la modificación ese tipo celular específico va a ser estudiado o retornado al paciente como parte de un tratamiento o régimen de ensayo. En tales circunstancias, la modificación de células distintas de la clase de célula diana puede tener efectos adversos. Varios métodos de separación celular han evolucionado para satisfacer estas necesidades.
Una revisión de las técnicas de separación celular presentes en la técnica está proporcionada por Cell Separation Methods and Applications, Recktenwald y col., eds. (1998). Una técnica de separación celular utilizada implica la separación de células magnéticas, mediante la cual las células diana pueden ser marcadas con un marcador magnético y posteriormente retenidas selectivamente en una cámara o columna expuesta a un campo magnético. Kantor y col. (1998, Magnetic Cell Sorting with Colloidal Superparamagnetic Particles, en Cell Separation Methods & Applications); Gee (1998, Immunomagnetic Cell Separation Using Antibodies and Superparamagnetic Microspheres en Cell Separation Methods & Applications); y Miltenyi, S., Patente de EE.UU. Nº 5.411.863, describen técnicas de separación celular magnética. Para una separación magnética de alto gradiente, típicamente una suspensión heterogénea que contiene células seleccionadas unidas a marcadores magnéticos es pasada a través de una columna, permitiendo que las células seleccionadas se adhieran magnéticamente a la columna o a una matriz paramagnética dentro de la columna. El resto de la suspensión es eluido, dejando las células magnetizadas seleccionadas unidas a la columna. Cuando se retira el campo magnético, las células seleccionadas pueden ser eluidas.
Los procesos de separación celular no magnéticos pueden ser utilizados para facilitar la modificación celular. Estos métodos incluyen técnicas de separación celular por inmunoafinidad, que son a menudo menos preferibles que los métodos de separación de células magnéticas, debido a que los primeros tienen a menudo como resultado una pérdida celular incrementada así como una utilización de reactivos incrementada y una concentración de sal incrementada, lo cual puede requerir la diálisis del eluato. Lebkowski y col. (1998, Isolation, Activation, Expansion and Gene Transduction of Cell-Based Therapeutics Using Polystyrene Immunoaffinity Devices, en Cell Separation Methods and Applications) describen un método mediante el cual clases seleccionadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) pueden ser seleccionadas positivamente mediante procesos de inmunoafinidad, en los cuales las células seleccionadas son inmovilizadas por anticuerpos monoclonales o lectinas unidos covalentemente a estructuras de poliestireno y posteriormente cultivadas, activadas o modificadas genéticamente mientras están inmovilizadas. Un método similar para modificar células madre está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.912.177. Una desventaja fundamental de estos métodos es, sin embargo, que unen las células seleccionadas a una superficie plana o de otro modo bidimensional, requiriendo un área sustancial de la superficie en relación con el número de células a seleccionar. Las células deben formar una monocapa, según se ilustra en la Figura 1. Además, los anticuerpos utilizados para la selección están fijados al propio dispositivo y tales técnicas requieren un dispositivo o una estructura específicos para cada diana deseada. Además, la liberación y la resuspensión de las células seleccionadas de esas estructuras pueden ser procesos que requieren mucho tiempo.
Se han utilizado técnicas de separación celular magnética para inmovilizar células según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.622.831 y en la Patente de EE.UU. Nº 5,876.593. La Patente de EE.UU. Nº 5.622.831, requiere un mecanismo de conmutación complicado para liberar y resuspender las células inmovilizadas y la Patente de EE.UU. Nº 5.876.593 no emplea una columna, sino que en su lugar requiere la inmovilización de las células como una monocapa sustancialmente unidimensional.
WO-A-94/11078 describe un dispositivo que tiene una estructura de recogida tal como un hilo ferromagnético, que actúa como un intensificador del flujo magnético e inmovilizaba las células marcadas magnéticamente en lo que es esencialmente una monocapa unidimensional. No describe una columna HGMS.
US-A-5.691.208 describe un aparato de separación magnética mejorado, que tiene una captura de aire reducida y una unión no específica reducida en comparación con otros dispositivos.
EP-A-0 670 185 no describe la modificación de células mientras están retenidas en una columna HGMS según se reivindica en la presente. Describe métodos para marcar magnéticamente células que van a ser extraídas de una población celular utilizando el dispositivo magnético, esto es, uniendo una partícula magnética a una molécula de la superficie celular.
WO-A-97/17611 describe un método en el cual partículas magnéticamente atraíbles que tienen afinidad por una especie deseada (por ejemplo, un microorganismo) son atraídas hacia un soporte sólido mediante fuerzas magnéticas. En una etapa posterior, una muestra que contiene la especie es aplicada a las partículas inmovilizadas sobre el soporte sólido. Las partículas magnéticamente atraíbles son mantenidas sobre el soporte sólido durante el tiempo en el que están en contacto con una muestra que contiene la especie que va a ser capturada.
Descripción de la invención
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modificar células seleccionadas, comprendiendo el método las etapas de:
(a) la aplicación de una población de células a una columna de separación magnética de alto gradiente, en el que dicha columna contiene una matriz que es más del 50% del volumen total de la columna, donde dicha población de células comprende células seleccionadas marcadas magnéticamente;
(b) la retención de dichas células seleccionadas marcadas magnéticamente en dicha columna mientras se permite que las células no marcadas pasen a través de la misma;
(c) el lavado de dichas células seleccionadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna y
(d) la modificación de dichas células seleccionadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna; en el cual la etapa (c) es opcional.
En un aspecto adicional más, la invención comprende además la etapa adicional de aplicación de las células seleccionadas extraídas a una segunda columna de separación celular magnética de alto gradiente, de tal manera que las células seleccionadas sean retenidas por la segunda columna, y la modificación posterior de las células seleccionadas retenidas por la segunda columna.
De forma ventajosa, el volumen de la matriz es más del 60% del volumen total de la columna.
La matriz puede comprender de forma ventajosa esferas ferromagnéticas.
Las células seleccionadas pueden ser extraídas de la columna, después de su modificación, retirando el campo magnético.
En algunas realizaciones, la modificación comprende la tinción intracelular de las células seleccionadas; la permeabilización de las células seleccionadas; el marcaje de las células seleccionadas marcadas magnéticamente con una segunda marca; la unión de un compuesto biológicamente reactivo a las células seleccionadas; la transfección de las células seleccionadas con un vector de expresión que contenga un gen de interés; la aplicación de un enzima a las células seleccionadas; la aplicación de un agente farmacológico a las células seleccionadas; la aplicación de un agente biológico o químico a las células seleccionadas o la aplicación de múltiples agentes modificadores. En algunas realizaciones, el compuesto biológicamente reactivo incluye anticuerpos, ligandos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, lectinas, lípidos o enzimas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra células inmovilizadas según las descripciones de la técnica anterior de Lebkowski y col.
La Figura 2 es un diagrama de flujo de un proceso típico de modificación de acuerdo con la presente invención.
Las Figuras 3A-3B son una serie de figuras representativas. 3A representa una mezcla de células marcadas y no marcadas aplicadas a un medio de columna de separación celular magnética (representando los campos magnéticos norte y sur) que permite la elución de células no marcadas y la retención en la columna de células marcadas. 3B representa la retirada del campo magnético y la elución de las células marcadas en una suspensión separada.
Las Figuras 4A-4C son una serie de representaciones gráficas de puntos de FACS relativas a los resultados del Ejemplo 1, que muestran la tinción intracelular de la cadena ligera lambda en células de mieloma aisladas (U266) añadidas a células mononucleares de sangre periférica. La Figura 4A muestra la tinción con CD138·PE frente a la tinción con PI de PMBC a las que se añadieron células de mieloma U266 antes de la separación en un dispositivo de separación celular magnética de alto gradiente MACS®; 4B muestra la tinción con CD138·PE frente a FL3 (el canal de FL3 del citómetro de flujo recoge luz fluorescente igual a o mayor de 650 nm) de una fracción de células positivas fijadas después de una segunda separación en un dispositivo de separación celular magnética de alto gradiente MACS® con acotamiento en células CD138 positivas; y 4C muestra la tinción intracelular de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana frente a la tinción con CD138·PE en células acotadas.
Las Figuras 5A-5D son una serie de representaciones gráficas de puntos de FACS relativas a los resultados del Ejemplo 2, que muestran el aislamiento de células plasmáticas CD138+ procedentes de leucoféresis de un paciente con mieloma. La Figura 5A muestra la tinción con CD138·PE de leucocitos vivos antes de la separación en un dispositivo de separación celular magnética de alto gradiente MACS® frente a FL1-H (el canal FL1-H del citómetro de flujo recoge la luz fluorescente entre 525-545 nm); la Figura 5B muestra la tinción con CD138·PE de leucocitos vivos después de la separación en un dispositivo de separación celular magnética de alto gradiente MACS® frente a FL1-H; la Figura 5C muestra las señales de Dispersión Frontal (FSC) frente a las señales de Dispersión Lateral (SSC) de los leucocitos antes de la separación; y la Figura 5D muestra las señales de FSC/SSC de la fracción de células
positivas.
Las Figuras 6A-6D son una serie de representaciones gráficas de puntos de FACS relativas a los resultados del Ejemplo 2, que muestran la tinción intracelular de las cadenas ligeras kappa/lambda en células plasmáticas aisladas de pacientes con mieloma. Las Figuras 6A y 6B muestran la tinción con CD138·PE frente a la autofluorescencia FL3 de la fracción positiva de células fijadas después de una segunda separación en el dispositivo de separación celular magnética de alto gradiente MACS® con acotamiento (de acuerdo con R1) sobre las células CD138 positivas; la Figura 6C muestra la tinción intracelular de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana frente a la tinción con CD138·PE en células acotadas; y la Figura 6D muestra la tinción intracelular de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana frente a la tinción con CD138·PE en células acotadas.
La Figuras 7A-7B son una serie de gráficas de puntos relativas a los resultados del Ejemplo 3. La Figura 7A muestra la tinción con anti-lambda humana de cabra·FITC de células teñidas en una columna de separación celular magnética de alto gradiente MACS®; y la Figura 7B muestra la tinción con anti-lambda humana de cabra·FITC de células teñidas fuera de una columna de separación celular magnética de alto gradiente MACS®.
Las Figuras 8A-8E son una serie de representaciones gráficas de puntos de FACS relativas a los resultados del Ejemplo 4, que muestran la tinción de Ig de superficie después de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS® de CD138. La Figura 8A muestra la tinción con CD19·Cy5™ frente a CD138·PE antes de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS®; la Figura 8B muestra la tinción con CD19·Cy5™ frente a CD138·PE de la fracción de células positivas después de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS®; la Figura 8C muestra la tinción con IgA·FITC en la superficie frente a CD138·PE de la fracción de células positivas acotada en células CD138 positivas; la Figura 8D muestra la tinción con IgM·FITC en la superficie frente a CD138·PE de la fracción de células positivas acotada en células CD138 positivas; y la Figura 8E muestra la tinción con IgG·FITC en la superficie frente a CD138·PE de la fracción de células positivas acotada en células CD138
positivas.
Las Figuras 9A-9C son una serie de representaciones gráficas de puntos de FACS relativas a los resultados del Ejemplo 5, que muestran el inmunofenotipaje de linfocitos después de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS® de CD45 de sangre completa. La Figura 9A muestra las señales FSC/SSC de la fracción de células positivas con acotamiento en linfocitos; la Figura 9B muestra la tinción con CD19·PE frente a LDS de la fracción de células positivas con el acotamiento de LDS sobre las células nucleadas; y la Figura 9C muestra la tinción con CD4·FITC frente a CD19·PE de células positivas acotadas por R1 y R2.
La Figura 10 es una foto de microscopio electrónico con exploración total de imagen ("raster") de una matriz de esferas de hierro de una columna MS+ con células CD8+ marcadas magnéticamente unidas a la matriz.
Modo mejor de llevar a cabo la invención
La presente invención proporciona un proceso para modificar células seleccionadas mediante la modificación de células seleccionadas retenidas en una columna de separación celular magnética de alto gradiente (HGMS). La presente invención tiene que ver con la selección positiva, esto es, la modificación de una población celular específica que ha sido sometida a selección directa. Mediante la realización de los métodos en una población de células, tal como sangre completa, que contenga las células seleccionadas, la población celular seleccionada puede ser enriquecida. La presente invención reduce sustancialmente el número de etapas necesarias en comparación con la técnica anterior, en la cual los procesos de enriquecimiento y modificación se llevan a cabo separadamente.
La invención emplea un dispositivo o metodología con una columna HGMS que está destinada a permitir la especificidad para células seleccionadas o para células seleccionadas marcadas. Una ventaja particular de la invención es la concentración incrementada de células que puede ser utilizada con el sistema HGMS y la reducción del número de etapas en el método. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, se obtiene una muestra, tal como sangre completa, directamente de un organismo, se seleccionan las células tal como mediante marcaje magnético en sangre completa, la sangre completa se aplica a una columna HGMS, las células seleccionadas retenidas en la columna son modificadas y las células seleccionadas modificadas son eluidas y se procede al análisis sin una etapa de centrifugación inter-
media, proporcionando de este modo la oportunidad de automatización y disminuyendo el potencial de pérdida celular.
Otra ventaja de la invención es la oportunidad para controlar la temperatura durante el proceso. La HGMS puede tener lugar en un incubador o en un refrigerador y/o con la utilización de tampones a la temperatura deseada. La utilización de una matriz para HGMS que comprenda una matriz conductora de calor incluyendo, por ejemplo, esferas de acero, esferas de lana de acero u otras esferas, proporciona la oportunidad de controlar la temperatura durante el proceso.
Otra ventaja de la invención es que las células pueden ser movidas rápidamente de fase a fase en la columna HGMS, esto es, desde la fase móvil a la fase inmóvil o desde la fase inmóvil a la fase móvil, mediante la conexión y desconexión del campo magnético o mediante el cambio del campo magnético. En una realización preferida, el campo magnético puede ser ajustado moviendo la columna con relación al imán o, alternativamente, modificando el electroimán.
Definiciones
Según se utiliza en la presente, las "células seleccionadas" son aquellas células que el técnico desea modificar. Típicamente, las células tendrán ciertas características que las diferenciarán de otras células en una suspensión heterogénea, y que permitirán que sean marcadas y separadas. De acuerdo con la invención, las células seleccionadas son retenidas en una columna HGMS, modificadas mientras están retenidas en la columna y posteriormente eluidas.
La "retención" de las células seleccionadas asegura que las células seleccionadas permanezcan en la columna mientras que las células no deseadas son eliminadas. Típicamente, la retención de las células seleccionadas es por inmovilización.
Según se utiliza en la presente, la "inmovilización" de las células seleccionadas en una columna de separación celular magnética se refiere a la retención de las células en la columna en una posición sustancialmente fijada.
La "extracción" de las células seleccionadas de una columna de separación celular magnética implica la elución de las células seleccionadas después de la retención o a la inmovilización. En situaciones en las que se desea una pureza elevada de las células seleccionadas, las células seleccionadas pueden ser extraídas y resuspendidas en un tampón adecuado. Alternativamente, las células seleccionadas pueden ser extraídas y retornadas a la suspensión original después de la modificación de las células seleccionadas en la columna según se describe en la presente.
Según se utiliza en la presente, el "marcaje" es el proceso de fijar un marcador a las células, permitiendo que esas células, algunas veces después de su procesamiento, sean separadas de una suspensión heterogénea y/o detectadas, analizadas o contadas. Las marcas pueden ser estar dirigidas específicamente a las células seleccionadas, pero no es necesario. Tales marcadores o marcas incluyen, pero no se limitan a, moléculas o partículas coloreadas, radiactivas, fluorescentes o magnéticas conjugadas a anticuerpos o a otras moléculas o partículas biológicas que se sabe que se unen a las células o a componentes celulares. Los anticuerpos son utilizados a menudo como componentes de la marca debido a su capacidad para dirigirse a tipos celulares específicos. Otros componentes de la marca biológicamente reactivos que pueden servir como alternativa a los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, sondas genéticas, proteínas, péptidos, aminoácidos, azúcares, polinucleótidos, enzimas, coenzimas, cofactores, antibióticos, esteroides, hormonas o vitaminas.
Según se utiliza en la presente, "marcar magnéticamente" una célula significa unir una marca magnética a una célula, siendo realizado tal marcaje uniendo a dicha célula una partícula o una molécula con propiedades magnéticas. En una realización, la marca magnética comprende un anticuerpo conjugado a un partícula magnética. Marcas magnéticas que comprenden un anticuerpo conjugado a una partícula magnética están disponibles comercialmente en Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). Tal marca puede incluir también opcionalmente una partícula o componente fluorescente o radiactivo.
Según se utiliza en la presente, una "columna de separación celular magnética" es una columna de separación magnética de alto gradiente (HGMS). Columnas HGMS están descritas en, por ejemplo, Miltenyi, S., Patente de EE.UU. Nº 5.411.863, titulada Methods and Materials for Improved High Gradient Magnetic Separation of Biological Materials y están disponibles comercialmente en Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania).
Según se utiliza en la presente, la "separación celular magnética de alto gradiente" es un procedimiento para retener selectivamente materiales magnéticos en una cámara o columna situada en un campo magnético, que puede ser también aplicado a dianas no magnéticas marcadas selectivamente con partículas magnéticas. En presencia de un gradiente magnético suministrado a través de la cámara, la diana marcada magnéticamente es retenida en la cámara. Si la cámara contiene una matriz, la diana marcada magnéticamente resulta asociada a la matriz. Los materiales que no tienen marcas magnéticas pasan a través de la cámara. Los materiales retenidos pueden ser eluidos posteriormente (extraídos) cambiando la potencia de, o eliminando, el campo magnético. Para las dianas marcadas magnéticamente, la liberación es también posible mediante otros medios, tal como con esferas magnéticas que contienen además un sitio de corte enzimático, en las que el corte enzimático (dentro o fuera de la columna) libera las dianas magnéticas. Alternativamente, los materiales retenidos pueden ser liberados mediante, por ejemplo, un cambio del pH o un cambio de la fuerza iónica. El proceso de retención y liberación de las células seleccionadas está ilustrado en las Figuras 3A-3B. El campo magnético puede ser suministrado por un imán permanente o por un electroimán. La selectividad para un material diana deseado es proporcionada por la pareja de unión específica conjugada a la partícula magnética. La cámara a través de la cual se aplica el campo magnético está provista a menudo de una matriz de un material de susceptibilidad magnética adecuada para inducir un campo magnético de alto gradiente localmente en la cámara en volúmenes cercanos a la superficie de la matriz. Esto permite la retención de partículas magnetizadas muy débilmente. Ver Miltenyi, S., Patente de EE.UU. Nº 5.411.863.
Preferiblemente, la columna de separación celular magnética empleará una columna conteniendo un volumen elevado de la matriz. La matriz es suministrada para proporcionar un campo magnético local de fuerte gradiente y es frecuentemente un material ferromagnético tal como lana de acero revestida con un polímero. Preferiblemente, se emplea una matriz de esferas ferromagnéticas revestidas con un polímero biocompatible sólidamente empaquetada. Ver Kantor y col., Magnetic Cell Sorting with Colloidal Superparamagnetic Particles en Cell Separation Methods and Applications (1998). El volumen de la matriz es más de un 50% del volumen total de la columna y preferiblemente más de un 60% del volumen total de la columna. Las columnas MS+ o VS+ comercialmente disponibles (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania), que contienen matrices de esferas de hierro, proporcionan una capacidad elevada de células unidas con un volumen libre de la columna bajo, según está detallado en la Tabla 1.
TABLA 1
Columna Células Unidas Volumen Total Volumen Libre de la Columna
MS+ hasta 10^{7} 150 \mul aprox. 70 \mul
VS+ hasta 10^{8} 1,2 ml aprox. 500 \mul
Habiendo sido inmovilizadas en la columna, las células seleccionadas pueden ser modificadas por el técnico mientras están retenidas.
Según se utiliza en la presente, la "modificación" de células se refiere a cualquier proceso para alterar físicamente, biológicamente o químicamente las células seleccionadas a partir de su estado previo. Ejemplos de modificaciones dentro del ámbito de la invención incluyen, pero no se limitan a, el marcaje de células (con marcas tales como anticuerpos o marcadores fluorescentes o radiactivos o ligandos biológicos y sustratos), tinción intracelular, tinción superficial, fijación, permeabilización, recombinación genética, activación, transfección, infección y otros cambios celulares causados por la aplicación de enzimas, modificadores biológicos o agentes farmacológicos o químicos.
Según se utiliza en la presente, un "agente modificador" se refiere de manera general a cualquier agente capaz de llevar a cabo una modificación. Tales agentes modificadores pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos, ligandos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, polinucleótidos, lectinas, lípidos, modificadores biológicos, agentes de fijación, agentes farmacológicos, agentes químicos, agentes de permeabilización, colorantes intracelulares, colorantes de superficie, vectores de expresión y enzimas.
Según se utiliza en la presente, "fijación" o "fijar" se refiere a cualquier proceso que sirva para conservar una célula en cierto estado, teniendo como resultado preferiblemente el mantenimiento de una representación exacta de la estructura de la célula in vivo, tal como mediante el mantenimiento de su tamaño original, sufriendo una mínima pérdida de los materiales celulares o conservando la reactividad de sus constituyentes intracelulares. Los agentes fijadores preferidos incluyen soluciones de formaldehído, formalina, glutaraldehído y otros. La fijación con formaldehído incluye preferiblemente una etapa de incubación en la que se da un tiempo a la solución de formaldehído para que penetre en las células a una temperatura óptima. Aunque la fijación con formaldehído puede ser realizada mientras las células están retenidas en una columna de separación celular, se lleva a cabo preferiblemente con las células antes de su aplicación a la columna. La fijación puede ser realizada antes o después del marcaje magnético. Después de las etapas de fijación e incubación, las células pueden ser aplicadas directamente a la columna de separación celular para su separación y para una modificación posterior en la columna. Esto reduce la formación de agregados que puede tener lugar cuando la fijación se realiza en células inmovilizadas en una columna.
Según se utiliza en la presente, la "tinción intracelular" se refiere al proceso de unir una marca a una molécula, componente o estructura intracelular, incluyendo, pero sin limitarse a, proteínas, enzimas, nucleótidos, cromosomas, inmunoglobulinas o componentes de inmunoglobulinas o membranas. Típicamente, las células son permeabilizadas antes de la tinción intracelular.
Según se utiliza en la presente, la "permeabilización" de una célula se refiere a cualquier proceso que facilite el acceso al citoplasma celular o a moléculas, componentes o estructuras intracelulares de una célula. La permeabilización puede ser mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, la exposición a formaldehído, etanol o detergentes. La saponina en tampón ha sido utilizada con éxito de acuerdo con la invención.
Según se utiliza en la presente, "transfección" es la modificación genética de células cultivadas por la captación de ADN que es aplicado normalmente en forma de plásmidos o de otros tipos de vectores de ADN que contienen genes de interés. La transfección puede ser realizada mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, transfección mediada por fosfato de calcio o por DEA-dextrano, lipofección, o a través de la utilización de vectores víricos tales como vectores adenovíricos o retrovíricos.
Un "vector", según se utiliza en la presente, es una pequeña molécula de ADN transportadora en la que puede insertarse una secuencia de ADN para su introducción en una célula huésped en la que se replicará y/o expresará. Los vectores pueden derivar de plásmidos, bacteriófagos o virus de vegetales o animales.
Según se utiliza en la presente, un "modificador biológico" es cualquier compuesto biológico capaz de producir una reacción o cambio en la actividad de una célula viva. Tales modificadores pueden acelerar o retardar la actividad celular, estimular o retrasar la mitosis, activar o desactivar ciertos genes, incrementar o reducir la receptividad o permeabilidad celular o producir otro cambio. Ejemplos de modificadores biológicos incluyen, pero no se limitan a, agentes farmacológicos, citoquinas, interleuquinas, hormonas, factores de crecimiento y otras señales intercelulares o intracelulares.
Según se utiliza en la presente, el término "agentes farmacológicos" se refiere a cualquiera de varias sustancias disponibles para el tratamiento de una enfermedad o disfunción.
Según se utiliza en la presente, el término "agentes químicos" se refiere a cualquiera de varias sustancias que producen una reacción química con una célula. Ejemplos de agentes químicos incluyen, pero no se limitan a, ácidos, bases, colorantes y solventes.
HGMS y Modificación de las Células Seleccionadas
La invención de la presente es llevada a cabo preferiblemente marcando en primer lugar las células seleccionadas con una marca que comprende una partícula magnética, típicamente de 20-100 nm de diámetro. Tales microesferas están disponibles comercialmente como microesferas magnéticas conjugadas covalentemente a una variedad de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, MicroBeads de Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) y el marcaje se realiza por medios conocidos en la técnica. El marcaje con fluorescencia de las células seleccionadas puede ser también realizado en esta etapa. Si es posible, las células son preferiblemente lavadas en esta etapa y suspendidas en un tampón apropiado tal como PBS/BSA/EDTA.
Las células seleccionadas marcadas magnéticamente son aplicadas posteriormente a una columna de separación celular magnética de alto gradiente (HGMS). Las columnas HGMS están descritas en la Patente de EE.UU. Nº 5.411.863 y están disponibles comercialmente como columnas de separación magnética de alto gradiente MACS® en Miltenyi Biotec GmbH (Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). Sin embargo, puede utilizarse de acuerdo con esta invención cualquier separación celular magnética de alto gradiente.
La columna de separación celular magnética retiene las células seleccionadas en la columna mientras que permite que las células no marcadas (y otras materias no deseadas) fluyan a través de la misma. Típicamente, la columna contiene una matriz ferromagnética y está colocada en un potente campo magnético externo y las células seleccionadas, marcadas, son inmovilizadas magnéticamente en la matriz de la columna. Preferiblemente, la columna es lavada mientras las células están inmovilizadas con el fin de incrementar la homogeneidad de la población celular retenida.
Mientras están retenidas selectivamente en la columna, las células seleccionadas son relativamente homogéneas. Esto proporciona un marco óptimo para la modificación selectiva de estas células, ya que la concentración del agente modificador puede ser minimizada a la vez que se maximiza la eficacia de la modificación. Además, pueden llevarse a cabo modificaciones sucesivas o múltiples de acuerdo con la invención. Por ejemplo, las células inmovilizadas pueden ser modificadas, lavadas y luego teñidas antes de ser eluidas de la columna. Alternativamente, las células inmovilizadas pueden ser modificadas, lavadas y extraídas, manipuladas fuera de la columna, vueltas a aplicar a la columna, inmovilizadas y teñidas, y luego extraídas una vez más. La modificación puede comprender fijación y/o permeabilización, después de lo cual puede realizarse una modificación adicional tal como tinción intracelular. Otras modificaciones incluyen la tinción superficial según se describió anteriormente y se describe en los ejemplos siguientes. En la Figura 2 se proporciona un diagrama de flujo que describe este proceso.
El rango de las modificaciones no está limitado a protocolos analíticos o de tinción; por el contrario, cualquier modificación celular conocida en la técnica puede ser adaptada de acuerdo con esta invención. Así, por ejemplo, la modificación por la aplicación de cualquier agente modificador, modificador biológico, agente farmacológico, agente químico o enzima a las células retenidas en la columna, está dentro del ámbito de la invención. Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, el ámbito de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Fijación y Tinción Combinada Intracelular y Superficial de Células Mononucleares de Sangre Periférica CD138 Positivas
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron mezcladas con células de la línea celular de mieloma U266 que expresan CD138 en una proporción 200:1, esto es, teniendo como resultado un 0,5% de células U266 entre las PBMCs. Se marcaron 5 x 10^{7} células con MicroBeads conjugadas al mAb B-B4 anti-CD138 de ratón (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) en 1000 \mul de PBS/BSA/EDTA (tampón) durante 15 minutos a 8ºC. Se añadió el mAb B-B4 anti-CD138 de ratón conjugado a ficoeritrina (CD138·PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) durante 5 minutos adicionales a 8ºC. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 500 \mul de tampón.
Las células CD138 positivas fueron enriquecidas con el sistema de separación celular magnética MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). La suspensión de células marcadas magnéticamente fue pipeteada sobre la parte superior de una columna de separación en una unidad de separación MiniMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). Se dejó pasar la suspensión celular a través de la columna y la columna fue lavada con 3 x 500 \mul de tampón. El efluente fue recogido como fracción negativa. La columna fue retirada del separador y colocada en un tubo adecuado. Se pipetearon 0,5 ml de PBS/EDTA conteniendo un 2% de formaldehído (Merck) sobre la parte superior de la columna y las células marcadas magnéticamente se hicieron salir con el líquido utilizando un émbolo. Las células eluidas fueron incubadas durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT) y aplicadas directamente en la parte superior de una segunda columna de separación en una unidad de separación MiniMACS. Se dejó pasar la suspensión celular a través de la columna y la columna fue lavada con 2 x 500 \mul de tampón conteniendo un 0,5% de saponina (tampón-saponina de Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Alemania). El efluente fue recogido como fracción negativa. Posteriormente, 100 \mul de tampón-saponina conteniendo 10 \mug/ml de anti-lambda humana de cabra·FITC (Southern BioTechnology Associates (SBA) 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) y 2 \mug/ml del mAb B-B2 anti-CD138 de ratón conjugado a Ficoeritrina (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) fueron aplicados a la columna y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La columna fue lavada con 1 x 500 \mul de tampón-saponina. La columna fue retirada del separador y colocada en un recipiente adecuado para recibir el eluato. Se pipetearon 0,5 ml de tampón sobre la parte superior de la columna y las células marcadas magnéticamente se hicieron salir con el líquido utilizando un émbolo.
En paralelo, células CD138 positivas fueron enriquecidas mediante dos rondas de separación en MiniMACS con el fin de comparar las eficacias de separación.
Las células originales (esto es antes de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS®), las fracciones de células negativas (de la primera y también de la segunda separación celular magnética de alto gradiente en MACS®) y las fracciones de células positivas de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS® fueron analizadas mediante citometría de flujo. Para el análisis de citometría de flujo se utilizaron un FACScan y el programa de ordenador para investigación CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las células muertas y los desechos celulares fueron excluidos según sus propiedades de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml) de las células vivas.
Los resultados están mostrados en las Figuras 4A-4C. La Figura 4A muestra la tinción de las células con CD138·PE frente a PI antes de la separación celular magnética de alto gradiente (MACS®). Mientras que en la separación del control las células CD138 positivas fueron enriquecidas hasta un 52% de pureza entre todas las células (sin acotar) (que corresponde a un 98% de pureza de células vivas), las células CD138 positivas fueron enriquecidas hasta un 64% de pureza entre todas las células (sin acotar) en la separación incluyendo fijación y tinción intracelular. La Figura 4B muestra la tinción con CD138·PE frente a la autofluorescencia FL3 de la fracción de células positivas fijadas después de la segunda separación celular magnética de alto gradiente en MACS® con acotamiento en células CD138 positivas. El canal FL3 del citómetro de flujo recoge la luz fluorescente igual o mayor de 650 nm. La Figura 4C muestra la tinción intracelular de la cadena ligera lambda de inmunoglobulina humana frente a la tinción con CD138·PE en células acotadas. Casi todas las células CD138 positivas expresan la cadena ligera lambda intracelular según se informó para células U266. Las recuperaciones de células CD138+ en las fracciones positivas fueron también muy similares en ambas separaciones, con un 81% y un 91%, respectivamente. Por tanto, las eficacias de separación fueron equivalentes en ambos casos.
Ejemplo 2 Fraccionamiento y Tinción Intracelular de una Muestra de Leucoféresis
Una muestra de leucoféresis de un paciente con mieloma múltiple fue marcada con MicroBeads conjugadas al mAb B-B4 anti-CD138 de ratón (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) en PBS/BSA/EDTA (tampón) durante 15 minutos a 8ºC. Se añadió el mAb B-B4 anti-CD138 de ratón conjugado a Ficoeritrina (CD138·PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) durante 5 minutos adicionales a 8ºC. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 2 ml de tampón. El CD138 se expresa en las células plasmáticas normales así como en las malignas.
Las células CD138 positivas fueron enriquecidas mediante separación celular magnética de alto gradiente en MACS®. La suspensión de células marcadas magnéticamente fue pipeteada sobre la parte superior de una columna de separación VS+ en una unidad de separación MiniMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania), se dejó pasar la suspensión celular a través de la columna y la columna fue lavada con 3 x 3 ml de tampón. El efluente fue recogido como fracción negativa. La columna fue retirada del separador y colocada en un tubo adecuado. Se pipetearon 5 ml de PBS/EDTA sobre la parte superior de la columna y las células marcadas magnéticamente se hicieron salir con el líquido utilizando un émbolo. Una parte de las células fue aplicada directamente a una segunda ronda de separación en MiniMACS. A la otra parte de las células (5 x 10^{5} células en 1 ml) se añadió el mismo volumen de tampón conteniendo un 4% de formaldehído (Merck) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las células fueron divididas en dos muestras y aplicadas directamente sobre la parte superior de dos columnas de separación en dos unidades de separación MiniMACS. Se dejó que las suspensiones celulares pasaran a través de las columnas y se lavaron las columnas con 2 x 500 \mul de tampón conteniendo un 0,5% de saponina (tampón-saponina de Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Alemania). Los efluentes fueron recogidos como fracciones negativas. Posteriormente, 100 \mul de tampón-saponina conteniendo 2 \mug/ml de CD138·PE y 10 \mug/ml de anti-lambda humana de cabra·FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) fueron aplicados a una columna y 100 \mul de tampón-saponina conteniendo 2 \mug/ml de CD138·PE y 10 \mug/ml de anti-kappa humana de cabra·FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) fueron aplicados a la otra columna. Ambas columnas fueron incubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las columnas fueron lavadas con 1 x 500 \mul de tampón-saponina y 1 x 500 \mul de tampón. Las columnas fueron extraídas de los separadores y colocadas en tubos adecuados. Se pipetearon 0,5 ml de tampón en la parte superior de cada columna y las células marcadas magnéticamente se hicieron salir con el líquido utilizando un émbolo.
Las células originales (esto es, antes de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS®), las fracciones de células negativas (de la primera así como de la segunda separación celular magnética de alto gradiente en MACS®) y las fracciones de células positivas de la separación celular magnética de alto gradiente con MACS® fueron analizadas mediante citometría de flujo. Para el análisis citométrico de flujo se utilizaron FACScan y el programa de ordenador para investigación CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las células muertas y los desechos celulares fueron excluidos de acuerdo con las propiedades de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml) de las células vivas.
Los resultados están mostrados en las Figuras 5A-5D y 6A-6D. Las Figuras 5A y 5B muestran la tinción de células vivas con CD138·PE antes y después de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS®. Las Figuras 6A y 6B muestran la tinción con CD138·PE frente a la autofluorescencia FL3 de la fracción positiva de las células fijadas después de la segunda separación celular magnética de alto gradiente en MACS® con acotamiento en las células CD138 positivas. Las representaciones gráficas de puntos 6C y 6D muestran la tinción intracelular de la cadena ligera lambda (6C) o de la cadena ligera kappa (6D) de inmunoglobulina humana frente a la tinción con CD138·PE en células acotadas. Alrededor de un 96% de las células CD138 positivas expresan la cadena ligera kappa intracelular, mientras que proporcionalmente el 4% de las células CD138 positivas expresan la cadena ligera lambda intracelular, indicando la presencia de una población monoclonal de células tumorales.
Ejemplo 3 Tinción Intracelular Selectiva de Células U266 de una Suspensión Heterogénea
Células de la línea celular de carcinoma SKBR3 fueron mezcladas con células de la línea celular de mieloma U266 en una proporción 1:1. Se marcaron 2 x 10^{6} células con MicroBeads conjugadas al mAb B-B4 anti-CD138 de ratón (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) y con MicroBeads conjugadas al anti-antígeno epitelial humano (HEA) de ratón (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) en 100 \mul de PBS/BSA/EDTA (tampón) durante 15 minutos a 8ºC. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 1 ml de tampón. Posteriormente se añadió 1 ml de tampón conteniendo un 4% de formaldehído (Merck) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente.
La suspensión de células marcadas magnéticamente y fijadas fue pipeteada directamente sobre la parte superior de una columna de separación en una unidad de separación MiniMACS. Se dejó que la suspensión celular pasara a través de la columna y la columna se lavó con 2 x 500 \mul de tampón conteniendo un 0,5% de saponina (tampón-saponina de Serva, Carl-Benz-Str. 7, 69115 Heidelberg, Alemania). El efluente fue recogido como fracción negativa. Posteriormente, 100 \mul de tampón-saponina conteniendo 10 \mug/ml de anti-lambda humana de cabra·FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) fueron aplicados a la columna y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La columna fue retirada del separador y colocada en un recipiente adecuado para recoger el eluato. Se pipetearon 0,5 ml de tampón sobre la parte superior de la columna y se hicieron salir con el líquido las células marcadas magnéticamente utilizando un émbolo.
En paralelo, 2 x 10^{6} células fueron fijadas en tampón conteniendo un 2% de formaldehído (Merck) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas con tampón-saponina, resuspendidas en 15 \mul de tampón-saponina conteniendo 10 \mug/ml de anti-lambda humana de cabra·FITC (SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) e incubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas con tampón-saponina y resuspendidas en tampón.
La muestra control y las fracciones de células positivas procedentes de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS® fueron analizadas por citometría de flujo. Para los análisis de citometría de flujo se utilizaron un FACScan y el programa de ordenador para investigación CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
Los resultados están mostrados en las Figuras 7A-7B y en la Tabla 2 siguiente. Las Figuras 7A y 7B muestran la tinción con anti-lambda humana de cabra·FITC de las células teñidas en la columna (7A) o fuera de la columna (7B). En ambas muestras, alrededor de un 50% de las células expresan la cadena ligera kappa intracelular, según se informó para las células U266, con intensidades de tinción muy similares (Tabla 2). Por tanto, la tinción de las células en la columna es al menos igual de eficaz que la tinción en suspensión.
TABLA 2 Intensidad media de la tinción fluorescente de
Células negativas Células positivas
Tinción en columna 44 3100
Tinción en suspensión 56 2647
Ejemplo 4 Tinción en Superficie de Diferentes Clases de Ig en Células CD138, Incluyendo la Unión de Estreptavidina/Biotina
Se marcaron 4 x 10^{8} células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con MicroBeads conjugadas al mAb B-B4 anti-CD138 de ratón (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) en 2 ml de PBS/BSA/EDTA (tampón) durante 30 minutos a 8ºC. Las células fueron lavadas y resuspendidas en 2 ml de tampón.
Las células CD138 positivas fueron enriquecidas con el sistema de separación celular magnética MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). La suspensión de células marcadas magnéticamente fue pipeteada sobre la parte superior de una columna de separación en una unidad de separación MiniMACS, se dejó que la suspensión celular pasara a través de la columna y se lavó la columna con 3 x 500 \mul de tampón. El efluente fue recogido como fracción negativa. La columna fue extraída del separador y colocada en un recipiente adecuado para recoger el eluato. Se pipetearon 1,5 ml de tampón sobre la parte superior de la columna y se hicieron salir con el líquido las células marcadas magnéticamente utilizando un émbolo. Las células eluidas fueron divididas y aplicadas directamente sobre la parte superior de tres columnas de separación diferentes (a, b y c) en unidades de separación MiniMACS. Se dejó que las suspensiones celulares pasaran a través de las columnas y se lavó cada columna con 2 x 500 \mul de tampón. Los efluentes fueron recogidos como fracciones negativas. Posteriormente, 100 \mul de tampón conteniendo el mAb B-B4 anti-CD138 de ratón conjugado a Ficoeritrina (CD138·PE) (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania), anti-CD19 de ratón·Cy5 y (a) 5 \mug/ml de anti-IgA humana de ratón·biotina, (b) 5 \mug/ml de anti-IgM humana de ratón·FITC o (c) 2 \mug/ml de anti-IgG humana de ratón·FITC (obtenidos todos de Southern BioTechnology Associates, SBA, 160A Oxmoor Boulevard, Birmingham, Alabama 35209, EE.UU.) fueron aplicados a las diferentes columnas, respectivamente, y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Cada columna fue lavada con 500 \mul de tampón. Para (a), se aplicaron 100 \mul adicionales de tampón conteniendo 2 \mug/ml de estreptavidina·FITC, seguido por incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente y una etapa de lavado con 500 \mul de tampón. Las columnas fueron retiradas del separador y colocadas en un recipiente apropiado para recoger el eluato. Se pipetearon 0,5 ml de tampón en la parte superior de cada columna y se hicieron salir con el líquido las células marcadas magnéticamente de cada columna utilizando un émbolo.
Las células originales (esto es, antes de la separación celular magnética de alto gradiente con MACS®) y las fracciones de células positivas de la separación celular magnética de alto gradiente con MACS® fueron analizadas mediante citometría de flujo. Para el análisis de citometría de flujo se utilizaron un FACScan y el programa de ordenador para investigación CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las células muertas y los desechos celulares fueron excluidos según las propiedades de dispersión y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml).
La mayoría, alrededor del 50%, de las células CD138+ procedentes de PBMC normales expresan IgA en la superficie, mientras que alrededor del 32% expresan IgM en la superficie y alrededor del 3% expresan IgG en la superficie.
Ejemplo 5 Tinción en Superficie de Linfocitos CD19 Frente a CD4 Después del Aislamiento de CD45 Directamente de Sangre Completa
Se marcó 1 ml de sangre humana heparinizada con 20 \mul de MicroBeads para el CD45 humano (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se añadió 1 ml de PBS/EDTA.
Las células CD45 positivas fueron posteriormente enriquecidas con el sistema de separación celular magnética MACS® (Miltenyi Biotec GmbH, Friedrich Ebert Str. 68, D-51429 Bergisch Gladbach, Alemania). La suspensión de células marcadas magnéticamente fue pipeteada sobre la parte superior de una columna de separación en una unidad de separación MiniMACS. Se dejó pasar la suspensión celular a través de la columna y se lavó la columna con 2 x 500 \mul de tampón. El efluente fue recogido como fracción negativa. Posteriormente, 100 \mul de tampón conteniendo un mAb hacia CD19 conjugado a Ficoeritrina (CD19·PE) y un mAb hacia CD4 conjugado a FITC (CD4·FITC) fueron aplicados a la columna y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La columna fue lavada con 500 \mul de tampón. La columna fue retirada del separador y colocada en un recipiente adecuado para recoger el eluato. Se pipetearon 0,5 ml de tampón sobre la parte superior de cada columna y se hicieron salir con el líquido las células marcadas magnéticamente utilizando un émbolo.
La fracción de células positivas del sistema de separación celular magnético de alto gradiente MACS® fue analizada mediante citometría de flujo. Para el análisis de citometría de flujo se utilizaron un FACScan y el programa de ordenador para investigación CELLQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Las células muertas, las células no nucleadas y los desechos celulares fueron excluidos según las propiedades de dispersión (acotamiento en R1) y la tinción con yoduro de propidio (PI; 0,3 \mug/ml) y LDS 751 (1 \mug/ml) (acotamiento en R2).
Según se muestra en la Fig. 9C, las células B CD19+, las células T CD4++ y los monocitos CD4 dim pueden ser claramente discriminados en la fracción positiva. No hay un número significativo de células doble positivas, lo cual podría haber sido esperado si diferentes subtipos de linfocitos CD45+ como las células B, las células T o los monocitos, hubieran formado agregados estables después de la separación celular magnética de alto gradiente en MACS® para CD45 y la tinción en la columna.
La Figura 10 es una foto de microscopio electrónico con exploración total de imagen ("raster") de una matriz de esferas de hierro de una columna MS+ con células CD8+ marcadas magnéticamente unidas a la matriz. La Figura 10 muestra que las células no están distribuidas homogéneamente sobre toda la superficie de la matriz, sino que están concentradas en distintas áreas. Las células no están inmovilizadas como una monocapa. Pero en vez de esto, muchas células están a menudo muy próximas.
Aunque la invención precedente ha sido descrita con detalle por medio de ilustraciones y ejemplos con el fin de facilitar la claridad y la comprensión de la misma, será obvio para los expertos en la técnica que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones. Por tanto, la descripción y los ejemplos no deben ser considerados como limitantes del ámbito de la invención que está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (20)

1. Un método para modificar células seleccionadas, comprendiendo el método las etapas de:
(a) la aplicación de una población de células a una columna de separación magnética de alto gradiente, donde dicha columna contiene una matriz que es más del 50% del volumen total de la columna, donde dicha población de células comprende células seleccionadas marcadas magnéticamente;
(b) la retención de dichas células seleccionadas marcadas magnéticamente en dicha columna a la vez que se permite el paso de las células no marcadas a través de la columna;
(c) el lavado de dichas células seleccionadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna y
(d) la modificación de dichas células seleccionadas mientras dichas células seleccionadas están retenidas por dicha columna;
en el que la etapa (c) es opcional.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el volumen de la matriz es más de un 60% del volumen total de la columna.
3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicha modificación comprende la tinción intracelular de dichas células seleccionadas.
4. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la permeabilización de dichas células seleccionadas.
5. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende un segundo marcaje de dichas células seleccionadas.
6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la unión de un compuesto biológicamente reactivo a las células seleccionadas.
7. El método de la reivindicación 6, en el que dicho compuesto biológicamente reactivo incluye anticuerpos, ligandos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos, oligonucleótidos, lectinas, lípidos o enzimas.
8. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la transfección de las células seleccionadas con un vector de expresión.
9. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la aplicación de un enzima a dichas células seleccionadas.
10. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la aplicación de un agente farmacológico a dichas células seleccionadas.
11. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la aplicación de un modificador biológico a dichas células seleccionadas.
12. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la aplicación de un agente químico a dichas células seleccionadas.
13. El método de la reivindicación 1, en el que dicha modificación comprende la aplicación de un primer y un segundo agente modificador a dichas células seleccionadas.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de extracción de las células seleccionadas de la columna después de su modificación.
15. El método de la reivindicación 14, en el que dicha extracción es mediante la retirada de dicho campo magnético.
16. El método de la reivindicación 14 o de la reivindicación 15, que comprende además la aplicación de las células seleccionadas extraídas a una segunda columna de separación celular magnética de alto gradiente, de tal manera que las células seleccionadas sean retenidas por dicha segunda columna; y la modificación posterior de las células seleccionadas retenidas por dicha segunda columna.
17. El método de la reivindicación 16, que comprende además la etapa de extracción de las células seleccionadas de dicha segunda columna después de su modificación posterior.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz comprende esferas ferromagnéticas.
19. El método de la reivindicación 18, en el que dichas esferas ferromagnéticas están revestidas con un polímero biocompatible.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la población de células comprende células sanguíneas humanas.
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