CN116751260B - 一种通过级联聚合反应生成尺寸可控的通用多聚显色物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种“一拖多”形式的能发生正交点击化学反应的分子元件组合物以及通过级联的多聚伞状反应制备伞状多聚物的方法。该组合物，包括分子元件M和分子元件N；分子元件M是在基础物质m上连接了互不干扰的点击化学基团p2，q1，其中，一种基团数目为1，即单价，则另一种基团数目大于1，即多价；分子元件N是在基础物质n上连接了互不干扰的点击化学基团p1，q2，其中，一种基团数目为1，即单价，则另一种基团数目大于1，即多价；元件M的单价端与元件N的多价端形成一组正交点击化学反应，而元件M的多价端与元件N的单价端形成另一组正交的点击化学反应。本发明提供的分子元件组合物可用于合成伞状多聚物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过级联聚合反应生成尺寸可控的通用多聚显色物的方法。
背景技术
在基于分子染色的检测技术中，我们可以框架性的把染色分子分成两个模块，(A)结合目标分子的识别模块，(B)负责信号显示的显色模块。染色分子或分子复合物通过(A)-(B)的结构进行目标物的显示。
显色模块B有许多种类，比如荧光基团，胶体物质，化学发光基团，酶等，配合下游的相关路线，构成各种相关的显色方法学，以抗原抗体反应为例，可以分别产生但不限于免疫荧光，侧向层析，电化学发光，免疫组化等方法学。
为产生灵敏的显色信号，对于B模块，把显色基团多聚在和识别模块A结合，构成(A)-(B)n的结构。其中使用最广泛的是免疫组化中的二抗染色。在二抗染色分子中，(A)是识别一抗Fc端的抗体，(B)n是多聚酶，通常为辣根过氧化酶。目前，生成多聚酶的方式主要有两种，一种是团聚法，即把单体酶随机交联团聚，形成团聚型多聚酶；二是链式法，即把单体酶和一个链式多聚物，如葡聚糖连接在一起，形成长链型多聚酶。
现有的方法对于多聚物大小控制力弱，既对于(B)n，n值控制不易，导致产物的尺寸受限，或者均一性不佳。另外，目前多聚显色物主要集中在多聚酶，对于多聚荧光等另外的多聚显色物不易生成，缺乏通用的办法。
发明内容
本发明通过制作分子元件M和N，在两种不互相干扰的点击化学反应作用下形成由M和N构成的伞状多聚物，其尺寸大小由反应轮数控制。并且，在伞状多聚物外周的点击化学基团可以方便的插上各类显色基团，生成可控尺寸的通用多聚显色物。
本发明的第一个目的是提供一种“一拖多”形式的能发生正交点击化学反应的分子元件组合物。
本发明所提供的分子元件组合物，包括分子元件M和分子元件N；
所述分子元件M是在基础物质m上连接了互不干扰的点击化学基团p2，q1，其中p2，q1的数量有特别的安排，一种基团数目为1(即单价)，则另一种基团数目大于1(即多价)；
所述分子元件N是在基础物质n上连接了互不干扰的点击化学基团p1，q2，其中p1，q2的数量有特别的安排，一种基团数目为1(即单价)，则另一种基团数目大于1(即多价）；
所述分子元件M的单价端与所述分子元件N的多价端形成一组正交点击化学反应，而所述分子元件M的多价端与所述分子元件N的单价端形成另一组正交的点击化学反应；
所述点击化学反应，其中一组反应的功能团为p1,q1，另一组反应的功能团为p2,q2；
其中，所述p1，q1通过混合即通过点击化学反应生成共价键；所述p2,q2通过混合即通过点击化学反应生成共价键；
且所述(p1,p2)、(p1,q2)、(p2,q1)、(q2,q2)两两之间均不会相互发生反应，即上述两组点击化学反应有正交性。
进一步的，所述基础物质m和基础物质n可为多肽或DNA。
所述基础物质m和基础物质n可以相同或不同。
本发明中所述分子元件M以及分子原件N的合成方法可按照现有技术公开的常规修饰方法在基础物质M或N上连接上相应的点击化学基团。
根据本发明的一个实施例，两对正交的点击化学反应为(p1,q1,例如，p1可以是azide-叠氮基，q1可以是DBCO-二苯并环辛炔基；或p1可以是azide-叠氮基，q1可以是BCN-双环[6.1.0]壬炔；或p1可以是azide-叠氮基，q1可以是propargyl-炔丙基)和(p2,q2,p2可以是Tetrazine-四嗪基，q2可以是TCO-反式环辛烯基)。
对于分子元件M，其基础物质m可以为一段多肽(序列为GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC)，其上通过Maleimide反应带上1个q1(即DBCO或BCN或propargyl)，通过NHS反应带上多(此例为2)个p2(即Tetrazine)，则M＝q1-m-(p2)2，‘-’代表共价键。
同理，对于分子元件N，其基础物质n可以为一段多肽(序列为GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC)，其上通过NHS反应带上多(此例为2)个的p1(即azide)，通过Maleimide反应带上1个q2(即TCO)，则N＝q2-n-(p1)2,‘-’代表共价键。
本发明提供的分子元件组合物可用于合成伞状多聚物。
本发明的第二个目的是提供一种通过级联的多聚伞状反应制备伞状多聚物的方法。
本发明所提供的制备伞状多聚物的方法，包括下述步骤：
1)在固相基质上可逆固定上述分子元件M；
2)在第1轮的反应下，用过量的上述分子元件N与固定的分子元件M孵育，在点击化学(p2,q2)的作用下，生成M-2N的结构，洗去过量的N；
3)在第2轮的反应下，用过量的分子元件M与固定的M-2N孵育，在点击化学(p1,q1)的作用下，生成M-2N-4M的伞状结构，洗去过量的M；
4)在第3轮的反应下，用过量的分子元件N与固定的M-2N-4M孵育，在点击化学(p2,q2)的作用下，生成M-2N-4M-8N的伞状结构，洗去过量的N；
5)以此类推，可以根据反应的轮次，生成可控大小的伞状多聚物。
上述方法中，所述固相基质可为交联于琼脂糖凝胶上的修饰p1(如azide)的蛋白。所述琼脂糖凝胶具体可采用Ni NTA Beads 6FF珠子。
本发明的第三个目的是提供一种伞状多聚显色物的合成方法。
当所需尺寸的伞状多聚物生成完毕，最外周会留下多价端的点击化学基团(在此例是p1或p2)。使显色基团(包括荧光，化学发光分子，酶等)带上互补的点击化学基团(在此例是q1或q2)，与伞状物进行孵育，即得到相应尺寸的各类伞状多聚显色物。
本发明所提供的伞状多聚显色物的合成方法，包括下述步骤：
1)按照上述方法合成伞状多聚物；
2)使显色基团(包括荧光，化学发光分子，酶等)带上与所述伞状多聚物最外周残留的点击化学基团能发生点击化学反应的点击化学基团(在此例是q1或q2)与所述伞状多聚物进行孵育，得到伞状多聚显色物。
其中，所述显色基团包括荧光基团，化学发光分子，酶等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的优点第一是可控性，即聚合物大小根据轮次可控。第二是通用性，即可以方便的生成各类的伞状多聚显色物。第三是易操作性，利用方便的点击化学反应，在温和条件即可构建相关分子。
附图说明
图1为本发明合成伞状多聚物的反应流程图；
图2为实施例3中伞状多聚物每轮反应后产物的SDS-PAGE检测结果图；其中，1.固相蛋白：pA，2.固相基质：珠子-pA-AZ，3.多肽与固相基质固定反应，4.多肽与固相基质第一轮反应，5.多肽与固相基质第二轮反应，6.抗HumanIgG2抗体及dylight650与第二轮反应后的多聚物反应，7.抗HumanIgM抗体及dylight650与第二轮反应后的多聚物反应；
图3为实施例3中流式检测伞状多聚物dylight650-抗体(Anti-Human IgM抗体)与常规法标记dylight650-抗体(Anti-Human IgM抗体)的流式分析数据图；
图4为实施例3中流式检测伞状多聚物dylight650-抗体(Anti-Human IgM抗体)与常规法标记dylight650-抗体(Anti-Human IgM抗体)阴性对照的流式分析数据图；
图5为实施例3中流式检测伞状多聚物dylight650-抗体(Anti-Human IgG2抗体)与常规法标记dylight650-抗体(Anti-Human IgG2抗体)的流式分析数据图；
图6为实施例3中流式检测伞状多聚物dylight650-抗体(Anti-Human IgG2抗体)与常规法标记dylight650-抗体(Anti-Human IgG2抗体)阴性对照的流式分析数据图；
图7为实施例3中流式检测伞状多聚物dylight650-抗体与常规法标记dylight650-抗体的荧光强度比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、制作分子元件M和N
两对正交的点击化学反应为(p1,q1,p1为azide-叠氮基，q1为DBCO-二苯并环辛炔基)和(p2,q2,p2为Tetrazine-四嗪基，q2为TCO-反式环辛烯基)。
对于分子元件M，其基础物质m为一段多肽(序列为GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC)，其上通过Maleimide反应带上1个q1(即DBCO)，通过NHS反应带上多(此例为2)个p2(即Tetrazine)，则M＝q1-m-(p2)2，‘-’代表共价键。
同理，对于分子元件N，其基础物质n可以为一段多肽(序列为GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC)，其上通过NHS反应带上多(此例为2)个的p1(即azide)，通过Maleimide反应带上1个q2(即TCO)，则N＝q2-n-(p1)2,‘-’代表共价键。
实施例2、制备伞状多聚物以及伞状多聚显色物
(1)固定分子元件M：将q1-m-(p2)2固定于交联于琼脂糖凝胶上修饰p1(即azide)的蛋白上；
(2)第一轮反应：过量分子元件N:q2-N-(p1)2与固定于固相基质上的q1-M-(p2)2反应，q2与p2以共价键形式结合，反应结束后使用缓冲液洗去未与q1-M-(p2)2结合的q2-N-(p1)2，所得产物为伞状结构M-2N-(p1)4；
(3)第二轮反应：过量q1-M-(p2)2与固定于固相基质上的伞状结构M-2N-(p1)4反应，q1与p1以共价键形式结合，反应结束后使用缓冲液洗去未与伞状结构M-2N-(p1)4结合的q1-M-(p2)2，所得产物为伞状结构M-2N-4M(p2)8；
(4)第三轮反应：过量q2-N-(p1)2与固定于固相基质上的伞状结构M-2N-4M(p2)8反应，q2与p2以共价键形式结合，反应结束后使用缓冲液洗去未与伞状结构M-2N-4M(p2)8结合的q2-N-(p1)2，所得产物为伞状结构M-2N-4M-8N(p1)16；
(5)以此类推，可以进行N轮反应。根据实验需求选择适当反应轮数，制备不同大小的伞状聚合物，不同大小的伞状聚合物含有不同数量的点击化学接口。
(6)利用伞状聚合物上含有的点击化学接口连接含有对应接口的荧光分子基团、化学发光基团、酶等，制备出可控大小的伞状多聚显色物。
实施例3、荧光分子与伞状多聚物反应制备伞状多聚显色物
一、实验材料：
1.Ni NTA Beads 6FF天地人和，货号SA00501L
2.蛋白A(pA)，C末端含有His标签：自制。
pA表达纯化操作如下：
1)构建表达质粒pET30a-pA
将NCBI Reference Sequence:NC_016941.1序列的第382bp-1137bp所示的蛋白A的编码核酸构建到载体pET30a(+)质粒的XhoI和NdelI之间，得到的重组质粒，蛋白A的编码核酸与载体的his标签融合表达。
2)诱导表达pA蛋白
将上述表达质粒pET30a-pA转化到BL21(DE3)感受态中，在Kan+抗性的固体LB培养基培养16小时，得到pA细菌。挑取pA细菌一单克隆菌落于LB培养基(Kan+抗性)培养至细菌OD 0.6左右，加入IPTG 30℃诱导表达4小时，收集菌体超声裂解，收集诱导后裂解上清。
将诱导前菌体，诱导后裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果显示，pA蛋白以可溶形式表达，大小为30KD，与预期大小相同。
扩大培养pA细菌，IPTG 30℃诱导表达4小时，收集菌体超声裂解，收集诱导后裂解上清，将裂解上清过Ni柱纯化，最终SDS-PAGE检测PA蛋白纯度大于90％。
3.多肽1：GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC，江苏申琅合成
4.多肽2(多肽1修饰DBCO)：
GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLK-(DBCO)，江苏申琅合成
5.Methyltetrazine-PEG4-NHS Ester click chemistry tools货号：1069-100
6.DBCO-PEG4-Maleimide click chemistry tools货号：A108P-100
7.Azido-PEG4-NHS Ester click chemistry tools货号：AZ103-100
8.TCO-PEG3-Maleimide click chemistry tools货号：1002-100
9.DBCO-PEG5-NHS Ester click chemistry tools货号：A102P-100
10.二甲基亚砜 Merck 货号：D8418-50ML
11.DyLightTM 650NHS酯 Thermo ScientificTM货号:62265
12.MagneStarMP3-COOH磁珠苏州纳微货号MPHCC-30013.EDC:Merck货号：69075-47-4
14.Human IgG2 fitzgerald货号：31R-1086
15.Human IgM fitzgerald货号：31C-CH0913
16. Anti-Human IgG2 抗体 Absea 货号：K06088M12D06C
17. Anti-Human IgM 抗体 Absea 货号：K00001M04A06C
18.酪蛋白钠：Merck C8654-500G
19.500mM咪唑Ni NTABeads 6FF珠洗脱液：10mM Tris,50mM NaH2PO4·2H2O,0.3MNaCl,0.5M咪唑,pH8.0
二、实验步骤：
(一)制作分子元件M和N
1.制作分子元件M：DBCO-肽-(Methyltetrazine)2
(1)配置交联剂：将DBCO-PEG4-Maleimide和Methyltetrazine-PEG4-NHS Ester交联剂使用DMSO溶解，均配置为100mM反应液。
(2)配置多肽：取2mg多肽1，先使用20μl DMSO溶液溶解多肽粉末，粉末溶解后，再使用180μl PBS稀释，配置为10mg/ml多肽溶液。
(3)多肽与交联剂反应制备分子元件M
取配置好的10mg/ml多肽200μl，加入725μl PBS，吹打混匀。取25μl配置好的浓度为100mM DBCO-PEG4-Maleimide和50μl配置好的浓度为100mM的Methyltetrazine-PEG4-NHS Ester混匀，加入稀释后的多肽中，混匀室温反应1h。反应结束后，交联好的多肽对PBS透析过夜。
2.制作分子元件N：TCO-肽-(Azide)2
(1)配置交联剂：将TCO-PEG3-Maleimide和Azido-PEG4-NHS Ester交联剂使用DMSO溶解，配置为100mM反应液。
(2)配置多肽：取2mg多肽1，先使用20μl DMSO溶液溶解多肽粉末，粉末溶解后，再使用180μl PBS稀释，配置为10mg/ml多肽溶液。
(3)多肽与交联剂反应制备分子元件N
取配置好的10mg/ml多肽200μl，加入725μl PBS，吹打混匀。取25μl配置好的浓度为100mM TCO-PEG3-Maleimid和50μl配置好的浓度为100mM的Azido-PEG4-NHS Ester混匀，加入稀释后的多肽中，混匀室温反应1h。反应结束后，交联好的多肽对PBS透析过夜。
(二)制备伞状多聚物以及伞状多聚荧光显色物
1.制作固相基质：
(1)配置交联剂：将Azido-PEG4-NHS Ester交联剂使用DMSO溶解，配置为100mM反应液。
(2)pA蛋白交联Azido-PEG4-NHS Ester：取1mg pA蛋白，稀释于PBS中。取16.7μl浓度为100mM Azido-PEG4-NHS Ester加入pA蛋白溶液中，反应体系的蛋白终浓度为1mg/ml。室温反应1h。反应结束后，交联好的pA-(Azide)n蛋白对PBS透析过夜。
(3)制作固相基质：取100μl Ni NTA Beads 6FF珠子，使用PBS清洗3次后，加入500μg透析后的pA-(Azide)n蛋白，4℃反应过夜。反应结束后使用PBS清洗珠子6次，取5μl清洗后珠子跑胶检测交联效果。(结果见图2)
2.固定分子元件M DBCO-肽-(Methyltetrazine)
取50μl交联pA-(Azide)n蛋白的Ni NTA Beads 6FF珠子，加入1ml制备好的分子元件M，DBCO-肽-(Methyltetrazine)2，室温反应过夜。反应结束后使用PBS清洗珠子6次，取5μl清洗后珠子跑胶检测交联效果。(结果见图2)
3.第一轮反应：
取40μl已固定分子元件M DBCO-肽-(Methyltetrazine)2的Ni NTA Beads 6FF珠子，加入1ml制备好的分子元件N,TCO-肽-(Azide)2，室温反应过夜。反应结束后使用PBS清洗珠子6次，取5μl清洗后珠子跑胶检测交联效果。(结果见图2)
4.第二轮反应
(1)配置多肽：取5mg多肽2，先使用100μl DMSO溶液溶解多肽粉末，粉末溶解后，再使用900μl去离子水稀释，配置为5mg/ml多肽溶液。溶液对PBS透析过夜。
(2)取30μl第一轮反应结束后的Ni NTA Beads 6FF珠子，加入1ml透析后的多肽2，室温反应过夜。反应结束后使用PBS清洗珠子6次，取5μl清洗后珠子跑胶检测交联效果。(结果见图2)
5.制备dylight650多聚物
(1)将DyLightTM 650NHS酯粉末使用DMSO溶解为浓度10mM的溶液。
(2)将Azido-PEG4-NHS Ester使用DMSO溶解为浓度10mM的溶液。
(3)取25μl第二轮反应结束后的Ni NTA Beads 6FF珠子，加入PBS终体积到500μl。取1μl 10mM Azido-PEG4-NHS Ester与10μl10mM NHS-dylight650溶液混合，而后加入500μl体系珠子中，室温反应1h。反应结束后使用PBS清洗珠子6次。
(4)使用100μl 500mM咪唑Ni NTA Beads 6FF珠洗脱液将dylight650多聚物从珠子上洗脱下来，得到含Azide接口的dylight650伞状多聚物溶液。跑胶检测交联效果。
6.dylight650伞状多聚物连接抗体
(1)制备DBCO-PEG5-NHS Ester溶液：将DBCO-PEG5-NHS Ester粉末使用DMSO溶解为浓度100mM的溶液。
(2)取抗Human IgG2抗体和抗Human IgM抗体各1mg稀释到PBS中，分别制备浓度为1mg/ml的抗体溶液。
(3)抗体与DBCO-PEG5-NHS Ester交联形成DBCO-抗体复合物：取6μl浓度100mMDBCO-PEG5-NHS Ester加入1mg抗体(抗Human IgG2抗体或抗Human IgM抗体)中，室温反应1h。反应结束后对PBS透析过夜。得到DBCO-抗体溶液。
(4)取50μl洗脱后的dylight650伞状多聚物溶液与30μg抗体-DBCO溶液反应室温过夜，跑胶检测抗体-dylight650伞状多聚物。(结果见图2)
由上述图2结果可知，固相基质蛋白与元件M和元件N反应逐轮反应并形成多聚物，分子量随反应轮数逐渐变大。
(三)使用抗体-dylight650伞状多聚物检测交联在磁珠上的抗原
1.待检测抗原与磁珠交联
(1)取150μl MagneStar MP3-COOH磁珠，用1.5ml 20mM MES(吗啉乙磺酸)pH6.0缓冲液洗3次，弃上清。再加入1.5ml 20mM MES pH6.0缓冲液，按0.5ml每管进行分装，共分装成3管。
(2)称取EDC粉末溶于20mM MES pH6.0缓冲液中，配置1mg/ml EDC溶液。向每管0.5ml磁珠中加入8μl EDC溶液，震荡反应10min。
(3)向2管磁珠反应液中分别加入40μg Human IgM和40μgHuman IgG2，另1管对照组不加入待交联物作为对照。室温震荡反应2h。
(4)反应结束后，向每管中加入5％酪蛋白钠50μl封闭，4℃封闭过夜。
(5)使用PBS洗磁珠6次，每次加入1ml PBS洗涤。
(6)向每管磁珠中加入0.5ml PBS，备用。
2.流式检测：使用制备的抗体-dylight650伞状多聚物检测磁珠交联的抗原
(1)抗体稀释：使用PBS稀释常规标记法标记的抗体-dylight650，抗体浓度1ug/ml。将制备好的抗体-多聚物dylight650使用PBS按照1:100稀释。
(2)取2管交联Human IgM的磁珠各10μl，分别与稀释后常规法标记dylight650-抗Human IgM抗体和稀释后伞状多聚物标记dylight650-抗Human IgM抗体混合，室温反应1h。取2管交联Human IgG2的磁珠各10μl，分别与稀释后常规法标记dylight650-抗Human IgG2抗体和稀释后伞状多聚物标记dylight650-抗Human IgG2抗体混合，室温反应1h。
(3)反应结束后使用PBST清洗磁珠6次，再使用PBS清洗3次。
(4)使用流式细胞仪检测抗原抗体反应后磁珠的荧光强度，对比常规法标记抗体dylight650(具体标记方法来自DyLightTM 650NHS酯Thermo ScientificTM货号:62265说明书User Guide:DyLight Amine-Reactive Dyes)和多聚物法标记dylight650在检测抗原时的荧光强度差异。(结果见图3、图4、图5、图6、图7)
由上述图3-7可知，使用流式检测，对比常规标记法标记dylight650的抗体和伞状多聚物法标记dylight650的抗体荧光强度。实验结果显示使用伞状多聚物法标记dylight650的抗体荧光强度高于常规法标记dylight650的抗体。
以上所述仅为本发明的主要的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种能发生正交点击化学反应的分子元件组合物，包括分子元件M和分子元件N；
所述分子元件M是在基础物质m上连接了互不干扰的点击化学基团p2，q1，其中，一种基团数目为1，即单价，则另一种基团数目大于1，即多价；
所述分子元件N是在基础物质n上连接了互不干扰的点击化学基团p1，q2，其中，一种基团数目为1，即单价，则另一种基团数目大于1，即多价；
所述分子元件M的单价端与所述分子元件N的多价端形成一组正交点击化学反应，而所述分子元件M的多价端与所述分子元件N的单价端形成另一组正交的点击化学反应；
所述点击化学反应，其中一组反应的功能团为p1，q1，另一组反应的功能团为p2,q2；
其中，所述p1，q1通过混合即通过点击化学反应生成共价键；所述p2，q2通过混合即通过点击化学反应生成共价键；
且所述(p1,p2)、(p1,q2)、(p2,q1)、(q2,q2)两两之间均不会相互发生反应，即上述两组点击化学反应有正交性；
所述基础物质m和基础物质n为多肽；所述多肽的序列为GGGSYPYDVPDYAGKPIPNPLLGLDSTEQKLISEEDLC；
两对正交的点击化学反应为p1,q1反应以及p2, q2反应；
所述p1是 azide-叠氮基，q1是 DBCO-二苯并环辛炔基；
或，所述p1是azide-叠氮基，q1是BCN-双环[6.1.0]壬炔；
或，所述p1是azide-叠氮基，q1是propargyl -炔丙基；
或，所述p2是 Tetrazine-四嗪基，q2是TCO-反式环辛烯基。
2.一种通过级联的多聚伞状反应制备伞状多聚物的方法，包括下述步骤：
1）在固相基质上可逆固定权利要求1所述的分子元件M；
2）在第1轮的反应下，用过量的权利要求1所述的分子元件N与固定的分子元件M孵育，在点击化学(p2,q2)的作用下，生成M-2N的结构，洗去过量的N；
3）在第2轮的反应下，用过量的分子元件M与固定的M-2N孵育，在点击化学(p1,q1)的作用下，生成M-2N-4M的伞状结构，洗去过量的M；
4）在第3轮的反应下，用过量的分子元件N与固定的M-2N-4M孵育，在点击化学(p2,q2)的作用下，生成M-2N-4M-8N的伞状结构，洗去过量的N；
5）以此类推，根据反应的轮次，生成可控大小的伞状多聚物；
所述固相基质为含p1的His标签蛋白与Ni珠交联的产物；所述Ni珠为Ni NTA Beads6FF珠子。
3.一种伞状多聚显色物的合成方法，包括下述步骤：
1）按照权利要求2所述的方法合成伞状多聚物；
2）使显色基团带上与所述伞状多聚物最外周残留的点击化学基团能发生点击化学反应的点击化学基团与所述伞状多聚物进行孵育，得到伞状多聚显色物。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述显色基团包括荧光基团，化学发光分子或酶。
5.权利要求3或4所述方法合成得到的伞状多聚显色物。
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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