CN117362447B - 一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法。所述蛋白质偶联聚合体为通过将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得的免疫聚合体蛋白。使用该免疫聚合体蛋白进行生物发光酶联免疫分析检测，可提高检测荧光强度、降低底物使用浓度并实现通用、可自由组合的多重偶联，从而更好地满足生物分析领域的需求。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法。
背景技术
酶联免疫分析技术(ELISA)是一种常用于生物分析领域的方法，其原理是利用酶标记的抗体与目标分析物特异性结合，通过酶的催化反应产生可定量测量的信号。这种方法具有高度的灵敏度和特异性，广泛应用于临床诊断、药物研发和环境监测等领域。常用的酶标记包括辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AP)等。
传统的酶联免疫分析技术需要使用单克隆抗体进行一抗、二抗等多步免疫反应，且标记的酶难以通过廉价的大肠杆菌表达系统获得。基于纳米荧光素酶(Nano-Luciferase，Nluc)和纳米抗体(nanobody，NB)的生物发光酶联免疫分析技术解决了一部分传统酶联免疫分析方法的缺陷。纳米抗体是传统单克隆抗体的VHH区域，其分子量大概为14Kda，具有易表达、稳定性强等优点。纳米荧光素酶是一种新型的生物发光酶，其特点之一是其小尺寸(约19KDa)，这使得它能够轻松地在表达纯化。此外，纳米荧光素酶还具有极高的光稳定性和长寿命，这使得它成为应用于生物发光研究和生物成像的理想工具。生物发光酶联免疫分析技术使用纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白进行检测，与传统的酶标记技术相比，纳米抗体-纳米荧光素酶融合蛋白可以通过大肠杆菌表达系统大规模表达纯化，避免了多步免疫反应，具有更高的灵敏度和稳定性。生物发光酶联免疫分析技术已广泛应用于生物学研究、药物筛选和环境监测等领域。
尽管生物发光酶联免疫分析技术在分析灵敏度和特异性方面相对于传统的酶联免疫分析技术有明显优势，但仍存在一些缺陷。其中包括：(1)催化底物价格高：纳米荧光素酶需要使用非天然化合物作为底物，例如coelenterazine-H、furimazin，这些化合物的价格昂贵；(2)多重标记困难：目前的方法往往仅能将单一纳米抗体和纳米荧光素酶融合蛋白应用于检测，限制了多重标记和多参数分析的实现。
发明内容
针对现有缺陷，我们发明了一种基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法，为实现本技术发明，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种免疫聚合体蛋白，其是将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得。
优选地，所述支架蛋白mi3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1第109-313位所示，所述荧光素酶为纳米荧光素酶，所述纳米抗体为真菌毒素纳米抗体。
优选地，所述真菌毒素纳米抗体为抗AFB1特异性纳米抗体或/和抗OTA特异性纳米抗体。
本发明的第二个目的是提供上述的免疫聚合体蛋白的制备方法，其包括如下步骤：构建、表达并纯化mi3的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；依次加入纯化后的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；充分结合后分离获取已偶联的组分。
优选地，所述聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白的体积摩尔浓度比为10:1-2:9-10；所述充分结合为4℃下结合12h；所述分离为通过凝胶过滤层析。
优选地，所述的纳米抗体-连接多肽融合蛋白为抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或/和抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB28-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述的荧光素酶-连接多肽融合蛋白为纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的聚合体-接头蛋白融合蛋白为SpyCatcher-mi3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供一种生物发光酶联免疫试剂盒，其包括上述的免疫聚合体蛋白。
本发明的第四个目的是提供一种生物发光酶联免疫分析方法，为使用上述的免疫聚合体蛋白或上述的试剂盒进行检测。
本发明的第五个目的是提供上述的免疫聚合体蛋白、上述的试剂盒或上述的方法在检测真菌毒素中的应用。
优选地，所述真菌毒素为AFB1和/或OTA。
本发明的优点：
本发明降低了Nluc底物的使用浓度，并成功地将抗AFB1特异性纳米抗体和抗OTA特异性纳米抗体与纳米荧光素酶融合，实现了多重标记。通过本发明提供的方法，可以将生物发光与酶联免疫结合，提高检测荧光强度、降低底物使用浓度并实现通用、可自由组合的多重偶联，从而更好地满足生物分析领域的需求。
附图说明
图1是基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析原理图。
图2是不同浓度下多种免疫聚合体蛋白的生物发光强度检测。
图3是基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析技术的建立及其与传统方法的比较(免疫聚合体蛋白与纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白浓度相同)。
图4是基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析技术的建立(免疫聚合体蛋白中抗体浓度为纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白的三分之一)。
图5是基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法中不同荧光素酶底物浓度的比较。
图6是基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法中多种抗体的同时偶联及其在单一毒素和多种毒素同时检测中的应用。
具体实施方式
为实现本技术发明，本发明采用如下技术方案：
根据蛋白序列设计DNA序列，交由基因合成公司进行合成。通过基因工程的方法生成聚合体-接头蛋白融合蛋白(SpyCatcher-mi3)、纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白(Nluc-SpyTag)、抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白(NB26-SpyTag)、抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白(NB28-SpyTag)。基于上述蛋白，建立蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法(图1)。该方法可应用于常见真菌毒素中黄曲霉毒素(AFB1)和赭曲霉毒素(OTA)的检测。同时通过基因工程的方法生成纳米荧光素酶-纳米抗体(Nluc-NB26,氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；Nluc-NB28，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)融合蛋白，基于融合蛋白建立传统的生物发光酶联免疫分析方法，并用于与基于蛋白质偶联聚合体方法的定量比较。
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：表达载体的构建
上述目的片段的DNA序列如下：
SpyCatcher-mi3如SEQ ID NO.5所示，Nluc-SpyTag如SEQ ID NO.6所示，NB26-SpyTag
如SEQ ID NO.7所示，NB28-SpyTag如SEQ ID NO.8所示，Nluc-NB26如SEQ IDNO.11所示，Nluc-NB28如SEQ ID NO.12所示。
上述序列均由商业公司(苏州硅基生物科技有限公司)合成，并使用BamH1和Ecor1酶切位点将基因插入Pet.M.3C载体(苏州硅基生物科技有限公司，货号Pet.M.3C：G080-2)，以获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含100μg/mL氨苄霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养16小时，得到生长均匀的单菌落。挑取单克隆分别在50mL培养基进行37℃过夜培养，采用Pet.M.3C载体通用引物T7和T7-ter对单克隆进行菌落PCR验证，得到阳性克隆后提取质粒，进行测序验证。经测序验证后的重组质粒用于后续实验。
实施例2：目的蛋白质表达
S1.将实施例1测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21感受态细胞。取1μL重组质粒加入感受态细胞，冰浴30分钟左右，然后于42℃热激90秒，再冰浴5分钟。
S2.加入200μL相应质粒至amp(100μg/mL)抗性的LB培养基，220rpm、37℃培养一小时左右，将菌液涂于amp抗性的LB培养基平板，37℃恒温培养箱过夜培养。
S3.挑取抗性平板上状态较好的单菌落接种于5mL含amp(100μg/mL)抗性的LB培养基中，220rpm、37℃过夜培养。将培养后的全部菌液转接到1L含amp抗性的LB培养基中，220rpm、37℃培养至OD约为0.6-0.8。4-8℃静置一段时间将培养基冷却至16℃，加入IPTG诱导蛋白表达(LB培养基IPTG终浓度约0.3mM)，220rpm、16℃诱导表达18小时。
实施例3：目的蛋白质纯化
S1.诱导后的菌液，4000rpm离心15min，弃上清，菌体用25-30mLbinding缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM Imidazole,pH 7.9)重悬。
S2.在重悬后的菌液中加入通用型蛋白酶抑制剂150μLPMSF(100mM溶于异丙醇)，超声波20KHz,130W，超声5s停5s破碎菌体，共15分钟。
S3.4℃，15000rpm离心破碎菌体30分钟，将离心后的上清和沉淀分别跑胶来确定蛋白是否可溶。
S4.将S3得到的上清倒入置于4℃的Ni亲和柱中，充分搅拌混合均匀后，每隔10分钟再搅拌混匀使蛋白与亲和柱充分结合，总结合时间约半个小时。
S5.结合一段时间后流下上清液，用binding缓冲液冲洗亲和柱2次
S6.用5-10mL elution缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,1M Imidazole,pH7.9)洗脱10分钟并收集洗脱液。
S7.通过凝胶过滤层析(AKTA蛋白纯化仪，HiLoad 16/600Superdex 200pg层析柱)进一步纯化蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况。
实施例4：聚合体蛋白SpyCatcher-mi3与纳米荧光素酶、单一纳米抗体偶联
通过以上方式纯化得到聚合体蛋白SpyCatcher-mi3(即聚合体-接头蛋白融合蛋白SpyCat cher-mi3)、OTA的纳米抗体NB28-SpyTag(即抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白N B28-SpyTag)、AFB1的纳米抗体NB26-SpyTag(即抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag)、荧光素酶Nluc-SpyTag(即纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-Spy Tag)后，以聚合体蛋白SpyCatcher-mi3为支架，加入浓度100μM的聚合体蛋白SpyCatcher-mi3，按照10:1的比例加入10μM浓度的纳米抗体NB28-SpyTag或者NB26-SpyTag，在4℃下结合12h，使其充分结合后。再加入100μM浓度的荧光素酶Nluc-SpyTag，在4℃条件下结合12h，使其完成聚合体蛋白SpyCatcher-mi3与纳米抗体、荧光素酶的偶联。随后通过凝胶过滤层析(AKTA蛋白纯化仪，Superdex 75Increase 10/300GL层析柱)进一步分离未偶联上的组分。取偶联的聚合体蛋白组分放入100KDa的超滤管离心，浓缩，得到最终的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)或(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:Nluc-SpyTag)。
实施例5：聚合体蛋白SpyCatcher-mi3与纳米荧光素酶、两种纳米抗体同时偶联
通过以上方式纯化得到聚合体蛋白SpyCatcher-mi3、OTA的纳米抗体NB28-SpyTag、AF B1的纳米抗体NB26-SpyTag、荧光素酶Nluc-SpyTag后，以聚合体蛋白SpyCatcher-mi3为支架，加入浓度100μM的聚合体蛋白SpyCatcher-mi3，按照10:1的比例依次加入10μM浓度的NB28-SpyTag和NB26-SpyTag，在4℃下结合12h，使其充分结合后。再加入90μM浓度的Nluc-SpyTag，在4℃条件下结合12h，使其完成聚合体蛋白SpyCatcher-mi3与纳米抗体、荧光素酶的偶联。随后通过凝胶过滤层析(AKTA蛋白纯化仪，Superdex 75Increase10/300GL层析柱)进一步分离未偶联上的组分。取偶联的聚合体蛋白组分放入100KDa的超滤管离心，浓缩，得到最终的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)。
实施例6：BCA定量以及酶活性的测定
使用上海雅酶生物医药科技有限公司(Omni-Easy,ZJ102)BCA蛋白定量试剂盒测定偶联后的免疫聚合体蛋白浓度。随后取高结合白色96孔板，在孔板上由低到高依次加入10μL包含不同浓度Nluc(1nM、10nM、100nM、1μM浓度)的实施例4和5制备的免疫聚合体蛋白，随后每孔加入100μL配置好的显色液，放入酶标仪，检测生物发光信号总强度。测定结果表明由低到高浓度的免疫聚合体蛋白荧光值具有相对应的趋势(图2)，因此判定实施例4和5制备的免疫聚合体蛋白具有良好的酶活性。
测试酶活性所需显色液及底物的制备：
S1.缓冲液配置：
S2.coelengterazine-H底物配置：250μg的coelengterazine-H用613μL的溶剂(85％甲醇，15％甘油)溶解成终浓度1mM的母液。
S3.100μL显色液配置
实施例7：基于单一抗体偶联的免疫聚合体蛋白检测AFB1的生物发光酶联免疫分析方法
使用实施例4的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]单独检测AFB1：用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的AFB1-BSA抗原溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％(质量比，下同)脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次，每孔加入50μL毒素AFB1标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(0.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液(如实施例6)，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度AFB1标准品的变化曲线。
实施例8：基于单一抗体偶联的免疫聚合体蛋白检测OTA的生物发光酶联免疫分析方法
使用实施例4的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]单独检测OTA：用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的OTA-BSA抗原溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素OTA标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(0.5ug/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液(如实施例6，下同)，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度OTA标准品的变化曲线。
实施例9：基于单一抗体偶联的免疫聚合体蛋白检测OTA的生物发光酶联免疫分析方法-降低Nluc底物浓度
使用实施例4的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]单独检测OTA：用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的OTA-BSA抗原溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素OTA标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(2.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液或稀释5倍、稀释10倍浓度的显色液，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度OTA标准品的变化曲线。
结果(图5)表明在降低5倍和10倍底物浓度时，基于单一抗体偶联的免疫聚合体蛋白检测OTA的生物发光酶联免疫分析的检测信号强度相比于未稀释底物降低了2.3倍和6.9倍左右，但其发光强度仍然很强，数量级为107和106，强于或相似于传统方法使用未稀释底物，其检测的半抑制浓度IC50值分别为0.512和0.723ng/mL。相比于传统方法使用未稀释底物，基于单一抗体偶联的免疫聚合体蛋白在使用稀释5倍底物的条件下，荧光强度是其3.8倍，IC50值是其1.2倍，表明在保持比传统方法更高荧光强度、相近灵敏度且满足食品安全检测要求的前提下，基于蛋白偶联聚合体的检测方法可以降低底物使用浓度至少5倍.
实施例10：基于多抗体偶联的免疫聚合体蛋白分别或同时检测OTA、AFB1的间接酶联免疫分析法
S1.使用实施例5的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:1:9(100μM:10μM:10μM:90μM)]单独检测OTA：用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的OTA-BSA抗原溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素OTA标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(0.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度OTA标准品的变化曲线。
S2.使用实施例5的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:1:9(100μM:10μM:10μM:90μM)]单独检测AFB1：用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的AFB1-BSA抗原溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素AFB1标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(0.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度AFB1标准品的变化曲线。
S3.使用实施例5的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:1:9(100μM:10μM:10μM:90μM)]同时检测OTA和AFB1：用P BS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL的混合OTA-BSA、AFB1-BSA两种抗原的溶液，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL等质量比的AFB和OTA标准品(0、0.05、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5或12.5ng/mL)，随后加入50μL的免疫聚合体蛋白(0.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度等质量比的AFB和OTA标准品的变化曲线。
结果如图6所示，基于多抗体偶联的免疫聚合体蛋白检测AFB1的半抑制浓度IC50值为0.263ng/mL，检测曲线的拟合R2值为0.990；检测OTA的半抑制浓度IC50值为0.135ng/mL，检测曲线的拟合R2值为0.990；同时检测等质量比的AFB1和OTA的半抑制浓度IC50值为1.129ng/mL，检测曲线的拟合R2值为0.992；均表现出很好的灵敏度及稳定性，满足食品安全检测要求。更为重要的是，基于多抗体偶联的免疫聚合体蛋白实现了一套试剂对A FB1和OTA的高灵敏定量检测及同时检测，能够显著降低对AFB1和OTA大规模筛查的人力、时间和经济成本。
实施例11：基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法与传统方法对比
传统的生物发光酶联免疫分析方法使用纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白作为生物发光检测信号来源，进行检测。分别使用免疫聚合体蛋白与纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白在整体浓度蛋白相同和按比例计算得到的免疫聚合体蛋白中抗体浓度为传统方法中纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白三分之一的条件下，进行两种方法的对比实验。即：
(一)用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL抗原的溶液(AFB1-BSA或者OTA-BSA)，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素AFB1或OTA标准品(0、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10或25ng/mL)，随后加入50μL的相同浓度的免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]、免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]、纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白N luc-NB28或纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白Nluc-NB26(均为0.5μg/mL)，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，分别使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度的AFB或OTA标准品的变化曲线。
(二)用PBS缓冲液(PH＝7.4)配置抗原浓度5μg/mL抗原的溶液(AFB1-BSA或OT A-BSA)，加入96进口白色高结合孔板(100μL/孔)，4℃过夜；次日，甩干孔板，PBST洗三次，加入3％脱脂奶粉(300μL/孔)，37℃恒温箱反应1h；PBST洗五次,每孔加入50μL毒素AFB1或OTA标准品，随后加入50μL的2.5μg/mL的免疫聚合体蛋白(SpyCatche r-mi3:NB26-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]或免疫聚合体蛋白(SpyCatcher-mi3:NB28-SpyTag:Nluc-SpyTag)[浓度比为10:1:10(100μM:10μM:100μM)]，37℃反应30min后，PBST洗孔板五次，每孔加入100μL显色液，分别使用酶标仪检测生物发光信号总强度随不同浓度的AFB1或OTA标准品的变化曲线。
结果(如图3、图4所示)表明，(一，见图3)在相同蛋白浓度下，免疫聚合体蛋白中抗体摩尔浓度约1nM、Nluc摩尔浓度8.5nM，纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白中抗体及Nluc的浓度为15nM，基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法与传统方法得到的生物发光强度在相同数量级106，基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法检测AFB1和OTA的IC50值分别为0.350和0.276ng/mL，传统方法检测AFB1和OTA的IC50值分别为2.208和0.412ng/mL，检测灵敏度分别提高了7.3和1.5倍。(二，见图4)在免疫聚合体蛋白中抗体浓度为传统方法中纳米荧光素酶-纳米抗体融合蛋白三分之一的条件下，免疫聚合体蛋白中抗体摩尔浓度约5nM、Nluc摩尔浓度42nM，基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法的生物发光强度在数量级107数量级，相比于传统方法，在抗体摩尔浓度为其三分之一，Nluc摩尔浓度为其2.8倍的情况下，检测AFB1和OTA的发光强度分别升高了9.7倍和8.8倍，基于免疫聚合体蛋白的生物发光酶联免疫分析方法检测AFB1和OTA的IC50值分别为0.475和0.559ng/mL，检测灵敏度分别提高了4.6和降低了1.4倍。总的来说，相比于传统方法，基于蛋白质偶联聚合体的生物发光酶联免疫分析方法在保持发光强度相似的条件下明显提高了对AFB1和OTA检测的灵敏度；在使用发光强度大幅度升高的条件下，AFB1的检测灵敏度仍然明显升高，OTA的检测灵敏度略有下降；显示出蛋白质偶联聚合体明显增强了生物发光酶联免疫分析的检测性能。
SEQ ID NO.1(聚合体-接头蛋白融合蛋白SpyCatcher-mi3氨基酸序列)
MGSSDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGGSGGSGGSGGSMKMEELFKKHKIVAVLRANSVEEAKKKALAVFLGGVHLIEITFTVPDADTVIKELSFLKEMGAIIGAGTVTSVEQARKAVESGAEFIVSPHLDEEISQFAKEKGVFYMPGVMTPTELVKAMKLGHTILKLFPGEVVGPQFVKAMKGPFPNVKFVPTGGVNLDNVCEWFKAGVLAVGVGSALVKGTPVEVAEKAKAFVEKIRGCTESEQ ID NO.2(纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-SpyTag氨基酸序列)
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGSGGSAHIVMVDAYKPTK SEQ ID NO.3(抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag氨基酸序列)
MQLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAVVNWSGRRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYNCAAGKWDGSYYGAPDYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQDGQAGGGSGGSAHIVMVDAYKPTKSEQ ID NO.4(抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB28-SpyTag氨基酸序列)
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTVGVNAMDMGWYRQAPGKQRELVAAIINGGGSTNLADSVKGRFTISRDGAKRTLYLQMNSLKPEDTAVYYCYVRSGVGLVYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQGGSGGSAHIVMVDAYKPTKSEQ ID NO.5(聚合体-接头蛋白融合蛋白SpyCatcher-mi3核苷酸序列)
ATGGGTAGCTCTGACAGCGCAACTCACATCAAATTCTCCAAACGTGACGAAGATGGTAAAGAACTGGCCGGTGCGACTATGGAACTGCGTGATTCCTCTGGCAAAACTATCTCCACGTGGATTTCTGATGGCCAAGTTAAGGATTTCTACCTGTACCCGGGCAAATACACCTTCGTTGAAACTGCGGCTCCGGACGGTTACGAGGTAGCTACTGCTATTACCTTCACCGTCAACGAACAAGGTCAGGTGACCGTTAACGGTAAAGCGACCAAAGGTGACGCACACATCGGTGGCTCTGGTGGTAGCGGTGGTTCTGGTGGTTCTATGAAGATGGAAGAACTGTTCAAAAAACATAAAATCGTGGCGGTTCTGCGTGCAAACAGCGTCGAAGAAGCGAAAAAAAAAGCTCTGGCAGTATTCCTGGGTGGTGTCCATCTGATCGAAATCACCTTCACCGTCCCTGACGCAGACACTGTTATCAAGGAACTGAGCTTCCTGAAAGAAATGGGTGCTATTATCGGTGCCGGCACCGTTACCTCTGTCGAACAGGCACGTAAAGCTGTGGAGAGCGGCGCGGAGTTTATCGTTTCTCCGCATCTGGATGAAGAGATCAGCCAGTTCGCAAAAGAGAAAGGCGTTTTCTACA TGCCGGGCGTCATGACCCCGACGGAACTGGTTAAGGCCATGAAACTGGGTCACACCATCCTGAAACTGTTCCCGGGTGAAGTTGTAGGCCCGCAGTTCGTGAAAGCCATGAAGGGTCCGTTCCCAAACGTCAAGTTTGTGCCGACCGGCGGCGTTAACCTGGACAACGTATGCGAATGGTTTAAAGCTGGCGTGCTGGCTGTAGGTGTGGGTTCTGCACTGGTAAAGGGCACTCCGGTGGAAGTTGCAGAAAAAGCTAAAGCTTTTGTGGAAAAAATCCGTGGCTGCACTGAASEQ ID NO.6(纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-SpyTag核苷酸序列)
ATGGTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGCTCATATCGTAATGGTTGATGCGTACAAACCGACCAAASEQ ID NO.7(抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag核苷酸序列)
ATGCAGCTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAAGCTGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCATCCGGTCGTACTTTCTCTTCTTACGCGATGGGCTGGTTCCGTCAGGCTCCTGGTAAAGAACGTGAATTTGTTGCGGTGGTTAACTGGAGCGGTCGTCGTA CCTACTACGCAGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCTCGTGATAACGCAAAAAATACCGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCCGTTTACAACTGCGCTGCTGGCAAATGGGATGGTAGCTACTACGGCGCACCAGATTATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTTACCGTCTCCTCTGAACCTAAAACCCCGAAACCTCAGGACGGTCAGGCAGGTGGTGGTTCTGGCGGCTCCGCTCATATCGTAATGGTTGATGCGTACAAACCGACCAAASEQ ID NO.8(抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB28-SpyTag核苷酸序列)
CAACTGCAACTGGTAGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGTAGCACTGTGGGTGTTAACGCAATGGACATGGGTTGGTACCGTCAGGCACCGGGCAAACAGCGTGAACTGGTAGCCGCAATCATCAACGGCGGCGGTTCCACCAATCTGGCGGATTCCGTAAAAGGTCGCTTCACCATCAGCCGTGATGGTGCTAAGCGCACCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAGCCGGAAGATACCGCCGTTTACTATTGCTATGTCCGTTCCGGTGTTGGCCTGGTATACTGGGGTCAGGGCACCCAGGTCACCGTTTCTTCCGAACCAAAAACTCCGAAACCGCAGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGCTCATATCGTAATGGTTGATGCGTACAAACCGACCAAASEQ ID NO.9(纳米荧光素酶-抗AFB1特异性纳米抗体Nluc-NB26氨基酸序列)
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGSGGSGGSGGSMQLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAVVNWSGRRTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYNCAAGKWDGSYYGAPDYWGQGT QVTVSSEPKTPKPQDGQAGSEQ ID NO.10(纳米荧光素酶-抗OTA特异性纳米抗体Nluc-NB28氨基酸序列)
VFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILAGGSGGSGGSGGSQLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTVGVNAMDMGWYRQAPGKQRELVAAIINGGGSTNLADSVKGRFTISRDGAKRTLYLQMNSLKPEDTAVYYCYVRSGVGLVYWGQGTQVTVSSEPKTPKPQSEQ ID NO.11(纳米荧光素酶-抗AFB1特异性纳米抗体Nluc-NB26核苷酸序列)
ATGGTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGGCGGTAGCGGTGGCTCTATGCAGCTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGTGGTCTGGTACAAGCTGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCATCCGGTCGTACTTTCTCTTCTTACGC GATGGGCTGGTTCCGTCAGGCTCCTGGTAAAGAACGTGAATTTGTTGCGGTGGTTAACTGGAGCGGTCGTCGTACCTACTACGCAGACTCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCTCGTGATAACGCAAAAAATACCGTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCCGTTTACAACTGCGCTGCTGGCAAATGGGATGGTAGCTACTACGGCGCACCAGATTATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTTACCGTCTCCTCTGAACCTAAAACCCCGAAACCTCAGGACGGTCAGGCAGGTSEQ ID NO.12(纳米荧光素酶-抗OTA特异性纳米抗体Nluc-NB28核苷酸序列)
GTGTTCACTCTGGAAGATTTCGTGGGTGATTGGCGCCAGACTGCAGGTTACAATCTGGATCAGGTTCTGGAACAGGGCGGCGTCTCCTCTCTGTTCCAAAACCTGGGCGTTTCTGTTACTCCGATCCAACGTATCGTCCTGTCTGGTGAAAACGGCCTGAAAATTGACATCCACGTGATTATTCCGTACGAAGGTCTGAGCGGTGATCAGATGGGCCAGATTGAAAAAATTTTCAAGGTTGTTTATCCGGTTGACGACCACCACTTTAAAGTTATCCTGCACTATGGTACGCTGGTTATCGACGGTGTCACCCCGAACATGATCGATTATTTTGGTCGTCCGTACGAAGGTATCGCGGTTTTCGACGGCAAAAAAATCACGGTGACCGGCACCCTGTGGAACGGTAACAAAATCATCGACGAACGTCTGATCAACCCGGACGGTTCCCTGCTGTTCCGTGTTACCATCAACGGCGTCACCGGTTGGCGTCTGTGCGAACGTATCCTGGCGGGTGGTTCTGGCGGCTCCGGCGGTAGCGGTGGCTCTCAACTGCAACTGGTAGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGTAGCACTGTGGGTGTTAACGCAATGGACATGGGTTGGTACCGTCAGGCACCGGGCAAACAGCGTGAACTGGTAGCCGCAATCATCAACGGCGGCGGTTCCACCAATCTGGCGGATTCCGTAAAAGGTCGCTTCACCATCAGCCG
TGATGGTGCTAAGCGCACCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAAGCCGGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGCTATGTCCGTTCCGGTGTTGGCCTGGTATACTGGGGTCAGGGCACCC
AGGTCACCGTTTCTTCCGAACCAAAAACTCCGAAACCGCAG
Claims (5)
1.一种免疫聚合体蛋白，其特征在于，是将支架蛋白mi3与荧光素酶和纳米抗体偶联获得，
所述支架蛋白mi3为聚合体-接头蛋白融合蛋白SpyCatcher-mi3，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，mi3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1第109-313位所示；
所述荧光素酶为纳米荧光素酶，所述纳米荧光素酶为纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述纳米抗体为真菌毒素纳米抗体，所述真菌毒素纳米抗体为抗AFB1特异性纳米抗体或/和抗OTA特异性纳米抗体；所述抗AFB1特异性纳米抗体为抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗OTA特异性纳米抗体为抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB28-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的免疫聚合体蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建、表达并纯化mi3的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；依次加入纯化后的聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白；充分结合后分离获取已偶联的组分；
所述的纳米抗体-连接多肽融合蛋白为抗AFB1特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB26-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或/和抗OTA特异性纳米抗体-连接多肽融合蛋白NB28-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的荧光素酶-连接多肽融合蛋白为纳米荧光素酶-连接多肽融合蛋白Nluc-SpyTag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的聚合体-接头蛋白融合蛋白为SpyCatcher-mi3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述聚合体-接头蛋白融合蛋白、纳米抗体-连接多肽融合蛋白和荧光素酶-连接多肽融合蛋白的体积摩尔浓度比为10:1-2:9-10；所述充分结合为4℃下结合12h；所述分离为通过凝胶过滤层析。
3.一种生物发光酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的免疫聚合体蛋白。
4.一种生物发光酶联免疫分析方法，其特征在于，使用权利要求1所述的免疫聚合体蛋白或权利要求3所述的试剂盒进行检测。
5.权利要求1所述的免疫聚合体蛋白、权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的方法在检测真菌毒素中的应用，所述真菌毒素为AFB1和/或OTA。
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