CN108796041A - 一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法 - Google Patents

一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统，该系统涉及一种能与DNA结合的能量供体蛋白质、一种能与DNA结合的能量受体蛋白质、以及由三种DNA探针所组成的核酸组装体系；上述能量供体蛋白质和能量受体蛋白质可与核酸组装体系产生的双链DNA产物进行特异性结合，从而实现了生物发光共振能量转移的信号扩增。本发明提供的信号扩增系统可应用于不同蛋白质标志物的分析，并提高了生物发光共振能量转移检测方法的灵敏度和通用性。

Description

一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测 方法
技术领域
本发明涉及一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增技术，及其在蛋白质标志物检测中的应用，属于生物医学分析领域。
背景技术
生物发光共振能量转移是一种以萤光素酶作为能量供体，以荧光分子作为能量受体的生物医学分析技术。该技术无需外源激发光，从而有效避免了传统荧光检测方法中存在的生物自荧光干扰、光漂白、光毒性等问题。此外，基于该技术的自发光特性，相应的检测设备无需配备激发光源，因此可直接通过便携式设备完成检测，具有成本低廉、简便、快速的优点。
目前，生物发光共振能量转移技术需要将能够与特定靶标物质进行作用的分子识别元件直接融合在能量供体和受体上，并最终通过上述能量供体和受体对靶标物质的共同作用产生相应的检测信号。然而，上述方法只能将供体和受体对靶标物质的识别转化为单一的检测信号，尚无法实现检测信号的扩增，因此在很多实际应用中存在检测灵敏度偏低的问题。此外，由于核酸适配体、抗体等通用型分子识别元件还无法应用于目前的生物发光共振能量转移技术，因此绝大多数疾病标志物仍然无法通过该技术进行检测与分析。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种灵敏度高、通用型好的信号扩增系统，至少包括能量供体和能量受体，所述的信号扩增系统包括：
(1)、能与DNA结合的能量供体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括锌指结构域Zif268的氨基酸序列、萤光素酶结构域的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；
(2)、能与DNA结合的能量受体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，包括绿色荧光蛋白结构域的氨基酸序列、锌指结构域AZP4的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；
(3)、核酸组装体系，由三种DNA探针所组成，分别为：DNA探针Probe1、DNA探针Probe2、生物素化的DNA探针Probe3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示；生物素化的DNA探针Probe3的核苷酸序列为：
ctggatgatgatgagatgagaatgccacgta-TEG-Biotin；
上述核酸组装体系产生的双链DNA产物具有锌指结构域Zif268和锌指结构域AZP4的特异性结合位点，能够与能量供体蛋白质及能量受体蛋白质进行特异性结合。
本发明的第二目的是提供利用上述信号扩增系统进行蛋白质标志物检测的方法，该方法实现了同一信号扩增体系在不同蛋白质标志物检测中的应用，因此具有良好的通用性。该方法通过使用核酸适配体或抗体作为分子识别元件，针对不同种蛋白质标志物进行特异性检测；
若分子识别元件为核酸适配体，检测方法为：
(1)、核酸适配体免疫磁珠的制备：通过分子交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐将巯基修饰的核酸适配体A1偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用，所述巯基修饰的核酸适配体A1的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示：agtccgtggtagggcaggttggggtgact-C6-SH；
(2)、基于核酸适配体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的核酸适配体免疫磁珠与待测样本、以及核酸适配体A2充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1和Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测；所述核酸适配体A2中融合有DNA探针Probe3序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
若分子识别元件为抗体，检测方法为：
(1)、抗体免疫磁珠的制备：通过Sulfo-SMCC将待测抗体偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用；
(2)、基于抗体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的抗体免疫磁珠与待测样本、链霉亲和素、生物素化的抗体、以及DNA探针Probe3充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1、Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测。
本发明还提供了编码上述能量供体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，包括锌指结构域Zif268的编码序列、萤光素酶结构域的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。以及编码上述能量受体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，包括绿色荧光蛋白结构域的编码序列、锌指结构域AZP4的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。
本发明进一步提供了上述能量供体蛋白质的制备方法，包括以下步骤：
(1)、能量供体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P1和P2对人工合成的萤光素酶编码片段进行PCR扩增，再通过引物P3和P4对人工合成的锌指结构域Zif268编码片段进行PCR扩增；扩增得到的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P3和P2为引物的重叠PCR扩增得到编码能量供体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.13所示；
(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；
(3)、表达：接种含有能量供体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养，取上述培养物至含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续摇床震荡培养；
(4)、纯化：上述所得培养物离心，所得细胞沉淀用细菌蛋白抽提液重悬，并加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，直至样品澄清；将上述裂解液离心，所得上清通过过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化；纯化所得的能量供体蛋白质于冰箱中透析脱盐，并通过凝胶电泳分析后，分装保存。
本发明更进一步提供了上述能量受体蛋白质的制备方法，包括以下步骤：
(1)、能量受体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P5和P6对人工合成的绿色荧光蛋白编码片段进行PCR扩增，再通过引物P7和P8对人工合成的锌指结构域AZP4编码片段进行PCR扩增；上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P5和P8为引物的重叠PCR扩增得到编码能量受体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P5、P6、P7和P8的核苷酸序列如SEQ IDNO.14～SEQ ID NO.17所示；
(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；
(3)、表达：接种含有能量受体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养，取上述培养物至含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续摇床震荡培养；
(4)、纯化：上述所得培养物离心，所得细胞沉淀用细菌蛋白抽提液重悬，并加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，直至样品澄清；将上述裂解液离心，所得上清通过过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化；纯化所得的能量受体蛋白质于冰箱中透析脱盐，并通过凝胶电泳分析后，分装保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：首次实现了生物发光共振能量转移的信号扩增，从而提高了相应方法的检测灵敏度。此外，本项目提供的技术将不同类型的分子识别元件合理应用于生物发光共振能量转移检测过程当中，从而实现了同一信号扩增体系在不同蛋白质标志物检测中的应用，因此具有良好的通用性。
附图说明
图1为本发明中能量供体蛋白质的结构示意图；
图2为本发明中能量受体蛋白质的结构示意图；
图3为本发明提供的信号生物发光共振能量转移信号扩增的原理示意图；
图4为能量供体蛋白质的纯化过程凝胶电泳分析示意图；
图5为能量受体蛋白质的纯化过程凝胶电泳分析示意图；
图6为生物发光共振能量转移信号扩增系统的光谱结果示意图；
图7为实施例3中生物发光共振能量转移信号对α-凝血酶浓度变化的线性响应关系图；
图8为实施例3中生物发光共振能量转移信号对前列腺特异性抗原浓度变化的线性响应关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1：能量供体蛋白质和能量受体蛋白质的制备
本发明中能量供体蛋白质的结构如图1所示，能量受体蛋白质的结构如图2所示，两者的制备方法如下：
(1)能量供体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P1和P2对人工合成的萤光素酶编码片段进行PCR扩增，再通过引物P3和P4对人工合成的锌指结构域Zif268编码片段进行PCR扩增。扩增得到的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P3和P2为引物的重叠PCR扩增得到编码能量供体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并保存于-20℃冰箱中待用。
(2)能量受体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P5和P6对人工合成的绿色荧光蛋白编码片段进行PCR扩增，再通过引物P7和P8对人工合成的锌指结构域AZP4编码片段进行PCR扩增。上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P5和P8为引物的重叠PCR扩增得到编码能量受体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化，并保存于-20℃冰箱中待用。
(3)酶切、连接、及转化：上述两种全长基因片段经过NdeI和SalI酶切3h后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，全长基因片段与质粒载体的摩尔比为5:1，所得混合物通过T4DNA连接酶于16℃连接6h。连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验。
(4)能量供体蛋白质和能量受体蛋白质的表达与纯化：
(4-1)接种含有能量供体蛋白质和能量受体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于5mL含卡那霉素的液体LB培养基(0.01g/mL蛋白胨，0.005g/mL酵母提取物，0.01g/mL NaCl，30μg/mL卡那霉素)中，于37℃摇床200r/min震荡培养12h，取0.5mL上述培养物至50mL含卡那霉素的液体LB培养基中，于30℃摇床150r/min震荡培养2h后加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，继续于30℃摇床150r/min震荡培养12h。
(4-2)上述所得培养物以3000g离心5min，所得细胞沉淀用6mL细菌蛋白抽提液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，2mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)，pH＝7.0)重悬，并加入60μL 100×蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，条件为：80W，超声4s，停4s，直至样品澄清。将上述裂解液于4℃，30,000g离心15min，所得上清通过0.22μM过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化。首先使用75mL的咪唑洗涤缓冲液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，40mM咪唑，pH＝7.5)淋洗柱子，再用10mL洗脱缓冲液(20mM Tris-Cl，500mM NaCl，500mM咪唑，pH＝7.5)洗脱目的蛋白质。纯化所得的能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于4℃冰箱中透析脱盐6h，并通过凝胶电泳分析后，分装保存于-80℃冰箱中待用。图4为能量供体蛋白质的纯化过程凝胶电泳分析示意图。图4中泳道M：蛋白质marker；泳道1：大肠杆菌裂解液上清；泳道2：大肠杆菌裂解液沉淀；泳道3：大肠杆菌裂解液上清过柱流出液；泳道4：洗涤缓冲液洗涤亲和层析柱后的流出液；泳道5：能量供体蛋白质洗脱、透析后的流出液。图5为能量受体蛋白质的纯化过程凝胶电泳分析示意图。图5中泳道M：蛋白质marker；泳道1：大肠杆菌裂解液上清；泳道2：大肠杆菌裂解液沉淀；泳道3：大肠杆菌裂解液上清过柱流出液；泳道4：洗涤缓冲液洗涤亲和层析柱后的流出液；泳道5：空白；泳道6：能量受体蛋白质洗脱、透析后的流出液。
实施例2：生物发光共振能量转移的信号扩增
本发明提供的信号生物发光共振能量转移信号扩增的原理如图3所示，其反应体系制备及信号检测的原理如下：
(1)反应体系的配制：将50nM probe1、50nM probe2、50nM能量供体蛋白质、250nM能量受体蛋白质，以及5nM probe3混合于100μL的ZnK缓冲液(20mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，1mM TCEP，0.1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，pH＝7.4)中，于室温下孵育30min。
(2)信号检测：向上述溶液中加入等体积的萤光素酶检测缓冲液(购自Promega公司)，通过光谱仪进行检测，检测时关闭光谱仪光源，检测波长范围为400nm至600nm，检测结果可显示强烈的生物发光共振能量转移信号，光谱检测结果如图6所示。
实施例3：α-凝血酶的检测
(1)核酸适配体免疫磁珠的制备：取5mg氨基修饰的磁珠(粒径为300nm)与50mM的Sulfo-SMCC共孵育1h，所得磁珠用磁力架进行分离，并用200μL HEPES缓冲液(10mM HEPES，5mM EDTA，pH＝7.2)洗涤3次，取1mg的Sulfo-SMCC活化磁珠与10μM核酸适配体A1在200μLHEPES缓冲液中孵育4小时后，用5％(w/v)BSA封闭过夜，并保存于4℃冰箱中待用。
(2)α-凝血酶的检测：取0.5mg/mL步骤(1)制备的核酸适配体免疫磁珠与0.1μM核酸适配体A2、以及待检测样本于室温下共同孵育30min，通过磁力架分离磁珠，并用200μLZnK缓冲液洗涤三次后，将磁珠与50nM probe1、50nM probe2、50nM能量供体蛋白质、250nM能量受体蛋白质共同孵育30min，向上述溶液中加入等体积的萤光素酶检测缓冲液，通过光谱仪进行检测，检测时关闭光谱仪光源，检测波长范围为400nm至600nm，检测结果可显示生物发光共振能量转移信号对α-凝血酶浓度变化的线性响应关系，结果如图7所示，α-凝血酶的最低检测限可达12.8pM。
实施例4：前列腺特异性抗原的检测
(1)抗体免疫磁珠的制备：向0.5mg/mL的前列腺特异性抗原抗体溶液中加入终浓度为0.5M的二硫苏糖醇(DTT)，并于室温下孵育30min。通过50kDa超滤管对还原抗体进行脱盐处理，并将所得溶液与1mg的Sulfo-SMCC活化磁珠共同孵育4h，并通过5％(w/v)BSA封闭过夜，所得抗体免疫磁珠保存于4℃冰箱中待用。Sulfo-SMCC活化磁珠的制备方法与实施例4相同。
(2)前列腺特异性抗原的检测：取0.5mg/mL抗体免疫磁珠与0.1μM probe 3、0.1μM链霉亲和素、0.1μM生物素化的抗体、以及待检测样本共同孵育30min，通过磁力架分离磁珠，后续检测方法与实施例4相同，检测结果可显示生物发光共振能量转移信号对前列腺特异性抗原浓度变化的线性响应关系，结果如图8所示，前列腺特异性抗原的最低检测限可达6.4pM。
以上描述是对本发明的解释，不是对本发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以做任何形式的修改。
序列表
<110> 中南民族大学
<120> 一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Thr Gly Glu Lys Arg Pro Tyr Ala Cys Pro Val Glu Ser Cys
1 5 10 15
Asp Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Ile Arg Ile
20 25 30
His Thr Gly Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe
35 40 45
Ser Arg Ser Asp His Leu Thr Thr His Ile Arg Thr His Thr Gly Glu
50 55 60
Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg Lys Phe Ala Arg Ser Asp
65 70 75 80
Glu Arg Lys Arg His Thr Lys Ile His Thr Gly Glu Lys Glu Phe Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu Glu Asp
100 105 110
Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val
115 120 125
Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser
130 135 140
Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys
145 150 155 160
Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln
165 170 175
Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp
180 185 190
His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly
195 200 205
Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile
210 215 220
Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn
225 230 235 240
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu
245 250 255
Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu
260 265 270
Arg Ile Leu Ala
275
<210> 2
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaccg gtgaaaaacg tccgtacgct tgcccggttg aatcttgcga ccgtcgtttc 60
tctcgttctg acgaactgac ccgtcacatc cgtatccaca ccggtcagaa accgttccag 120
tgccgtatct gcatgcgtaa cttctctcgt tctgaccacc tgaccaccca catccgtacc 180
cacaccggtg aaaaaccgtt cgcttgcgac atctgcggtc gtaaattcgc tcgttctgac 240
gaacgtaaac gtcacaccaa aatccacacc ggtgaaaaag aattcggtgg tggtggttct 300
ggtggtggtg gttctatggt tttcaccctg gaagacttcg ttggtgactg gcgtcagacc 360
gctggttaca acctggacca ggttctggaa cagggtggtg tttcttctct gttccagaac 420
ctgggtgttt ctgttacccc gatccagcgt atcgttctgt ctggtgaaaa cggtctgaaa 480
atcgacatcc acgttatcat cccgtacgaa ggtctgtctg gtgaccagat gggtcagatc 540
gaaaaaatct tcaaagttgt ttacccggtt gacgaccacc acttcaaagt tatcctgcac 600
tacggtaccc tggttatcga cggtgttacc ccgaacatga tcgactactt cggtcgtccg 660
tacgaaggta tcgctgtttt cgacggtaaa aaaatcaccg ttaccggtac cctgtggaac 720
ggtaacaaaa tcatcgacga acgtctgatc aacccggacg gttctctgct gttccgtgtt 780
accatcaacg gtgttaccgg ttggcgtctg tgcgaacgta tcctggctgt cgac 834
<210> 3
<211> 341
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ser Leu Pro Ala Thr
1 5 10 15
His Glu Leu His Ile Phe Gly Ser Ile Asn Gly Val Asp Phe Asp Met
20 25 30
Val Gly Gln Gly Thr Gly Asn Pro Asn Asp Gly Tyr Glu Glu Leu Asn
35 40 45
Leu Lys Ser Thr Lys Gly Asp Leu Gln Phe Ser Pro Trp Ile Leu Val
50 55 60
Pro His Ile Gly Tyr Gly Phe His Gln Tyr Leu Pro Tyr Pro Asp Gly
65 70 75 80
Met Ser Pro Phe Gln Ala Ala Met Val Asp Gly Ser Gly Tyr Gln Val
85 90 95
His Arg Thr Met Gln Phe Glu Asp Gly Ala Ser Leu Thr Val Asn Tyr
100 105 110
Arg Tyr Thr Tyr Glu Gly Ser His Ile Lys Gly Glu Ala Gln Val Lys
115 120 125
Gly Thr Gly Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Thr Asn Ser Leu Thr
130 135 140
Ala Ala Asp Trp Cys Arg Ser Lys Lys Thr Tyr Pro Asn Asp Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ile Ser Thr Phe Lys Trp Ser Tyr Thr Thr Gly Asn Gly Lys Arg
165 170 175
Tyr Arg Ser Thr Ala Arg Thr Thr Tyr Thr Phe Ala Lys Pro Met Ala
180 185 190
Ala Asn Tyr Leu Lys Asn Gln Pro Met Tyr Val Phe Arg Lys Thr Glu
195 200 205
Leu Lys His Ser Lys Thr Glu Leu Asn Phe Lys Glu Trp Gln Lys Ala
210 215 220
Phe Thr Asp Val Met Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Lys Thr Gly Glu Lys Arg Pro Tyr Ala
245 250 255
Cys Pro Val Glu Ser Cys Asp Arg Arg Phe Ser Gln Ser Asn Asp Leu
260 265 270
Thr Arg His Ile Arg Ile His Thr Gly Gln Lys Pro Phe Gln Cys Arg
275 280 285
Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Arg Ser Asp Ser Leu Thr Arg His Ile
290 295 300
Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ile Cys Gly Arg
305 310 315 320
Lys Phe Ala Glu Ser Asp Asn Arg Lys Thr His Thr Lys Ile His Thr
325 330 335
Gly Glu Lys Glu Phe
340
<210> 4
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtttcta aaggtgaaga agacaacatg gcttctctgc cggctaccca cgaactgcac 60
atcttcggtt ctatcaacgg tgttgacttc gacatggttg gtcagggtac cggtaacccg 120
aacgacggtt acgaagaact gaacctgaaa tctaccaaag gtgacctgca gttctctccg 180
tggatcctgg ttccgcacat cggttacggt ttccaccagt acctgccgta cccggacggt 240
atgtctccgt tccaggctgc tatggttgac ggttctggtt accaggttca ccgtaccatg 300
cagttcgaag acggtgcttc tctgaccgtt aactaccgtt acacctacga aggttctcac 360
atcaaaggtg aagctcaggt taaaggtacc ggtttcccgg ctgacggtcc ggttatgacc 420
aactctctga ccgctgctga ctggtgccgt tctaaaaaaa cctacccgaa cgacaaaacc 480
atcatctcta ccttcaaatg gtcttacacc accggtaacg gtaaacgtta ccgttctacc 540
gctcgtacca cctacacctt cgctaaaccg atggctgcta actacctgaa aaaccagccg 600
atgtacgttt tccgtaaaac cgaactgaaa cactctaaaa ccgaactgaa cttcaaagaa 660
tggcagaaag ctttcaccga cgttatgggt atggacgaac tgtacaaagg tggtggtggt 720
tctggtggtg gtggttctat gaaaaccggt gaaaaacgtc cgtacgcttg cccggttgaa 780
tcttgcgacc gtcgtttctc tcagtctaac gacctgaccc gtcacatccg tatccacacc 840
ggtcagaaac cgttccagtg ccgtatctgc atgcgtaact tctctcgttc tgactctctg 900
acccgtcaca tccgtaccca caccggtgaa aaaccgttcg cttgcgacat ctgcggtcgt 960
aaattcgctg aatctgacaa ccgtaaaacc cacaccaaaa tccacaccgg tgaaaaagaa 1020
ttcgtcgac 1029
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacgtggcat tctcatctca tcatcatcca ggcgtgggcg tactggatga tgatgagatg 60
ag 62
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctggatgatg atgagatgag aatgccacgt actcatctca tcatcatcca gtacgcccac 60
gc 62
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctggatgatg atgagatgag aatgccacgt a 31
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtccgtggt agggcaggtt ggggtgact 29
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggatgatg atgagatgag aatgccacgt aggttggtgt ggttgg 46
<210> 10
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaattcggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctatgg ttttcaccct ggaaga 56
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agacgtcgac agccaggata cgttcgcac 29
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggaattccat atgaaaaccg gtgaaaaacg 30
<210> 13
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accatagaac caccaccacc agaaccacca ccaccgaatt ctttttcacc ggtgt 55
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaattccat atggtttcta aaggtgaaga agacaac 37
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
catagaacca ccaccaccag aaccaccacc acctttgtac agttcgtcca tacccataa 59
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaaggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctatgaaa accggtgaaa aacgtccgt 59
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agacgtcgac gaattctttt tcaccggtgt gg 32

Claims (7)

1.一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统，至少包括能量供体和能量受体，其特征在于：所述的信号扩增系统包括：
(1)、能与DNA结合的能量供体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括锌指结构域Zif268的氨基酸序列、萤光素酶结构域的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；
(2)、能与DNA结合的能量受体蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，包括绿色荧光蛋白结构域的氨基酸序列、锌指结构域AZP4的氨基酸序列以及上述两个结构域的连接区的氨基酸序列；
(3)、核酸组装体系，由三种DNA探针所组成，分别为：DNA探针Probe1、DNA探针Probe2、生物素化的DNA探针Probe3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示；
上述核酸组装体系产生的双链DNA产物具有锌指结构域Zif268和锌指结构域AZP4的特异性结合位点，能够与能量供体蛋白质及能量受体蛋白质进行特异性结合。
2.权利要求1所述基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统在蛋白质标志物检测中的应用。
3.一种利用权利要求1所述信号扩增系统进行蛋白质标志物检测的方法，其特征在于：该方法通过使用核酸适配体或抗体作为分子识别元件，针对不同种蛋白质标志物进行特异性检测；
若分子识别元件为核酸适配体，检测方法为：
(1)、核酸适配体免疫磁珠的制备：通过分子交联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐将巯基修饰的核酸适配体A1偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用，所述巯基修饰的核酸适配体A1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(2)、基于核酸适配体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的核酸适配体免疫磁珠与待测样本、以及核酸适配体A2充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1和Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测；所述核酸适配体A2中融合有DNA探针Probe3序列，其核苷酸序列如SEQID NO.9所示；
若分子识别元件为抗体，检测方法为：
(1)、抗体免疫磁珠的制备：通过Sulfo-SMCC将待测抗体偶联于氨基修饰的磁珠表面，所得样品置于冰箱保存备用；
(2)、基于抗体的蛋白质标志物检测：取上步骤制备所得的抗体免疫磁珠与待测样本、链霉亲和素、生物素化的抗体、以及DNA探针Probe3充分混匀后于室温孵育，再通过磁力架分离磁珠，洗涤后，将磁珠与DNA探针Probe1、Probe2、以及能量供体蛋白质和能量受体蛋白质于室温孵育，然后利用光谱仪进行分析，得到生物发光共振能量转移信号对蛋白质标志物浓度变化的线性响应关系，完成检测。
4.编码权利要求1所述能量供体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括锌指结构域Zif268的编码序列、萤光素酶结构域的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。
5.权利要求1所述能量供体蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、能量供体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P1和P2对人工合成的萤光素酶编码片段进行PCR扩增，再通过引物P3和P4对人工合成的锌指结构域Zif268编码片段进行PCR扩增；扩增得到的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P3和P2为引物的重叠PCR扩增得到编码能量供体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～SEQID NO.13所示；
(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；
(3)、表达：接种含有能量供体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养，取上述培养物至含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续摇床震荡培养；
(4)、纯化：上述所得培养物离心，所得细胞沉淀用细菌蛋白抽提液重悬，并加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，直至样品澄清；将上述裂解液离心，所得上清通过过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化；纯化所得的能量供体蛋白质于冰箱中透析脱盐，并通过凝胶电泳分析后，分装保存。
6.编码权利要求1所述能量受体蛋白质的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，包括绿色荧光蛋白结构域的编码序列、锌指结构域AZP4的编码序列以及上述两个结构域的连接区的编码序列。
7.权利要求1所述能量受体蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、能量受体蛋白质编码基因的扩增：首先通过引物P5和P6对人工合成的绿色荧光蛋白编码片段进行PCR扩增，再通过引物P7和P8对人工合成的锌指结构域AZP4编码片段进行PCR扩增；上述扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和回收后，以等摩尔量混合，最后通过以P5和P8为引物的重叠PCR扩增得到编码能量受体蛋白质的全长基因片段，所得全长基因片段通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化；所述引物P5、P6、P7和P8的核苷酸序列如SEQ IDNO.14～SEQ ID NO.17所示；
(2)、酶切、连接、及转化：上述全长基因片段经过NdeI和SalI酶切后，分别与经过相同酶切处理的质粒载体pET-26(b+)进行混合，所得混合物通过T4DNA连接酶于连接，连接产物通过CaCl2法转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株当中，所得载体经测序验证正确后用于后续实验；
(3)、表达：接种含有能量受体蛋白质表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株于含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养，取上述培养物至含卡那霉素的液体LB培养基中，摇床震荡培养后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，继续摇床震荡培养；
(4)、纯化：上述所得培养物离心，所得细胞沉淀用细菌蛋白抽提液重悬，并加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破碎，直至样品澄清；将上述裂解液离心，所得上清通过过滤器加入镍亲和层析柱中进行目的蛋白质纯化；纯化所得的能量受体蛋白质于冰箱中透析脱盐，并通过凝胶电泳分析后，分装保存。
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