CN107703109A - 二维硫化钼多肽复合材料及其在靶向cd47癌症标记中的应用 - Google Patents

二维硫化钼多肽复合材料及其在靶向cd47癌症标记中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二维硫化钼多肽复合材料的构建及其用途，具体来说，涉及一种由5‑tamra标记由10个氨基酸组成的多肽链类化合物合成、材料组装及其在癌症诊断中的应用。本发明的发明人经深入研究，设计并应用高效多肽标记手段，以廉价、高生物相容度并具备长激发波的罗丹明衍生物（5‑tamra）为荧光染料合成了荧光多肽探针。然后将多肽探针与二维片层材料（氧化石墨烯和二硫化钼）进行自组装，形成由于FRET效应导致的荧光淬灭的多肽和二维片层材料的复合生物传感器，可用于对肝癌信号分子CD47和肿瘤组织的荧光“关‑开”式标记。

Description

二维硫化钼多肽复合材料及其在靶向CD47癌症标记中的应用
技术领域
本发明涉及一种二维硫化钼多肽复合材料的构建及其用途具体来说，涉及一种由5-tamra标记由10个氨基酸组成的多肽链类化合物合成、材料组装及其在癌症诊断中的应用。
背景技术
肝癌作为一种恶性肿瘤，其致死率在全球恶性肿瘤中排名第三，尤其在我国发病率极高。CD47是一种跨膜蛋白，广泛存在于多个物种和多个组织之间。生理条件下，CD47与配体分子如凝血酶反应蛋白1(TSP1)等相互作用，参与调控细胞黏附、增殖、存活等生物学行为。目前研究发现CD47在肝癌发生发展中亦发挥重要作用。临床前研究发现肝癌细胞CD47通过与信号调节蛋白α(SIRPα)相结合，抑制巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫；阻断CD47-SIRPα相互作用后，肝癌的体内生长显著抑制。临床研究发现肝癌患者肿瘤组织CD47的表达水平与预后相关，肝癌高表达CD47提示预后较差。以上结果提示CD47分子可能是肝癌患者预后预测的重要指标，并有潜力成为肝癌治疗的新靶点，因此高效准确检测肝癌组织CD47分子的表达水平极为重要。
由于CD47分子是高度糖基化的五次跨膜蛋白，胞内段较短，空间构象的特殊性导致针对CD47分子的抗体较难制备，因此目前检测CD47蛋白水平组织表达的手段极为有限，文献报道的方法仅有通过流式细胞术检测组织经酶解消化的单细胞CD47分子表达。但是酶解法不仅费时费力，不利于临床大样本量的规范化检测，酶解效率也受到组织类型、大小等多种因素的制约而不稳定，因此急需开发新的针对CD47蛋白的快速组织原位检测手段。目前对于蛋白质的检测主要通过酶联免疫法(ELISA)与免疫组化(免疫荧光)等，其缺点在于由于蛋白构象的不稳定导致抗体的不灵敏，并不是所有的抗体都适合做标记(如CD47分子)，而且测试费用十分昂贵。而荧光多肽探针的合成技术已经十分成熟，多肽和蛋白之间的结合十分牢固，多肽的荧光修饰简易且产量高。应用多肽配体进行细胞标记的优点在于合成简便，灵敏度高，操作简单，耗时短。
发明内容
本发明的发明人经深入研究，设计并应用高效多肽标记手段，以廉价、高生物相容度并具备长激发波的罗丹明衍生物(5-tamra)为荧光染料合成了荧光多肽探针。然后将多肽探针与二维片层材料(氧化石墨烯和二硫化钼)进行自组装，形成由于FRET效应导致的荧光淬灭的多肽和二维片层材料的复合生物传感器，可用于对肝癌信号分子CD47和肿瘤组织的荧光“关-开”式标记。
本项目使用的多肽序列为CD47配体分子TSP1的末端序列类似物RFYVVMWKK(4N1K)，文献报道该多肽能特异结合CD47分子。
本发明一个目的在于，提供一种新颖的可用于对CD47荧光检测的5-tamra标记的多肽探针。
本发明所述荧光标记的多肽探针，其为式I所述化合物、或其异构体，多肽RFYVVMWKK(4N1K)为特异识别CD47分子的多肽
式I中，m＝0-12，n＝0-12，R1或R2为荧光发色团，如下所示：
5-FAM(5-羧基荧光素)、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、FITC(异硫氰酸荧光素)、Cy(3，3.5，5，5.5，7)(菁染料琥珀酰亚胺酯)、Rhodamine123(罗丹明123)、BODIPY(氟硼二吡咯)、TRITC(四甲基罗丹明-5(6)异硫氰酸酯)、香豆素类荧光染料、吡喃菁荧光染料等。
本发明另一个目的在于，揭示上述荧光多肽探针的一种用途，即式I所述化合物、或其异构体在检测CD47蛋白纯品、肝癌细胞的标记和肿瘤组织的荧光生物传感器(或称荧光“关开式”生物传感器)中的应用。
本发明还有一个目的在于，研究了二维片层材料生物传感方面的应用，所涉及的二维片层材料如：二硫化钼(MoS2)、硫化镉(CdS)、二硫化铬(CrS2)、CoS2(二硫化钴)、NiS(硫化镍)、PtS2(二硫化铂)、石墨烯，氧化石墨烯，氧化还原石墨烯等。
附图说明
图1.二维片层材料和荧光探针复合材料的荧光淬灭和恢复；
图2.二维片层材料和荧光探针复合材料的DLS和Zeta电位表征；
图3.荧光探针和荧光探针复合材料的肝癌细胞标记图；
图4.荧光探针复合材料对肝癌细胞荧光增强式标记图；
图5.荧光探针复合材料检测肝癌组织样本中CD47分子表达；
图6.荧光探针复合材料检测胆管癌细胞系CD47分子表达。
具体实施方式
在本发明一个优选的技术方案中，R1为5-TAMRA。
在本发明又一个优选的技术方案中，n为0和m为0。
在本发明另一个优选的技术方案中，本发明提出了一种用于检测蛋白质分子、癌细胞表面蛋白受体和肿瘤组织的荧光生物传感器(或称荧光“关开式”生物传感器)的构建方法。所述的荧光生物传感器主要由本发明荧光多肽类化合物(式I所示化合物，或其异构体)通过范德瓦尔兹力而与二维片层材料发生自组装行为而得到。
其中，所述二维片层材料水分散液由主要步骤如下的方法制得：
将适量二硫化钼粉末放置于一定比例的乙醇/水的混合溶液中，室温条件下，超声数个小时后，静置数小时，得到薄层二硫化钼的乙醇/水分散液。取出分散液，放在表面皿上，包上保鲜膜留孔，待乙醇挥发完全，制得薄层二硫化钼粉末，将粉末置于超纯水中，即得薄层二硫化钼的水分散液。
下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。
实施例1
式I所示化合物的制备：
II的合成：合成方向为序列的C端至N端。原料Fmoc-Lys(Boc)-OH，2CI树脂为载体，Fmoc为笏甲氧羰基，Boc为叔丁基氧羰基，加缩合剂HBTU(苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐)进行偶联，形成Fmoc-Lys(Boc)-树脂。后用哌啶-DMF(N，N-二甲基甲酰胺)(V∶V＝1∶5)脱除笏甲氧羰基(Fmoc)保护基，反应15分钟后，用二氯甲烷(DCM)和DMF洗涤后，分别加入Fmoc-Lys(Boc)-OH、HBTU、DIEA(N，N-二异丙基乙胺)进行偶联30分钟。继续用DMF和DCM洗涤后，循环脱除Fmoc保护基-洗涤-偶联-再洗涤的步骤，直至最后一个氨基酸偶联结束。
I的合成：II的多肽脱除Fmoc保护基团后，再加入5-tamra(5-羧基四甲基罗丹明)原料、缩合剂等试剂完成荧光试剂的修饰合成。形成全保护多肽树脂。最后以切肽试剂TFA∶苯甲硫醚∶苯酚∶乙二硫醇∶双蒸水(82.5∶5∶5∶2.5∶5)将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2小时后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到多肽粗品。
纯化和鉴定：将得到的粗品多肽分析鉴定，粗品用制备型反相液相色谱(RP-HPLC)法纯化，以HPLC和MS分析鉴定。色谱柱为Symmetrix ODS-R，4.6*250mm，5μm；流动相A：0.1％TFA/乙腈，流动相B：0.1％TFA/H2O；线性洗脱梯度：20％A-45％A；流速为1ml/min，检测波长为220nm；经冷冻干燥机后得到精品多肽。
HPLC：流速为1ml/min，检测波长为220nm，出峰时间11.35，纯度98.33％
实施例2
薄层二硫化钼水分散液的制备
本发明中运用超声剥离法，以二硫化钼粉末为原料，加入到将超纯水与乙醇按照一定的比例混合的分散液中，通过选择合适的超声时间，温度，可得到纳米级片层状的二硫化钼水/乙醇分散溶液，然后均匀涂抹在表面皿上，并用保鲜膜封住扎孔，放置于通风橱中。待乙醇挥发完全，制得薄层二硫化钼粉末，将粉末置于超纯水中，即得薄层二硫化钼的水分散液。
实施例3
化合物I-MoS2复合材料的制备
在0.01M的Tris-HCI缓冲液(pH值为7.4)中加入一定量的化合物I溶液(10-3M)与二硫化钼水分散液，后定容至一定体积，制成化合物I-MoS2复合物的水分散液，使化合物I的终浓度为1×10-6M，MoS2的浓度从0到100μg/mL按照一定的梯度不等，搅拌形成均一体系后室温下静置数分钟，得到化合物I-MoS2复合材料，备用。
实施例4
化合物I-MoS2复合材料荧光淬灭与恢复
取化合物I的母液微量加入到400uL Tris-HCI缓冲液(pH值为7.4)的比色皿中，然后将其放置于荧光光谱测试仪中进行检测，激发波长510nm，电压750V。然后加入一定比例的MoS2水分散液，摇匀并静置5min后测试。通过实验可以明显的发现，I的荧光随着MoS2的不断加入，呈现下降的趋势。在荧光淬灭至10％时，按照一定比例加入CD47的蛋白纯品溶液(100ug/mL)，实验结果显示，随着CD47的不断加入，荧光呈现不断增强的趋势。具体结果如图1所示。
实施例5
化合物I-MoS2复合材料动态光散射(DLS)和电动电位(Zeta)表征
在1mL比色皿中加入600uL Tris-HCl缓冲液(pH值为7.4)，后加入4uL化合物I的母液，摇匀并静置5分钟，分别进行动态光散射(DLS)和电动电位(Zeta)测试。随后加入一定比例的MoS2水分散液，摇匀并静置5分钟，再分别进行动态光散射(DLS)和电动电位(Zeta)测试。具体结果如图2所示。
实施例6
化合物I与化合物I-MoS2复合材料均能特异识别CD47分子
委托上海吉凯基因化学技术有限公司制备CD47分子的干扰慢病毒、过表达慢病毒与对照慢病毒。选取人肝癌细胞系HCC-LM3作为研究对象，待细胞生长至60％汇合度时，按照慢病毒MOI＝50的剂量感染细胞，待72小时后加入嘌呤霉素筛选，约1周后挑取单克隆并扩增。利用商品化CD47抗体(克隆号B6H12)流式检测细胞CD47表达，确定得到差异表达CD47分子的HCC-LM3细胞系，分别记为对照细胞-CD47-NC、过表达CD47细胞-CD47-FlagOV与干扰CD47细胞-shCD47(图3A)。将上述细胞按照相同密度传至荧光共聚焦小皿，后用4％多聚甲醛固定，Triton X-100穿孔，将化合物I与化合物I-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后置于激光扫描共聚焦显微镜观察(图3B)。
实施例7
MoS2生物传感平台对肝癌细胞荧光增强式检测
该发明中的生物传感平台，可以实现对肝癌细胞荧光增强式灵敏检测。具体实验步骤为：将HCC-LM3细胞传至12孔板，待细胞密度为60％左右时，经多聚甲醛与Triton X-100固定穿孔，后用DAPI染料染色细胞核，经PBS清洗后，将化合物I与化合物I-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，不经清洗，置于荧光显微镜观察。可见化合物I染色不经清洗后背景较高，而化合物I-MoS2复合材料染色不经清洗后具有较好的荧光灵敏度。具体结果如图4所示。
实施例8
化合物I-MoS2复合材料快速检测肝癌组织样本中CD47分子表达
收取临床手术切除的肝癌患者组织，经冰冻处理后切片，4℃丙酮固定，后将化合物I-MoS2复合材料按照15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后甘油封片，置于激光扫描共聚焦显微镜观察。具体结果如图5所示。
实施例9
化合物I-MoS2复合材料可检测胆管癌细胞系CD47分子表达
以人胆管癌细胞系QBC9810、RBE、HuCCT作为研究对象，利用流式细胞术检测CD47分子的表达水平，均发现CD47呈现高表达(结果见图6A)。将上述细胞传至荧光共聚焦小皿，后用4％多聚甲醛固定，Triton X-100穿孔，将化合物I-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后置于激光扫描共聚焦显微镜观察(图6B)。
I-GO复合材料具有类似的检测效果，此专利中不予累述。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 荧光多肽探针对于癌症信号分子CD47的检测
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<400> 1
Lys Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Lys
1 5 10

Claims (8)

1.一种基于多肽探针4N1K对于癌症分子CD47的靶向标记，其中4N1K的特征序列为RFYVVMWKK的10个天然氨基酸组成，通过固相合成法得到，并且可以实现对CD47分子的特异性识别。
2.通过对权利要求书1中提到的多肽探针4N1K进行荧光修饰，从而实现靶向荧光标记。其中荧光修饰可以从多肽的两端分别进行荧光团的修饰，可以修饰的荧光团包括5-FAM(5-羧基荧光素)、5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)、FITC(异硫氰酸荧光素)、Cy(3,3.5,5,5.5,7)(菁染料琥珀酰亚胺酯)、Rhodamine123(罗丹明123)、BODIPY(氟硼二吡咯)、TRITC(四甲基罗丹明-5(6)异硫氰酸酯)、香豆素类荧光染料、吡喃菁荧光染料等。而本专利所用到的荧光团为5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)，利用荧光团的羧基和多肽N端的氨基酰胺化反应高效的得到荧光团修饰4N1K多肽探针Ⅰ。
3.通过将权利要求书2中提到的多肽探针和二维荧光淬灭材料通过超分子组装得到一种复合材料Ⅰ-MoS2，从而利用4N1K对CD47分子的特异性识别实现对靶标的关-开式荧光标记。其中所涉及的二维片层材料如：二硫化钼(MoS2)、硫化镉(CdS)、二硫化铬(CrS2)、CoS2(二硫化钴)、NiS(硫化镍)、PtS2(二硫化铂)、石墨烯，氧化石墨烯，氧化还原石墨烯等，制作方法为将二硫化钼粉末分散于一定的比例的溶剂(水、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、二氯甲烷等)中，通过超声剥离的方法得到单层二硫化钼，进而通过收集、提纯、干燥一系列操作后，再复溶到溶剂中得到二硫化钼的分散液。其中涉及到的探针和二硫化钼的超分子的组装主要方法是通过将两者按照一定的比例加入到相应的生物缓冲液中，通过较长时间的超声、搅拌、震荡后，得到一种均一的液相复合材料。
4.将权利要求书3中提到的复合材料Ⅰ-MoS2用于纯化的CD47蛋白分子样品的荧光恢复测试。取400uL复合材料Ⅰ-MoS2加入到比色皿中，然后将其放置于荧光光谱测试仪中进行检测，激发波长510nm，电压750V。按照一定比例加入CD47的蛋白纯品溶液(100ug/mL)加入后摇匀，并静置5min后测试。直至加入CD47荧光不再上升为止。
5.通过一系列的测试方法对权利要求书3中提到的Ⅰ-MoS2复合材料对其进行表征。其中涉及到的测试方法包括动态光散射(DLS)和zeta电位，分别测试了化合物Ⅰ、二硫化钼MoS2和复合材料Ⅰ-MoS2的粒径和电位，实验结果显示化合物Ⅰ和二硫化钼MoS2可以通过超分子组装方式得到一种较好的均相的液体复合材料。
6.将权利要求书3中提到的复合材料Ⅰ-MoS2用于过表达CD47的肝癌细胞系HCC-LM3的标记。委托上海吉凯基因化学技术有限公司制备CD47分子的干扰慢病毒、过表达慢病毒与对照慢病毒。选取人肝癌细胞系HCC-LM3作为研究对象，待细胞生长至60％汇合度时，按照慢病毒MOI＝50的剂量感染细胞，待72小时后加入嘌呤霉素筛选，约1周后挑取单克隆并扩增。利用商品化CD47抗体(克隆号B6H12)流式检测细胞CD47表达，确定得到差异表达CD47分子的HCC-LM3细胞系，分别记为对照细胞-CD47-NC、过表达CD47细胞-CD47-FlagOV与干扰CD47细胞-shCD47。将上述细胞按照相同密度传至荧光共聚焦小皿，后用4％多聚甲醛固定，Triton X-100穿孔，将化合物Ⅰ与化合物Ⅰ-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后置于激光扫描共聚焦显微镜观察。接下来还做了肝癌细胞荧光增强式灵敏检测。具体实验步骤为：将HCC-LM3细胞传至12孔板，待细胞密度为60％左右时，经多聚甲醛与Triton X-100固定穿孔，后用DAPI染料染色细胞核，经PBS清洗后，将化合物Ⅰ与化合物Ⅰ-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，不经清洗，置于荧光显微镜观察。
7.将权利要求书3中提到的复合材料Ⅰ-MoS2快速检测肝癌组织样本中CD47分子表达。收取临床手术切除的肝癌患者组织，经冰冻处理后切片，4℃丙酮固定，后将化合物Ⅰ-MoS2复合材料按照15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后甘油封片，置于激光扫描共聚焦显微镜观察。
8.将权利要求书3中提到的复合材料Ⅰ-MoS2用于表达CD47分子的胆管癌细胞系的标记。以人胆管癌细胞系QBC9810、RBE、HuCCT作为研究对象，利用流式细胞术检测CD47分子的表达水平。将上述细胞传至荧光共聚焦小皿，后用4％多聚甲醛固定，Triton X-100穿孔，将化合物Ⅰ-MoS2复合材料按15μg/ml剂量染色30分钟，经PBS洗脱后，用DAPI染色细胞核1分钟，PBS清洗后置于激光扫描共聚焦显微镜观察。
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