CN102532197A - 一类光亲和标记双功能探针分子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类光亲和标记双功能探针分子。本发明所涉及的探针分子具有GABAB受体强亲和力、高选择性的结合能力，同时可用于在活细胞水平对膜上GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内相关信号蛋白的动态变化过程，以及用于新靶点的发现与蛋白质谱的研究，为与GABAB受体相关疾病的诊断和相应治疗药物的开发提供更为直接的精确的重要信息。
Description
技术领域
本发明涉及一类光亲和标记双功能探针分子。本发明所涉及的探针分子具有γ氨基丁酸B型受体(Gamma Aminobutyric Acid B Receptor，简称GABABR或GABAB受体)强亲和力、高选择性的结合能力，同时可用于在活细胞水平对膜上GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内相关信号蛋白的动态变化过程，以及用于新靶点的发现与蛋白质谱的研究，为与GABAB受体相关疾病的诊断和相应治疗药物的开发提供更为直接的精确的重要信息。本发明还涉及该类探针分子的结构设计及制备方法。
背景技术
药物发现过程包括许多阶段，如：靶点的鉴别、先导化合物的发现、小分子化合物的结构优化、临床前及临床试验等。靶点的鉴别是药物发现与发展过程中的关键步骤(Curr.Opin.Chem.Biol.2002，6：427～433)，而目前基因水平上的生物技术不能确定针对某种疾病的小分子药物的特异性蛋白质靶点。可以预见，在基因组学基础上开展的蛋白质组学研究将推动药物开发方面的实质性突破，使得生命科学研究能实现其最终目标，研制出治疗包括癌症和艾滋病等在内的多种疾病的药物。因此针对药物发现的技术重心已经由基因组转向了蛋白质组。光亲和标记技术是研究蛋白质组学的主要策略之一，它不仅对蛋白质进行鉴别，同时也对其功能及相互作用进行研究。
光亲和标记技术是结合现代分子生物学、细胞生物学、有机化学等多学科的优势，运用合成的光亲和小分子化合物作为工具探针，经特定波长的光照射分解产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆的共价结合。探针分子(参见图1)包括三个功能部位：活性基团(activity group)、光亲和标记基团(photoaffinity labeling group)、报告基团(reporter group)，功能部位之间通过连接部位(spacer)连接。活性基团的作用是将探针分子导向受体蛋白的活性中心；光亲和标记基团的作用是在探针分子被导向受体蛋白的活性中心之后经特定波长的紫外光照射分解产生高活性的卡宾或氮宾中间体，将探针分子共价修饰在受体蛋白的活性中心；报告基团主要是方便以后的分离、纯化、检测等操作。
光亲和标记技术是在分子水平上研究配体与受体相互作用的核心工具之一，阐明配体与受体相互作用的机理对药物先导物的发现有着巨大的推动作用(Curr.Top.Med.Chem.2002，2：271～288)。它在药物的发现中主要有两个方面的应用：新靶点的确定及靶标蛋白与小分子配体作用模式的确定。运用这一技术的优势在于可在不同的层面对疾病相关的靶点进行深入的研究：1)未知作用靶点的活性化合物：通过设计探针标记捕获的靶标蛋白，进而确定该活性化合物的作用靶点，更进一步，对由生物大分子与探针分子形成的共价复合物的解析可获取小分子活性化合物与其作用靶点的作用模式；2)已知作用靶点，但具体作用模式未知的活性化合物，运用这一技术可直接从微观角度解析其与靶标蛋白的可能的作用模式。
运用光亲和标记技术，大量的与疾病相关的靶点被发现，多种小分子与生物大分子作用的模式被确定，这些信息对合理药物设计具有非常重要的意义。比如新的药物靶点的发现，或者对一个已知蛋白的功能作新的阐述，这对于从分子水平阐明疾病的发生、发展及治疗的意义是不言而喻的。这些靶点可被发展为高效、高速的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的小分子化合物，发现一些更高活性的小分子化合物作为先导物用于进一步的新药开发研究。这样，从一个小分子探针为起点，其母体化合物或许在类药性、有效性甚至代谢稳定性等方面存在问题，但新发现的化合物则不受原有结构的限制，有更宽的改造空间。
γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，在体内通过作用于离子通道型的GABAA、GABAC受体及代谢型的GABAB受体而发挥生理功能。GABAB受体属于G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptor，GPCR)家族的C家族，具有七次跨膜结构，它存在于神经元的突触前及突触后部位，介导慢的抑制性效应，在脑内参与许多重要的生理活动和病理变化，包括认知损害、癫痫、痉挛及药物成瘾等。因此，GABAB受体作为药物作用的重要靶点，其结构特征、作用机理以及信号转导途径的研究，对于阐明相关神经系统疾病的发病机理以及相应治疗药物的开发具有重要意义。
虽然GABAB受体具有重要的生理及病理意义，但其结构的特殊性使得利用传统的蛋白质组学方法进行研究非常有难度；而ABPP技术，尽管目前已经广泛的用于不同酶家族的研究，在离子型受体方面的应用也有报道，但是在GPCR家族尤其是GABAB受体方面的应用仍然很少。一般来说，GPCR的不同构象在体内同时存在并处于平衡状态，而GPCR的不同的小分子配体可以使受体在不同的构象之间转换。这种体系的复杂性可能是制约ABPP广泛用于GABAB受体研究的主要原因。如果能克服上述困难，成功设计合成强亲和力、高选择性的光亲和探针分子，将会对GABAB受体的生理学和结构特征的研究起到相当大的推动作用。此外，利用小分子光亲和探针还可以将GABAB受体固定在激活或拮抗状态，来研究活性状态下GABAB受体在细胞上的定位及功能，以及所引起胞内信号的变化。因此，开发GABAB受体的强亲和力、高选择性的小分子配体对深入研究GABAB受体，以及开发新型作用于GABAB受体的药物具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一类对GABAB受体具有强亲和力、高选择性的光亲和标记双功能探针分子。
本发明的另一个目的是提供上述的光亲和标记双功能探针分子的制备方法。
本发明的另一个目的是提供上述的光亲和标记双功能探针分子的用途。本发明所涉及的光亲和标记双功能探针分子可用于活细胞水平对膜上GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内信号蛋白的动态变化过程以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究，为深入研究GABAB受体提供更有效的研究工具，为开发新型作用于GABAB受体的药物提供重要信息。
根据本发明的第一个目的，本发明提供一类结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子：
其中：
R1为活性基团，对GABAB受体具有高亲和力、高选择性，可为已知的GABAB受体拮抗剂经结构改造获得；具体可以是R1a、R1b或R1c；
R2为报告基团，可以为生物素(biotin)，或多肽标签：HA(序列为：N-YPYDVPDYA-C)、Flag(序列为：N-DYKDDDDK-C)、Myc(序列为：N-EQKLISEEDL-C)、His(序列为：HHHHHH)，其中：序列两端的N表示多肽的N端，C表示C端，中间的字母为天然氨基酸的代号，具体为：A丙氨酸，D天冬氨酸，E谷氨酸，H组氨酸，I异亮氨酸，K赖氨酸，L亮氨酸，P脯氨酸，Q谷氨酰胺，S丝氨酸，V缬氨酸，Y酪氨酸，或荧光染料：羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine B)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、花菁(cyanine)类染料(如Cy3、Cy5等)以及Alexa Fluro系列染料(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568等)；
R3为光亲和标记基团，可为叠氮基、三氟甲基双吖丙啶基(trifluoromethyldiazirine)、苯甲酰基或二苯甲酮基；
X为连接部位，可为：-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-或者-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-三氮唑基-C1～C4亚烷基-NH-；n为0～4间的整数，优选n为2；
且，R3与X中的苯基相连。
在本发明的进一步实施方式中，通式I中：
R1为GABAB受体拮抗剂经结构改造获得；具体为R1c；
R2为生物素(biotin)，或多肽标签：HA、Flag、Myc、His，或荧光染料：羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine B)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、花菁(cyanine)类染料(如Cy3、Cy5等)以及Alexa Fluro系列染料(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568等)；
R3为三氟甲基双吖丙啶基、苯甲酰基或二苯甲酮基；
X为连接部位，可为-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-或者-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-三氮唑基-C1～C4亚烷基-NH-；n为0～4的整数，优选n为2；
且，R3与X中的苯基相连。
在本发明的进一步实施方式中，通式I为如下的通式II：
其中：
m为0～7的整数；优选地，m为4；
R2通过连接部位Y与苯环相连；
R3与苯环直接相连；
Y和R3可以取代苯环的任意两个位置；优选地，Y取代苯环的2位，R3取代苯环的4位；
R2为生物素(biotin)，或多肽标签：HA、Flag、Myc、His，或荧光染料：羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine B)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、花菁(cyanine)类染料(如Cy3、Cy5等)以及Alexa Fluro系列染料(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568等)；
R3为三氟甲基双吖丙啶基或苯甲酰基；优选地，R3为三氟甲基双吖丙啶基。
Y为-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-或者-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-三氮唑基-C1～C4亚烷基-NH-；n为0～4的整数，优选n为2。
在本发明的一个实施方式中，通式II为如下的通式III：
其中：
n为0～4的整数；优选地，n为2；
R2为生物素(biotin)，或多肽标签：HA、Flag、Myc、His，或荧光染料：羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine B)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、花菁(cyanine)类染料(如Cy3、Cy5等)以及Alexa Fluro系列染料(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568等)；优选地，R2为biotin、HA、Flag、Rhodamine B、TAMRA、Cy3、Cy5、AlexaFluro 488或Alexa Fluor 568；更优选地；R2为biotin或Alexa Fluro 488。
在本发明的另一实施方式中，通式II为如下的通式IV：
n为0～4的整数；优选地，n为2；
R2为生物素(biotin)，或多肽标签：HA、Flag、Myc、His，或荧光染料：羧基荧光素(carboxyfluorescein，FAM)、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine B)、羧基四甲基罗丹明(carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)、花菁(cyanine)类染料(如Cy3、Cy5等)以及Alexa Fluro系列染料(如Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 568等)；优选地，R2为biotin、HA、Flag、Rhodamine B、TAMRA、Cy3、Cy5、AlexaFluro 488或Alexa Fluor 568；更优选地；R2为biotin、Rhodamine B或HA。
在本发明的另一实施方式中，结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子具体为：
根据本发明的第二个目的，本发明提供一类结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子的制备方法：
根据通式I中X的定义，通式I可以表示为下式中的两类结构的化合物Ia和Ib。
化合物Ia的制备：化合物R1-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH2可由R1-C1～C8亚烷基-NH2与SuOOC-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NHBoc经缩合后再脱除Boc保护基得到。R1-C1～C8亚烷基-NH2的合成可参考Bioorgan.Med.Chem.1999，7：2697～2704以及专利文献WO9709335A1和US5376684A，SuOOC-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NHBoc的合成可参考Bioorgan.Med.Chem.2010，18：3012～3019。缩合反应在如下溶剂中进行：DMF、CH2Cl2或上述溶剂的混合溶剂；反应加入Et3N(三乙胺)或i-Pr2NEt(二异丙基乙基胺)作碱；通常反应温度为0℃～60℃；反应时间约需1～24小时；反应完成后一般用AcOEt、Et2O、CH2Cl2或CHCl3等溶剂提取，饱和食盐水洗，经干燥后，低温减压除去溶剂，浓缩物经柱层析纯化，所得产物用NMR等方法来证明。脱除Boc保护基的反应在如下溶剂中进行：AcOEt、CH2Cl2或上述的混合溶剂，反应所需的酸通常为HCl的AcOEt溶液或TFA(三氟乙酸)，通常反应温度为0℃～60℃；反应时间约需0.5～1小时；反应完成后，反应液经减压浓缩，即得目标产物，直接用于下一步反应。
探针分子Ia可由R1-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH2与R2的活性酯经缩合反应得到。反应在如下溶剂中进行：DMF、CH2Cl2或上述溶剂的混合溶剂；反应加入Et3N或i-Pr2NEt作碱；通常反应温度从0℃～60℃；反应时间约需1～24小时；反应完成后一般用AcOEt、Et2O、CH2Cl2、CHCl3等溶剂提取，饱和食盐水洗，经干燥后，低温减压除去溶剂，浓缩物经柱层析得探针分子Ia；得到的产物用NMR等方法来证明。
化合物Ib的制备：化合物R1-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-叠氮基可由R1-C1～C8亚烷基-NH2与SuOOC-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-叠氮基经缩合反应得到。SuOOC-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-叠氮基的合成可参考J.Med.Chem.2008，51：3057-3060。缩合反应在如下溶剂中进行：DMF、CH2Cl2或上述溶剂的混合溶剂；反应加入Et3N或i-Pr2NEt作碱；通常反应温度为0℃～60℃；反应时间约需1～24小时；反应完成后一般用AcOEt、Et2O、CH2Cl2或CHCl3等溶剂提取，饱和食盐水洗，经干燥后，低温减压除去溶剂，浓缩物经柱层析纯化，所得产物用NMR等方法来证明。
化合物炔基-C1-C4亚烷基-NH-R2可由炔基-C1-C4亚烷基-NH2与R2的活性酯经缩合反应得到。缩合反应在如下溶剂中进行：DMF、CH2Cl2或上述溶剂的混合溶剂；反应加入Et3N或i-Pr2NEt作碱；通常反应温度从0℃～60℃；反应时间约需1～24小时；反应完成后一般用AcOEt、Et2O、CH2Cl2或CHCl3等溶剂提取，饱和食盐水洗，经干燥后，低温减压除去溶剂，浓缩物经柱层析纯化，所得产物用NMR等方法来证明。
探针分子Ib可由R1-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基(-R3)-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-叠氮基与炔基-C1-C4亚烷基-NH-R2经Cu(I)催化的叠氮-炔1，3-偶极环加成反应得到。Cu(I)通常在反应体系中由VcNa还原CuSO4得到，反应在如下溶剂中进行：MeOH、EtOH、H2O或上述溶剂的混合溶剂；通常反应温度从0℃～60℃；反应时间约需1～24小时；反应完成后一般低温减压除去溶剂，浓缩物经柱层析得探针分子Ib；得到的产物用NMR等方法来证明。
根据本发明的第三个目的，本发明提供了上述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子的用途。本发明所述的探针分子可用于活细胞水平对膜上GABAB受体的标记、示踪、分析因激活或拮抗引起的胞内信号蛋白的动态变化过程以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究。
本发明的光亲和标记双功能探针分子具有以下的用途：
(1)作为活性的GABAB受体探针分子，可特异性标记细胞膜上的GABAB受体，包括在原代神经细胞和过表达系统；或
(2)作为GABAB受体特异性示踪剂；或
(3)作为特异性探针，用于观察细胞膜内信号蛋白的变化情况以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究。
附图说明
图1为光亲和标记探针分子的基本结构。
图2为化合物5影响细胞内磷酸肌醇产生量的定量测试结果。
图3为化合物5特异性标记细胞膜上GABAB受体的Western实验结果。
图4为用化合物7将GABAB受体标记在拮抗状态，在GB2的激动剂CGP7930刺激下，高特异性Ca2+荧光指示剂Fluo-3显示细胞内Ca2+浓度随时间变化的情况。
图5为用化合物5将GABAB受体标记在拮抗状态，在GB2的激动剂CGP7930刺激下细胞内信号蛋白Akt和磷酸化Akt随时间变化的情况。
具体实施方式
下列实施例说明被本发明所涵盖的探针分子及其设计、制备、应用，但这里仅仅是举例说明，并不限制本发明。
制备实施例
制备实施例1——化合物5的制备
化合物3的制备
化合物1(53mg，0.12mmol，制备参考Bioorg.Med.Chem.，1999，7：2697-2704)溶于3mL甲醇中，加入化合物2(71mg，0.13mmol，制备参考J.Med.Chem.，2008，11：3057-3060)及i-Pr2NEt(92μl，0.52mmol)，体系室温避光搅拌过夜，减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0-2∶1∶0.2梯度洗脱，得无色油状物68mg，收率71.3％。
1HNMR(δ，ppm，CD3OD+CDCl3)：1.42-1.90(10H，m)，1.72(3H，d，J＝6.3Hz)，2.89-3.01(2H，m)，3.35-3.38(4H，m)，3.53(2H，m)，3.63(2H，m)，3.69(2H，m)，3.85(2H，s)，3.89(2H，m)，4.24(1H，m)，4.35(2H，m)，4.37(1H，q，J＝6.9Hz)，6.80(1H，s)，6.98(1H，d，J＝8.4Hz)，7.47(1H，t，J＝7.5Hz)，7.57(1H，d，J＝7.2Hz)，7.99-8.08(3H，m).HR-ESIMS：实测值：837.2897[M+Na]+(计算值：837.2924[C34H46F3N8O10P+Na]+)；ESIMS：m/z＝815.0(M+H)+.
化合物5的制备
圆底烧瓶中加入化合物3(8mg，9.82μmol)，化合物4(2.8mg，9.82μmol，制备参考Org.Lett.，2007，11：2131-2134)及甲醇(2mL)，搅拌溶解，加入CuSO4溶液(10mM，222μL)，体系N2气置换，换气完毕加入VcNa水溶液(222mM，50μL)。反应液室温避光搅拌1h。减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0.2洗脱得白色固体8mg，收率74.7％。
1HNMR(δ，ppm，CD3OD+CDCl3)：1.30-1.70(19H，m)，2.24(2H，t，J＝6.9Hz)，2.72(1H，d，J＝12.9Hz)，2.89-2.94(3H，m)，3.20(1H，m)，3.32(2H，m)，3.37(4H，m)，3.54(2H，m)，3.64(2H，m)，3.75(2H，m)，3.90(2H，s)，4.17-4.30(4H，m)，4.40-4.50(4H，m)，5.12(1H，s)，6.86(1H，s)，7.00(1H，d，J＝9.0Hz)，7.51(1H，m)，7.61(1H，m)，7.90(1H，s)，7.97(1H，d，J＝9.0Hz)，8.02(1H，m).HR-ESIMS：实测值：1118.4067[M+Na]+(计算值：1118.4122[C47H65N11O12F3PS+Na]+)；ESIMS：m/z＝1118.6(M+Na)+.
制备实施例2——化合物7的制备
化合物6的制备
Rodamine B(500mg，1.04mmol)溶于干燥DCM(25mL)，搅拌条件下依次加入DCC(430mg，2.08mmol)，HOBt(282mg，2.08mmol)及炔丙胺(100μL，1.57mmol)。反应液于室温搅拌18h，减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化，PE∶EA＝4∶1洗脱得白色固体311mg，收率61.8％。
1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：1.15(12H，t，J＝6.9Hz)，1.77(1H，t，J＝2.4Hz)，3.34(8H，q，J＝6.9Hz)，3.95(2H，d，J＝2.4Hz)，6.28(2H，d，J＝9.0Hz)，6.40(2H，s)，6.48(2H，d，J＝9.0Hz)，7.10(1H，m)，7.43(2H，m)，7.93(1H，m).13CNMR(δ，ppm，CDCl3)12.72，28.62，44.54，64.90，70.15，78.40，97.91，105.20，108.11，123.10，123.90，128.11，129.21，130.54，132.75，148.97，153.60，153.88，167.48.
化合物7的制备
圆底烧瓶中加入化合物3(7mg，8.6μmol)，化合物6(5mg，9.8μmol)及甲醇(2mL)，搅拌溶解，加入CuSO4溶液(10mM，222μL)，体系N2气置换，换气完毕加入VcNa水溶液(222mM，50μL)。反应液室温避光搅拌1h。减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化，PE∶EtOAc＝2∶1洗脱得粉红色固体10mg，收率89.9％。
1HNMR(δ，ppm，CD3OD+CDCl3)：1.13(12H，t，J＝6.9Hz)1.40-1.80(13H，m)，2.89(2H，m)，3.31-3.34(10H，m)，3.49(2H，m)，3.54-3.60(4H，m)，3.68(4H，m)，3.87(2H，s)，4.20-4.35(3H，m)，4.35-4.50(3H，m)，4.80(1H，s)，6.22(4H，m)，6.36(2H，s)，6.78(1H，s)，6.97(1H，d，J＝7.5Hz)，7.09(1H，d，J＝6.6Hz)，7.50(3H，m)，7.65(1H，m)，7.75(1H，m)，7.90(1H，m)，7.98(1H，d，J＝7.5Hz)，8.12(1H，m).HR-ESIMS：实测值1294.5623[M+H]+(计算值1294.5678[C65H80N11O12F3P+H]+)；ESIMS：m/z＝1316.4(M+Na)+.
制备实施例3——化合物9的制备
化合物8的制备
保护的HA(200mg，0.062mmol)溶于干燥DCM(3mL)，搅拌条件下依次加入EDC(23.8mg，0.125mmol)，Et3N(13mg，0.138mmol)，DMAP(1.5mg，0.0125mmol)及炔丙胺(17.2mg，0.312mmol)。反应液于室温搅拌18h，减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化，CHCl3∶MeOH＝25∶1洗脱得浅黄色固体78mg，收率76.2％。
1HNMR(δ，ppm，CDCl3)：0.94(3H，d，J＝6.6Hz)，0.98-1.06(6H，m)，1.15-1.30(27H，m)，1.33-1.48(18H，m)，1.70-2.30(9H，m)，2.52-3.33(11H，m)，3.45-3.80(5H，m)，3.85-4.70(12H，m)，4.75-4.85(1H，m)，5.69(1H，t，J＝6.3Hz)，5.78(1H，t，J＝7.2Hz)，6.76-7.00(5H，m)，7.00-7.12(3H，m)，7.12-7.22(2H，m)，7.22-7.45(5H，m)，7.45-7.67(3H，m)，7.75(2H，dd，J＝10.8，8.1Hz)，7.90(1H，dd，J＝15.6，8.1Hz).ESIMS：m/z＝843.6(M+2Na)2+.
化合物9的制备
圆底烧瓶中加入化合物3(8mg，9.8μmol)，化合物8(16.4mg，10.0μmol)及甲醇(2mL)，搅拌溶解，加入CuSO4溶液(10mM，222μL)，体系N2气置换，换气完毕加入VcNa水溶液(222mM，50μL)。反应液室温避光搅拌1h。减压旋除溶剂后硅胶柱层析纯化，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0.2洗脱得浅黄色固体。该浅黄色固体溶于DCM(1.4ml)，加入哌啶(0.16ml)，室温搅拌2h，反应液减压浓缩，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0.15洗脱得白色固体。该白色固体溶于DCM(0.8ml)，加入TFA(1ml)以及苯甲醚(0.2ml)，室温搅拌12h，反应液减压浓缩，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0.15洗脱得白色固体5.6mg，收率29.9％。
1HNMR(δ，ppm，CD3OD)：0.80-1.02(6H，m)，1.20-1.40(7H，m)，1.45-1.72(7H，m)，1.72-1.92(4H，m)，1.93-2.12(4H，m)，2.56-2.80(5H，m)，2.80-3.30(12H，m)，3.44-3.55(4H，m)，3.55-3.65(4H，m)，3.65-3.70(3H，m)，3.80-3.92(4H，m)，4.10-4.60(12H，m)，5.10(2H，s)，6.63-6.76(6H，m)，6.78(1H，d，J＝8.1Hz)，6.83(1H，s)，6.95-7.10(6H，m)，7.16(1H，d，J＝8.7Hz)，7.53(1H，t，J＝7.5Hz)，7.67(1H，d，J＝7.5Hz)，7.88(1H，d，J＝4.5Hz)，7.93(1H，d，J＝8.1Hz)，8.04(1H，d，J＝7.2Hz)，8.14(1H，s)，8.45(1H，m).ESIMS：m/z＝1953.3(M+Na)+.
制备实施例4——化合物13的制备
化合物11的制备
化合物1(31mg，0.076mmol)溶于2mL甲醇中，加入化合物10(48mg，0.084mmol，制备参考Bioorg.Med.Chem.，2010，18：3012-3019)及i-Pr2NEt(55μl，0.33mmol)，体系室温避光搅拌过夜，减压旋干溶剂后，EA溶解，有机层依次用0.1N HCl、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化，CHCl3∶MeOH∶H2O＝2∶1∶0-2∶1∶0.2梯度洗脱，得无色油状物38mg，收率60.0％。
1HNMR(δ，ppm，CD3OD+CDCl3)：1.30-1.60(18H，m)，1.60-1.80(4H，m)，3.24(3H，s)，3.51(3H，s)，3.62(3H，s)，3.67(3H，s)，3.91(3H，s)，4.27(3H，s)，6.73(1H，s)，6.84-6.96(1H，m)，7.43(1H，s)，7.50-7.88(1H，m)，7.92-8.15(2H，m)，8.26(1H，s).ESIMS：m/z＝832.3(M+H)+.
化合物13的制备
化合物11(10mg，0.012mmol)溶于0.2ml TFA中，0℃避光反应5分钟。然后减压浓缩除去TFA，所得粗品溶于0.3ml H2O与0.18ml CH3CN中，室温搅拌下加入8μl i-Pr2NEt，以及化合物12(21mg，0.032mmol，制备参考专利US006130101)，室温避光搅拌过夜。减压旋干溶剂后硅胶柱层析纯化，CH3CN∶H2O＝4∶1洗脱，含目标产物部分用1％TFA/H2O溶解后，再经C-18反相硅胶纯化，MeOH∶H2O＝0∶2-1∶2梯度洗脱，所得红色固体与0.1ml浓氨水、5mg NaHCO3和0.5ml H2O混合，该溶液再经Sephadex-LH20柱层析纯化，H2O洗脱，得红色固体2.1mg，收率13％。
1HNMR(δ，ppm，D2O)：1.30-1.80(13H，m)，3.10-3.30(3H，m)，3.35-3.74(9H，m)，3.90-4.00(3H，m)，4.00-4.15(3H，m)，6.60-6.90(2H，m)，6.92-7.10(1H，m)，7.26-7.54(2H，m)，7.64-7.90(2H，m).ESIMS：m/z＝1246.2(M-H)-.
实验实施例
实验实施例1：保持本身作为拮抗剂的活性以及特异性标记识别受体的能力
1、保持本身作为拮抗剂的活性
转染细胞的磷酸肌醇积累量测定是在96孔版中进行的。1×107个人胚肾细胞HEK293转染野生型GB1(4μg)和GB2(4μg)以及改进的Gqi9(2μg)cDNA。细胞用一定浓度的探针孵育15min，然后用10μM的GABA刺激30min。磷酸肌醇信息数据用磷酸肌醇/总量的比率来表示，取三次独立实验的平均值。抑制曲线拟合根据Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))公式，用GraphPad PRISM软件进行计算分析。Top和Bottom分别指实验中所测得的磷酸肌醇/总量的比率的最大值和最小值，IC50是探针抑制GABA诱导的激活响应最大值和最小值间的中值，HillSlope是曲线的斜率，最大值和最小值分别在Y轴上表现出来。
结果：图2为化合物5影响细胞内磷酸肌醇产生量的定量测试结果。在共转染GB1，GB2以及Gqi9的HEK293细胞中，化合物5可以抑制由10μMGABA引起的GABAB受体诱导的磷酸肌醇的生成，IC50为1.03μM，与拮抗剂CGP54626相当。
2、特异性标记识别受体的能力
2.1单转染GB1ASA HA、GB1HA、GB2Flag和共转染GB1HA、GB2Flag质粒的HEK293细胞与2μM化合物5孵育2h，同时用转染空质粒PRK6的细胞作为阴性对照。然后365nm紫外光照射1h，细胞用HBS(pH 7.4)洗涤两次以除去过量的探针分子。将细胞转移至离心管中，加入冰浴冷却的细胞裂解液，超声混匀，然后4℃在12000rpm转速下离心5min，取出上清液，将其分成两份。一份与Avidin磁珠孵育，HBS(pH7.4)洗涤两次，在磁珠上富集的蛋白样品与另一份上清液用SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉和0.1％吐温20的TBS溶液在室温下封闭1h，再与抗HA或抗Flag的抗体在4℃孵育过夜，之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育2h，免疫印迹用化学发光试剂检测，用X-射线胶片成像。
结果：在单转染GB1ASA HA、GB1HA、GB2Flag和共转染GB1HA、GB2Flag质粒的HEK293细胞中，化合物5可以特异性标记膜上的GB1ASA HA亚基和GB1HA+GB2Flag亚基，经Avidin磁珠亲和层析，所标记的蛋白可以被抗HA或抗Flag的抗体检测(见图3-a)。
2.2小鼠的小脑颗粒神经元与2μM化合物5孵育2h，然后365nm紫外光照射1h，细胞用HBS(pH 7.4)洗涤两次以除去过量的探针分子。将细胞转移至离心管中，加入冰浴冷却的细胞裂解液，超声混匀，然后4℃在12000rpm转速下离心5min，取出上清液，将其分成两份。一份与Avidin磁珠孵育，HBS(pH7.4)洗涤两次，在磁珠上富集的蛋白样品与另一份上清液用SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉和0.1％吐温20的TBS溶液在室温下封闭1h，再与抗GB1或抗GB2的抗体在4℃孵育过夜，之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育2h，免疫印迹用化学发光试剂检测，用X-射线胶片成像。
结果：在小鼠的小脑颗粒神经元中，化合物5可以特异性标记细胞膜上的GABAB受体，经细胞裂解、Avidin磁珠亲和层析，所标记的GABABB受体的GB1与GB2亚基能分别被抗GB1与抗-GB2抗体检测(见图3-b)。
实验实施例2：标记活细胞膜表面受体实验
共转染野生型GB1、GB2以及改进的Gqi9的cDNA的人胚肾细胞HEK293与10μM化合物7以及1μM高特异性Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM孵育1h，然后加入10μM GB2的激动剂CGP7930，用荧光显微镜观测不同时间点细胞内荧光的颜色以及强度情况。
结果：化合物7可以特异性拮抗膜上的GABAB受体，该受体依旧可以被CGP7930激活并引起胞内Ca2+浓度的变化(见图4)。
实验实施例3：将GABAB受体标记在拮抗状态下，在激动剂刺激下研究信号蛋白的变化情况。
小鼠的小脑颗粒神经元与2μM化合物5孵育2h，然后365nm紫外光照射1h，细胞用HBS(pH 7.4)洗涤两次以除去过量的探针分子，然后加入CGP7930(100μM)，在不同时间点裂解细胞，一半裂解液用Avidin磁珠富集，富集的蛋白与另一半裂解液用SDS-PAGE分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉和0.1％吐温20的TBS溶液在室温下封闭1h，再与抗Akt或抗磷酸化Akt的抗体在4℃孵育过夜，之后与连有辣根过氧化物酶的第二抗体孵育2h，免疫印迹用化学发光试剂检测，用X-射线胶片成像。
结果：在小鼠的小脑颗粒神经元中，化合物5与细胞预孵育使膜上的GABAB受体保持在拮抗状态，再用作用于GB2的激动剂CGP7930刺激细胞，激活G蛋白并引起下游信号蛋白的变化。经温和裂解细胞、Avidin磁珠亲和层析、SDS-PAGE分离以及相应抗体检测，可以发现化合物5所标记的GABAB受体与其它蛋白形成的复合物中信号蛋白Akt以及磷酸化Akt的含量随着时间变化(见图5)。
Claims (9)
1.一类结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子：
其中：
R1为R1a、R1b或R1c；
R2为生物素biotin、HA、Flag、Myc、His、羧基荧光素FAM、异硫氰酸荧光素FITC、四乙基罗丹明Rhodamine B、羧基四甲基罗丹明TAMRA、Cy3、Cy5、Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568；
R3为叠氮基、三氟甲基双吖丙啶基、苯甲酰基或二苯甲酮基；
X为-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-或者-C1～C8亚烷基-NH-C(O)-苯基-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-三氮唑基-C1～C4亚烷基-NH-；n为0～4的整数；
且，R3与X中的苯基相连。
2.根据权利要求1所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式I中：
R1为R1c；
R2的定义与权利要求1相同；
R3为三氟甲基双吖丙啶基、苯甲酰基或二苯甲酮基；
X的定义与权利要求1相同。
3.根据权利要求1或2所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式I为如下的通式II：
其中：
m为0～7的整数；
Y为-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-或者-O-(C1～C4亚烷基-O)n-C1～C4亚烷基-NH-C(O)-C1～C4亚烷基-三氮唑基-C1～C4亚烷基-NH-；n为0～4的整数；
R2的定义与权利要求2相同；
R3为三氟甲基双吖丙啶基或苯甲酰基。
4.根据权利要求3所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式II为如下的通式III：
其中：
n为0～4的整数；
R2的定义与权利要求3相同。
5.根据权利要求4所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式III中：
n为2；
R2为生物素或Alexa Fluro 488。
6.根据权利要求3所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式II为如下的通式IV：
n为0～4的整数；
R2的定义与权利要求3相同。
7.根据权利要求6所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，其中，通式IV中：
n为2；
R2为生物素、四乙基罗丹明或HA。
8.根据权利要求1所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子，该光亲和标记双功能探针分子具体为：
9.权利要求1所述的结构式如通式I所示的光亲和标记双功能探针分子的用途：
所述光亲和标记双功能探针分子
(1)作为活性的GABAB受体探针分子，特异性标记细胞膜上的GABAB受体，包括在原代神经细胞和过表达系统；或
(2)作为GABAB受体特异性示踪剂；或
(3)作为特异性探针，用于观察细胞膜内信号蛋白的变化以及用于新靶点的发现和蛋白质谱的研究。
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