CN1908661A - 一类小分子探针设计的结构模块、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类小分子探针设计的结构模块,制备方法及用途。该类结构模块包括:活性基团的连接位点、光亲合标记基团,潜在的报告基团以及连接部位。此类结构模块设计的探针分子用于高通量筛选,进行相关蛋白谱研究,靶标蛋白的鉴别,与其靶点作用模式的研究。本发明结构新颖、合理、制备方法相对简单,易于制备。
Description
技术领域
本发明涉及一类用于小分子探针设计的结构模块的制备及其在寻找新药中的应用。本发明涉及的结构模块将“click”化学的应用拓展到非共价作用的探针分子的设计、应用,应用此类结构模块设计的探针分子可用于高通量筛选;进行相关蛋白谱的研究;靶标蛋白的鉴别、及与其靶点作用模式的研究。本发明还涉及该类结构模块的结构设计及制备方法。
背景技术
药物发现过程包括许多阶段如:靶点的鉴别、先导化合物的发现、小分子化合物的结构优化、临床前及临床试验等。靶点的鉴别是药物发现与发展过程中的关键步骤(Curr.Opin.Chem.Biol.2002,6:427~433),而目前基因水平上的生物技术不能解决哪种蛋白质是针对某种疾病的小分子药物的靶点。可以预见,在基因组学基础上开展的蛋白质组学研究将导致药物开发方面的实质性突破,使得生命科学研究能实现其最终目标,研制出治疗包括癌症和艾滋病等在内的多种疾病的药物。因此针对药物发现的技术重心已经由基因组转向了蛋白质组。运用基于活性分子设计合成的高选择性的探针分子对蛋白质的功能与结构进行研究,它不仅应用于鉴别与活性分子相互作用的靶标蛋白,同时也对其相互作用模式进行研究,为寻找新药提供重要信息。
通常根据与受体蛋白的作用方式,探针分子可分共价作用与非共价作用两类。共价作用的探针分子(图1,a所示)包括:活性基团(reactivity group)、连接部位(linkerunit)、报告基团(reporter group)。活性基团就像一个弹头,结合并共价修饰靶蛋白,报告基团或称为标签(tag)如荧光素(fluorescence)由于其高灵敏性,可用于定量检测标记蛋白,或如尘物素(biotin)可以富集、纯化或鉴别被标记蛋白。非共价作用的探针分子(图1,b所示)包括:活性基团、光亲合标记基团(photoaffinity labelinggroup)、报告基团以及连接部位。活性基团的作用是将探针分子导向受体蛋白的活性中心;光亲和标记基团的作用是在探针分子被导向受体蛋白的活性中心之后经特定波长的紫外光照射分解产生高活性的卡宾或氮宾中间体,将探针分子共价修饰在受体蛋白的活性中心;报告基团主要是方便以后的分离、纯化、检测等操作。
探针分子的分子量通常在700-1000Da,这主要是由于报告基团造成的,这些报告基团可能改变活性分子在体内的性质及其与靶蛋白的作用模式,并因此限制了探针分子在体内细胞的吸收与分布。标记试验一般都是在体外进行的,如细胞或组织匀浆液,这种试验方式可能会改变细胞或组织内活性酶或非活性酶的浓度及它们各自的亚细胞分布。因此体外的功能蛋白质组学研究只能大致的揭示活细胞或动物体内组织中蛋白质的功能状态。
近年来共价作用的探针分子标记试验引入了“click”化学(DDT.2003,8:1128~1137),发展了没有标签(tag-free)的探针分子(如图2,a所示),它可以在细胞内或动物体内(在原位)对受体蛋白进行标记试验。它包括:活性基团、连接部位、潜在的报告基团。报告基团是在探针分子共价标记了靶蛋白后,通过Huisgen 1,3-偶极环加成反应(炔基与叠氮基反应形成稳定的三氮唑结构)连接到探针分子上。Sharpless等发现在Cu(I)催化下炔基与叠氮基可以在温和的条件下高产率得到三氮唑(如图2,b所示),这一发现使得“click”化学可以有效地应用于功能蛋白质组学的研究中。其前提条件是必需找到与靶蛋白不可逆、共价结合的活性小分子,并以此为基础设计与靶蛋白不可逆结合的“click”探针分子。但是很多情况下我们所能得到的活性小分子与靶蛋白之间的作用是可逆的,活性小分子不能共价修饰靶蛋白,它们之间的作用是不牢固的。
本发明涉及的结构模块可将“click”化学的应用拓展到非共价作用的探针分子的设计、应用。本发明涉及的结构模块包括:用于连接活性基团的连接位点、光亲和标记基团、潜在的报告基团及连接部位。
发明内容
本发明目的是提供一类用于小分子探针设计的结构模块。
本发明另一目的是提供该类结构模块的制备方法。
本发明再一目的是提供该类结构模块的用途。
本发明是一类用于小分子探针设计的结构模块的制备及其在药物发现中应用。这类结构模块将“click”化学的应用从共价作用的探针分子的设计、应用,拓展到非共价作用的探针分子的设计、应用。应用此类结构模块设计的“click”探针分子可用于高通量筛选;进行相关蛋白谱的研究;靶标蛋白的鉴别、及与其靶点作用模式的研究本。本发明的另一目的在于提供制备该类结构模块的方法。
本发明所述的一类结构模块具有如下结构:
该类结构模块包括:活性基团的连接位点、光亲合标记基团、潜在的报告基团,以及连接部位。
其中X为C、NH、O;
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,在某些情况下则为活性基团中的一部分;
R1为叠氮基、trifluoromethyldiazirine、苯甲酰基、二苯甲酮基;
R2为H、-OCH3;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
当X为C时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,在某些情况下则为活性基团中的一部分;
R1为trifluoromethyldiazirine;
R2为H、-OCH3;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
当X为NH时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,
R1为trifluoromethyldiazirine或R1为trifluoromethyldiazirine且R1在苯环上处于连接部位的对位;
R2为H、-OCH3或R2为-OCH3且R2在苯环上处于连接部位的邻位;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
当X为O时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,
R1为trifluoromethyldiazirine或R1为trifluoromethyldiazirine且R1在苯环上处于连接部位的对位;
R2为H、-OCH3或R2为-OCH3且R2在苯环上处于连接部位的邻位;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
本发明通过下列步骤实施:
根据化学反应式
化合物I’、II’由化合物I、II与氯乙酰氯反应得到;反应在如下溶剂中进行:DMF、EtOAc、CH2Cl2、或上述溶剂的混合溶剂;反应中需加入碱作催化剂如:Py、Et3N、DMAP;通常反应温度从0℃到60℃;反应时间约需1到24小时;反应完成后一般用EtOAc、CH2Cl2、CHCl3等溶剂提取,饱和食盐水洗,经干燥后,低温减压除去溶剂,浓缩物经柱层析得化合物I’、II’;得到的产物用NMR等方法来证明。
化合物I”、II”由化合物I’、II’与叠氮化钠反应得到;反应在如下溶剂中进行:DMF、EtOAc、CH2Cl2、丙酮、或上述溶剂的混合溶剂;反应中加入或不加入NaI作催化剂;通常反应温度从0℃到100℃;反应时间约需1到24小时;反应完成后一般用EtOAc、CH2Cl2、CHCl3等溶剂提取,饱和食盐水洗,经干燥后,低温减压除去溶剂,浓缩物经柱层析得化合物I”、II;得到的产物用NMR等方法来证明。
附图说明
图1是探针分子的结构示意图。
图2是没有标签的探针分子,它可以在细胞内或动物体内,对受体蛋白进行标记试验。它包括:活性基团、连接部位、潜在的报告基团。报告基团是在探针分子共价标记了靶蛋白后,通过Huisgen1,3-偶极环加成反应,连接到探针分子上。
图3是Click探针分子(Qiu720)能特异性的标记大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶,同时被Luo288竞争。
有益效果:
本发明设计、制备了一类用于小分子探针设计的结构模块,并运用此类结构模块设计、制备了针对大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶(EcMetAP1)的“click”探针分子,试验表明探针分子能很有效的标记大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶。所以应用此类结构模块设计的探针分子可用于高通量筛选;进行相关蛋白谱的研究;靶标蛋白的鉴别、及与其靶点作用模式的研究。这些工作将为构效关系的研究提供必须的重要的信息,促进药物的发现。本发明涉及的该类结构模块的结构新颖、合理,制备方法相对简单,易于制备。
具体实施方式
下列实施例说明应用被本发明所涵盖的结构模块设计、制备针对大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶(EcMetAP1)的“click”探针分子及其应用,但这里仅仅是举例说明,并不限制本发明。
化合物2的制备:
化合物1(350mg,0.76mmol)溶解在15mL 4N HCl的二氧六环溶液中,室温搅拌2小时减压除去溶剂,0℃加入H2O(10mL),二氧六环(10mL),NaHCO3(255mg,3.0mml),室温搅拌5小时反应完成。加入30mLH2O,3×30mL EtOAc萃取,合并有机层,3×30mL饱和食盐水洗,分出有机层,无水Na2SO4干燥。柱层析(石油醚∶乙酸乙酯=2∶3)得淡黄色油状物220mg,产率66.3%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.48(2H),3.57(m,2H),3.63(2H),3.70(2H),3.89(2H),4.02(2H),4.24(2H),6.72(1H),6.84(1H),7.03(1H),7.82(1H),10.45(1H)。
化合物3的制备:
化合物2(170mg,0.39mmol)溶解在30mL丙酮中,加入NaN3(126mg,1.94mmol),NaI(58mg,039mmol),60℃搅拌12小时反应完成。减压除去溶剂,加入50mL H2O,3×30mL EtOAc萃取,合并有机层,3×30mL饱和食盐水洗,分出有机层,无水Na2SO4干燥。柱层析(氯仿∶甲醇=30∶1)得淡黄色油状物170mg,产率98.5%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.50(2H),3.58(2H),3.64(2H),3.72(2H),3.91(2H),3.96(2H),4.27(2H),6.75(1H),6.86(1H),7.85(1H),10.48(1H)。
化合物4的制备:
化合物3(84mg,0.19mmol)溶解在6mL吡啶中,0℃加入Bu4NMnO4(136mg,0.38mmol),室温搅拌3小时反应完成。加入10mL饱和亚硫酸钠溶液,1N HCl调pH 3至4,3×30mL EtOAc萃取,合并有机层,3×30mL饱和食盐水洗,分出有机层,无水Na2SO4干燥。柱层析(氯仿∶甲醇=30∶1)得淡黄色油状物45mg,产率51.7%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.39(2H),3.56(2H),3.63(2H),3.73(2H),3.88(4H),4.24(2H),6.85(1H),6.95(1H),7.83(1H)。
化合物5的制备:
化合物4(35mg,0.08mmol)溶解在6mL THF与6mLCH3CN的混合溶液中,加入EDC(22mg,0.11mmol),HOSu(13mg,0.11mmol),室温搅拌12小时反应完成。减压除去溶剂,加入30mL H2O,3×30mL EtOAc萃取,合并有机层,3×30mL饱和食盐水洗,分出有机层,无水Na2SO4干燥。柱层析(氯仿∶甲醇=30∶1)得淡黄色油状物35mg,产率82.7%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ2.90(4H),3.37(2H),3.54(2H),3.60(2H),3.71(2H),3.86(2H),3.89(2H),4.27(2H),6.91(1H),7.05(1H),8.04(1H)。
化合物6(“click”探针分子,Qiu720)的制备:
化合物5(35mg,0.06mmol),化合物7(21mg,0.08mmol)溶解在8mL DMF中,加入45uL Et3N,室温搅拌12小时反应完成。加入30mL H2O,3×30mL EtOAc萃取,合并有机层,3×30mL饱和食盐水洗,分出有机层,无水Na2SO4干燥。柱层析(氯仿∶甲醇=30∶1)得白色固体45mg,产率99.1%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.34(2H),3.45(2H),3.54(2H),3.64(2H),3.85(2H),3.92(2H),4.35(2H),4.43(2H),7.00-7.08(3H),7.48(1H),7.63(1H),8.20(1H),8.42(1H),9.17(1H)。
“click”探针分子(Qiu720)与靶标蛋白大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶(EcMetAP1)结合的实施例:
实验步骤:
EcMetAP1的表达纯化
通过RT-PCR方法获得大肠杆菌甲硫氨酰氨肽酶基因,并构建入pGEMEX-1载体(购自Promega公司)。所获得的pGEMEX-1/EcMetAP1重组质粒经测序验证,转化至表达型大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株。挑单克隆菌落于1L含100.μg/mL氨苄青霉素的LB丰富培养基,37℃,180rpm培养过夜至细菌浓度达OD600值达0.4-0.6,加入1mMIPTG于30℃诱导表达5小时。6000g离心3分钟收获表达细菌(约1.6g/L表达菌),用含50mM HEPES,pH 7.5、150mM KCl、15mM methionine、5mM EDTA、0.1%TritonX-100和10%glycerol的60mL裂解液重新悬浮细胞,并于4℃进行2分钟超声波破细胞处理。将上述含有目的蛋白的裂解液于4℃12000g离心15分钟,弃沉淀取上清,加入固体硫酸铵至30%饱和度,4℃搅拌30分钟后12000g离心15分钟收集上清,同样方法加入硫酸铵至60%饱和度,离心后收集上清加入硫酸铵颗粒至70%饱和度,离心得沉淀,并将沉淀重新溶解于HEPES缓冲液(50mM HEPES,pH 7.5、150mM KCl)。采用55mL HiPrep16/10层析柱除去蛋白溶液中的残余硫酸铵。再将目的蛋白流经HiPrepQ-Sepharose,结合去掉蛋白溶液中的一些杂质,最后纯化得到蛋白经SDS-PAGE胶分离,考马斯亮兰染色呈单一条带,分子量大小约为30kDa。
光亲和标记实验
40uM EcMetAP1加入80uM的Co2+,孵育5分钟,再加入80uM的化合物6(Qiu720,溶解在DMSO中),黑暗中4℃孵育2小时。孵育完成后,转移到核磁管中,紫外照射2小时。然后移至1.5mL的eppendorf管中,10,000rpm离心15分钟。取上清至另一个eppendorf管中,加入5mM的EDTA,4℃孵育过夜。用2L HEPES缓冲液(50mM HEPES、pH 7.5、150mM KCl)透析,12小时换一次溶液,总共3次。
Click反应
透析后的EcMetAP1约20uM,加入50uM的Cu2+、50uM带炔基的Biotin、50mM维生素C的钠盐,混匀,室温反应2小时。
Western blot检测
Click反应后的样品进行SDS-PAGE,然后把蛋白转移到PVDF膜上,用1%的BSA封阻一个小时,TBST洗膜两次,每次5分钟。接着把膜与用TBST 1∶10,000稀释的streptavidin-HRP(Sigma,Cat.S 2438)室温孵育1小时。用TBST洗膜六次,每次5分钟后,用Enhanced ChemiLuminescence(ECL,Amersham)检测试剂盒曝光,带有Biotin的蛋白就可以在X-胶片上看到。
本应用实例表明(如下图所示),“click”探针分子(Qiu720)能特异性的标记大肠杆菌I型甲硫氨酰氨肽酶(29kD),同时能被Luo288竞争。(Luo288是EcMetAP1的抑制剂,作为一个阳性化合物与Qiu720竞争同一活性位点)。
Claims (7)
2、根据权利要求1所述的小分子探针的结构模块,其特征在于
当X为C时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,在某些情况下则为活性基团中的一部分;
R1为trifluoromethyldiazirine;
R2为H、-OCH3;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
3、根据权利要求1所述的小分子探针的结构模块,其特征在于
当X为NH时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,
R1为trifluoromethyldiazirine或R1为trifluoromethyldiazirine且R1在苯环上处于连接部位的对位;
R2为H、-OCH3或R2为-OCH3且R2在苯环上处于连接部位的邻位;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
4、根据权利要求1所述的小分子探针的结构模块,其特征在于
当X为O时
Y为各种活性基团的连接位点:活化的羧基、或氨基、酯基、羟基,
R1为trifluoromethyldiazirine或R1为trifluoromethyldiazirine且R1在苯环上处于连接部位的对位;
R2为H、-OCH3或R2为-OCH3且R2在苯环上处于连接部位的邻位;
连接部位为C1-C8的烷基、取代烷基、C1-C8的烷氧基、取代烷氧基。
5、根据权利要求2所述的小分子探针的结构模块的制备方法,包括
a、化合物I、II与氯乙酰氯在碱作催化剂,反应温度以0℃~60℃,反应时间为1到24小时,用有机溶剂提取,饱和NaCl溶液洗,干燥,低温减压浓缩,浓缩物柱层析分离分别得到I′和II′;
b、化合物I′和II′分别与叠氮化钠在DMF、EtOAc、CH2Cl2、丙酮、或上述溶剂的混合溶剂中反应,反应中加入或不加入催化剂NaI反应温度从0℃~100℃,反应时间为1~24小时,反应用有机溶剂提取饱和NaCl溶液洗、干燥、低温减压浓缩,浓缩物分别上柱层析分离分别得化合物I″和II″。
6、根据权利要求5所述的小分子探针的结构模块的制备方法,其特征在于反应完毕后,化合物I′、II′或I″、II″用CH2Cl2、CHCl3或EtOAc提取。
7、如权利要求1所述结构模块的用途,用于高通量筛选、靶标蛋白的鉴别,靶点作用模式研究以及对相关蛋白谱的研究。
8、根据权利要求1所述的小分子探针的结构模块的用途,其特征在于将“Click”化学从设计共价作用的探针分子拓展到设计非共价作用的探针分子以及它们的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070207 |