CN108069966B - 用于snap蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于SNAP蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用。探针分子合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便,对蛋白识别能力专一,响应速度较快。在水溶液中,该探针荧光信号微弱,在SNAP蛋白的存在下,其与SNAP蛋白专一性结合并且荧光增强约30倍,结合后探针的发射波长发生蓝移约为530nm。与现有的SNAP荧光探针相比,该探针选择性高,能够在复杂环境的生物体系中专一识别SNAP,在生物及医学领域有极其重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测领域,具体涉及一种用于SNAP蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用。
背景技术
蛋白质是细胞的基本组成成分,是生命功能的体现者。研究蛋白质的结构、功能机器在细胞内的运动特征、相互作用和化学微环境等,对于了解细胞复杂的生命过程至关重要。近年来,蛋白质特异性标记技术,尤其是基因编码融合标签技术的不断发展,满足了这些研究的需求。绿色荧光蛋白(GFP)的发现及医用,是活细胞蛋白特异性标记方法发展的一个里程碑,它可以再不额外加入任何底物的情况下发出荧光,结合荧光成像技术可实现对活细胞内蛋白质的可视化监测。但GFP的荧光光谱较为单一,发光具有氧依赖性,且存在应答较为缓慢、灵敏度不高等缺点,使得GFP在生物物理及机理方面的研究中存在一定的局限性。
近十年来,蛋白质的特异性小分子荧光探针标记技术的发展,克服了GFP在蛋白等诸多领域应用中的局限性。小分子荧光探针对蛋白的标记主要通过共价键(双砷-四半胱氨酸体系、SNAP-tag、Halo-tag等),非共价键(氢键,金属配位等)以及基因工程(非天然氨基酸等)等对目标蛋白进行修饰而达到荧光标记的效果。
SNAP-tag蛋白是对由207个氨基酸组成的DNA修复蛋白酶(O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶,hAGT)进行突变改造而获得的。其中作为反应位点的半胱氨酸能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤进行亲核反应。脱去鸟嘌呤后,半胱氨酸能够与苄基形成稳定的硫醚键,从而以共价键形式达到与荧光底物高特异性的结合。因此,通过有机合成手段可以将多种多样的有机小分子荧光探针引入苄基端,从而达到荧光探针与SNAP-tag蛋白的特异性结合。荧光探针具有灵敏度高、选择性好、操作简单等优点,已成为细胞生物学和医学领域最为有用的工具。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于SNAP蛋白标记的小分子荧光探针和应用,在水溶液中,该探针荧光信号微弱,在SNAP蛋白的存在下,其与SNAP蛋白专一性结合并且荧光增强约30倍,结合后探针的发射波长发生蓝移约为530nm。
本发明的另一目的是提供一类用于SNAP蛋白标记的小分子荧光探针的合成方法,该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。
本发明所采用的技术方案为:
本发明提供了一种用于蛋白标记的小分子荧光探针,该荧光探针结构如下:
本发明提供了所述荧光探针的制备方法,该方法具体步骤如下:
具体合成步骤如下:
(1)中间体化合物1的合成:
将4-溴-1,8-萘酐溶于无水乙醇中,并向该反应液加入4-氨甲基苄醇,将反应液加热至回流,6-8h后,减压除去乙醇,二氯甲烷为展开剂,柱色谱分离,得化合物1;
(2)中间体化合物2的合成:
将化合物1溶于乙二醇甲醚,并在氮气保护下向其中加入乙胺水溶液,将反应液缓慢加热至100-120℃,并搅拌24-48h,减压除去乙二醇甲醚,残留物以二氯甲烷和甲醇为展开剂,经硅胶柱分离,得化合物2;
(3)荧光探针3的合成:
将化合物2,6-(1-甲基吡咯)嘌呤和叔丁醇钾溶于二甲基甲酰胺DMF中,并在氮气下室温反应3-4h,减压除去二甲基甲酰胺DMF,残留物以二氯甲烷和甲醇为展开剂,硅胶柱分离,得到所需荧光探针3。
步骤(1)中柱色谱采用硅胶柱;
步骤(2)中硅胶柱以二氯甲烷:甲醇体积比为400:1-200:1为展开剂;
步骤(3)中硅胶柱以二氯甲烷:甲醇体积比为50:1-10:1为展开剂。
步骤(1)中,4-溴-1,8-萘酐、无水乙醇和4-氨甲基苄醇的质量比为(1-3):(10-30):1。
步骤(2)中,化合物1、乙二醇甲醚和乙胺水溶液的质量体积比为(150-250)mg:(3-6)mL:(50-150)μL。
步骤(3)中,化合物2、6-(1-甲基吡咯)嘌呤、叔丁醇钾和二甲基甲酰胺的质量体积比为100mg:(15-20)mg:(30-90)mg:(50-100)mL。
本发明还提供上述小分子荧光探针用于标记SNAP蛋白。
本发明具有以下有益效果:
探针分子合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便。
该探针在水溶液中,由于水的介电常数大导致其荧光信号微弱,然而乙醇、DMSO、丙酮等极性溶剂介电常数远小于水,非辐射跃迁减小其荧光显著增强,且波长蓝移。
该类探针能成功用于荧光标记,探针与SNAP蛋白特异性结合之后,荧光明显增加约30倍,通过这种荧光的显著增加,可以排除背景光的干扰。
该类探针可以通过SNAP标签技术,引入到目标蛋白中,对目标蛋白进行标记并应用于生物荧光成像等领域。
附图说明
图1本发明荧光探针的结构式;
图2本发明荧光探针合成路线图;
图3本发明荧光探针核磁谱图氢谱;
图4本发明荧光探针核磁谱图碳谱;
图5本发明荧光探针和SNAP作用前后的荧光光谱图,横坐标为波长,纵坐标为荧光强度,荧光探针的浓度为1μM,SNAP浓度为5μM;
图6本发明荧光探针与SNAP反应的动力学图谱,横坐标为时间,纵坐标为荧光强度,荧光探针的浓度为1μM,SNAP浓度为2μM;
图7本发明荧光探针在不同溶剂中的荧光光谱图,横坐标为波长,纵坐标为荧光强度,荧光探针的浓度为5μM,SNAP浓度为5μM。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
实施例1:用于蛋白标记的小分子荧光探针的合成
(1)中间体的合成:
将4-溴-1,8-萘酐(2.77g,10mmol)溶于25mL无水乙醇中,并向该反应液加入4-氨甲基苄醇(1.37g,10mmol)。将反应液加热至回流。6h后,减压除去乙醇,柱色谱分离(二氯甲烷:甲醇=100:1),得白色固体3.08g(中间体化合物1),产率78%。
将化合物1(200mg,0.51mmol)溶于5mL乙二醇甲醚,并在氮气保护下向其中加入100微升70%乙胺水溶液。将反应液缓慢加热至120℃,并搅拌2天。减压除去乙二醇甲醚,残留物经硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=80:1),得黄色固体150mg(中间体化合物2),产率82%。
(2)荧光探针的合成:
将化合物2(100mg,0.28mmol),6-(1-甲基吡咯)嘌呤和叔丁醇钾(60mg,0.54mmol)溶于50mL二甲基甲酰胺中,并在氮气下室温反应3h。减压除去溶剂,硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=20:1),得到黄色粉末100mg,产率73%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.41(s,1H),8.71(d,J=8.4Hz,1H),8.44(d,J=7.2Hz,1H),8.28(d,J=8.6Hz,1H),7.79(s,2H),7.67(t,J=7.8Hz,1H),7.43(d,J=7.7Hz,2H),7.35(d,J=7.9Hz,2H),6.76(d,J=8.7Hz,1H),6.28(s,1H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.42(dd,J=12.9,6.6Hz,2H),1.31(t,J=7.1Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ164.29,163.38,160.08,151.21,138.27,135.89,135.06,131.38,130.01,129.32,128.99,128.03,124.71,122.15,120.59,107.74,104.30,66.94,42.75,38.02,14.13.
实施例2:荧光探针与SNAP反应后的荧光变化
将该探针溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液,在4mL,20mM pH=7.4的PBS溶液中分别配置1μM探针和5μM SNAP。另用5μM SNAP配置1μM探针。37℃搅拌1h。测定荧光得到图5。
图5中只有探针存在时(1μM)显示微弱的荧光。而当探针与SNAP反应后,荧光有显著的增强,增强数倍,发射波长约为530nm。
实施例3:荧光探针与SNAP反应的动力学
在4mL,2μM SNAP溶液中加入1μM探针,测定530nm波长下的荧光变化(激发波长为460nm)得到图6,结果显示加入探针后荧光迅速增强,说明本探针能与SNAP特异性识别并迅速反应。
荧光明显增加约30倍,通过这种荧光的显著增加,可以排除背景光的干扰。
实施例4:荧光探针在不同溶剂里的荧光性质
探针在丙酮、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、纯水、甲醇、四氢呋喃和SNAP溶液中的荧光性质。每次取10μL荧光探针母液(2mM),分别加入4mL丙酮、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醇、纯水、甲醇、四氢呋喃和SNAP溶液中,配置成5μM荧光探针测试液,测定荧光得到图7。探针在水溶液中,由于水的介电常数大导致其荧光信号微弱,然而乙醇、DMSO、丙酮等极性溶剂介电常数远小于水,非辐射跃迁减小其荧光显著增强,且波长蓝移。在未与SNAP蛋白结合前,由于探针分子处于水环境中,其荧光亮度较低;当与SNAP蛋白结合之后,探针处于蛋白的疏水环境中,其亮度就会明显增强。
Claims (7)
2.一种权利要求1所述小分子荧光探针的合成方法,其特征在于:该方法步骤如下:
(1)中间体化合物1的合成:
将4-溴-1,8-萘酐溶于无水乙醇中,并向该反应液加入4-氨甲基苄醇,将反应液加热至回流,6-8 h 后,减压除去乙醇,二氯甲烷为展开剂,柱色谱分离,得化合物1;
(2)中间体化合物2的合成:
将化合物1溶于乙二醇甲醚,并在氮气保护下向其中加入乙胺水溶液,将反应液缓慢加热至100-120℃,并搅拌24-48h,减压除去乙二醇甲醚,残留物以二氯甲烷和甲醇为展开剂,经硅胶柱分离,得化合物2;
(3)荧光探针3的合成:
将化合物2,6-(1-甲基吡咯)嘌呤和叔丁醇钾溶于二甲基甲酰胺DMF中,并在氮气下室温反应3-4 h,减压除去二甲基甲酰胺DMF,残留物以二氯甲烷和甲醇为展开剂,硅胶柱分离,得到所需荧光探针3。
3.如权利要求2所述的合成方法,其特征在于:
步骤(1)中柱色谱采用硅胶柱;
步骤(2)中硅胶柱以二氯甲烷:甲醇体积比为400:1-200:1为展开剂;
步骤(3)中硅胶柱以二氯甲烷:甲醇体积比为50:1-10:1为展开剂。
4.如权利要求2所述的合成方法,其特征在于:步骤(1)中,4-溴-1,8-萘酐、无水乙醇和4-氨甲基苄醇的质量比为(1-3):(10-30):1。
5.如权利要求2所述的合成方法,其特征在于:步骤(2)中,化合物1、乙二醇甲醚和乙胺水溶液的质量体积比为(150-250)mg:(3-6)mL:(50-150)μL。
6.如权利要求2所述的合成方法,其特征在于:步骤(3)中,化合物2、6-(1-甲基吡咯)嘌呤、叔丁醇钾和二甲基甲酰胺的质量体积比为100mg:(15-20)mg:(30-90)mg:(50-100)mL。
7.一种权利要求1所述小分子荧光探针用于非疾病诊断结果或健康状况为直接目的的标记SNAP蛋白。
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