CN112939978B - 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用 - Google Patents

一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112939978B
CN112939978B CN201911258677.4A CN201911258677A CN112939978B CN 112939978 B CN112939978 B CN 112939978B CN 201911258677 A CN201911258677 A CN 201911258677A CN 112939978 B CN112939978 B CN 112939978B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhob
snap
cooh
reaction
under reduced
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911258677.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112939978A (zh
Inventor
徐兆超
周伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201911258677.4A priority Critical patent/CN112939978B/zh
Publication of CN112939978A publication Critical patent/CN112939978A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112939978B publication Critical patent/CN112939978B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/18—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 one oxygen and one nitrogen atom, e.g. guanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1074—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing more than three nitrogen atoms as heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种高亮度、快速标记的SNAP蛋白标签及其合成与生物应用，其结构为从底环位置引出甲胺丁酸后，再通过酰胺化连接BG基团，设计一例高亮度、高光稳定性的红色荧光SNAP蛋白标签。该SNAP蛋白标签在水相中分散度好，与SNAP蛋白反应快速，通过染料在细胞膜上的密度增强获得荧光增强响应效果，实现对SNAP蛋白的长时间免洗成像，在细胞生物学的研究中有着广阔前景。

Description

一种高亮度、快速标记的SNAP蛋白标签及其合成与生物应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体地说，涉及一例基于罗丹明B母体、高亮度高稳定性的快速标记SNAP蛋白标签及其制备方法。
背景技术
蛋白质是由多种氨基酸为基本构成单元经组装、折叠形成的复杂生物大分子,它是组成所有生物体的物质基础,参与了生物体几乎所有的生命活动。由于组成氨基酸单元的数量、序列，以及折叠方式的不同,可形成数量繁多,性质、功能不同的蛋白质。研究细胞内蛋白质的结构、性质、功能、微环境、动态变化及蛋白间相互作用等对于了解细胞复杂的生命过程至关重要。
可视化的荧光分析方法对于在细胞内原位研究蛋白质的相关性质及功能提供了强有力的工具。但是如何实现荧光分子在复杂生物体系中对靶标蛋白质的特异性标记是一项巨大的挑战。近年来,基因编码融合蛋白标签方法的不断发展满足了活细胞内蛋白质特异性荧光标记研究的需求,极大地提高了蛋白质荧光标记的时间与空间分辨率。荧光蛋白的发现及应用是活细胞内蛋白质特异性标记方法发展的里程碑,荧光蛋白可通过分子生物学技术实现与目标蛋白的融合表达, 具有极高的特异性,可实现对活细胞内蛋白质微观动态变化过程的可视化追踪。不过由于荧光蛋白的种类相对较少,结构较为单一,功能不够丰富,光性质较差,而小分子的荧光染料具有结构易修饰，种类繁多，波谱范围全面，光性质优越等性质，同时与蛋白标签相连，实现了多种蛋白质特异性荧光小分子标记的构想，具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的内容在于提供一例基于四乙基罗丹明的SNAP蛋白标签，具有高亮度、快速标记等优势。
本发明的内容提供一种基于四乙基罗丹明的SNAP蛋白标签的合成方法，该方法具有原料价格低廉、制备方法简便等特点。
本发明提供一种SNAP蛋白标签，该SNAP蛋白标签以四乙基罗丹明为母体，螺酯羧酸或底环羧酸位置引出甲胺丁酸后连接BG基团，具体的化学结构如下：
Figure BDA0002311013340000021
该SNAP蛋白标签基于四乙基罗丹明为母体，具有高亮度、高稳定性的优异性质，以及水相中良好的分散性，可以进行固定细胞的快速免洗的SNAP蛋白标记成像；同时由于其高度的不透膜性，又可以作为活细胞细胞膜的长时间 SNAP蛋白成像。
一类基于四乙基罗丹明的SNAP蛋白标签(结构1)合成方法如下：
结构1的合成方法：
Figure BDA0002311013340000031
结构1的RhoB-SNAP具体制备过程如下：
(1)中间体RhoB-NHS的合成：在单口瓶中加入罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，得到粗产品RhoB-NHS，直接进行下一步反应；其中罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.6-0.8:0.2-0.4，罗丹明B与二氯甲烷的质量与体积比为1:10-20(g/mL)；
(2)中间体RhoB-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入粗产品RhoB-NHS、N- 甲基丁酸盐酸盐，加入色谱纯乙腈溶解，再向反应体系中加入有机碱，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝7-10：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体；其中RhoB-NHS、N-甲基丁酸盐酸盐的质量比为1:0.3-0.4，有机碱与乙腈的体积比为1:8-15，RhoB-NHS与有机碱的质量与体积比为1:2-3(g/mL)；
步骤(2)中使用的有机碱为三乙胺或N,N-二乙基丙胺。
缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC，反应时间以点板检测为准。
(3)结构1的SNAP蛋白标签RhoB-SNAP的合成：分别称取RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂于于史莱克瓶中，抽充氮气3 次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体SNAP蛋白标签RhoB-SNAP；其中，RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂的质量比为1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB- 甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。
步骤(3)中碱试剂为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、为三乙胺或N,N-二乙基丙胺。
缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC，反应时间以点板检测为准。
结构2 RhoB-COOH-SNAP的合成方法具体如下：
Figure BDA0002311013340000041
Figure BDA0002311013340000051
结构2 RhoB-COOH-SNAP的合成方法具体如下：
(1)中间体RhoB-COOH的合成：在双口瓶中加入间二乙氨基苯酚、偏苯酸酐，抽充氮气三次后，升温至170℃，搅拌4h后，再向反应体系中加入酸性催化剂后，继续维持这个温度搅拌2h；降温降到70℃后，向反应体系中加入甲醇，回流搅拌30min，水洗，二氯甲烷萃取；收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-5：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH；其中二乙氨基苯酚、偏苯酸酐的质量比为1:0.5-1，酸性催化剂与甲醇的体积比为1:1-3，二乙氨基苯酚与酸性催化剂的质量与体积比为1:1-3(g/mL)；
结构2的步骤(1)中使用的酸性催化剂为磷酸、硫酸、甲磺酸或三氟乙酸中的一种或两种以上混合试剂。
(2)中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入混合物RhoB -COOH、缩合试剂、HOBt，抽充氮气三次后，加入无水DMF溶解，再向反应体系中加入碱试剂，室温搅拌30分钟后，再向反应体系中加入甲胺丁酸盐酸盐的无水DMF溶液，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸；其中RhoB-COOH、缩合试剂、HOBt的质量比为1:0.3-0.4：0.3-0.5，无水DMF与碱试剂的体积比为5-15:1， RhoB-COOH与无水DMF的质量与体积比为20-60:1(mg/mL)；
(3)结构2的SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的合成：分别称取RhoB -COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碳酸钾于于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP；其中，RhoB-COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碳酸钾的质量比1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB-COOH-甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。
缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC；碱试剂为无机碱碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺或N,N-二乙基丙胺。
本发明的有益效果如下：提供一种SNAP蛋白标签及其应用，该SNAP蛋白标签具有高的荧光亮度以及光稳定性，同时具有高的细胞膜非穿透性，可以应用于固定细胞任意转染SNAP蛋白以及活细胞细胞膜蛋白的快速免洗成像；同时合成步骤简便，易于生产。
本发明提供了一种新型的具有高亮度、快速标记等优势的SNAP蛋白标签，可以应用于固定细胞及活细胞膜蛋白的免洗标记。
附图说明
图1实施例1得到的SNAP-蛋白标签RhoB-SNAP的高分辨质谱图
图2实施例2得到的中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的高分辨质谱图
图3实施例2得到的SNAP-蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的高分辨质谱图
图4实施例1得到的SNAP-蛋白标签RhoB-SNAP在转染完细胞核SNAP蛋白后得固定细胞的细胞核成像图
图5实施例2得到的SNAP-蛋白标签RhoB-COOH-SNAP在转染完细胞核 SNAP蛋白后得固定细胞的细胞核成像图
具体实施方式
实施例1
SNAP-蛋白标签RhoB-SNAP的合成
中间体RhoB-NHS的合成：
Figure BDA0002311013340000071
在单口瓶中加入1g的罗丹明B、520mg的缩合剂EDC、240mg的N-羟基琥珀酰亚胺，加入15mL二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜。点板监测，待反应完毕后，停止反应。减压除去溶剂后，得到粗产品RhoB-NHS，直接进行下一步反应。
中间体RhoB-甲胺丁酸的合成
Figure BDA0002311013340000072
在单口瓶中加入上一步全部的粗产品RhoB-NHS、320mgN-甲基丁酸盐酸盐，加入色谱纯20mL乙腈溶解，再向反应体系中加入2mL三乙胺，室温搅拌过夜。点板监测，待反应完毕后，停止反应。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝7-10：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体530mg，产率42％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.88(s,2H),7.77–7.70(m,2H),7.69–7.64 (m,1H),7.55–7.49(m,1H),6.94(s,2H),6.86(s,2H),3.48(d,J＝6.9Hz,8H), 3.14–3.06(m,2H),2.15(s,12H),1.68(t,J＝7.3Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,2H). 结构1的SNAP蛋白标签RhoB-SNAP的合成
Figure BDA0002311013340000081
分别称取30mg的RhoB-甲胺丁酸、15mg的BG标签分子、17mg缩合剂 EDC盐酸盐、13mg的HOBt、52mg碳酸钾于于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入4mL的无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体22mg，产率39％。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.08(s,1H),8.08(s,1H),8.08(s,2H),8.08(s, 2H),7.98(d,J＝8.1Hz,4H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.53(d,J＝7.6Hz,2H),7.29 (d,J＝8.0Hz,2H),7.02(d,J＝9.1Hz,4H),6.78(d,J＝5.5Hz,2H),5.59(d,J＝7.7 Hz,2H),4.24(s,2H),3.49–3.40(m,8H),3.22(s,2H),2.09–2.00(m,2H),1.74– 1.68(m,2H),0.91(d,J＝6.8Hz,12H).
实施例1中得到的SNAP蛋白标签分子RhoB-SNAP的高分辨质谱如图1 所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C49H52N9O4[M]+794.4137,实测值 794.4076.
实施例2
SNAP-蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的合成
中间体混合物RhoB-COOH的合成
Figure BDA0002311013340000091
在双口瓶中加入500mg的间二乙氨基苯酚、437mg的偏苯酸酐，抽充氮气三次后，升温至170℃，搅拌4h后，再向反应体系中加入1mL的磷酸后，继续维持这个温度搅拌2h。降温降到70℃后，向反应体系中加入1mL的甲醇，回流搅拌30min，水洗，二氯甲烷萃取。收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-5：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体320mg，产率37％。
中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的合成
Figure BDA0002311013340000092
在单口瓶中加入400mg的混合物RhoB-COOH、130mg的HBTU、150mg 的HOBt，抽充氮气三次后，加入10mL的无水DMF溶解，再向反应体系中加入2mL的N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌30分钟后，再向反应体系中加入140mg 的甲胺丁酸盐酸盐溶于无水DMF溶液，室温搅拌过夜。点板监测，待反应完毕后，停止反应。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体220mg产率43％。
实施例2中得到的中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的高分辨质谱如图2所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C34H40N3O6[M]+586.2912,实测值586.2901.
结构2中的SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的合成
Figure BDA0002311013340000101
分别称取30mg的RhoB-COOH-甲胺丁酸、17mg的BG标签分子、15mg 的缩合剂EDC盐酸盐、18mg的HOBt、60mg的碳酸钾于于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入2mL的无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体11mg，产率27％。
实施例2中得到的中间体RhoB-COOH-SNAP的高分辨质谱如图3所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C47H52N9O6[M]+838.4035,实测值838.4021.
实施例3
取实施例1得到的SNAP蛋白标签RhoB-SNAP加入到用多聚甲醛固定后得HeLa细胞培养皿中，染料终浓度为1μM。孵育10min后进行共聚焦成像。
图4即SNAP蛋白标签RhoB-SNAP在固定的Hela细胞细胞核成像图，有个清晰的细胞膜成像效果，其细胞核与细胞质的荧光强度比为12倍，有个高的信噪比。
实施例4
取实施例1得到的SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP加入到用多聚甲醛固定后得HeLa细胞培养皿中，染料终浓度为1μM。孵育10min后进行共聚焦成像。
图5即SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP在固定的Hela细胞细胞核成像图，有个清晰的细胞膜成像效果，其细胞核与细胞质的荧光强度比为4倍，有个较高的成像信噪比。

Claims (8)

1.一种SNAP蛋白标签，其特征在于：该SNAP蛋白标签以四乙基罗丹明为母体，螺酯羧酸或底环羧酸位置引出甲胺丁酸后连接BG基团得到；
结构式如下：
Figure FDA0003790295680000011
2.一种如权利要求1所述的SNAP蛋白标签的合成方法，其特征在于，具体制备过程如下：
RhoB-SNAP
(1)中间体RhoB-NHS的合成：在单口瓶中加入罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，得到粗产品RhoB-NHS，直接进行下一步反应；其中罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.6-0.8:0.2-0.4，罗丹明B与二氯甲烷的质量与体积比为1:10-20(g/mL)；
(2)中间体RhoB-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入粗产品RhoB-NHS、N- 甲基丁酸盐酸盐，加入色谱纯乙腈溶解，再向反应体系中加入有机碱，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝7-10：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体；其中RhoB-NHS、N-甲基丁酸盐酸盐的质量比为1:0.3-0.4，有机碱与乙腈的体积比为1:8-15，RhoB-NHS与有机碱的质量与体积比为1:2-3(g/mL)；
(3)蛋白标签RhoB-SNAP的合成：分别称取RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体SNAP蛋白标签RhoB-SNAP；其中，RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂的质量比为1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB-甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。
3.一种如权利要求1所述的SNAP蛋白标签的合成方法，其特征在于，具体制备过程如下：
RhoB-COOH-SNAP
(1)中间体RhoB-COOH的合成：在双口瓶中加入间二乙氨基苯酚、偏苯酸酐，抽充氮气三次后，升温至170℃，搅拌4h后，再向反应体系中加入酸性催化剂后，继续维持这个温度搅拌2h；降温降到70℃后，向反应体系中加入甲醇，回流搅拌30min，水洗，二氯甲烷萃取；收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-5：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH；其中二乙氨基苯酚、偏苯酸酐的质量比为1:0.5-1，酸性催化剂与甲醇的体积比为1:1-3，二乙氨基苯酚与酸性催化剂的质量与体积比为1:1-3(g/mL)；
(2)中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入混合物RhoB-COOH、缩合试剂、HOBt，抽充氮气三次后，加入无水DMF溶解，再向反应体系中加入碱试剂，室温搅拌30分钟后，再向反应体系中加入甲胺丁酸盐酸盐的无水DMF溶液，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸；其中RhoB-COOH、缩合试剂、HOBt的质量比为1:0.3-0.4：0.3-0.5，无水DMF与碱试剂的体积比为5-15:1，RhoB-COOH与无水DMF的质量与体积比为20-60:1(mg/mL)；
(3)SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的合成：分别称取RhoB-COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合试剂、HOBt、碳酸钾于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体；其中，RhoB-COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合试剂、HOBt、碳酸钾的质量比1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB-COOH-甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC，反应时间以点板检测为准。
5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤(2)中使用的有机碱为三乙胺或N,N-二乙基丙胺；步骤(3)中碱试剂为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺或N,N-二乙基丙胺。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：步骤(1)中使用的酸性催化剂为磷酸、硫酸、甲磺酸或三氟乙酸中的一种或两种以上混合试剂。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：缩合试剂为HATU、HBTU、DCC或EDC；碱试剂为无机碱碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、三乙胺或N,N-二乙基丙胺。
8.一种如权利要求1所述SNAP蛋白标签的应用，其特征在于：该SNAP蛋白标签具有高的荧光亮度以及光稳定性，同时具有高的细胞膜非穿透性，可以应用于固定细胞任意转染SNAP蛋白以及活细胞细胞膜蛋白的快速免洗成像。
CN201911258677.4A 2019-12-10 2019-12-10 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用 Active CN112939978B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911258677.4A CN112939978B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911258677.4A CN112939978B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112939978A CN112939978A (zh) 2021-06-11
CN112939978B true CN112939978B (zh) 2023-01-13

Family

ID=76225478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911258677.4A Active CN112939978B (zh) 2019-12-10 2019-12-10 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112939978B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115010615B (zh) * 2022-07-14 2023-12-08 四川沃肯精细化工有限公司 一种二乙氨基羟苯甲酰基苯甲酸正己酯的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106432257A (zh) * 2016-09-14 2017-02-22 湘潭大学 基于罗丹明的gsh水溶性荧光探针的制备方法和应用
CN106929003A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 深圳先进技术研究院 一种多功能近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN108069967A (zh) * 2016-11-15 2018-05-25 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用
CN108069966A (zh) * 2016-11-14 2018-05-25 中国科学院大连化学物理研究所 用于snap蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用
CN109400609A (zh) * 2017-08-15 2019-03-01 中国科学院大连化学物理研究所 具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8163479B2 (en) * 2004-03-02 2012-04-24 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Specific substrates for O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929003A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 深圳先进技术研究院 一种多功能近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN106432257A (zh) * 2016-09-14 2017-02-22 湘潭大学 基于罗丹明的gsh水溶性荧光探针的制备方法和应用
CN108069966A (zh) * 2016-11-14 2018-05-25 中国科学院大连化学物理研究所 用于snap蛋白标记的小分子荧光探针及其合成方法与应用
CN108069967A (zh) * 2016-11-15 2018-05-25 中国科学院大连化学物理研究所 一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用
CN109400609A (zh) * 2017-08-15 2019-03-01 中国科学院大连化学物理研究所 具有特异快速标记能力的SNAP-tag蛋白标签荧光探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Evaluation of Fluorophores to Label SNAP-Tag Fused Proteins for Multicolor Single-Molecule Tracking Microscopy in Live Cells》;Peter J. Bosch等;《Biophysical Journal》;20140831;第107卷;第803-814页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112939978A (zh) 2021-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110927137B (zh) 一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用
CN112939978B (zh) 一种高亮度、快速标记的snap蛋白标签及其合成与生物应用
CN111334083B (zh) 一类高亮度、高稳定性的活性荧光染料及其合成和应用
CN112945913A (zh) 一种萘酰亚胺类荧光探针在脂滴成像领域中的应用
CN114805262B (zh) 一种粘度和极性响应型平台荧光探针、硫化氢检测荧光探针及其合成工艺与应用
CN111333649B (zh) 一种基于SNAP-tag技术的细胞膜荧光探针及其制备和应用
CN112250700B (zh) 氟硼二吡咯类蛋白质错误折叠探针Halo-BODIPY及其制备方法与应用
CN114262335B (zh) 一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料及其合成方法和生物应用
CN112939960B (zh) 羰基氮杂环丁烷取代的nbd类荧光染料及其合成方法和应用
CN111333646B (zh) 一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用
CN111333618B (zh) 一种488nm激发的免洗SNAP-tag探针及其制备方法
CN102627636B (zh) 萘基取代的罗丹明b噁二唑化合物制备方法与应用
CN110669084A (zh) 一种可用于超分辨荧光成像的小分子探针及其制备方法
JP5437615B2 (ja) ケイ光ソルバトクロミック色素
CN114262336B (zh) 一种用于溶酶体超分辨荧光成像的自闪荧光染料及其合成方法与应用
CN110862405A (zh) 实时检测细胞内nadh/nad+的荧光探针材料及制备方法和应用
CN114230495B (zh) 一种氢化亚硝酰供体及其制备方法
CN111334076A (zh) 一类高亮度、高光稳定性的细胞核荧光探针
CN111334068A (zh) 一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用
CN112945912B (zh) 一类高亮度、大斯托克斯位移免洗脂滴荧光探针及其合成方法与应用
CN111333574A (zh) 一类高亮度、高光稳定性的碳酸酐酶检测荧光探针
CN111647001B (zh) 一种基于小分子抑制剂的荧光探针及其制备方法和应用
CN115073487B (zh) 一种罗丹明衍生物及其制备方法和应用
CN117777151B (zh) 一种af594tsa的制备方法
JP2010090268A6 (ja) ケイ光ソルバトクロミック色素

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant