CN114262335B

CN114262335B - 一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料及其合成方法和生物应用

Info

Publication number: CN114262335B
Application number: CN202010972091.0A
Authority: CN
Inventors: 徐兆超; 乔庆龙; 尹文婷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN114262335A

Abstract

本发明涉及一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料及其合成方法与生物应用，此类染料的结构特征在于基于罗丹明110母体，引入2‑氨基吡啶衍生物进行锁环。本发明涉及的荧光染料在pH>5的缓冲溶液中均处于闭环结构的暗态存在；吡啶基团使染料精准定位活细胞内溶酶体。此外，本发明开发了一种在罗丹明110母体中引入螺酰胺的新方法，此方法可应用于多种罗丹明110螺酰胺分子的合成中。该类染料能够在溶酶体中实现自闪，从而用于纳米尺度下对溶酶体动态、长时间的监测。

Description

一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料及其合成方法和生物应用

技术领域

本发明属于超分辨荧光染料领域，具体涉及一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法及其在荧光成像领域中的应用。

背景技术

荧光成像技术能够通过荧光信号将微观世界的变动以宏观的形式呈现给研究工作者，借助这种技术科研工作者实现了细胞精细结构的动态监测。但是这一研究仍然面临时间与空间分辨率低的难题，其中空间分辨率也只停留在光学衍射极限以上(>200nm)，无法在纳米尺度对细胞器运动轨迹、细胞器与细胞相互作用进行解析。近些年应运而生的超分辨荧光成像技术的空间分辨率可以达到10nm以内，实现在单分子水平上对细胞精细结构、蛋白分布的观察，使得人们能够在纳米层次上进一步了解各种生命过程，对生命科学的发展意义重大。

然而，没有运动就没有生命，微观的细胞结构亦是如此。其中，作为细胞内高度动态的酸性细胞器，溶酶体功能的行使往往伴随着分布、pH值、大小等变化，与其他细胞结构相互作用等诸多动态行为。但是目前纳米尺度下溶酶体动态的捕捉仍然面临巨大困难。这主要因为溶酶体定位的荧光染料很难承受超分辨技术中高强度的激光，应用于长时间的超分辨成像。而近些年出现的自闪荧光染料会大部分以稳定的闭环形式存在，具有抗漂白能力。基于这一策略有望设计多种颜色、多种定位功能的自闪荧光染料用于长时间的超分辨荧光成像。

发明内容

本发明涉及一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料及其合成方法和生物应用，此类染料的结构特征在于基于罗丹明110母体，引入2-氨基吡啶衍生物进行锁环。本发明涉及的荧光染料在pH>5的缓冲溶液中均处于闭环结构的暗态存在；吡啶基团使染料精准定位活细胞内溶酶体。此外，本发明开发了一种在罗丹明110母体中引入螺酰胺的新方法，此方法可应用于多种罗丹明110螺酰胺分子的合成中。该类染料能够在溶酶体中实现自闪，从而用于纳米尺度下对溶酶体动态、长时间的监测。

本发明所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料，是以罗丹明110母体为基础，通过2-氨基吡啶衍生物进行锁环，其结构式如下所示，

其中，R₁，R₂，R₃，R₄中若一个不为H，则其余取代基为H；具体为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、COONH-R₅中的任何一种基团；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基、苄基嘌呤、2-吗啉基乙基；R₆为H或烯丙基，n是0-4之间的整数。

其合成步骤如下：

步骤一烯丙基保护的罗丹明合成：

将3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚与邻苯二甲酸酐置于1,2-二氯苯中，而后逐渐升温至190℃，并在此温度下反应6-10h。反应液冷却至室温后，硅胶柱层析得到紫红色固体。

步骤二烯丙基保护的罗丹明螺酰胺分子的合成：

将步骤一得到的烯丙基保护的罗丹明110置于1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入三氯氧磷，并在80℃下反应2-6h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基吡啶衍生物，80℃下反应6-12h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体。

步骤三基于罗丹明110的螺酰胺染料的合成

烯丙基保护的罗丹明螺酰胺分子，1,3-二甲基巴比妥酸与四三苯基膦钯溶于乙醇中，并在80℃下搅拌3-10h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体。

其中，步骤一中3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的质量比为2.6:1；3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚的质量与1,2-二氯苯的体积为1:0.05-0.10mg/mL。

步骤二中烯丙基保护的罗丹明110与2氨基吡啶衍生物的质量比为1:3-5；烯丙基保护的罗丹明110的质量与三氯氧磷的体积比为1:0.005-0.01mg/mL；烯丙基保护的罗丹明110的质量与1,2-二氯乙烷的体积比为1:0.1-0.2mg/mL；烯丙基保护的罗丹明110的质量与乙腈的体积比为1:0.1-0.2mg/mL。

烯丙基保护的罗丹明螺酰胺与1,3-二甲基巴比妥酸的质量比为1：0.5-2；烯丙基保护的罗丹明螺酰胺与四三苯基膦钯的质量比为：1:0.05-0.1；烯丙基保护的罗丹明螺酰胺的质量与乙醇的体积比为1:0.1-0.2mg/mL。

上述这类染料能够用于溶酶体的长时间、动态超分辨荧光成像，在纳米尺度下监测溶酶体的动态变化。

本发明具有以下特征：

这类染料具有合成方法简单、价格低廉且易于功能化等优点。

这类染料通过在罗丹明110体系中引入2-氨基吡啶衍生物，降低了分子的pKa使其在溶酶体中仅存在少量开环的荧光态分子。

这类染料在溶酶体中以闭环的暗态形式存在，能够在溶酶体中保持较高的光稳定性。这类染料在溶酶体中能够实现自闪，进行溶酶体的长时间超分辨荧光成像，实时监测溶酶体的的分布、pH变化、大小、与其它细胞结构相互作用进行。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中染料Rho-530的核磁氢谱；

图2为实施例1中染料Rho-530的核磁碳谱；

图3为实施例1中染料LysoM-530的核磁氢谱；

图4为实施例1中染料LysoM-530的核磁碳谱；

图5为实施例1中染料LysoM-488的核磁氢谱；

图6为实施例1中染料LysoM-488的核磁碳谱；

图7为实施例1中染料LysoM-530在不同pH下的荧光谱图；

图8为实施例1中染料LysoM-530的556nm处荧光强度在不同pH下的归一化曲线图；

图9为实施例1中染料LysoM-488在不同pH下的荧光谱图；

图10为实施例1中染料LysoM-488的530nm处荧光强度在不同pH下的归一化曲线图；

图11为实施例1中染料LysoM-530对活细胞内溶酶体的超分辨成像图；

图12为实施例1中染料LysoM-530对单个溶酶体的超分辨成像图及强度分析图；

图13为实施例1中染料LysoM-530对活细胞内动态溶酶体的长时间超分辨成像图；

图14为实施例1中染料LysoM-488对活细胞内溶酶体的超分辨成像图；

图15为实施例1中染料LysoM-488对单个溶酶体的超分辨成像图及强度分析图；

图16为实施例1中染料LysoM-488对活细胞内动态溶酶体的长时间超分辨成像图；

图17为实施例5中染料LysoNN-488对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的制备方法进行详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

中间体Rho530的合成

将3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚(100mg,0.53mmol)与邻苯二甲酸酐(38mg，0.26mmol)置于5mL1,2-二氯苯中，而后逐渐升温至190℃，并在此温度下反应10h。反应液冷却至室温后，湿法上样，硅胶柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比20:1)得到紫红色固体45mg，产率32％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M]⁺：计算值：491.2335，实验值：491.2339。

其核磁氢谱如下图1所示，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.05–7.97(m,1H),7.60–7.50(m,2H),7.12(t,J＝8.8Hz,3H),6.85(dd,J＝9.4,2.4Hz,2H),6.81(d,J＝2.4Hz,2H),5.89–5.76(m,4H),5.17(d,J＝1.1Hz,2H),5.14(dd,J＝3.5,1.3Hz,4H),5.09(d,J＝1.2Hz,2H),4.12(d,J＝4.6Hz,8H).

其核磁碳谱如下图2所示，具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ157.40,156.25,134.41,131.48,131.33,129.90,129.51,129.27,128.54,116.22,116.08,115.14,113.63,113.48,99.99,96.77,53.05.

经检测，其结构如上式示。

染料LysoM-530的合成

将Rho530(20mg，0.038mmol)溶于4mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入0.1mL三氯氧磷，并在80℃下反应6h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于4mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基-6-甲基吡啶(100mg,0.925mmol)，80℃下反应12h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析分离(展开剂为二氯甲烷)得到白色固体14mg，产率64％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：581.2917，实验值：581.2906。

其核磁氢谱如下图3所示，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.02–7.93(m,1H),7.55–7.43(m,2H),7.38(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.13(dd,J＝6.2,1.7Hz,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),6.40(d,J＝2.6Hz,2H),6.38(d,J＝8.7Hz,2H),6.15(dd,J＝8.8,2.6Hz,2H),5.81(ddt,J＝16.9,10.1,4.9Hz,4H),5.15(dd,J＝8.1,1.6Hz,4H),5.11(t,J＝1.4Hz,4H),3.94–3.76(m,8H),2.17(s,3H).

其核磁碳谱如下图4所示，具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.97,155.89,153.72,153.37,149.57,149.26,137.01,133.77,133.41,131.04,128.13,127.68,124.52,123.09,118.01,116.15,111.84,109.97,107.39,98.48,66.06,52.66,23.04.

经检测，其结构如上式示。

取本实施例得到的化合物LysoM-530溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM染料母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其在pH下荧光光谱进行检测。

LysoM-530对pH响应的测试。取20μL母液置于4mL不同pH值的缓冲溶液中，配制成10μM的荧光探针测试液，而后置于石英比色皿中用于测试不同pH条件下的荧光光谱。

染料LysoM-488的合成

将LysoM-530(10mg,0.017mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(20mg，0.128mmol)与四三苯基膦钯(1mg)溶于2mL乙醇中，并在80℃下搅拌3h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比100:1)得到米白色固体5mg，产率70％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：421.1665，实验值：421.1658。

其核磁氢谱如下图5所示，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.16(d,J＝8.3Hz,1H),7.91(d,J＝7.3Hz,1H),7.63(t,J＝7.2Hz,1H),7.60–7.55(m,1H),7.55–7.49(m,1H),6.30(d,J＝1.8Hz,2H),6.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.03(dd,J＝8.4,1.9Hz,2H),5.19(s,4H),2.14(s,3H).

其核磁碳谱如下图6所示，具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ167.51,155.70,153.66,153.47,149.86,149.64,137.94,134.36,130.62,128.97,127.59,124.66,123.19,118.55,111.61,110.09,109.34,99.75,66.08,23.17.

经检测，其结构如上式示。

取本实施例得到的化合物LysoM-488溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM染料母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其在pH下荧光光谱进行检测。

LysoM-488对pH响应的测试。取20μL母液置于4mL不同pH值的缓冲溶液中，配制成10μM的荧光探针测试液，而后置于石英比色皿中用于测试不同pH条件下的荧光光谱。

实施例2

中间体Rho530的合成

将3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚(300mg,1.59mmol)与邻苯二甲酸酐(114mg，0.77mmol)置于30mL1,2-二氯苯中，而后逐渐升温至190℃，并在此温度下反应6h。反应液冷却至室温后，湿法上样，硅胶柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比20:1)得到紫红色固体194mg，产率46％。

经检测，其结构如上式示。

染料LysoH-530的合成

将Rho530(200mg，0.38mmol)溶于20mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入2mL三氯氧磷，并在80℃下反应2h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于20mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基吡啶(600mg,6.38mmol)，80℃下反应6h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析分离(展开剂为二氯甲烷)得到白色固体125mg，产率58％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：567.2760，实验值：567.2758。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.01–7.92(m,1H),7.54–7.42(m,2H),7.36(dd,J＝8.4,7.6Hz,1H),7.30(dd,J＝8.2,7.8Hz,1H),7.11(dd,J＝6.1,1.7Hz,1H),6.64(d,J＝7.5Hz,1H),6.42(d,J＝2.8Hz,2H),6.39(d,J＝8.8Hz,2H),6.16(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),5.82(ddt,J＝16.9,10.1,4.9Hz,4H),5.15(dd,J＝8.1,1.6Hz,4H),5.12(t,J＝1.3Hz,4H),3.92–3.76(m,8H).

其核磁碳谱如具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.78,155.92,153.75,153.66,149.52,149.22,137.15,133.82,133.39,131.14,128.18,127.658,124.57,123.11,118.11,116.12,111.82,110.01,107.42,98.44,66.10,53.12.

经检测，其结构如上式示。

染料LysoH-488的合成

将LysoH-530(100mg,0.18mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(50mg，0.328mmol)与四三苯基膦钯(5mg)溶于10mL乙醇中，并在80℃下搅拌10h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比100:1)得到米白色固体47mg，产率66％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：407.1508，实验值：407.1521。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.15(d,J＝8.2Hz,1H),7.96(d,J＝7.2Hz,1H),7.70(t,J＝7.3Hz,1H),7.63(t,J＝7.1Hz,1H),7.62–7.56(m,1H),7.55–7.48(m,1H),6.32(d,J＝1.9Hz,2H),6.19(d,J＝8.3Hz,2H),6.13(dd,J＝8.2,1.9Hz,2H),5.17(s,4H).

经检测，其结构如上式示。

实施例3

中间体Rho530的合成

将3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚(200mg,1.06mmol)与邻苯二甲酸酐(77mg，0.56mmol)置于15mL1,2-二氯苯中，而后逐渐升温至190℃，并在此温度下反应8h。反应液冷却至室温后，湿法上样，硅胶柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比20:1)得到紫红色固体118mg，产率42％。

经检测，其结构如上式示。

染料LysoN-530的合成

将Rho530(100mg，0.19mmol)溶于15mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入0.5mL三氯氧磷，并在80℃下反应4h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于15mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基-5-甲氨基羰基吡啶(400mg,2.65mmol)，80℃下反应10h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析分离(展开剂为二氯甲烷)得到白色固体72mg，产率61％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：624.2975，实验值：624.2972。

经检测，其结构如上式示。

染料LysoN-488的合成

将LysoN-530(50mg,0.08mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(50mg，0.328mmol)与四三苯基膦钯(4mg)溶于8mL乙醇中，并在80℃下搅拌5h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比100:1)得到米白色固体27mg，产率72％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：464.1723，实验值：464.1728。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.12(d,J＝8.4Hz,1H),8.03(d,J＝7.4Hz,1H),7.72(t,J＝7.2Hz,1H),7.65–7.57(m,1H),7.52–7.45(m,1H),6.35(d,J＝1.8Hz,2H),6.25(d,J＝8.4Hz,2H),6.18(dd,J＝8.4,1.9Hz,2H),5.27(s,4H),2.27(s,3H).

经检测，其结构如上式示。

实施例4

染料LysopM-530的合成

将Rho530(200mg，0.38mmol)溶于20mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入2mL三氯氧磷，并在80℃下反应4h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于30mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基-4-甲基吡啶(600mg,5.56mmol)，80℃下反应6h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析分离(展开剂为二氯甲烷)得到白色固体120mg，产率53％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：581.2917，实验值：581.2935。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.22(d,J＝8.4Hz,1H),8.00–7.91(m,1H),7.52–7.41(m,2H),7.37(dd,J＝8.1,7.7Hz,1H),7.10(dd,J＝6.1,1.7Hz,1H),6.67(d,J＝7.8Hz,1H),6.43(d,J＝2.7Hz,2H),6.41(d,J＝8.6Hz,2H),6.13(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),5.87(ddt,J＝16.2,10.0,4.8Hz,4H),5.17(dd,J＝8.2,1.6Hz,4H),5.10(t,J＝1.2Hz,4H),3.92–3.76(m,8H),2.13(s,3H).

经检测，其结构如上式示。

染料LysopM-488的合成

将LysopM-530(100mg,0.17mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(70mg，0.46mmol)与四三苯基膦钯(8mg)溶于20mL乙醇中，并在80℃下搅拌8h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比100:1)得到米白色固体51mg，产率70％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：421.1665，实验值：421.1685。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.13(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(d,J＝7.3Hz,1H),7.71(t,J＝7.2Hz,1H),7.62–7.56(m,1H),7.51–7.46(m,1H),6.31(d,J＝1.8Hz,2H),6.17(d,J＝8.4Hz,2H),6.12(dd,J＝8.2,1.9Hz,2H),5.16(s,4H),2.13(s,3H).

经检测，其结构如上式示。

实施例5

染料LysoNN-530的合成

将Rho530(200mg，0.38mmol)溶于30mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入1mL三氯氧磷，并在80℃下反应2h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于30mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基4-(二甲氨基乙氨基)羰基吡啶(800mg,3.85mmol)，80℃下反应6h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析分离(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比100:1)得到白色固体90mg，产率35％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：681.3553，实验值：681.3558。

经检测，其结构如上式示。

染料LysoNN-488的合成

将LysoNN-530(100mg,0.15mmol)，1,3-二甲基巴比妥酸(50mg，0.328mmol)与四三苯基膦钯(8mg)溶于20mL乙醇中，并在80℃下搅拌10h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂为二氯甲烷：甲醇体积比50:1)得到米白色固体40mg，产率52％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：521.2301，实验值：521.2309。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.17(d,J＝8.3Hz,1H),8.08(d,J＝7.2Hz,1H),7.73(t,J＝7.2Hz,1H),7.65(t,J＝7.2Hz,1H),7.62(d,J＝7.2Hz,1H),7.60(s,1H),6.33(d,J＝1.8Hz,2H),6.18(d,J＝8.2Hz,2H),6.12(dd,J＝8.2,1.9Hz,2H),5.21(s,4H),2.53(t,J＝7.1Hz,2H),2.38(t,J＝7.3Hz,2H),2.05(s,6H).

经检测，其结构如上式示。

实施例6

实施例1中制得的染料LysoM-530在不同pH下的荧光光谱测试。取20μL LysoM-530母液，加入4mL不同pH缓冲液中，配制成终浓度10μM的荧光探针测试液，进行荧光光谱的测试。

如图7所示，染料LysoM-530在pH值5以上基本处于闭环状态，无荧光；pH值降低5以下，分子逐渐由无荧光的闭环结构变为具有荧光的开环结构。如图7所示，LysoM-530的开环形式荧光最大发射峰位于556nm左右。

如图8所示，染料LysoM-530在556nm处最大值随pH变化的曲线。随着pH的降低，LysoM-530的荧光逐渐增强，且当pH值在2.5时，LysoM-530荧光强度达到最大，这说明LysoM-530在不同pH下存在很少的开环分子，适合作为溶酶体超分辨自闪染料。

实施例7

实施例1中制得的染料LysoM-488在不同pH下的荧光光谱测试。取20μL LysoM-488母液，加入4mL不同pH缓冲液中，配制成终浓度10μM的荧光探针测试液，进行荧光光谱的测试。

如图9所示，染料LysoM-488在pH值5以上基本无荧光；pH值降低5以下，分子荧光逐渐出现，这说明LysoM-488逐渐变为开环的荧光态。如图9所示，LysoM-488的开环形式荧光最大发射峰位于530nm左右。

如图10所示，染料LysoM-488在530nm处最大值随pH变化的曲线。随着pH的降低，LysoM-488的荧光逐渐增强，且当pH值在2.5时，LysoM-488荧光强度最大，这说明开环结构占比达到最大

实施例8

实施例1中制得的染料LysoM-530对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取2.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育2h，而后在超分辨显微镜下对溶酶体进行荧光成像。

如图11所示，染料LysoM-530实现了对溶酶体进行精准的定位，并能够全细胞的溶酶体进行超分辨成像。

如图11所示，(a)为染料LysoM-530对单个溶酶体的超分辨成像；(b)为单个溶酶体的强度分析，可见染料LysoM-530对单个溶酶体的分辨率达到120nm。

如图13所示，染料LysoM-530对单个溶酶体的溶酶体进行实时追踪。在0-100s内该溶酶体从起点沿曲线到终点运动了3.22μm。这说明，染料LysoM-530能够对溶酶体进行长时间超分辨荧光成像，监测活细胞内溶酶体动态。

实施例9

实施例1中制得的染料LysoM-488对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取2.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育2h，而后在超分辨显微镜下对溶酶体进行荧光成像。

如图14所示，染料LysoM-488实现了对溶酶体进行精准的定位，并能够全细胞的溶酶体进行超分辨成像。

如图15所示，(a)为染料LysoM-488对单个溶酶体的超分辨成像；(b)为单个溶酶体的强度分析，可见染料LysoM-488对单个溶酶体分辨率可达70nm。

如图16所示，染料LysoM-488对单个溶酶体的溶酶体进行实时追踪。在0-100s内该溶酶体从起点沿曲线到终点运动了1.05μm。这说明，染料LysoM-488能够在纳米尺度对活细胞溶酶体动态进行监测。

实施例10

实施例5中制得的染料LysoNN-488对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取2.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育2h，而后在超分辨显微镜下对溶酶体进行荧光成像。

如图17所示，染料LysoNN-488对溶酶体能够进行精准的定位，并能够全细胞的溶酶体进行超分辨成像。

Claims

1.一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料，其特征在于，其结构式如下所示，

其中，R₁，R₂，R₃，R₄为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、CONH-R₅中的任何一种基团，若R₁，R₂，R₃，R₄其中一个是(CH₂CH₂)_nCH₃或CONH-R₅，则其余为H；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基；R₆为H或烯丙基，n是0-4之间的整数。

2.一种如权利要求1所述靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于，该方法基于罗丹明110母体，引入2-氨基吡啶衍生物进行锁环得到靶向溶酶体的超分辨自闪染料。

3.根据权利要求2所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于：所述该方法先合成烯丙基保护的罗丹明110，引入2-氨基吡啶衍生物合成烯丙基保护的罗丹明螺酰胺分子，与1,3-二甲基巴比妥酸和四三苯基膦钯反应得到基于罗丹明110的螺酰胺染料，即靶向溶酶体的超分辨自闪染料。

4.根据权利要求3所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于，所述烯丙基保护的罗丹明110的制备方法具体为：将3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚与邻苯二甲酸酐置于1,2-二氯苯中，而后逐渐升温至190℃，并在此温度下反应6-10h，反应液冷却至室温后，硅胶柱层析得到紫红色固体，即得到烯丙基保护的罗丹明110。

5.根据权利要求3所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于，所述罗丹明螺酰胺分子的合成方法具体为：将烯丙基保护的罗丹明110置于1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入三氯氧磷，并在80℃下反应2-6h；而后减压除去得到紫色粗产物；将粗产物溶于乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基吡啶衍生物，80℃下反应6-12h；减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体，即为罗丹明螺酰胺分子。

6.根据权利要求3所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于，合成罗丹明110的螺酰胺染料具体方法为：烯丙基保护的罗丹明螺酰胺分子，1,3-二甲基巴比妥酸与四三苯基膦钯溶于乙醇中，并在80℃下搅拌3-10h；减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体，即为靶向溶酶体的超分辨自闪染料。

7.根据权利要求4所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于：

3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的质量比为2.6:1；3-N,N-二(烯丙基)氨基苯酚的质量与1,2-二氯苯的体积为1:0.05-0.10mg/mL。

8.根据权利要求5所述的靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于：

烯丙基保护的罗丹明110与2氨基吡啶衍生物的质量比为1:3-5；烯丙基保护的罗丹明110的质量与三氯氧磷的体积比为1:0.005-0.01mg/mL；烯丙基保护的罗丹明110的质量与1,2-二氯乙烷的体积比为1:0.1-0.2mg/mL；烯丙基保护的罗丹明110的质量与乙腈的体积比为1:0.1-0.2mg/mL。

9.根据权利要求6所述的一类靶向溶酶体的超分辨自闪染料的合成方法，其特征在于：

10.一种如权利要求1所述靶向溶酶体的超分辨自闪染料的应用，其特征在于，该染料作为非疾病的诊断与治疗应用于荧光成像及开关材料领域。