CN105567216A - 一类溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类结构式所示的内酰胺环隐色体调控的溶酶体靶向荧光探针，该荧光探针在复杂的缓冲溶液中，通过内酰胺环OFF-ON变构，实现对弱酸性环境（pH在4-6之间）高灵敏度、高选择性的响应。探针的荧光共聚焦成像实验表明其可对肿瘤细胞中的溶酶体进行靶向识别，对癌症等疾病诊断具有一定的应用前景广阔。

Description

一类溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一类内酰胺环调控的溶酶体靶向荧光探针及其制备方法和在生物检测系统和疾病诊断中的应用。

背景技术

溶酶体作为一种细胞器几乎存在于所有的真核细胞中，其包含了超过60多种酸性水解酶、组织蛋白酶以及多种具有特异性功能的膜蛋白酶。这些存在于溶酶体内部的酶，不仅能够控制生物体内大分子的降解，而且对于许多特殊的内分泌功能也具有十分重要的意义，在细胞的增长、凋亡、内吞、外排以及离子调控等过程中作用特殊。在溶酶体内部空腔中，相对于正常细胞溶酶体的弱酸性环境（pH在5-6之间），肿瘤细胞内溶酶体pH则更偏向于酸性（pH在4.5-5.5之间）。基于此，探究溶酶体内部pH分布及其波动，尤其是肿瘤细胞内溶酶体的pH变化，可为表达肿瘤组织可视化检测提供有效途径，对研究癌症的发病机制、诊断及其预防具有特殊意义。

荧光探针具有操作简单、灵敏度高、对细胞损伤小等特点，引起了疾病诊疗研发者的普遍关注。目前市售的溶酶体靶向荧光探针存在成本高、背景信号大、灵敏度低、选择性差等限制，有待进一步开发新品。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类内酰胺环隐色体调控的溶酶体靶向荧光探针。

本发明的另一目的是提供上述荧光探针的制备方法。

本发明还有一目的是提供上述荧光探针对弱酸性环境的高灵敏性响应及在活体细胞中实现对溶酶体的靶向识别，并检测表达其pH波动信号，提供疾病诊疗信息。

本发明的实现过程如下：

结构式（I）所示的化合物，

。

结构式具体为：

。

上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将罗丹明 B 溶于1,2-二氯乙烷中，加三氯氧磷搅拌回流，反应后将反应液冷却，旋干，得暗红色的中间产物罗丹明 B 酰氯；

（2）将步骤（1）所得罗丹明 B 酰氯溶于乙腈，加入三乙胺及2,6-二氨基吡啶或者化合物 2，搅拌回流，旋干，萃取，干燥有机相，旋干，经柱层析分离得到 RS1 或者 RS2；

（3）将步骤（2）所得RS1与水杨醛溶于无水乙醇，冷却后旋干，经柱层析得到RS3，

。

上述步骤（2）所述的化合物2经2,6-二氨基吡啶与乙酰丙酮在浓磷酸中制得，

。

上述步骤（2）中，所述的罗丹明 B 酰氯与2,6-二氨基吡啶或者化合物2的摩尔比1:1.2。

上述制备方法中，RS1 及 RS3柱层析分离的洗脱剂均为体积比30:1的二氯甲烷与甲醇；探针RS2柱层析分离的洗脱剂为体积比9:1的乙酸乙酯与甲醇。

上述目标荧光探针在环境及生物体系中对pH检测方面应用，尤其是在生物体系亚细胞层上，实现了对溶酶体的特异性识别，提供疾病诊治检测信息。

本发明所涉及的溶酶体靶向荧光探针采用螺内酰胺环隐色体的开、关环机理，由内酰胺环开环形成罗丹明B强荧光的共轭醌式结构，从而产生易于检测的光学信号输出。本发明所涉及的探针在环境体系中表现出很高的灵敏性，固定探针的浓度10 μ mol/L，加入相应pH的缓冲溶液后，在不到2 min的时间内，荧光强度即达到饱和，并且荧光信号稳定、可靠。同时上述探针还表现出良好的可逆性和很高的抗干扰能力，本发明所涉及的探针在相应pH区间内，其荧光信号与pH变化之间存在良好的线性关系，可以用于pH定量测量。由于上述探针具有与癌细胞溶酶体pH吻合的pKa值，发明人将探针应用于生物体系，与商品化的溶酶体靶向探针LysoTracker Green DND-26对细胞进行共定位实验，得到很好的叠加效果图，表明探针可以作为溶酶体靶向探针使用，进一步的生物实验表明，其作为溶酶体靶向探针在细胞膜透性、灵敏度、细胞毒性等方面均有优异的表现，可作为溶酶体靶向探针应用于活体细胞实验中。

附图说明

图1是RS1、RS2及RS3在不同pH条件下的紫外吸收光谱图，探针浓度10 μ mol/L，Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（ V/V=8:2）；

图2是RS1、RS2及RS3在不同pH条件下的荧光发射光谱图，探针浓度10 μ mol/L，Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（ V/V=8:2），λex: 520 nm，Slit: 5 nm/5 nm；

图3是RS1、RS2及RS3相对荧光强度I/Imax对pH之间的线性关系；

图4是RS1、RS2及RS3的pKa值计算结果，pKa = pH – log [(Imax-I)/(I-Imin)]；

图5是RS1、RS2及RS3在不同金属离子存在下的相对荧光强度变化图，探针浓度10 μmol/L，Na⁺(150 m mol/L); K⁺(10 m mol/L);Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺(5 m mol/L);其他金属离子0.1 m mol/L，Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（V/V=8:2），λex: 520 nm，λem: 590 nm，Slit: 5 nm/5 nm；

图6是RS1、RS2及RS3的可逆性实验图，探针浓度10 μ mol/L，Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（V/V=8:2）；

图7是RS1、RS2及RS3的动力学实验结果，探针浓度10 μ mol/L，Britton-Robison缓冲溶液/EtOH（V/V=8:2）；

图8是不同浓度探针RS1在A549细胞中的细胞膜透性实验，实验所选通道波长为543nm；

图9是不同浓度探针RS2在A549细胞中的细胞膜透性实验，实验所选通道波长为543nm；

图10是不同浓度探针RS3在A549细胞中的细胞膜透性实验，实验所选通道波长为543nm；

图11探针RS1与LysoTracker Green DND-26对A549细胞的共定位实验结果，2 h，LysoTracker Green (绿光通道, 0.5 μ mol/L, 波长488nm), RS1 (红光通道,10 μ mol/L，波长543 nm);

图12探针RS2与LysoTracker Green DND-26对A549细胞的共定位实验结果，2 h，LysoTracker Green (绿光通道, 0.5 μ mol/L, 波长488nm), RS2 (红光通道, 4 μ mol/L，波长543 nm);

图13探针RS3与LysoTracker Green DND-26对A549细胞的共定位实验结果，2 h，LysoTracker Green (绿光通道, 0.5 μ mol/L, 波长488nm), RS3 (红光通道, 6 μ mol/L，波长543 nm);

图14不同浓度巴洛佛霉素A1处理后，RS1、RS2、RS3及LysoTracker Green DND-26对A549细胞溶酶体的染色效果图，RS1浓度(10μ mol/L)，RS2浓度(10μ mol/L)，RS3浓度(10μmol/L) 以及 LysoTracker green DND-26(0.5μ mol/L)；

图15不同浓度RS1、RS2、RS3与LysoTracker Green DND-26，与A549细胞作用不同时间后对细胞活性影响。

具体实施方式

为了更加清楚的理解本发明，下面通过具体实施例对本发明做进一步的描述。

当R₁=H时，如下结构式分别代表探针RS1，RS2和RS3，且经实验筛选RS2和RS3对溶酶体的荧光响应效果最优。

实施例1：探针RS1的合成

（1）罗丹明 B 酰氯的合成：在50 ml 干燥的圆底烧瓶中，加入0.48g （1.0 m mol）罗丹明B，5 ml 干燥的1,2-二氯乙烷及1.0 ml 三氯氧磷，安装冷凝干燥装置及尾气处理装置，控制反应温度为90℃反应8小时。反应结束后将反应混合液冷却至室温，除去溶剂得暗红色粘稠固体，以备后用。

（2）RS1的合成：取2.5 ml干燥的乙腈，将上述（1）所得固体全部溶解，并在磁力搅拌下将溶有1.0 ml三乙胺、1.2 m mol（约0.13 g）2,6-二氨基吡啶的乙腈（5 ml）混合液缓慢滴加到上述反应液中，反应混合液82 ℃下回流6小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，除去溶剂，以二氯甲烷为萃取剂对产物进行萃取分离，并将有机相收集于100ml锥形瓶中，无水硫酸镁干燥0.5 h，过滤，除去溶剂得粗产品，用二氯甲烷与甲醇体积比30:1对其进行柱层析分离，得到目标产物。

RS1：白色固体0.21 g，产率：39.4%。

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.89 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.58 (dd, J =14.9, 6.7 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.04(d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.36 (d, J = 2.2 Hz, 2H), 6.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.18(dd, J = 8.9, 2.3 Hz, 2H), 6.02 (d, J = 7.9 Hz,1H), 5.15 (s, 2H), 3.27 (dd, J= 13.9, 6.8 Hz, 8H), 1.06 (t, J = 6.9 Hz, 12H).

¹³C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.19, 157.39, 153.81, 153.43, 149.10, 148.33,138.73, 134.16, 130.85, 128.95, 127.98, 124.72, 123.10, 108.87, 107.27,103.31, 102.89, 97.27, 65.72, 44.08, 12.92.

MS（ESI）calad. for C₃₃H₃₆N₅O₂ [M+H]⁺= 534.2869,found:534.2837。

实施例2：探针RS2的合成

（1）化合物2的制备：将0.5ml（4.85 mmol）乙酰丙酮及0.5g（4.85 mmol）2,6-二氨基吡啶溶于2.5ml磷酸中，磁力搅拌下回流2小时。反应完成后将反应混合物冷却至室温，倒入100ml冰水混合物中，浓氨水调节pH至中性，得到大量沉淀，抽滤，水洗数次，干燥，得灰白色粗产物，用乙酸乙酯：甲醇体积比20：1柱层析，得到目标产物。

化合物2：灰白色固体产率：70.3%。

¹H NMR (400 MHz, MeOD): δ 8.06 (dd, J = 8.9, 2.8 Hz, 1H), 6.95 (s,1H), 6.80 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 4.91 (s, 2H), 2.54 (d, J = 6.3 Hz, 6H).

¹³C NMR (101 MHz, MeOD) δ 160.76, 160.50, 155.73, 146.21, 134.07, 119.12,114.58, 111.54, 23.17, 16.50.

MS（ESI）calad. for C₁₀H₁₁N₃ [M+H]⁺= 174.1031,found:174.1035.

（2）罗丹明酰氯的制备方法如上实施例1中步骤（1）所述。

（3）RS2的合成：取2.5 ml干燥的乙腈，将上述固体全部溶解，再将溶有1.0 ml三乙胺，0.27 g 化合物2（1.2 mmol）的乙腈（5 ml）缓慢滴加到上述反应液中，约15分钟滴加完毕，反应液82 ℃下回流6小时。反应结束后，将反应液冷却至室温，除去溶剂后用二氯甲烷为萃取剂萃取分离，并将有机相收集于100 ml锥形瓶中，无水硫酸镁干燥0.5 h，过滤，除去溶剂，粗产物用乙酸乙酯：甲醇体积比9:1进行柱层析，得到目标产物。

探针RS2：白色固体0.19 g，产率：31.9%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.05 (t, J = 9.0 Hz, 3H), 7.49 (t, J = 7.5Hz, 2H), 7.13 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H),6.46 (s, 2H), 6.20 (s, 2H), 3.28 (dd, J = 14.1, 7.0 Hz, 8H), 2.63 (s, 3H),2.50 (s, 4H), 1.12 (t, J = 7.0 Hz, 12H).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 168.76, 162.00, 153.11, 133.89, 133.79, 129.49,128.05, 124.15, 123.52, 122.26, 118.43, 115.79, 107.61, 98.07, 66.69, 44.35,25.24, 17.92, 12.54.

MS（ESI）calad. for C₃₈H₃₉N₅O₂ [M+H]⁺= 598.3182,found:598.3174。

实施例3：探针RS3的合成

将0.53 g RS1（1.0 m mol）和0.15 g（1.2 m mol）水杨醛溶于10 ml无水乙醇中，搅拌回流8小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，旋干，粗产物用二氯甲烷与甲醇体积比30:1进行柱层析纯化。

探针RS3：黄色固体0.32 g 产率50.3%。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.57 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.50 (d, J =8.3 Hz, 1H), 8.00 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.73 – 7.63 (m, 2H), 7.42 (s, 2H),7.40 – 7.35 (m, 1H), 7.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.04 – 6.94 (m, 2H), 6.86 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 6.54 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.38 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.16(dd, J = 8.8, 2.5 Hz, 2H), 3.29 – 3.17 (m, 8H), 1.04 (t, J = 7.0 Hz, 12H).

¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 169.03, 165.16, 161.92, 154.96, 154.45, 152.18,150.03, 148.35, 139.31, 133.82, 133.32, 133.22, 128.82, 128.04, 127.40,124.06, 123.38, 119.51, 118.80, 117.14, 115.83, 115.18, 108.46, 107.70,97.91, 66.10, 44.25, 12.53.

MS（ESI）calad. for C₄₀H₃₉N₅O₃ [M+H]⁺= 638.3131,found: 638.3356。

实施例4：探针RS1、RS2及RS3的光谱测试

配置500 μ mol/L探针储备液，控制缓冲溶液pH在pH=3.76的弱酸性条件到pH=7的中性条件下变化，从图1中发明人可以看出，在中性条件下，由于其内酰胺环处于关环状态，探针不存在吸收，但当pH值逐渐减小时，三种探针在565nm处均产生吸收，并且随着pH降低，荧光信号逐渐增强，直至饱和。图2为三种探针的荧光发射光谱图，随着pH值降低，三种探针在590nm处均表现出强的荧光信号，且在同样的浓度、激发波长和pH条件下，很容易发现图2b、图2c所对应的探针RS2、RS3表现出相对于图2a更强的荧光信号，原因是在RS2，和RS3中分别引入了不同的共轭体系，这种特殊的共轭体系使其荧光信号增强，利于其在复杂体系中的应用。

实施例5：探针RS1、RS2以及RS3的光学信号与pH之间的关系

为更好地说明探针可用于检测pH，图3中将三种探针的相对荧光强度对pH进行作图，结果发现，三种探针RS1、RS2及RS3分别在pH=4.34-5.35、pH=4.62-5.13以及pH=4.16-5.25之间得到很好的线性关系。在图3b、图3c、图3d中，可发现相对荧光强度随pH的变化具有较大的斜率，分别是：0.72、0.86和0.80。这些表明三种探针对pH的变化过程，响应灵敏。

实施例6：探针RS1、RS2及RS3的pKa计算结果

根据pKa = pH – log [(I_max-I)/(I-I_min)]，对pH和log [(I_max-I)/(I-I_min)]作图得到图4，图中的截距分别对应RS1、RS2及RS3的pKa值，5.00、5.00和4.74。三种探针pKa值之间所存在的差异主要是由于两种不同的共轭链，影响螺内酰胺环中N原子外层孤对电子的分布，从而引起其性质变化。对内酰胺环的N原子而言，RS1由于其侧链氨基供电子效应，使其内酰胺环上氮原子电子云密度相对较高，接受质子的能力强。在RS2中，NH₂由萘啶环取代，其侧链刚性共轭，致使侧链氨基电子云离域，内酰胺环N原子电子云密度降低，接受质子能力降低，然而其稳定性提高，在溶酶体的检测应用中表现出较低的“碱性效应”和较弱的细胞毒性。相对而言，RS3中，由于链状共轭体系中的羟基拉电子作用，使其pKa进一步降低。RS2和RS3具有与癌细胞溶酶体pH吻合的pKa值，及其在结构设计上所表现出的良好性质，决定了其可作为优异的溶酶体探针。

实施例7：探针RS1、RS2及RS3的识别专一性和抗干扰性研究

本发明选择生物体内所必不可少的一些碱金属、碱土金属、过渡金属与重金属离子（K⁺, Na+, Ca²⁺, Mg²⁺, Pb²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺, Cu²⁺, Ag⁺, Cr³⁺, Mn²⁺, Al3⁺, Zn²⁺,Fe³⁺, Ni²⁺ 和Fe²⁺），并参照其在人体内分布，固定探针浓度为10 μ mol/L，Na⁺(150 m mol/L)， K⁺(10 m mol/L)，Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺(5 m mol/L)，其它金属离子浓度0.1 mmol/L，分别检测其在弱酸性和中性条件下的荧光强度变化。结果表明，其在酸性和中性条件下，加入上述任何一种离子，探针的荧光强度均不受其他离子的干扰，验证目标探针具有检测专一性和抗干扰能力。

实施例8：探针RS1、RS2及RS3的可逆性研究

固定探针浓度为10 μ mol/L，使用微量NaOH溶液和HCl溶液调节缓冲溶液pH分别在pH=4.2的弱酸性条件下与pH=7.0的中性条件下，经多次反复调节发现，三种探针的荧光强度都可恢复到初始值。这表明此三类探针具备良好的可逆性。这是由于，在酸性条件下，内酰胺环上的N原子被质子化，实现内酰胺环开环，罗丹明B顶环形成醌式共轭结构产生荧光；在碱性条件下，N原子又能迅速实现去质子化，内酰胺隐色环形成，醌式结构消失，荧光消失。如此循环往复，决定了目标探针具有很好酸碱调控的荧光可逆性。

实施例9：探针RS1、RS2及RS3的动力学研究

固定探针浓度在10 μ mol/L，在缓冲溶液与乙醇体积比8：2的体系中，研究其荧光强度与时间的关系。研究表明，在弱酸性条件下，三种探针的荧光强度可在200 s以内达到饱和，这表明其对弱酸性环境有很高的灵敏度。同时，在较长的实验检测时间下，三种探针表现出相对稳定的荧光信号输出，这保证了试验检测的可靠性。

实施例10：探针RS1、RS2及RS3的细胞膜透性研究

37℃下，在含有5% CO₂的孵化箱中，用含有10%灭活的胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基，将A549细胞培育在ɸ35 mm 的共聚焦培养皿中，待分化成功后，用PBS将A549细胞洗三次后，分别采用浓度为2 μ mol/L、4 μ mol/L 、6 μ mol/L 、8 μ mol/L 、10 μ mol/L的含有RS1、RS2、RS3的培养基，将上述细胞分别孵化0.5 h、2 h、4 h。如图8中，可发现将A549细胞在含有10 μ mol/L RS1培养基孵化2 h后，可见细胞荧光成像。图9中，将细胞在极低浓度4 μ mol/L 的RS2中处理0.5小时，即可观察到清晰的细胞成像。图10中，将细胞在浓度6μ mol/L 的RS3中处理2小时，可观察到清晰的细胞荧光成像。这表明，三种探针分别具有优良的细胞膜透性，其中以RS2和RS3表现最为突出。

实施例11：探针RS1、RS2以及RS3的共定位研究

37℃下，在含有5% CO₂的孵化箱中，用含有10%灭活的胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基，将A549细胞培育在ɸ35 mm 的共聚焦培养皿中，待分化成功后，将用PBS将A549细胞洗三次。如图11中，用含有LysoTracker Green DND-26（0.5 μ mol/L）以及RS1（10 μ mol/L）的培养基将细胞孵化2 h后，采用共聚焦显微成像，其中LysoTracker Green DND-26选用绿光通道，RS1选用红光通道，在二者的叠加图中，可清晰的获得红光和绿光的叠加色——黄光。同样的，在图12和图13中，0.5 μ mol/L的 LysoTracker Green DND-26与4 μ mol/L的RS2经过2 h的培养，得到了良好的共定位效果。0.5 μ mol/L的 LysoTracker GreenDND-26与6 μ mol/L 的RS3经过2 h的培养，也得到了理想的共定位效果。

实施例12：探针RS1、RS2及RS3的生物灵敏度研究

将A549细胞分别用0 nmol/L、10 nmol/L 、20 nmol/L 、80 nmol/L 、100 nmol/L的巴佛洛霉A1预处理5 h，（巴佛洛霉素A1来源于灰色链霉菌，是动物细胞、植物细胞和微生物液泡型H⁺-ATP酶的特异性抑制剂，能够促使溶酶体pH升高）。再分别用10 μ mol/L 的RS1、10μ mol/L的 RS2 、10 μ mol/L RS3 以及0.5 μ mol/L LysoTracker green DND-26处理两小时。图14中可发现，相比于商品化的溶酶体染料，RS2和RS3有良好的灵敏度，相对而言，RS1的灵敏度则较差。

实施例13：探针RS1、RS2及RS3的细胞毒性研究

为更进一步了解三类探针对细胞活性的影响，设计研究了包括商品化染料LysoTracker green DND-26在内的四种探针对细胞生物活性的影响。在96孔板中种植A549细胞1×10⁵/孔，并用100μL/孔的培养基在37℃下培养24 h。用PBS溶液洗三次，再分别加入不同浓度梯度（0μM, 0.312μM, 0.625μM, 1.25μM, 2.5μM, 5μM, 10μM, 20μM, 40 μM）的LysoTracker green DND-26、RS1、RS2和RS3孵化，使用没有经过任何药品处理的细胞作为空白样。6 h后，细胞经PBS洗涤后，每孔加入20uL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），180μLDMEM培养基，继续培养4 h。终止培养，吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，至于摇床，温度恒定37℃下低速震荡10 min，用酶标仪检测490 nm处的吸光值，计算其存活率。由图15可观察到，RS2 、RS3及商品化的溶酶体染料LysoTracker green DND-26即使在高浓度下，其对细胞的毒性也是微不足道的。相对而言，RS1则在超过10μM的浓度时，对A549细胞表现出明显的毒性，考虑其在细胞透性及灵敏度实验中的表现，这表明RS1并不适合作为一种灵敏的、低毒性的溶酶体探针。对比实验表明，探针RS2和RS3由于其高灵敏度和低毒性，可以作为优良的溶酶体探针。

Claims (7)

1.如下结构式所示的化合物，

。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于结构式为：

。

3.权利要求2所述化合物的制备方法包括以下步骤：

（1）将罗丹明 B 溶于1,2-二氯乙烷中，加三氯氧磷搅拌回流，反应后将反应液冷却，旋干，得暗红色的中间产物罗丹明 B 酰氯；

（2）将步骤（1）所得罗丹明 B 酰氯溶于乙腈，加入三乙胺及2,6-二氨基吡啶或者化合物 2，搅拌回流，旋干，萃取，干燥有机相，旋干，经柱层析分离得到 RS1 或者 RS2；

（3）将步骤（2）所得RS1与水杨醛溶于无水乙醇，冷却后旋干，经柱层析得到RS3,

。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于： 步骤（2）所述的化合物2经2,6-二氨基吡啶与乙酰丙酮在浓磷酸中制得，

。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于： 步骤（2）中，所述的罗丹明 B 酰氯与2,6-二氨基吡啶或者化合物2的摩尔比1:1.2。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：RS1 及 RS3柱层析分离的洗脱剂均为体积比30:1的二氯甲烷与甲醇；探针RS2柱层析分离的洗脱剂为体积比9:1的乙酸乙酯与甲醇。

7.权利要求1所述化合物在溶酶体靶向识别中的应用。