CN114262334B

CN114262334B - 一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨成像自闪荧光染料及其合成方法与应用

Info

Publication number: CN114262334B
Application number: CN202010972053.5A
Authority: CN
Inventors: 徐兆超; 乔庆龙; 尹文婷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN114262334A

Abstract

本发明涉及一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨成像自闪荧光染料及其合成方法与应用，该类染料的结构特征在于通过2‑氨基吡啶衍生物来调控罗丹明类染料的“开”与“关”的比例。本发明涉及的荧光染料在pH>5的水溶液中均处于无荧光的闭环状态，使得这类染料能够精准定位于活细胞内溶酶体并具有较高的信噪比。此外，这类染料能够在溶酶体中拥有优异的自闪性能，从而使其能够对溶酶体的动态实现长时间的超分辨成像，并能够对不同溶酶体的pH进行监测。

Description

一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨成像自闪荧光染料及其合成方法与应用

技术领域

本发明属于超分辨荧光染料领域，具体涉及一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料及其在荧光成像领域中的应用。

背景技术

在20世纪50年代，溶酶体被Christian de Duve首次发现，其是一种单层膜的酸性细胞器。溶酶体中含有大量水解酶，能够分解蛋白质、脂质、核酸、多糖等生物聚合物，并在细胞凋亡、自噬、细胞内外物质循环中扮演着重要的角色。然而，溶酶体是高度动态的细胞器可以在细胞内快速移动。它们分布在中心体周围保持相对静止的状态，也可分布于细胞外围保持高度运动的状态。溶酶体功能的行使往往伴随着溶酶体位置变动、溶酶体与其它亚细胞器相互作用等。因此，溶酶体的实时动态监测显得尤为重要且存在巨大挑战。

借助荧光显微技术与荧光染料，微观世界能够以宏观的形式呈现出来，因此荧光显微成像技术也成为了活细胞内溶酶体原位、实时动态监测的重要分析手段。而近年来迅速发展的超分辨成像技术也让科研工作者首次在活细胞能实现了纳米尺度对细胞微观结构的监测。但是，现有溶酶体染料无法实现纳米尺度下对活细胞内溶酶体的长时间动态监测。这主要由于这些染料所需的激发光太强或激活光波长短，因此带来较大的细胞损伤与光毒性。而自开关的荧光染料可以在基态实现荧光态与暗态两者的转变，无需强的激发光、激活光、外加硫醇等，为纳米尺度下活细胞溶酶体长时间动态检测开辟了新道路。然而，目前靶向溶酶体的自闪超分辨荧光染料十分匮乏，相关报道较少。溶酶体相关研究也亟待这类染料的开发以实现纳米尺度下溶酶体原位监测，为诸多生理过程的分析提供研究工具。

发明内容

本发明涉及一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料，该类染料的结构特征在通过2-氨基吡啶衍生物对罗丹明螺酰胺进行锁环以降低分子本身的pKa，调控罗丹明螺酰胺的开关比例。此类染料在pH>5的水溶液中均处于无荧光的闭环状态，使得这类染料能够精准定位于活细胞内溶酶体并具有较高的信噪比。这类染料能够实现对活细胞内动态的溶酶体进行实时的超分辨荧光成像，在纳米尺度对溶酶体的pH、分布、相互作用，及其他细胞器相互作用进行分析。

本发明所述的用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料，是以罗丹明母体为基础，通过2-氨基吡啶衍生物进行锁环，其结构式如下所示，

其中，R₁，R₂，R₃，R₄中若一个不为H，则其余取代基为H，且不同时为H；具体为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、COONH-R₅中的任何一种基团；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基、苄基嘌呤、2-吗啉基乙基。n是0-4之间的整数。

其合成步骤如下：

具体合成步骤为：

将罗丹明B置于1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入三氯氧磷，并在80℃下反应2-4h。而后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基吡啶衍生物，80℃下反应6-8h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体。

合成步骤中罗丹明B与2氨基吡啶衍生物的质量比为1:3-5；罗丹明B的质量与三氯氧磷的体积比为1:0.005-0.01mg/mL；罗丹明B的质量与1,2-二氯乙烷的体积比为1:0.1-0.2mg/mL；罗丹明B的质量与乙腈的体积比为1:0.1-0.2mg/mL。

上述这类染料能够用于活细胞内溶酶体的动态超分辨荧光成像，在纳米尺度下监测溶酶体动态变化。

本发明具有以下特征：

这类染料具有合成方法简单且易于衍生等优点。

这类染料通过在罗丹明B中引入2-氨基吡啶衍生物，大幅降低了分子的pKa。

这类染料对能够对溶酶体进行精准的定位，实现溶酶体的共聚焦及超分辨荧光成像。

这类染料在溶酶体中能够实现自闪，从而实现光稳定的提升，对溶酶体进行长时间超分辨荧光成像，对长时间内溶酶体动态变化进行成像。并对活细胞内溶酶体的分布、pH变化、溶酶体大小、相互作用进行纳米尺度下的实时监测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中染料LysoMe-560的核磁氢谱；

图2为实施例1中染料LysoMe-560的核磁碳谱；

图3为实施例1中染料LysoMe-560在不同pH下的荧光谱图；

图4为实施例1中染料LysoMe-560的589nm处荧光强度在不同pH下的归一化曲线图；

图5为实施例1中染料LysoMe-560的单分子性能测试图；

图6为实施例1中染料LysoMe-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图；

图7为实施例1中染料LysoMe-560对单个溶酶体的超分辨成像图及强度分析图；

图8为实施例1中染料LysoMe-560对活细胞内动态溶酶体的超分辨成像图；

图9为实施例1中染料LysoMe-560对饥饿处理的活细胞内溶酶体的超分辨成像图；

图10为实施例1中染料LysoMe-560对醋酸钠处理后的活细胞内溶酶体的超分辨成像图；

图11为实施例5中染料LysoNN-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的制备方法进行详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

染料LysoMe-560的合成

将Rho B(200mg,0.42mmol)置于30mL 1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入1.5mL三氯氧磷，并在80℃下反应2h。反应液冷却后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于30mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺，而后加入2-氨基-6-甲基吡啶(600mg,5.40mmol)。80℃下反应8h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂：二氯甲烷)得到白色固体118mg，产率53％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：533.2917，实验值：533.2966。

其核磁氢谱如下图1所示，具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.24(d,J＝8.4Hz,1H),8.06–7.95(m,1H),7.59–7.45(m,2H),7.37(t,J＝7.9Hz,1H),7.22–7.12(m,1H),6.61(d,J＝7.4Hz,1H),6.39(d,J＝9.0Hz,4H),6.12(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),3.29(qq,J＝14.4,7.0Hz,8H),2.21(s,3H),1.12(t,J＝7.0Hz,12H).

其核磁碳谱如下图2所示，具体数据如下：

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ168.05,155.88,154.00,153.52,149.65,148.35,136.98,133.38,131.08,128.07,127.90,124.53,123.04,118.05,111.86,109.02,106.90,97.50,66.23,44.30,23.12,12.63.

经检测，其结构如上式示。

取本实施例得到的化合物LysoMe-560溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成2mM染料母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其在pH下的响应性质进行荧光检测。

LysoMe-560对pH响应的测试。取20μL母液置于4mL不同pH值的缓冲溶液中，配制成10μM的荧光探针测试液，而后直接用于测试不同pH条件下的荧光光谱。

实施例2

染料LysoEt-560的合成

将Rho B(100mg,0.21mmol)置于20mL 1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入1.0mL三氯氧磷，并在80℃下反应4h。反应液冷却后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于20mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺，而后加入2-氨基-6-乙基吡啶(500mg,4.09mmol)。80℃下反应6h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂：二氯甲烷)得到白色固体50mg，产率44％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：547.3073，实验值：547.3068。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.26(d,J＝8.2Hz,1H),8.04–7.91(m,1H),7.60–7.42(m,2H),7.36(t,J＝7.8Hz,1H),7.23–7.12(m,1H),6.60(d,J＝7.6Hz,1H),6.35(d,J＝8.9Hz,4H),6.11(dd,J＝8.9,2.5Hz,2H),3.25(qq,J＝14.5,7.0Hz,8H),2.24(q,J＝7.8Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H),1.10(t,J＝7.2Hz,12H).

经检测，其结构如上式示。

实施例3

染料LysoNH-560的合成

将罗丹明B(400mg,0.82mmol)置于40mL1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入2.0mL三氯氧磷，并在80℃下反应3h。反应液冷却后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于40mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺，而后加入2-氨基-5-甲氨基羰基吡啶(1400mg,9.26mmol)。80℃下反应8h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂：二氯甲烷)得到白色固体102mg，产率21％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：576.2975，实验值：576.2987。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.28(d,J＝8.4Hz,1H),8.07–7.85(m,1H),7.78–7.65(m,2H),7.47(t,J＝7.8Hz,1H),7.42–7.21(m,1H),6.68(d,J＝7.5Hz,1H),6.45(d,J＝8.8Hz,4H),6.18(dd,J＝8.8,2.5Hz,2H),3.32(qq,J＝13.8,7.2Hz,8H),2.35(s,3H),1.11(t,J＝7.1Hz,12H).

经检测，其结构如上式示。

实施例4

染料LysopM-560的合成

将Rho B(200mg,0.42mmol)置于40mL 1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入1.5mL三氯氧磷，并在80℃下反应2h。反应液冷却后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于40mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺，而后加入2-氨基-4-甲基吡啶(600mg,5.40mmol)。80℃下反应6h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂：二氯甲烷)得到白色固体142mg，产率64％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：533.2917，实验值：533.2957。

其核磁氢谱具体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(d,J＝8.4Hz,1H),8.04–7.94(m,1H),7.57–7.44(m,2H),7.39(d,J＝7.8Hz,1H),7.18(J＝7.8Hz,1H),6.60(d,J＝7.3Hz,1H),6.42(d,J＝8.7Hz,4H),6.11(dd,J＝8.6,2.4Hz,2H),3.22(qq,J＝14.2,6.9Hz,8H),2.17(s,3H),1.11(t,J＝7.2Hz,12H).

经检测，其结构如上式示。

实施例5

染料LysoNN-560的合成

将Rho B(200mg,0.42mmol)置于40mL 1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入1.5mL三氯氧磷，并在80℃下反应4h。反应液冷却后减压除去得到紫色粗产物。将粗产物溶于40mL乙腈中并加入0.5mL三乙胺，而后加入2-氨基-4-(二甲氨基乙氨基)羰基吡啶(800mg,3.84mmol)。80℃下反应8h。减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析(展开剂：二氯甲烷)得到白色固体64mg，产率24％。

其高分辨质谱数据如下：

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺：计算值：633.3553，实验值：633.3561。

其核磁氢谱体数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.26(d,J＝8.1Hz,1H),8.03–7.94(m,1H),7.61–7.45(m,2H),7.38(d,J＝7.9Hz,1H),7.21(m,1H),6.62(d,J＝7.2Hz,1H),6.42(d,J＝8.8Hz,4H),6.15(dd,J＝8.7,2.4Hz,2H),3.31(qq,J＝14.3,7.0Hz,8H),2.31(t,J＝7.4Hz,2H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),2.17(s,6H),1.12(t,J＝7.1Hz,12H).

经检测，其结构如上式示。

实施例6

实施例1中制得的染料LysoMe-560在不同pH下的荧光光谱测试。取20μL母液，加入4mL不同pH缓冲液中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光光谱的测试。

如图3所示，染料LysoMe-560在pH值5以上大部分处于闭环状态，未出现开环的荧光；而当pH值5以下，分子逐渐由无荧光的闭环结构变为开环的荧光结构。如下图3所示，LysoMe-560的开环形式荧光最大发射峰位于589nm左右。

如图4所示，染料LysoMe-560在589nm处最大值随pH变化的曲线。当pH值在3.25时，LysoMe-560开环的量达到最大，而随着pH进一步降低，荧光降低。

实施例7

实施例1中制得的染料LysoMe-560的单分子性能测试图。取1μL母液置于20mL pH＝4的缓冲液中，配制成0.1μM的染料测试液。而后将上述测试液置于共聚焦成像中并静置20min。将测试液洗去并用pH＝4的缓冲液洗涤2次后，在超分辨显微镜下进行单分子性能测试。

如图5所示，染料LysoMe-560在单分子条件下，荧光成像亮暗的变化，在70s内亮暗变化20余次。这说明该染料在无激活光的条件下能够进行亮态与暗态的变化，及能够形成自闪现象。

实施例8

实施例1中制得的染料LysoMe-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h，而后在超分辨显微镜下进行长时间荧光成像。

如图6所示，染料LysoMe-560能够对溶酶体进行精准的定位，并在长时间内跟踪溶酶体运动。

如图7所示，(a)为染料LysoM-560对单个溶酶体的超分辨成像；(b)为单个溶酶体的强度分析，可见染料LysoM-560对单个溶酶体的分辨率达到127nm。

如图8所示，染料LysoMe-560对两个溶酶体进行精准的定位后长时间跟踪两个溶酶体的运动，并在不同的阶段存在不同的运动速度，最快可达0.138μm/s。并在258-314s之间发生两者时间的相互作用，而后原本静置的溶酶体2开始运动。

实施例9

实施例1中制得的染料LysoMe-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h。将培养皿中含10％胎牛血清的培养基置换成1mL无血清培养基，并孵育3h。而后在超分辨显微镜下超分辨荧光成像。

如图8所示，染料LysoMe-560能够对溶酶体进行精准的定位。经过饥饿处理后溶酶体逐渐向细胞核附近靠近，细胞外围溶酶体较少。

实施例10

实施例1中制得的染料LysoMe-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h。将培养皿中含10％胎牛血清的培养基置换成70mM培养液，并孵育15min。而后在超分辨显微镜下超分辨荧光成像。

如图9所示，染料LysoMe-560能够对溶酶体进行精准的定位。经过70mM培养液理后即酸化活细胞细胞质的pH，溶酶体逐渐向细胞两极运动，而细胞核周围溶酶体较少。

实施例8

实施例5中制得的染料LysoNN-560对活细胞内溶酶体的超分辨成像图。取0.5μL母液加入含1mL培养液的细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂下孵育1h，而后在超分辨显微镜下进行长时间荧光成像。

如图11所示，染料LysoNN-560能够对溶酶体进行精准的定位，并释放足够光子数，完整追踪溶酶体运动轨迹及分布。

Claims

1.一类用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料，其特征在于：其结构式如下所示，

其中，R₁，R₂，R₃，R₄为H、(CH₂CH₂)_nCH₃、CONH-R₅中的任何一种基团，若R₁，R₂，R₃，R₄其中一个是(CH₂CH₂)_nCH₃或CONH-R₅，则其余为H；R₅为(CH₂CH₂)_nCH₃、N,N-二甲胺基乙基、n是0-4之间的整数。

2.一种如权利要求1所述的用于实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料的合成方法，其特征在于：该合成的具体方法如下：

将罗丹明B置于1,2-二氯乙烷中，而后向反应液中加入三氯氧磷，并在80℃下反应2-4h；而后减压除去得到紫色粗产物；将粗产物溶于乙腈中并加入0.5mL三乙胺与2-氨基吡啶衍生物，80℃下反应6-8h；减压除去溶剂，碱性氧化铝柱层析得到白色固体。

3.如权利要求2所述的一类用于实时监测溶酶体动态的超分辨自闪荧光染料的合成方法，其特征在于：

4.一种如权利要求1所述的超分辨自闪荧光染料作为非疾病的诊断与治疗的用于纳米分辨率下实时监测溶酶体动态的应用，其特征在于，该染料用于荧光成像及开关材料领域。