CN114470244A - 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 - Google Patents
一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114470244A CN114470244A CN202210141414.0A CN202210141414A CN114470244A CN 114470244 A CN114470244 A CN 114470244A CN 202210141414 A CN202210141414 A CN 202210141414A CN 114470244 A CN114470244 A CN 114470244A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- imaging
- probe
- lipid
- fluorescence
- fluorescent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 23
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 19
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 claims abstract 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 3
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 3
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 claims description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000002535 lyotropic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 abstract description 2
- QNGVNLMMEQUVQK-UHFFFAOYSA-N 4-n,4-n-diethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=CC=C(N)C=C1 QNGVNLMMEQUVQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004729 solvothermal method Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 6
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 6
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- -1 lysosomes Chemical compound 0.000 description 3
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000000482 two photon fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N caprylic alcohol Natural products CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000006306 4-iodophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C([H])C([H])=C1I 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 1
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000001530 Raman microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006505 cellular lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000013190 lipid storage Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031852 maintenance of location in cell Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N n-Octanol Natural products CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
- A61K49/0067—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle quantum dots, fluorescent nanocrystals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法。该探针对溶剂极性敏感，具有单、双光子荧光特性。可免洗实现细胞内脂滴的快速成像。具体是将N,N‑二乙基对苯二胺与无水乙醇所形成的溶液在反应釜200℃条件下进行12h的溶剂热反应，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，后经旋转蒸发得到碳点类荧光探针。该探针量子产率高、稳定性好、生物相容性优异；在疏水性的油性介质里表现出极高的荧光强度，而在水环境中荧光得以淬灭，可实现脂滴的特异性成像。本发明所制备的纳米探针具有免洗特性，简化了细胞处理步骤，可实现成像信号与背景的高反差。可用作生物宽场成像、共聚焦成像、超分辨荧光成像等。
Description
技术领域
本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种活细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和使用方法，尤其涉及一种兼具上下转换荧光性质，可以匹配共聚焦成像和双光子荧光成像系统的环境敏感的、免洗的碳点探针。
背景技术
脂滴(LDs)是由中性脂质核心组成的脂质储存细胞器，主要包含胆固醇酯和甘油三酯，由磷脂单层外壳覆盖。脂滴主要存在于真核生物的脂肪组织中，也存在于其他类型的细胞中，因为脂滴参与了不同的细胞过程，如膜形成、运输和蛋白质-蛋白质相互作用等，故在调节细胞脂质代谢中起着非常重要的作用而受到了广泛关注。此外，脂滴功能的失调会导致代谢紊乱，如肥胖、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化等。为了探究脂滴在不同代谢紊乱中的作用，了解脂滴与其他细胞器之间的相互作用，发展可靠、实时、高保真的脂滴成像方法和探针是非常重要的。细胞脂滴的可视化可以通过多种成像和谱学方法来实现，例如传统的透射光显微镜、拉曼显微镜和质谱法等。这些先进的技术使人们能够研究细胞脂滴的相关信息，但它们需要复杂的样品制备和数据分析。此外，上述方法通常需要固定细胞或提取脂滴，忽略了研究细胞自身环境中脂滴的实时动态变化的特性。另一方面，荧光成像技术由于其高灵敏度，已被证明是研究复杂生物过程的有力方法，广泛应用于细胞相关生理过程的研究。
然而，目前用于脂滴的荧光探针(包括尼罗红和BODIPY 493/503)具有局限性。首先，尼罗红非特异性的细胞器靶向性，导致对脂滴具有较低的选择性。此外，尼罗红因其在细胞中的宽发射光谱而不适合多色成像。而BODIPY 493/503也由于其短斯托克斯位移和低的光稳定性不利于脂滴的成像研究。
双光子荧光是分子本身吸收两个光子后到达激发态能级，落回至基态过程中而发射出荧光的一种上转换发光现象。因其具有较长的激发波长，因而将生物体本身荧光和光损伤降低到最小。基于这种原理开发出的双光子显微镜(TPM)可以在成像生物样品的同时获得内在深层组织区域高分辨率图像。此外，具有双光子荧光特性并具备脂滴靶向性的探针为研究脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。因此，开发多色、低毒性、高靶向性、具有双光子特性的脂滴选择性荧光探针。是监测脂滴相关的生理过程的迫切需求。
碳点(CDs)，通常是指尺寸介于纳米尺度、具有荧光性质的含碳纳米颗粒。荧光碳点的结构一般是sp2、sp3碳的杂化结构,一般具有明显的晶格结构。由于具有合成工艺简单、光学性能优异、发光可调、生物相容性好等诸多优点，近来引发了人们的广泛关注。得益于其显著的优势，碳点被广泛应用于生物传感、细胞成像、光电催化等领域。然而，目前对于其光学性能的调控，尤其是开发具有双光子特性的碳点报道较少，具有一定挑战性。碳点另的一个优点是其良好的细胞内滞留能力，目前已经开发出多种细胞器靶向的碳点，如溶酶体、线粒体、细胞核等，允许对靶标物质进行连续和长期的跟踪。这种新型的荧光探针为长时间研究脂滴、脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。然而，目前针对脂滴特异性靶向的碳点报道较少。
发明内容
本发明涉及一种细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和用途。同时，该探针具有双光子荧光特性，可以在780nm皮秒激光激发下、免洗的实现活细胞内脂滴的高质量成像；且具有量子产率高、稳定性好、生物相容性优异、操作简单的优点。其优势是可以免洗，与背景信号相比，具有更高的成像反差。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
(1)称取40mgN,N-二乙基对苯二胺与10ml无水乙醇形成混合溶液，超声10min混匀；
(2)将步骤(1)所得的液体放入20mL不锈钢反应釜中于200℃、密封条件下在烘箱中充分反应12小时，得到棕褐色溶液；
(3)将步骤(2)得到的粗产品用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂；
(4)将步骤(3)得到的红色荧光组分进行旋转蒸发，得到纯化后的碳点。
本发明柱层析操作为：以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，不断调节洗脱剂的极性，控制二氯甲烷与甲醇的比例从300：1逐渐增至100：1，以更好地分离出明亮红色荧光组分。为了便于观察，本发明进一步采用的紫外灯照明。所述干燥方式可以为旋蒸、烘干等干燥方式。
本发明提供了一种用于细胞内脂滴靶向的纳米探针制备方法及其在单双光子荧光成像领域的应用方法。该探针可用于宽场荧光成像、共聚焦成像、超分辨荧光成像等领域，可实现细胞内脂滴相关过程的动态监测。
本发明的特点在于：
(1)本发明所合成的探针所使用的原料廉价易得，探针合成方法简单，提纯操作方便，成本低廉，无需对其进行后续修饰处理，也不需要昂贵复杂的设备，易于实现批量生产。
(2)本发明所合成的探针在二甲基亚砜中发射波长可以达到610nm，量子产量为84％。兼具上下转换荧光特性，组织穿透能力强，对细胞损伤小，更有利于活细胞、组织及活体长时间荧光成像。
(3)本发明碳化具有类分子内电荷转移特性，可在诸多有机溶剂中稳定存在，且表现出显著的溶致变色特征。
(4)本发明所合成的探针稳定性好、生物相容性优异，在活细胞中能够对脂滴进行精准定位，并能匹配常见的宽场、共聚焦及双光子荧光成像系统。
(5)本发明所合成的探针使用中，可免除清洗的步骤，简化了细胞处理操作。可减小对细胞造成的损伤。
附图说明
图1为本发明所制备的碳点荧光探针合成示意图；
图2为本发明所制备的碳点于正辛醇和水混合分层后在日光灯和365nm紫外灯下的照片；
图3为本发明所制备的碳点的透射电镜图；
图4为本发明所制备的碳点的紫外-可见光谱图、荧光激发与发射光谱图；
图5为本发明所制备的碳点的在不同溶剂中的荧光光谱图；
图6为本发明所制备的碳点的在1,4-二氧六环和水中的的荧光光谱差异对比图；
图7为本发明所制备的碳点的红外光谱图；
图8为本发明所制备的碳点的细胞毒性评价图；
图9为本发明所制备的碳点和商用脂滴染料BODPY493/503在HeLa细胞中的共定位效果图，标尺为30μm；
图10为本发明所制备的碳点与HeLa细胞孵育后，用PBS缓冲液洗涤不同次数的荧光成像照片，标尺为30μm；
图11为本发明所制备的碳点和细胞核染料Hochest在HeLa细胞中的双光子荧光成像图，标尺为30μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不能包含全部的实施例。结合实施例的目的是详细地、系统得阐释本发明,而不是要以此对本发明进行限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1、碳点纳米探针的制备方法
称取40mgN,N-二乙基对苯二胺，加入至10mL无水乙醇中，超声10min使其均匀混合。再将液体转移入容积为20mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,拧紧釜盖,将反应釜放置于已经升温至200℃的烘箱中,保温12小时后将反应釜取出。使反应釜自然冷却到室温,得到棕褐色的粗产品，后用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，不断调整溶剂极性，获得红光发射的碳点,将目标产物进行旋转蒸发，得到纯化后的碳点。如图1所示。
实施例2、碳点在有机溶剂和水中的荧光强度差异
测量浓度为0.05μg/mL的碳点在1,4-二氧六环和水中的荧光图谱。实验结果如图6所示，碳点在水中的荧光非常弱，可以忽略不计，可应用于免洗的细胞成像，并且具有高对比度。
实施例3、对实施例1所制备的碳点进行细胞毒性评价
将HeLa细胞接种在96孔板里，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后每个孔板加入不同浓度的碳点溶液(使用完全培养基和胎牛血清混合溶液中进行稀释)，在培养箱中共培养24小时后将原有培养基抽掉。用完全培养基(DMEM，购自Gibcos)清洗2次，除掉未结合的碳点后，每个孔板重新加入90μL完全培养基和10μLWST-1试剂(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-)，共同孵育3小时后，用酶标仪测细胞毒性。如图8所示。
实施例4、碳点荧光探针和商用脂滴染料的共定位成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养8小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min，用PBS洗涤细胞3次。使用50μMBODIPY 493/503至DMEM中与细胞共孵育10min，用PBS洗涤细胞3次。之后在荧光共聚焦显微镜(Olympus、FV1000)下以激发波长为543nm，收集波长为560nm-660nm观察细胞中脂滴成像效果。如图9所示。
实施例5、利用碳点荧光探针进行细胞内脂滴免洗成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养6小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min。之后在荧光共聚焦显微镜(Olympus，FV1000)下以激发波长为543nm，收集波长为560nm-660nm观察细胞中脂滴成像效果，后分别用PBS洗涤细胞1-3次，采集细胞成像效果图。如图10所示。
实施例6、利用碳点荧光探针进行进行细胞内脂滴的双光子荧光成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养8小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min。用PBS洗涤细胞3次。使用10μg/mLHochest至DMEM中与细胞共孵育5min，用PBS洗涤细胞3次。之后在双光子显微镜(Olympus，FVMPE-RS)下以激发波长为780nm，收集波长为575nm-645nm观察细胞中脂滴和细胞核成像效果。如图11所示。
Claims (6)
1.一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)称取40mgN,N-二乙基对苯二胺与10ml无水乙醇形成混合溶液，超声10min混匀；
(2)将步骤(1)所得的液体放入20mL不锈钢反应釜中于200℃、密封条件下在烘箱中充分反应12小时，得到棕褐色溶液；
(3)将步骤(2)得到的粗产品用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂；不断调节洗脱剂的极性，控制二氯甲烷与甲醇的比例从300：1逐渐增至100：1，分离出紫外灯照射下的明亮红色荧光组分；
(4)将步骤(3)得到的红色荧光组分进行旋转蒸发及烘干，得到纯化后的碳点。
2.如权利要求1所述的一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针的制备方法所制备的纳米探针，其特征在于：该材料具有单光子荧光性能，又具有双光子荧光性能。
3.如权利要求2所述的一种纳米探针，其特征在于：具有类分子内电荷转移特性，在二甲基亚砜中发射波长能达到600nm以上，且表现出显著的溶致变色特征。
4.如权利要求2或3所述的一种纳米探针的使用方法，其特征在于：将浓度为50μg/mL的探针溶液，加入到生长有活细胞的培养皿中，反应30分钟后，就能实现对细胞内脂滴特异性荧光染色，用于荧光成像设备观察拍照。
5.如权利要求4所述的一种纳米探针的使用方法，其特征在于：在细胞内脂滴成像中的应用时无需清洗除去未反应的探针；该免洗特性简化了细胞处理步骤，也减小了清洗步骤对细胞的损害。
6.如权利要求4所述的一种纳米探针的使用方法，其特征在于：探针毒性低，可用于活细胞成像、实现实时监测脂滴的动态变化的目的。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210141414.0A CN114470244B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210141414.0A CN114470244B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114470244A true CN114470244A (zh) | 2022-05-13 |
| CN114470244B CN114470244B (zh) | 2023-01-24 |
Family
ID=81480557
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210141414.0A Active CN114470244B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114470244B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115746839A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-07 | 无锡代际生物科技有限公司 | 一种用于脂滴标记的纳米荧光探针及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020018968A1 (en) * | 1999-11-10 | 2002-02-14 | Shirleyanne E. Haye | Calcium ion stable photographic color developing composition and metho |
| WO2011060143A1 (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-19 | Nanoselect, Inc. | Protection and surface modification of carbon nanostructures |
| US20150050672A1 (en) * | 2013-08-19 | 2015-02-19 | Catassays | Catalytic marking nanoparticles for ultrasensitive bioassay applications |
| CN113072937A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-06 | 郑州大学 | 一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用 |
-
2022
- 2022-02-16 CN CN202210141414.0A patent/CN114470244B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020018968A1 (en) * | 1999-11-10 | 2002-02-14 | Shirleyanne E. Haye | Calcium ion stable photographic color developing composition and metho |
| WO2011060143A1 (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-19 | Nanoselect, Inc. | Protection and surface modification of carbon nanostructures |
| US20150050672A1 (en) * | 2013-08-19 | 2015-02-19 | Catassays | Catalytic marking nanoparticles for ultrasensitive bioassay applications |
| CN113072937A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-07-06 | 郑州大学 | 一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NA ZHAO ET AL: "Multifunctional pyrazoline based AIEgens: real-time tracking and specific protein "fishing" of lipid droplets", 《CHEM. SCI.》 * |
| YI HAN ET AL: "Highly efficient ratiometric nanothermometers based on colloidal carbon quantum dots", 《J. MATER. CHEM. B》 * |
| 张震 等: "荧光碳点的制备、发光机理及应用", 《发光学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115746839A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-07 | 无锡代际生物科技有限公司 | 一种用于脂滴标记的纳米荧光探针及其应用 |
| CN115746839B (zh) * | 2022-11-22 | 2023-09-29 | 无锡代际生物科技有限公司 | 一种用于脂滴标记的纳米荧光探针及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114470244B (zh) | 2023-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112358873B (zh) | 用于脂滴特异性标记的碳量子点荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN113072937B (zh) | 一种脂滴靶向碳点、制备方法及应用 | |
| CN110272734A (zh) | 一种用于no检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用 | |
| CN110927137B (zh) | 一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 | |
| WO2019057196A1 (en) | FLUORESCENT COMPOUNDS FOR IMAGING LIPID DROPLETS AND IMAGE-GUIDED PHOTODYNAMIC THERAPY | |
| EP3798221A1 (en) | Fluorescent probe and preparation method and use thereof | |
| CN113358616B (zh) | 基于双噻吩并苯衍生物的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 | |
| CN114470244B (zh) | 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 | |
| CN110981842A (zh) | 一种区分正常细胞和癌细胞的特异性检测脂滴的荧光探针及应用 | |
| Sun et al. | Near-infrared dual-functional AIEgens for lipid droplets imaging in multispecies and photodynamic therapy | |
| CN108822031A (zh) | 一种检测线粒体的双光子红发射荧光探针 | |
| CN108219780A (zh) | 一种近红外荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN114456804A (zh) | 一种红光碳点及胶束的制备方法及应用 | |
| CN113651834A (zh) | 基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在细胞脂滴成像中的应用 | |
| CN111333617B (zh) | 一类用于脂滴标记的荧光染料及其合成方法和应用 | |
| CN112945913A (zh) | 一种萘酰亚胺类荧光探针在脂滴成像领域中的应用 | |
| CN112940021A (zh) | 一类高亮度、多色免洗脂滴荧光探针 | |
| CN111961072B (zh) | 一种溶酶体靶向的红外二窗发射荧光染料及其制备方法和应用 | |
| CN111334082B (zh) | 一种高稳定性近红外脂滴荧光染料及其合成和应用 | |
| CN114644598B (zh) | 二氢吩嗪衍生物及其用途 | |
| CN114605405B (zh) | 一种基于喹吖啶酮骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 | |
| CN115536669B (zh) | 一种电子给体-电子受体(d-a)型近红外发光的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 | |
| CN110862405A (zh) | 实时检测细胞内nadh/nad+的荧光探针材料及制备方法和应用 | |
| CN111333645B (zh) | 一种用于细胞骨架标记的荧光探针 | |
| CN110452206B (zh) | 一种3-羟基黄酮类化合物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |