CN114470244B - 一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针制备及使用方法。该探针对溶剂极性敏感，具有单、双光子荧光特性。可免洗实现细胞内脂滴的快速成像。具体是将N,N‑二乙基对苯二胺与无水乙醇所形成的溶液在反应釜200℃条件下进行12h的溶剂热反应，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，后经旋转蒸发得到碳点类荧光探针。该探针量子产率高、稳定性好、生物相容性优异；在疏水性的油性介质里表现出极高的荧光强度，而在水环境中荧光得以淬灭，可实现脂滴的特异性成像。本发明所制备的纳米探针具有免洗特性，简化了细胞处理步骤，可实现成像信号与背景的高反差。可用作生物宽场成像、共聚焦成像、超分辨荧光成像等。
Description
技术领域
本方案属于荧光纳米材料制造领域，涉及一种活细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和使用方法，尤其涉及一种兼具上下转换荧光性质，可以匹配共聚焦成像和双光子荧光成像系统的环境敏感的、免洗的碳点探针。
背景技术
脂滴(LDs)是由中性脂质核心组成的脂质储存细胞器，主要包含胆固醇酯和甘油三酯，由磷脂单层外壳覆盖。脂滴主要存在于真核生物的脂肪组织中，也存在于其他类型的细胞中，因为脂滴参与了不同的细胞过程，如膜形成、运输和蛋白质-蛋白质相互作用等，故在调节细胞脂质代谢中起着非常重要的作用而受到了广泛关注。此外，脂滴功能的失调会导致代谢紊乱，如肥胖、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化等。为了探究脂滴在不同代谢紊乱中的作用，了解脂滴与其他细胞器之间的相互作用，发展可靠、实时、高保真的脂滴成像方法和探针是非常重要的。细胞脂滴的可视化可以通过多种成像和谱学方法来实现，例如传统的透射光显微镜、拉曼显微镜和质谱法等。这些先进的技术使人们能够研究细胞脂滴的相关信息，但它们需要复杂的样品制备和数据分析。此外，上述方法通常需要固定细胞或提取脂滴，忽略了研究细胞自身环境中脂滴的实时动态变化的特性。另一方面，荧光成像技术由于其高灵敏度，已被证明是研究复杂生物过程的有力方法，广泛应用于细胞相关生理过程的研究。
然而，目前用于脂滴的荧光探针(包括尼罗红和BODIPY 493/503)具有局限性。首先，尼罗红非特异性的细胞器靶向性，导致对脂滴具有较低的选择性。此外，尼罗红因其在细胞中的宽发射光谱而不适合多色成像。而BODIPY 493/503也由于其短斯托克斯位移和低的光稳定性不利于脂滴的成像研究。
双光子荧光是分子本身吸收两个光子后到达激发态能级，落回至基态过程中而发射出荧光的一种上转换发光现象。因其具有较长的激发波长，因而将生物体本身荧光和光损伤降低到最小。基于这种原理开发出的双光子显微镜(TPM)可以在成像生物样品的同时获得内在深层组织区域高分辨率图像。此外，具有双光子荧光特性并具备脂滴靶向性的探针为研究脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。因此，开发多色、低毒性、高靶向性、具有双光子特性的脂滴选择性荧光探针。是监测脂滴相关的生理过程的迫切需求。
碳点(CDs)，通常是指尺寸介于纳米尺度、具有荧光性质的含碳纳米颗粒。荧光碳点的结构一般是sp2、sp3碳的杂化结构,一般具有明显的晶格结构。由于具有合成工艺简单、光学性能优异、发光可调、生物相容性好等诸多优点，近来引发了人们的广泛关注。得益于其显著的优势，碳点被广泛应用于生物传感、细胞成像、光电催化等领域。然而，目前对于其光学性能的调控，尤其是开发具有双光子特性的碳点报道较少，具有一定挑战性。碳点另的一个优点是其良好的细胞内滞留能力，目前已经开发出多种细胞器靶向的碳点，如溶酶体、线粒体、细胞核等，允许对靶标物质进行连续和长期的跟踪。这种新型的荧光探针为长时间研究脂滴、脂滴与其他细胞器互作、脂滴生成机制及其在细胞内动态变化提供了可能。然而，目前针对脂滴特异性靶向的碳点报道较少。
发明内容
本发明涉及一种细胞内脂滴特异性靶向的纳米探针的制备方法和用途。同时，该探针具有双光子荧光特性，可以在780nm皮秒激光激发下、免洗的实现活细胞内脂滴的高质量成像；且具有量子产率高、稳定性好、生物相容性优异、操作简单的优点。其优势是可以免洗，与背景信号相比，具有更高的成像反差。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
(1)称取40mgN,N-二乙基对苯二胺与10ml无水乙醇形成混合溶液，超声10min混匀；
(2)将步骤(1)所得的液体放入20mL不锈钢反应釜中于200℃、密封条件下在烘箱中充分反应12小时，得到棕褐色溶液；
(3)将步骤(2)得到的粗产品用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂；
(4)将步骤(3)得到的红色荧光组分进行旋转蒸发，得到纯化后的碳点。
本发明柱层析操作为：以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，不断调节洗脱剂的极性，控制二氯甲烷与甲醇的比例从300：1逐渐增至100：1，以更好地分离出明亮红色荧光组分。为了便于观察，本发明进一步采用的紫外灯照明。所述干燥方式可以为旋蒸、烘干等干燥方式。
本发明提供了一种用于细胞内脂滴靶向的纳米探针制备方法及其在单双光子荧光成像领域的应用方法。该探针可用于宽场荧光成像、共聚焦成像、超分辨荧光成像等领域，可实现细胞内脂滴相关过程的动态监测。
本发明的特点在于：
(1)本发明所合成的探针所使用的原料廉价易得，探针合成方法简单，提纯操作方便，成本低廉，无需对其进行后续修饰处理，也不需要昂贵复杂的设备，易于实现批量生产。
(2)本发明所合成的探针在二甲基亚砜中发射波长可以达到610nm，量子产量为84％。兼具上下转换荧光特性，组织穿透能力强，对细胞损伤小，更有利于活细胞、组织及活体长时间荧光成像。
(3)本发明碳化具有类分子内电荷转移特性，可在诸多有机溶剂中稳定存在，且表现出显著的溶致变色特征。
(4)本发明所合成的探针稳定性好、生物相容性优异，在活细胞中能够对脂滴进行精准定位，并能匹配常见的宽场、共聚焦及双光子荧光成像系统。
(5)本发明所合成的探针使用中，可免除清洗的步骤，简化了细胞处理操作。可减小对细胞造成的损伤。
附图说明
图1为本发明所制备的碳点荧光探针合成示意图；
图2为本发明所制备的碳点于正辛醇和水混合分层后在日光灯和365nm紫外灯下的照片；
图3为本发明所制备的碳点的透射电镜图；
图4为本发明所制备的碳点的紫外-可见光谱图、荧光激发与发射光谱图；
图5为本发明所制备的碳点的在不同溶剂中的荧光光谱图；
图6为本发明所制备的碳点的在1,4-二氧六环和水中的的荧光光谱差异对比图；
图7为本发明所制备的碳点的红外光谱图；
图8为本发明所制备的碳点的细胞毒性评价图；
图9为本发明所制备的碳点和商用脂滴染料BODPY493/503在HeLa细胞中的共定位效果图，标尺为30μm；
图10为本发明所制备的碳点与HeLa细胞孵育后，用PBS缓冲液洗涤不同次数的荧光成像照片，标尺为30μm；
图11为本发明所制备的碳点和细胞核染料Hochest在HeLa细胞中的双光子荧光成像图，标尺为30μm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不能包含全部的实施例。结合实施例的目的是详细地、系统得阐释本发明,而不是要以此对本发明进行限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1、碳点纳米探针的制备方法
称取40mgN,N-二乙基对苯二胺，加入至10mL无水乙醇中，超声10min使其均匀混合。再将液体转移入容积为20mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中,拧紧釜盖,将反应釜放置于已经升温至200℃的烘箱中,保温12小时后将反应釜取出。使反应釜自然冷却到室温,得到棕褐色的粗产品，后用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，不断调整溶剂极性，获得红光发射的碳点,将目标产物进行旋转蒸发，得到纯化后的碳点。如图1所示。
实施例2、碳点在有机溶剂和水中的荧光强度差异
测量浓度为0.05μg/mL的碳点在1,4-二氧六环和水中的荧光图谱。实验结果如图6所示，碳点在水中的荧光非常弱，可以忽略不计，可应用于免洗的细胞成像，并且具有高对比度。
实施例3、对实施例1所制备的碳点进行细胞毒性评价
将HeLa细胞接种在96孔板里，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后每个孔板加入不同浓度的碳点溶液(使用完全培养基和胎牛血清混合溶液中进行稀释)，在培养箱中共培养24小时后将原有培养基抽掉。用完全培养基(DMEM，购自Gibcos)清洗2次，除掉未结合的碳点后，每个孔板重新加入90μL完全培养基和10μLWST-1试剂(2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-)，共同孵育3小时后，用酶标仪测细胞毒性。如图8所示。
实施例4、碳点荧光探针和商用脂滴染料的共定位成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养8小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min，用PBS洗涤细胞3次。使用50μMBODIPY 493/503至DMEM中与细胞共孵育10min，用PBS洗涤细胞3次。之后在荧光共聚焦显微镜(Olympus、FV1000)下以激发波长为543nm，收集波长为560nm-660nm观察细胞中脂滴成像效果。如图9所示。
实施例5、利用碳点荧光探针进行细胞内脂滴免洗成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养6小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min。之后在荧光共聚焦显微镜(Olympus，FV1000)下以激发波长为543nm，收集波长为560nm-660nm观察细胞中脂滴成像效果，后分别用PBS洗涤细胞1-3次，采集细胞成像效果图。如图10所示。
实施例6、利用碳点荧光探针进行进行细胞内脂滴的双光子荧光成像
将HeLa细胞接种在共聚焦皿中，使细胞在载玻贴壁生长，在含10％(v)胎牛血清的完全培养基(DMEM)中于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，将原有培养基抽走，然后加入300μM油酸刺激细胞以产生更多的脂滴，在培养箱中共培养8小时后将原有培养基抽掉。用PBS清洗3次，除掉多余油酸溶液，后加入50μg/mL的碳点的DMSO溶液至DMEM中与细胞共孵育30min。用PBS洗涤细胞3次。使用10μg/mLHochest至DMEM中与细胞共孵育5min，用PBS洗涤细胞3次。之后在双光子显微镜(Olympus，FVMPE-RS)下以激发波长为780nm，收集波长为575nm-645nm观察细胞中脂滴和细胞核成像效果。如图11所示。
Claims (6)
1.一种纳米探针在制备靶向脂滴的免洗荧光成像纳米探针中的应用，其特征在于：该纳米探针的制备方法包括如下步骤：
(1)称取40mgN,N-二乙基对苯二胺与10ml无水乙醇形成混合溶液，超声10min混匀；
(2)将步骤(1)所得的液体放入20mL不锈钢反应釜中于200℃、密封条件下在烘箱中充分反应12小时，得到棕褐色溶液；
(3)将步骤(2)得到的粗产品用硅胶色谱柱进行纯化，该过程中使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂；不断调节洗脱剂的极性，控制二氯甲烷与甲醇的比例从300：1逐渐增至100：1，分离出紫外灯照射下的明亮红色荧光组分；
(4)将步骤(3)得到的红色荧光组分进行旋转蒸发及烘干，得到纯化后的碳点。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：该纳米探针具有单光子荧光性能，又具有双光子荧光性能。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：纳米探针具有类分子内电荷转移特性，在二甲基亚砜中发射波长能达到600nm以上，且表现出显著的溶致变色特征。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：将浓度为50μg/mL的探针溶液，加入到生长有活细胞的培养皿中，反应30分钟后，就能实现对细胞内脂滴特异性荧光染色，用于荧光成像设备观察拍照。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：该纳米探针在细胞内脂滴成像中的应用时无需清洗除去未反应的探针；该免洗特性简化了细胞处理步骤，也减小了清洗步骤对细胞的损害。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：探针毒性低，可用于活细胞成像、实现实时监测脂滴的动态变化的目的。
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