CN108069908A - 荧光探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种荧光探针及其应用。探针具有供体‑π‑受体的电子结构，具有扭曲的分子内电荷转移和聚集诱导发光的性质，可被双光子激发。克服商用脂滴荧光染料背景大和斯托克斯位移小造成的自吸收问题，具有良好的生物兼容性，高亮度，低背景和较好的光稳定性。同时，本发明利用双光子的激发过程，可以降低自发荧光，提高信噪比，提高三维分辨率和光稳定性；本发明所提出的探针可适用于多种细胞和组织切片的脂滴成像。

Description

荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及具有聚集诱导发光特征的双光子荧光探针以及它们在生物细胞中脂滴成像的应用。
背景技术
脂滴(Lipid droplets,LDs)由磷脂单分子表层和中性脂内核组成，是细胞内中性脂的主要贮存场所,广泛存在于多种动植物细胞中。近来的研究发现脂滴并非是一个“惰性”的能量贮存器，而是一个活跃的多功能细胞器，它的异常与肥胖，II型糖尿病，脂肪肝，高脂血症和动脉粥样硬化等疾病有着密切联系。因此，脂滴的检测对生物医学研究和临床诊断具有重要意义。近年来，荧光检测方法以其高灵敏性、高分辨率、操作简单和价格低廉而逐渐成为生物医学研究的重要研究手段。商业化的脂滴荧光染料主要有尼罗红(NileRed)和 BODIPY493/503，但是，它们仍存在着一些重要缺陷：荧光背景强和斯托克斯位移小。更糟的是，这些传统的荧光分子还面临着聚集诱导淬灭 (aggregation-causedquenching，ACQ)的问题。ACQ迫使这些分子只能在低浓度下使用，进而在成像中极易因光漂白而荧光强度快速减弱。从2001年聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)的提出至今，香港科技大学唐本忠院士课题组便致力于利用AIE的概念解决一些传统荧光分子面临的问题，AIE脂滴荧光探针便是其中一个方面。相比传统商用荧光染料，AIE脂滴荧光探针在成像上具有亮度高，斯托克斯位移大和光稳定性好的优点，能满足研究中细胞内脂滴的跟踪与分析的要求。
然而，这些AIE脂滴荧光探针仍然存在激发波长短的问题，导致在组织切片中有较强的背景荧光和较低的穿透深度等问题。为解决这些问题，大量的精力投入到合成长波长激发的荧光染料，然而成功的例子却寥寥无几。该方案主要面临的挑战是增大分子间共轭引起了合成困难，分子量变大，分子疏水性增强，细胞穿透性降低，红光量子产率低等问题。另一方面，双光子激发在生物医学研究和临床诊断中越来越受欢迎。双光子激发是指物质在强激光下同时吸收了两个低能量的光子(一般是近红外光子)而从基态跃迁到激发态的非线性光物理过程。随着飞秒泵浦激光器的商业化，双光子激发或双光子荧光成像已经越来越普及。相比于单光子激发，双光子激发具有长波长激发，较少自发荧光，高3D分辨率，较少光漂白和较深的组织穿透深度等优点。若能将AIE 特征与双光子激发的结合起来，构建一个双光子AIE荧光探针，便可以为脂滴跟踪和分析提供优越的生物探针，促进脂滴相关疾病的研究。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提出了用于脂滴的双光子成像的荧光探针及其制备方法，以及脂滴的成像方法。
本发明所提出的技术方案如下：
本发明提出了一种用于脂滴荧光成像的探针，由以下的化学骨架构成：
其中，每个R基团均可独立地选自氢原子、氟原子、烷基、烷氧基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、呋喃和噻吩。
本发明上述的探针中，包括：
本发明上述的探针中，所述探针具有供体-π-受体的电子结构。
本发明上述的探针中，所述探针具有扭曲的分子内电荷转移和聚集诱导发光的性质。
本发明上述的探针中，所述探针用于被双光子激发。
本发明上述的探针中，所述探针用于指示环境的极性。
本发明上述的探针中，所述探针用于细胞荧光成像。
本发明上述的探针中，所述探针用于细胞内脂滴的成像。
本发明上述的探针中，所述探针用于流式细胞仪对细胞内脂滴的含量分析。
本发明上述的探针中，所述细胞包括活细胞、固定细胞、组织中的细胞。
本发明还提出了一种探针的制备方法，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到TPA-GFP 探针。
本发明还提出了一种探针的制备方法，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到 Naph-BMO探针。
本发明还提出了一种探针的制备方法，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到TPE-BMO探针。
本发明还提出了一种探针的制备方法，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到DM-TPE-BMO探针。
本发明还提出了一种探针的制备方法，包括：
在氮气保护下，将四三苯基膦钯、碳酸钾水溶液、乙醇以及甲苯混合，并一起回流反应；然后冷却至室温，再选用二氯甲烷萃取，然后经洗涤、干燥后，分离提纯得到
在氮气保护下，将TPAP、二异丙基乙基胺和二氯甲烷混合，再在冰盐浴下，加入三溴化硼；然后，升温至室温；接着，加入饱和碳酸钾溶液，并选用二氯甲烷萃取，再经洗涤、干燥，分离提纯得到
在氮气保护下，将TPAP-BBr、甲苯溶液、二苯基锌混合，并一起在65℃ -85℃下反应；之后，加入蒸馏水；然后选用乙酸乙酯萃取，再经洗涤、干燥，得到TPAP-BB探针。
本发明还提出了一种脂滴的成像方法，包括：
将细胞与TPA-GFP共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
本发明上述的脂滴的成像方法中，在拍摄荧光图像时，TPA-GFP被840nm 激发光所激发。
本发明还提出了一种脂滴的成像方法，包括：
使用DSPE-PEG-2000包覆TPE-BMO或DM-TPE-BMO，得到染料；
将染料与细胞共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
本发明还提出了一种脂滴的成像方法，包括：
将细胞与TPAP-BB共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
本发明公开了几种对生物细胞内的脂滴具有选择性的荧光探针。克服商用脂滴荧光染料背景大和小斯托克斯位移造成的自吸收问题，具有良好的生物兼容性，高亮度，低背景和较好的光稳定性。同时，本发明利用双光子的激发过程，可以降低自发荧光，提高信噪比，提高三维分辨率和光稳定性；本发明所提出的探针可适用于多种细胞和组织切片的脂滴成像。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1示出了TPA-GFP的合成路线图；
图2示出了BMO化合物的合成路线图；
图3示出了化合物TPAP-BB的合成路线图；
图4示出了TPA-GFP在含有不同水分(fw)的DMSO/水混合物中的发光光谱；插图：在365nm的手持式UV灯的照射下，TPA-GFP在0，40，60和90vol ％的水含量的DMSO/水混合物中的照片；
图5示出了TPA-GFP在最大发射波长的相对荧光强度(I/I0)随水含量的变化过程，其中I0是fw＝40％的荧光强度；染料浓度为10μM；激发波长为380 nm；
图6示出了TPA-GFP在不同溶剂中的发光光谱；
图7示出了在手持式365nm紫外灯照射下拍摄的TPA-GFP在不同溶剂中的照片；
图8示出了TPA-GFP的最大发射波长随溶剂的ET(30)的变化，其中ET(30) 是溶剂极性的经验参数；染料浓度为10μM；激发波长为380nm；
图9示出了通过密度泛函(DFT)计算得到的TPA-GFP的前线轨道HOMO 和LUMO的结构示意图；
图10示出了TPA-GFP在THF溶液中的双光子吸收光谱；
图11示出了TPA-GFP在THF溶液中发光强度与激光功率的关系图；染料浓度为40μM，钛：蓝宝石激光；
图12示出了通过MTT测定确定不同浓度的TPA-GFP下的HeLa细胞的细胞活力柱状图；
图13示出了用1μM的TPA-GFP染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像；
图14示出了用1μg/ml(3.8μM)的BODIPY 493/503染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图15示出了用1μM的TPA-GFP和1μg/ml(3.8μM)BODIPY 493/503的共同染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像(明场)；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图16示出了用1μM的TPA-GFP和1μg/ml(3.8μM)BODIPY 493/503的共同染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像(BODIPY 493/503的荧光图像)；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图17示出了用1μM的TPA-GFP和1μg/ml(3.8μM)BODIPY 493/503的共同染色15分钟的HeLa细胞的荧光图像(TPA-GFP的荧光图像)；HeLa细胞预先用 50μM的油酸处理5.5小时。比例尺为30μm；
图18示出了光稳定性比较图：用5μM的TPA-GFP或5μM的BODIPY染色的 HeLa细胞的荧光信号随扫描次数的变化；每次扫描的扫描时间为5.24秒；
图19示出了用1μM的TPA-GFP染色10分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图20示出了用2μM的TPA-GFP染色10分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图21示出了用5μM的TPA-GFP染色10分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图22示出了用1μg/ml的BODIPY 493/503染色15分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图23示出了用3μg/ml的BODIPY 493/503染色15分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图24示出了用5μg/ml的BODIPY 493/503染色15分钟的HeLa细胞荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为30μm；
图25示出了通过流式细胞仪对细胞中的脂滴含量的柱状分析图；HeLa细胞用50μM油酸预处理0、2、3和4小时，然后用1μM的TPA-GFP或1μg/mL的 BODIPY 493/503染色；测量了10000个事件；
图26示出了HepG2细胞、A549细胞和固定后的HeLa细胞分别用1μM的 TPA-GFP染色15分钟的(A-C)明场和(D-F)荧光图像；激发波长为442nm；比例尺为20μm；
图27示出了用TPA-GFP染色后的HeLa细胞中脂滴的荧光光谱；激发波长为405nm；
图28示出了用5μM的TPA-GFP(A和C)或5μM的BODIPY 493/503(B和D) 染色20分钟的HeLa细胞的共聚焦荧光图像；A和B为单光子成像(OPM)，在 442nm激发TPA-GFP，在488nm激发BODIPY 493/503；C和D为双光子成像 (TPM)，两者均在840nm激发；
图29示出了用5μM的BODIPY 493/503染色20分钟并在900nm激发的HeLa 细胞的双光子荧光图像；
图30示出了用5μM的BODIPY 493/503染色20分钟并在980nm激发的HeLa 细胞的双光子荧光图像；
图31示出了用1μM的TPA-GFP染色的HeLa细胞的在442nm的激发波长下的荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为25μm；
图32示出了用1μM的TPA-GFP染色的HeLa细胞的在840nm的激发波长下的荧光图像；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；比例尺为25μm；
图33示出了用1μM的TPA-GFP染色后的HeLa细胞中的荧光强度随扫描次数的变化的结果示意图；HeLa细胞预先用50μM的油酸处理5.5小时；对于OPM，激发波长为442nm；对于TPM，激发波长为840nm；
图34示出了未染色(A和B)和用10μM的TPA-GFP染色(C和D)15分钟的固定肝组织切片的共聚焦图像；A和C的激发波长为442nm；B和D的激发波长为840nm；比例尺：50μm(A和B)和25μm(C和D)；
图35示出了用10μM的TPA-GFP染色15分钟的小鼠的固定肝组织切片的不同深度下的共聚焦图像；激发波长为840nm；
图36示出了用10μM的TPA-GFP染色15分钟的小鼠的固定脑组织切片的不同深度下的共聚焦图像；激发波长为840nm；
图37示出了Naph-BMO在含有不同水分(fw)的THF-水混合物中的发光光谱；染料浓度为10μM；
图38示出了Naph-BMO荧光强度随水含量的变化过程的示意图；染料浓度为10μM；
图39示出了TPE-BMO在含有不同水分(fw)的DMSO-水混合物中的发光光谱；染料浓度为5μM；
图40示出了TPE-BMO荧光强度(I/I0)随水含量的变化过程的示意图；染料浓度为5μM；
图41示出了DM-TPE-BMO在含有不同水分(fw)的THF-水混合物中的发光光谱；染料浓度为10μM；
图42示出了DM-TPE-BMO荧光强度随水含量的变化过程的示意图；染料浓度为10μM；
图43示出了DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子的尺寸分布图；
图44示出了DSPE-PEG-2000包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子的尺寸分布图；
图45示出了DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子和DSPE-PEG-2000 包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子激发和发射光谱；
图46示出了DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子在365nm紫外灯照射下的照片；
图47示出了DSPE-PEG-2000包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子在365nm紫外灯照射下的照片；
图48示出了将HeLa细胞与含有不同染料浓度的TPE-BMO纳米粒子一起孵育的结果示意图；采用MTT试验测试细胞活力；
图49示出了将HeLa细胞与含有不同染料浓度的DM-TPE-BMO纳米粒子一起孵育的结果示意图；采用MTT试验测试细胞活力；
图50示出了HeLa细胞用TPE-BMO纳米粒子孵育24小时的荧光图像；染料浓度均为20μg/ml；比例尺：20μm；
图51示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育24 小时的荧光图像；染料浓度均为20μg/ml；比例尺：20μm；
图52示出了HeLa细胞用DM-TPE-BMO纳米粒子孵育4小时的荧光图像；染料浓度均为20μg/ml；比例尺：20μm；
图53示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子孵育4小时的荧光图像；染料浓度均为20μg/ml；比例尺：20μm；
图54示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育12h的荧光图像；染料浓度为20μg/ml。比例尺：20μm；
图55示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育6h 的荧光图像；染料浓度为20μg/ml。比例尺：20μm；
图56示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育2h 的荧光图像；染料浓度为20μg/ml。比例尺：20μm；
图57示出了HeLa细胞用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育 0.5h的荧光图像；染料浓度为20μg/ml。比例尺：20μm；
图58示出了HeLa细胞与20μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育6h的荧光图像；比例尺：20μm；
图59示出了HeLa细胞与10μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育6h的荧光图像；比例尺：20μm；
图60示出了HeLa细胞与5μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育6h的荧光图像；比例尺：20μm；
图61示出了HeLa细胞与2.5μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子孵育6h的荧光图像；比例尺：20μm；
图62示出了用20μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子染色 4h的HeLa细胞的明场图像；激发波长为740nm；
图63示出了用20μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子染色 4h的HeLa细胞的荧光图像；激发波长为740nm；
图64示出了用10μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子染色4h的HeLa细胞的明场图像；激发波长为780nm；
图65示出了用10μg/ml的DSPE-PEG-2000包覆的DM-TPE-BMO纳米粒子染色4h的HeLa细胞的荧光图像；激发波长为780nm；
图66示出了用10μg/ml DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO纳米粒子染色4h 的HeLa细胞的荧光强度随扫描次数的变化的结果示意图；每次扫描时间5.24s；
图67示出了化合物TPAP-BB在四氢呋喃和水不同比例下的荧光光谱图；
图68示出了化合物TPAP-BB在四氢呋喃和水不同比例下的相对荧光强度图；
图69示出了化合物TPAP-BB在正己烷、甲苯、四氢呋喃和二甲亚砜中的荧光光谱图；
图70示出了化合物TPAP-BB在不同研磨状态下的荧光光谱图；
图71示出了化合物TPAP-BB在不同研磨状态下的XRD衍射图；
图72示出了HeLa细胞在不同TPAP-BB浓度下的存活率分析图；
图73示出了化合物TPAP-BB和尼罗红在HeLa细胞内不同扫描次数下的相对荧光强度图；
图74示出了染有化合物TPAP-BB的HeLa细胞荧光共聚焦显微照片；
图75示出了染有尼罗红的HeLa细胞荧光共聚焦显微照片；
图76示出了染有化合物TPAP-BB的HeLa细胞和染有尼罗红的HeLa细胞在暗场下的荧光共聚焦显微照片的合并图；
图77示出了染有化合物TPAP-BB的HeLa细胞和染有尼罗红的HeLa细胞在明场下的荧光共聚焦显微照片的合并图；
图78示出了染有化合物TPAP-BB和尼罗红的HeLa细胞在不同发光强度下的荧光共聚焦显微图片(a:1.1,b:2.4,c:2.9)；
图79示出了TPAP-BB和尼罗红对HeLa细胞的脂滴染色信噪比示意图；
图80示出了化合物TPAP-BB在HeLa细胞内的荧光发射光谱图；
图81示出了染有化合物TPAP-BB和尼罗红的HeLa细胞随双氧水溶液(5 mmol)处理时间变化的荧光共聚焦显微图片(a:0分钟；b:20分钟；c:40分钟； d:60分钟)。
具体实施方式
本发明的用于单/双光子细胞成像和脂滴荧光成像的荧光探针由以下的化学骨架构成：
其中，每个R基团均可独立地选自氢原子、氟原子、烷基、烷氧基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、呋喃和噻吩。
具体地，本发明的荧光探针的具体结构的实施例包括：
1.实验部分
1.1材料
试验所需化学药品如无另外说明则均从J&K chemicals，Sigma-Aldrich和 TCI等公司购买并直接使用，无进一步纯化。在干燥氮气下，从二苯甲酮羰基钠蒸馏得到四氢呋喃(THF)。其他溶剂则从公司购买后直接使用，无进一步纯化。
1.2仪器
以CDCl3作为溶剂和四甲基硅烷(TMS)作为内标，在Bruker ARX 400 光谱仪上获得1H和13C-NMR光谱。在以MALDI-TOF模式操作的GCT primer CAB048质谱仪上获得高分辨率质谱(HRMS)。在Milton Roy Spectronic 3000 阵列光谱仪上获得UV-Vis吸收光谱。在Perkin-Elmer LS 55光谱仪上获得光致发光光谱。使用Zetaplus电位分析仪(BrookhavenInstruments Corporation， USA)在室温下测定粒径分析。用于上述试验的溶液均在1cm厚的石英电池中进行测量。通过积分球法测量固体和溶液荧光量子效率。通过双光子激发荧光法，使用罗丹明6G和荧光素作为参考，测量双光子吸收和双光子激发荧光截面。
1.3细胞培养
HeLa细胞在含有10％FBS和抗生素和双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素)的细胞培养液中并置于37℃含有5％CO2湿度培养箱中培养。
1.4MTT法测定细胞活力
将细胞以5000-10000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。过夜培养后，每孔中的培养基用100μL含有不同浓度(0,0.5,1,2.5,5,10和20μM)TPA-GFP 的新鲜培养基代替原培养液。控制DMSO的体积分数低于0.2％。24小时后，在每个孔中加入10μL的MTT溶液(5mg/mL溶于PBS中)。继续孵育 4小时后，向每个孔中加入100μL的SDS-HCl水溶液(含有10％SDS和0.01M HCl)。孵育6小时后，通过酶标仪(Perkin-Elmer Victor3TM)记录每个孔在 595nm的吸收。每个试验组重复6次。
1.5用油酸处理细胞
HeLa细胞在具有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。将细胞与50μM油酸一起培养一定时间以诱导脂滴形成。
1.6细胞成像
HeLa细胞在具有盖玻片的35mm培养皿上生长过夜。细胞用含有一定浓度的染料的培养液染色一定时间(通过在2mL培养基中加入2μLDMSO溶液， DMSO<0.1vol％)后用荧光显微镜观察。
1.7光稳定性
在共焦显微镜(Leica DMI 6000全电动倒置显微镜)上，在相应的激发光条件下，调整成像参数获得最佳图像。重复拍摄的图像数帧。然后在每个图像上，选取五个/六个区域绘制荧光信号强度关于图像帧数(或扫描图像次数) 的图。第一帧图像的荧光信号强度设置为100％。
1.8流式细胞术
用流式细胞仪(Becton Dickinson FACS Aria IIIu)分析每个细胞的荧光强度。将六个培养基的HeLa细胞培养过夜。然后将细胞与50μM油酸一起孵育 0,2,3和4小时，然后收集相应细胞用于流式细胞分析。每组细胞单独用1μM 的TPA-GFP染色10分钟或用1μg/ml的BODIPY染色15分钟后，用PBS洗涤2次。每次试验都有10000次事件。
1.9DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO的纳米粒子的制备
以TPE-BMO为例，将DSPE-PEG-2000(2mg)和TPE-BMO(0.25mg) (8:1重量比)混合在氯仿中。然后，使用空气流将氯仿除去，然后加入2.5mL 蒸馏水的蒸馏水并超声分散得到澄清的溶液。用0.45μm的滤头过滤所得的溶液，然后用于细胞培养。
1.10合成
示例#1(TPA-GFP)
TPA-GFP的合成采用Suzuki偶联，如图1的合成路线所示。在氮气保护下下，将化合物1(307mg，1mmol)，化合物2(289mg，1mmol)，Pd(PPh3)4 (40mg)，K2CO3(210mg)在20ml THF/水(4:1v/v)中的溶液加热至回流过夜。冷却至室温后，产物用二氯甲烷萃取。除去溶剂后，粗产物用硅胶柱进一步纯化获得橙色固体产物210mg，产率45％。1H-NMR(400MHz；CDCl3)δ8.18 (d,2H,J＝8.0Hz),7.63(d,2H,J＝8.0Hz),7.52(d,2H,J＝8.4Hz),7.29(d,2H, J＝7.6Hz),7.15-7.13(m,7H),7.05-7.03(m,2H),3.59(t,2H,J＝7.4Hz),2.42(s, 3H),1.71-1.65(m,2H),0.97(t,2H,J＝7.4Hz)ppm；13C-NMR(100MHz；CDCl3) δ170.9,162.5,148.0,147.7,142.2,138.5,134.0,132.9,132.8,129.5,127.9,127.1, 126.9,124.9,123.7,123.4,42.4,22.8,16.0,11.4ppm；MALDI-MS C32H29N3O [M]+计算得471.2311,实测得471.2324。
上述中的化合物1(4-溴-亚苄基恶唑酮)的合成方法参照文献中的方法。简言之，将丙胺(320mg，5.4mmol)，4-溴-亚苄基恶唑酮(1.34g，5mmol) 和碳酸钾(60mg)在24mLTHF/水(v/v＝1/1)中的混合物于油浴中加热回流并搅拌过夜。除去THF后，溶液用二氯甲烷萃取。合并有机相并用无水硫酸镁干燥。除去溶剂后，粗产物用硅胶柱纯化并采用己烷/乙酸乙酯为流动相得到产物。白色固体，0.83克，产率54％。
1H-NMR(400MHz；CDCl3)δ8.00(d,2H,J＝8.4Hz),7.54(d,2H,J＝8.4Hz), 7.00(s,1H),3.57(t,2H,J＝7.4Hz),2.39(s,3H),1.69-1.62(m,2H),0.96(t,2H, J＝7.4Hz)ppm；13C-NMR(100MHz；CDCl3)δ170.8,163.3,139.2,133.6,133.3, 132.1,125.6,124.7,42.4,22.8,16.0,11.4ppm；MALDI-MS C14H15BrN2O[M]+计算得306.0368,实测得306.0367。
示例#2(Naph-BMO)
如图2所示，简而言之，将含有相应的醛(2mmol)，N-乙酰基甘氨酸 (476mg，4mmol)和醋酸钠(164mg，2mmol)的5mL乙酸酐溶液在120℃油浴中加热3小时。然后反应液冷却至室温后，加入冷水。混合物用二氯甲烷萃取。除去溶剂后，粗产物通过硅胶柱纯化，使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂。在使用前，将该固体在二氯甲烷/己烷中结晶。并通过X射线分析方法获得单晶结构。Naph-BMO,黄色固体,35％产率.1H-NMR(400MHz；CDCl3)δ8.36(d, 1H,J＝8.4Hz),8.19(d,2H,J＝8.0Hz),7.89(d,1H,J＝8.4Hz),7.58(d,2H,J＝8.0 Hz),7.53-7.45(m,2H),7.37(d,1H,J＝8.0Hz),7.24(s,1H),6.89(d,1H,J＝8.0Hz), 4.06(s,3H),2.43(s,3H)ppm；13C-NMR(100MHz；CDCl3)δ168.1,166.2,155.7, 144.2,132.6,132.3,132.0,131.9,131.8,131.5,131.0,127.3,127.0,125.9,125.6, 122.6,55.8,15.9ppm；MALDI-MSC22H17NO3[M+H]+计算得344.1281,实测得 344.1281。
示例#3(TPE-BMO)
TPE-BMO的合成方法与Naph-BMO相似,黄色固体,产率46％.1H-NMR (400MHz；CDCl3)δ8.11(d,2H,J＝8.4Hz),7.63(d,2H,J＝8.4Hz),7.40(d,2H, J＝6.8Hz),7.16(s,1H),7.14 7.02(m,17H),2.42(s,3H)ppm；13C-NMR (100MHz；CDCl3)δ168.1,166.1,144.0,143.8,143.4,141.7,140.5,137.7,132.9, 132.5,132.2,131.6,131.3,128.0,127.9,127.4,126.8,126.7,126.4,15.9ppm； MALDI-MS C37H27NO2[M+H]+计算得518.2115,实测得518.2120。
示例#4(DM-TPE-BMO)
DM-TPE-BMO的合成方法与Naph-BMO相似,黄色固体,产率33％. 1H-NMR(400MHz；CDCl3)δH 8.11(d,2H,J＝8.4Hz),7.65(d,2H,J＝8.4Hz),7.40 (d,2H,J＝8.0Hz),7.17(s,1H),7.14-7.05(m,7H),7.00 6.94(m,4H),6.68-6.63 (m,4H),3.75(s,6H),2.42(s,3H)ppm；13C-NMR(100MHz；CDCl3)δC 168.1, 166.1,158.4,144.7,144.4,143.5,140.9,138.8,137.3,136.5,132.9,132.8,132.5, 132.2,131.7,131.4,128.0,127.3,126.5,113.4,113.2,55.3,15.9ppm；MALDI-MS C39H21NO4[M]+计算得577.2253,实测得577.2260。
示例#5(TPAP-BB)
TPAP-BB的合成路线图如图3所示。
化合物TPAP的合成：
在氮气保护下，向装有化合物1(2.0g,6.9mmol)和化合物2(1.1g,6.9 mmol)的两口瓶中加入四三苯基膦钯(150mg)、碳酸钾水溶液(2M,34mL)、乙醇(10mL)以及甲苯(50mL)。回流反应12h后停止加热，冷却至室温。淬灭反应后，选用二氯甲烷萃取混合相(3×50mL)。合并的有机相经饱和食盐水洗涤(3×100mL)、无水硫酸镁干燥后减压去除溶剂。所得粗产物通过柱层析分离提纯，得到化合物TPAP(1.85,产率：83％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δH8.68(d,J＝4.8Hz,1H),7.89(d,J＝8.6Hz,2H),7.76-7.68(m,2H),7.36-7.24(m, 4H),7.20-7.16(m,7H),7.10-7.06(t,J＝7.8Hz,2H)。
化合物TPAP-BBr的合成：
氮气保护下，向装有化合物TPAP(1.0g,3.1mmol)的三口瓶中加入二异丙基乙基胺(20mg)和二氯甲烷(50mL)。冰盐浴下，向体系中缓慢加入三溴化硼(1.0M,10mL)。之后，将反应体系升至室温。24h后，加入饱和碳酸钾溶液淬灭反应，并选用二氯甲烷萃取有机相(3×100mL)，合并的有机相用蒸馏水洗涤后(3×100mL)，干燥并去除溶剂，最终得到化合物TPAP-BBr(1.12g,产率：74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.81(d,J＝5.9Hz,1H),8.06-8.02(t,J ＝7.8Hz,1H),7.73(d,J＝8.2Hz,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),7.49(d,J＝2.1 Hz,1H),7.44-7.30(m,5H),7.24-7.10(m,6H),6.98-6.96(m,1H)。
化合物TPAP-BB的合成：
氮气保护下，向装有化合物TPAP-BBr(0.5g,1.0mmol)的甲苯溶液中(30 mL)加入二苯基锌(0.45g,2.0mmol)，并于70℃下反应12h。之后，加入蒸馏水淬灭反应，选用乙酸乙酯萃取有机层(3×80mL)，合并的有机层经饱和食盐水洗涤(3×100mL)、干燥后，去除溶剂，得到的粗产物通过柱层析分离得到化合物TPAP-BB(0.33g,产率：67％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δH 8.44(d,J ＝5.3Hz,1H),7.98-7.95(t,J＝7.5Hz,1H),7.88(d,J＝7.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(s,1H),7.30-7.17(m,19H),7.09-7.06(t,J＝7.0Hz,2H),6.96(d, J＝7.6Hz,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δC 158.14,150.60,147.47,143.98, 140.21,133.12,129.71,129.24,127.32,125.59,125.30,123.73,123.47,122.59, 120.35,120.22,117.44.MALDI-MS calculated forC35H27BN2[M]+486.23,found 486.2288。
2.TPA-GFP
2.1光物理性质：TICT+AIE
如图4-图5所示，在DMSO-水的混合溶剂中，随着水的体积分数从0增加到40％，TPA-GFP的荧光发射强度而轻微的红移而下降。由于水的极性大和扭曲分子内电子转移(TICT)效应。由于TPA-GFP在水中的溶解性差，进一步增加水的含量(>50体积％)导致聚集体的形成。在形成纳米聚集体之后， TPA-GFP的发射强度增加近100倍，峰值波长从615nm到蓝移到555nm。这是由于聚集的形成导致分子的局部环境的疏水性增加以及相邻染料分子对分子的内旋转产生的抑制。在60％水的DMSO-水混合溶剂中TPA-GFP的荧光量子效率可达0.22。
对于供体-π-受体(D-π-A)结构的分子，分子内电荷转移受溶剂极性的影响。因此，我们研究了TPA-GFP在一系列有机溶剂中的光谱性质。溶剂包括己烷(hexane)，甲苯(toluene)，乙醚(Et2O)，1,4-二恶烷(dioxane)四氢呋喃(THF)，乙酸乙酯(EA)，丙酮(acetone)，二甲基亚砜(DMSO)和乙腈 (MeCN)。TPA-GFP在不同溶剂中的光物理数据总结在表1中。
表1
a量子产率；b荧光寿命；c双光子激发荧光截面,其中1GM≡10-50 cm4s/光子；d双光子吸收截面；e TPA-GFP在水含量为60％的DMSO-水混合溶剂中的聚集体.溶液中的染料浓度为40μM；形成聚集体的溶液中染料的浓度为20μM以防止严重的沉淀。
TPA-GFP的吸收峰波长随溶剂极性的增长很小。例如，TPA-GFP在己烷中的吸收峰波长为400nm，在DMSO中为414nm，仅红移14nm。图6-图7 中的荧光光谱显示出对溶剂极性的显着依赖性。随着溶剂极性的增加， TPA-GFP的荧光发射波长从己烷中的447nm增加到MeCN中的619nm，荧光波长红移了172nm，表明TPA-GFP对极性的极高灵敏度。在不同溶剂中观察到的47-212nm的大斯托克斯位移有利于减小化吸收和发射光谱的重叠，改善探针的自吸收或“内滤”效应，从而增加信号荧光成像的信噪比。
值得一提的是，如图8所示，对荧光波长与每种溶剂的极性参数ET(30) 进行线性拟合，线性拟合的相关系数高达0.992，表明TPA-GFP可以通过荧光波长作为指示溶剂的极性。密度泛函(DFT)计算的前线轨道(图9)进一步解释TICT形成的状态。结果表明，光激发后的TPA-GFP的电子从HOMO(最高占据分子轨道)到LUMO(最低未占分子轨道)的过程中存在较大程度的分子内电荷转移(ICT)。由于供体和受体通过自由旋转的单键连接，因此大程度的ICT过程可能伴随着显着的分子几何形状的变化，而形成扭曲的分子内电荷转移(TICT)状态。TICT状态在高极性的溶剂将更稳定存在，导致分子的发光随溶剂极性增加而红移。同时。如表1所示，TPA-GFP的荧光量子效率随溶剂极性的变化显示分段行为：它们在低极性溶剂中从0.17在己烷中保持相当高，在THF中为0.61，随着溶剂极性变强，其量子产率快速降低，在MeCN中仅为0.04。这可以通过TICT状态的相对低的量子产率来解释。在许多系统中，TICT状态的辐射跃迁是禁阻的，分子通过快速非辐射跃迁来淬灭激发态。
以罗丹明6G和荧光素作为参考，使用双光子激发荧光(TPEF)法研究了 TPA-GFP的双光子光学性质，并总结在表1中。首先，如图10所示，以20nm 的间隔测量TPA-GFP在THF中的双光子激发光谱。结果显示TPA-GFP的双光子最大激发波长为840nm。图11表明双光子发光强度的对数与激发光的功率的对数具有线性关系，线性拟合斜率为1.911，进一步证明了双光子的吸收过程。计算出TPA-GFP的最高双光子吸收截面为213GM，远高于大多数荧光蛋白(通常<100GM，其中EGFP只有39GM)，合成GFP发色团(<40GM)，和文献中报道的BODIPY染料(82-128GM)。
1.2细胞成像
在细胞成像之前，我们通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)方法评估染料的生物兼容性。如图12所示，在低于20μM的浓度的染料作用下，HeLa细胞一直保持较高的生物活性，高于80％。HeLa细胞与1μM的TPA-GFP共同孵育15分钟，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像。由于疏水作用，亲脂性TPA-GFP易于积聚在疏水的脂滴(LD)中，呈现明亮的蓝绿色荧光。与商业脂滴染料BODIPY 493/503的荧光图像相比，TPA-GFP 的荧光图像具有较低的背景(图13-图14)。与BODIPY493/503共染的实验进一步验证了TPA-GFP的脂滴选择性(图15-图17)。在光稳定性方面，50次扫描后TPA-GFP荧光信号仍保持在80％以上，与具有高的光稳定性BODIPY染料相仿(图18)。将染料浓度从1μM增加到5μM，TPA-GFP染色的细胞脂滴的荧光强度增加，背景没有明显的增加，显示出TPA-GFP对脂滴的高选择性，而相比之下BODIPY染料在细胞中的绿色背景始终非常明显(图19-图24)。
由于TPA-GFP对脂滴具有高选择性，我们尝试使用TPA-GFP进行细胞中脂滴的定量分析。为了获得统计学结果，我们使用流式细胞仪对10000个细胞中脂滴的荧光强度进行数据采集和分析。HeLa细胞用50μM的油酸分别处理 0，2，3和4小时以诱导细胞中脂滴的形成，结果如图25所示。BODIPY染色的结果表明细胞内的脂滴随着油酸的孵育时间增加而增加。同时，TPA-GFP 的染色结果也具有类似的趋势，表明TPA-GFP可用于脂滴的定量分析。此外，TPA-GFP也适用于其他细胞系的脂滴成像，如HepG-2和A549以及固定细胞 (图26)。TPA-GFP在脂滴中的原位荧光光谱峰值波长为495nm(图27)，表明TPA-GFP主要位于脂滴内部的非极性疏水环境中。根据荧光发射波长与极性ET(30)的关系，我们可以推测出脂滴内部的极性ET(30)为34.8kcal/ mol，表明脂滴内的极性极低。
2.3脂滴的双光子成像
由于TPA-GFP具有高达213GM的双光子吸收横截面，我们进一步评估了 TPA-GFP是否适用于脂滴的双光子成像实验。与BODIPY进行比较，如图28 所示，在单光子激发下TPA-GFP和BODIPY均可获得较清晰的图像。然而，在840nm处被激发时，仍然可以观察到用TPA-GFP染色后的脂滴的清晰图像，而由BODIPY 493/503染色的脂滴的图像信号却非常微弱，将激发波长移动到到900nm和980nm后获得的的结果类似(图29-图30)。这些数据表明TPA-GFP更适合于双光子成像，因为它可以更容易被激发，激发时需要较少的激光功率，可以避免由高激光功率而引起的细胞的热损伤。
接下来，我们进一步通过实验证明双光子成像相对于单光子成像的优越性：更好的3D分辨率，较少的光漂白，较少的自发荧光和更深的穿透深度。首先，如图31-图32所示，相比于单光子成像中观察到模糊的荧光背景，这些背景来自扫描平面上方和下方的脂滴的被激发的荧光。双光子成像可以获得了一个扫描平面上更清晰的图像。这是因为双光子吸收取决于光强度的二次方，荧光团的激发只发生在激发光的焦点处。因此，双光子成像具有良好的3D分辨率。这种3D分辨在共聚焦显微镜中通过控制针孔的尺寸来实现，但同时却是以牺牲荧光强度为代价。
由于双光子成像时只激发扫描平面上的荧光团，而单光子成像却激发光通路中的所有荧光团，所以在双光子成像过程中，细胞内的荧光团更不容易发生光漂白的现象。如图33所示，单光子成像的图像信号随着扫描次数增加而减小。经过50次扫描后，仅有一半的信号残留，而双光子成像却依然保持几乎 100％的信号强度。
自发荧光通常是观察组织切片时的棘手问题，降低图像的对比度，尤其对低强度的荧光染料更是致命的。如图34的A照片和B照片所示，单光子激发下固定肝组织切片具有强烈的自发荧光，而当采用双光子激发时，切片中的自发荧光显着降低。采用用TPA-GFP染色并用单光子激发后，我们可以看到图像中具有强烈信号的清晰的呈球形斑点的脂滴(图34的C照片)。这是由于TPA-GFP的强荧光发射和其对脂滴的高特异性。当通过双光子激发时，我们得到了具有更高对比度的脂滴图像(图34的D照片)，这是由于双光子在很大程度上消除了自发荧光。最后，由近红外光在组织中的吸收和散射较少， 840nm激发光被认为具有比单光子激发光442nm更深的穿透深度。如图35和图36所示，我们展示了在不同的z轴深度获得用TPA-GFP染色后的肝脏和脑组织切片的图像。随着z轴深度的增加，荧光强度降低。
以上所述的结果表明TPA-GFP适合于在组织切片中的脂滴成像，为组织切片病理诊断脂滴的分布和含量提供了新工具。
3.具有类TPA-GFP的结构的荧光谭政用于双光子成像
3.1光物理性质
与TPA-GFP具有相似的结构，我们还制备了Naph-BMO，TPE-BMO和 DM-TPE-BMO。我们研究了它们在THF中，含有95％水的THF和水的混合溶剂中，和固态中的光物理性质，包括UV-Vis最大吸收波长，最大荧光波长，量子产率和寿命，并列于表2和表3中。
表2
[a]在10μM浓度下在THF中进行测量；[b]在10μM浓度下在THF水溶液(THF和水的体积比为1/99)中进行测量；[c]晶体，通过积分球面法进行测量；激发波长为370nm或360nm；
表3
[a]在THF的溶液中，染料浓度为40μM。[b]在THF-水的混合溶剂中 (THF：水＝10：90v/v)，染料浓度为40μM。
这化合物在固态下具有强烈的荧光发射，量子产率为39-59％。寿命的时间尺度表明它们的发光主要由荧光组成。
这些分子具有供体-π-受体的电子结构，因此表现出强烈的扭转分子内电荷转移(TICT)效应：它们的发射波长和强度随着溶剂极性的增加而红移和降低(以Naph-BMO作为例子，表4)。
表4
[a]染料浓度为10μM。[b]激发波长为360nm。[c]染料浓度为40μM。 [d]采用积分球的方法测量，激发波长为370nm。[e]激发波长为740nm，激发光来源于100mW钛：蓝宝石飞秒激光器。采用罗代明B(Φ:68％,σTPA＝48 GM)和荧光素(Φ:90％,σTPA＝23.87GM)为参比；nd表示没有测量。
因此在THF-水的混合溶剂中(或DMSO-水的混合溶剂中)它们荧光强度随含水量的增加而下降。然而，当分子因溶解度降低而形成聚集体时，分子间的相互作用禁止了分子内旋转而引起的非辐射衰变，因此荧光强度大大增强，这是典型的AIE现象，如图37、图38、图39、图40、图41和图42所示。因此，这些化合物具有TICT和AIE特征。
这些化合物也可被双光子激发的性质。通过TPEF方法测定这些分子在 THF中和含有95％水的THF和水的混合溶剂中的光物理性质，并列于表5中。
表5
[a]在THF-水的混合溶剂中(THF：水＝5：95v/v)，染料浓度为20μM，激发波长为720nm，激发光来源于100mW钛:蓝宝石飞秒激光器。采用罗代明B(Φ:68％,σTPA＝48GM)和荧光素(Φ:90％,σTPA＝23.87GM)为参比。[b] 采用积分球的方法测量，激发波长为360nm。
结果表明，这些化合物具有从30GM到90GM不等的双光子吸收截面，这些数值的大小还是比较可观的。
3.2TPE-BMO/DM-TPE-BMO在单、双光子细胞成像中的应用
为了探索这些发色团在单、双光子细胞成像中的应用，初步试验表明这些化合物的细胞穿透性差，无法直接用于细胞成像。我们采用DSPE-PEG-2000 制作为载体将TPE-BMO/DM-TPE-BMO递送到细胞中。DSPE-PEG-2000是被FDA(食品药品管理局)批准用于临床医学的药物的载体。如图43和图44 所示，DLS结果表明，使用DSPE-PEG-2000包覆的TPE-BMO或DM-TPE-BMO 纳米粒子的水合粒径分别为299nm和281nm(PDI为0.143和0.384)。这些 DSPE-PEG-2000包覆的纳米粒子与未包覆的纳米聚集体具有几乎相同的激发波长和荧光波长(图45-图47)。此外，我们还测量了它们在740至840nm的区间内不同波长激发下的双光子吸收截面和双光子激发荧光截面，并列于表6 中。
表6
在740至840nm的激发波长范围内，它们的双光子吸收截面的变化不大， TPE-BMO为30-34GM，DM-TPE-BMO为60-79GM。
在细胞成像之前，我们通过MTT的方法测试了DSPE-PEG-2000包覆的 TPE-BMO或DM-TPE-BMO纳米粒子的细胞兼容性。结果显示，在不同浓度的作用下(0-20ug/mL)，细胞的活性均高于90％，表明它们具有较好的生物兼容性(图48-图49)。
与未包覆TPE-BMO和DM-TPE-BMO的纳米粒子相比较，在相同染色时间下，DSPE-PEG-2000包覆的纳米粒子可以更有效地对细胞进行荧光染色 (图50、图51、图52和图53)。染色后的细胞的荧光强度可以通过孵育时间和染料的浓度来调节(TPE-BMO为例，图54、图55、图56、图57、图58、图59、图60和图61)。相较于体外，位于细胞质膜系统中的染料的发射明显蓝移，这应归因于化合物的TICT效应，因为细胞内的膜系统是相当疏水和低极性的。我们还获得这些纳米粒子染色的HeLa细胞的双光子荧光图像，如图 62、图63、图64和图65所示。同时，我们还测试化合物TPE-BMO在细胞中的光稳定性。如图66所示，TPE-BMO的荧光强度在100次扫描后几乎没有降低，表现出优异的光稳定性(图66)。这些结果表明这些化合物有望用于细胞成像。使用靶向基团或其他功能进一步修饰发色团将提高这些化合物细胞渗透性，而使之应用于生物传感，成像引导治疗，体内组织成像中。
4.TPAP-BB
4.1化合物TPAP-BB的光物理性能；
化合物TPAP-BB的四氢呋喃溶液在450-550nm范围内具有较强的荧光发射峰，同时随着少量水的加入，发射峰略有红移同时伴随着荧光强度的显着降低。当水含量为70％时，荧光强度最低。当继续加入水促进TPAP-BB的聚集之后，体系的荧光强度得到进一步加强，同时荧光发射峰略微蓝移(图67和图68所示)。研究发现当改变化合物所处溶剂的极性时，化合物TPAP-BB的荧光发射光谱也发生了明显变化：随着溶剂极性的增强，荧光光谱红移(图69 所示)，说明该化合物可用于研究外界环境的微小变化。
该类化合物也具有较为明显的力致变色效果，即当碾磨TPAP-BB粉末时，化合物的发光颜色发生红移。同时值得注意的是，当对研磨后的样品进行加热处理后，TPAP-BB的发射光谱与碾磨前光谱一致(图70所示)。这主要是由于化合物研磨前后的堆积性能有非常明显的变化，同时热处理可以使TPAP-BB 粉末由无定型态恢复为结晶态(图71所示)。
4.2化合物TPAP-BB在细胞标记中的应用；
通过HeLa细胞与不同浓度的TPAP-BB共培养并监测细胞的活性，发现即使TPAP-BB在较大的使用浓度下，多数细胞仍具有较好的生物活性，证明该类材料具有良好的生物兼容性，可以被用于细胞标记等生物应用(图72所示)。同时，通过对TPAP-BB共培养的HeLa细胞进行长时间的激发照射发现，细胞内仍然具有较好的荧光强度信号。而作为对比的商用染料尼罗红在照射过程中，荧光强度则迅速降低(图73所示)。化合物TPAP-BB良好的光稳定性也为细胞等生物组织的长时间追踪提供了可能，鉴于此，我们通过荧光共聚焦显微镜切片扫描和3D重组技术实现了HeLa细胞的3D成像(图73所示)。
另一方面，通过采用尼罗红和TPAP-BB分别与HeLa细胞共培养和比对发现：化合物TPAP-BB具有较好的脂滴标记特异性，其皮尔森相关系数高达 96％(图74-图77所示)。同时，当分别调节尼罗红和TPAP-BB在脂滴内的荧光发射强度时，尼罗红标记的细胞质对脂滴的干扰较大，而选用化合物 TPAP-BB标记时该干扰较小，证明TPAP-BB具有较好的脂滴标记特性(图78 所示)。
此外，由于外界环境极性会对化合物TPAP-BB的发射光谱产生影响(图 79所示)，因此，化合物TPAP-BB在细胞微环境下的发射光谱对于其与其他染料共染、并进一步研究细胞等的状态而言至关重要(图80所示)。
4.3化合物TPAP-BB在动态监测细胞凋亡中的应用；
利用化合物TPAP-BB标记HeLa细胞的脂滴，然后通过采用双氧水(5 mmol)处理和诱导HeLa细胞产生凋亡，实现了对细胞凋亡过程中脂滴变化的动态监测(图81所示)。其凋亡过程主要分为以下几个步骤：1)未进行双氧水处理时，TPAP-BB显示了良好的脂滴标记性能，而MT-Red则主要集中在线粒体细胞器内；2)当双氧水处理20分钟左右时，细胞线粒体形貌发生明显变化(连续的线状变为点状)，而此时脂滴变化不明显；3)当双氧水处理40分钟左右后，细胞质内出现大量脂滴的荧光信号，同时该荧光信号与线粒体内的荧光信号具有较好的重叠；4)当双氧水处理时间进一步延长时，细胞凋亡程度得以进一步加强，因此，细胞质脂滴的荧光信号得到进一步加强。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (19)

1.一种用于脂滴荧光成像的探针，其特征在于，由以下的化学骨架构成：
其中，每个R基团均可独立地选自氢原子、氟原子、烷基、烷氧基、不饱和烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、呋喃和噻吩。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，包括：
3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针具有供体-π-受体的电子结构。
4.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针具有扭曲的分子内电荷转移和聚集诱导发光的性质。
5.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针用于被双光子激发。
6.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针用于指示环境的极性。
7.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针用于细胞荧光成像。
8.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针用于细胞内脂滴的成像。
9.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针用于流式细胞仪对细胞内脂滴的含量分析。
10.根据权利要求8或9所述的探针，其特征在于，所述细胞包括活细胞、固定细胞、组织中的细胞。
11.一种探针的制备方法，其特征在于，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到TPA-GFP探针。
12.一种探针的制备方法，其特征在于，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到Naph-BMO探针。
13.一种探针的制备方法，其特征在于，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到TPE-BMO探针。
14.一种探针的制备方法，其特征在于，包括：
将Pd(PPh3)4和K2CO3投入THF水溶液中，一起加热回流，再冷却至室温；然后用二氯甲烷萃取，硅胶层析柱分离提纯得到
然后，将N-乙酰基甘氨酸和醋酸钠的乙酸酐溶液在油浴中加热，然后冷却至室温后，加入冷水，然后用二氯甲烷萃取，分离提纯得到DM-TPE-BMO探针。
15.一种探针的制备方法，其特征在于，包括：
在氮气保护下，将四三苯基膦钯、碳酸钾水溶液、乙醇以及甲苯混合，并一起回流反应；然后冷却至室温，再选用二氯甲烷萃取，然后经洗涤、干燥后，得到
在氮气保护下，将TPAP、二异丙基乙基胺和二氯甲烷混合，再在冰盐浴下，加入三溴化硼；然后，升温至室温；接着，加入饱和碳酸钾溶液，并选用二氯甲烷萃取，再经洗涤、干燥，分离提纯得到
在氮气保护下，将TPAP-BBr、甲苯溶液、二苯基锌混合，并一起在65℃-85℃下反应；之后，加入蒸馏水；然后选用乙酸乙酯萃取，再经洗涤、干燥，硅胶层析柱分离提纯得到TPAP-BB探针。
16.一种脂滴的成像方法，其特征在于，包括：
将细胞与TPA-GFP共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
17.根据权利要求16所述的脂滴的成像方法，其特征在于，在拍摄荧光图像时，TPA-GFP被840nm激发光所激发。
18.一种脂滴的成像方法，其特征在于，包括：
使用DSPE-PEG-2000包覆TPE-BMO或DM-TPE-BMO，得到染料；
将染料与细胞共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
19.一种脂滴的成像方法，其特征在于，包括：
将细胞与TPAP-BB共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到细胞内脂滴的荧光图像。
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