CN112945911A - 一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 - Google Patents
一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112945911A CN112945911A CN201911257422.6A CN201911257422A CN112945911A CN 112945911 A CN112945911 A CN 112945911A CN 201911257422 A CN201911257422 A CN 201911257422A CN 112945911 A CN112945911 A CN 112945911A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- super
- solvent
- fluorescent dye
- dye
- intramolecular
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 38
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 37
- -1 salt ions Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 69
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 40
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 40
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 17
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical class O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 9
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 7
- JYWKEVKEKOTYEX-UHFFFAOYSA-N 2,6-dibromo-4-chloroiminocyclohexa-2,5-dien-1-one Chemical compound ClN=C1C=C(Br)C(=O)C(Br)=C1 JYWKEVKEKOTYEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Substances C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JJCRDRWLOVYESJ-UHFFFAOYSA-N CC1N(C(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C Chemical compound CC1N(C(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C JJCRDRWLOVYESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000006837 decompression Effects 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 24
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 79
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 18
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 15
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 14
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 13
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 10
- 238000010869 super-resolution microscopy Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 9
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 8
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KLMIYOSCYBTUJO-UHFFFAOYSA-N CC1N(CCCC(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C Chemical compound CC1N(CCCC(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C KLMIYOSCYBTUJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IVWSGOOPQGMALJ-UHFFFAOYSA-N 2,3,3-trimethyl-1,2-dihydroindole Chemical compound C1=CC=C2C(C)(C)C(C)NC2=C1 IVWSGOOPQGMALJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLRHFNKFOHIXNL-UHFFFAOYSA-N CC(CCBr)=S Chemical compound CC(CCBr)=S YLRHFNKFOHIXNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OXMKSBSTSDSJFM-UHFFFAOYSA-N CCCCN1C2=CC=CCC2C(C)(C)C1C Chemical compound CCCCN1C2=CC=CCC2C(C)(C)C1C OXMKSBSTSDSJFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 1,2-dibromoethane Chemical compound BrCCBr PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMWHQYDMBYABKL-UHFFFAOYSA-N 1-iodohexadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCI KMWHQYDMBYABKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIAOIWGJZVLILK-UHFFFAOYSA-N CC1N(CCCBr)C2=CC=CCC2C1(C)C Chemical compound CC1N(CCCBr)C2=CC=CCC2C1(C)C KIAOIWGJZVLILK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYMGVJCGCUPQAZ-UHFFFAOYSA-N CC1N(CCCCBr)C2=CC=CCC2C1(C)C Chemical compound CC1N(CCCCBr)C2=CC=CCC2C1(C)C HYMGVJCGCUPQAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QERNGWQOHWWKEH-UHFFFAOYSA-N CC1N(CCCCC(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C Chemical compound CC1N(CCCCC(C)=S)C2=CCCCC2C1(C)C QERNGWQOHWWKEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPFQSCYCILZILN-UHFFFAOYSA-N CCCCC1(C(C)(C)C(C)N2C(C)=S)C2=CCCC1 Chemical compound CCCCC1(C(C)(C)C(C)N2C(C)=S)C2=CCCC1 HPFQSCYCILZILN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYFBLSZDIFFHLZ-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCCCCCN1C2=CC=CCC2C(C)(C)C1C Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN1C2=CC=CCC2C(C)(C)C1C HYFBLSZDIFFHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFKDLAAZADVCEZ-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCCCCCN1C2=CCCCC2C(C)(C)C1C Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN1C2=CCCCC2C(C)(C)C1C PFKDLAAZADVCEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RPZAVJPSPPSOPS-UHFFFAOYSA-N [C].N1C=CC2=CC=CC=C12 Chemical compound [C].N1C=CC2=CC=CC=C12 RPZAVJPSPPSOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N copper;hydrate Chemical compound O.[Cu].[Cu] LBJNMUFDOHXDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Chemical compound O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/08—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines
- C09B23/083—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups more than three >CH- groups, e.g. polycarbocyanines five >CH- groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/10—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups
- C09B23/107—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups four >CH- groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
- C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
- C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
- C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
- C09K2211/1037—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom with sulfur
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，该类染料为具有分子内开关的五甲川菁。此开关在绝大多数有机溶剂、固体状态及水溶液的酸性至碱性的较宽pH范围内均处于闭环状态，保护分子免受光漂白。成像条件下，分子可在质子、盐离子、激光、蛋白质及细胞内其他物质的作用下少量开环，闭环分子仍占大多数。这类分子开环比例低，开环分子亮度高、光稳定性强，适用于超分辨成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用。
背景技术
荧光成像技术是现代生命科学领域强最有力的工具之一，超分辨成像技术的出现更是将荧光成像分辨率提高至单分子尺度。依托超分辨技术在纳米尺度上对生命活动进行的长时间实时、动态跟踪与观察，是推动生命科学发展的强大动力。
为了实现更高的定位精度，超分辨显微成像技术要求单位时间内获得的光子数更多，这就对染料亮度提出了更高要求。此外，相比于传统的共聚焦荧光显微镜，超分辨显微镜所使用的激光器强度亦大幅度提高，因此更高光稳定性的染料不仅是实现高分辨成像的必要条件，也是满足长时间动态观察生命过程的必要条件。遗憾的是，目前大部分染料在亮度和光稳定性上都不足以满足长时间超分辨成像的要求。
花菁类染料是目前已知的吸光度最高，亮度最高的一类染料，在超分辨成像领域应用最为广泛。限制其应用的主要问题在于，这类染料的甲川链完全暴露，激发态极易受到单线态氧进攻而发生光漂白，不能满足长时间成像的需求。基于花菁类染料开发一类适用于长时间超分辨成像的荧光染料，是获得高亮度、可长时间成像的超分辨荧光染料的最有效途径。
发明内容
本发明涉及一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，该类荧光染料在五甲川菁染料母体上构建了分子内开关。此开关在绝大多数有机溶剂、固体状态及水溶液的酸性至碱性的较宽pH范围内均处于闭环状态，分子可在质子、盐离子、激光、蛋白质及细胞内其他物质的作用下开环。这类分子开环比例低，开环分子亮度高，光稳定性强，从而用于超分辨成像。
本发明公开了可用于超分辨成像的具有分子内开关荧光染料，是以五甲川菁染料为结构单元，其结构式如下所示，
其中，X、Y为是相同或不同的取代基，具体为H、COOH、SO3H或SO3 -中的任何一种基团；
Z为R1，R1SH，R1OH，R1COOH，R1PPh3 +，R1NHS，R1NH2，R1具体为H、CmH2m+1、CmH2m、CmH2m-1、CmH2m-3中的任一基团，或其带有单个或多个二级取代基团的衍生结构；m是1～20之间的整数；
同时，本发明还提供了用于超分辨成像的具有分子内开关荧光染料的合成方法，合成步骤如下：
具体合成步骤为：
步骤一：半菁的合成
将Y、Z取代基修饰的2,3,3-三甲基三氢吲哚与丙二醛衍生物按摩尔比1:1-1:1.1置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到红棕色产物半菁；
步骤二：X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
将X修饰的N-溴烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚和硫代乙酸钾按摩尔比1:1-10溶于N,N-二甲基乙酰胺中，25-90℃下搅拌1-12小时；减压除去溶剂，得到产物待用；
步骤三：花菁的合成
将步骤一得到的半菁，步骤二得到的X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚按及醋酸钠按摩尔比1:1-1.1:1-10置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到蓝色产物花菁；
步骤四：具有分子内开关的五甲川菁染料的合成
将步骤三得到的花菁染料与无水碳酸钾按摩尔比1:1-5加入圆底烧瓶中，向其中加入溶剂甲醇，室温下搅拌反应0.5-2小时；减压除去溶剂，色谱柱层析得到浅黄色产物即具有分子内开关的五甲川菁染料。
上述这类染料能够应用于活细胞的超分辨荧光成像，并作为探针用于荧光传感。
本发明具有以下特征：
这类染料具有合成原料低价、方法简单且易于衍生等优点。
这类染料通过在五甲川菁染料的母体上构建分子内开关，使其具备了光稳定的性质。细胞内超分辨荧光成像条件下，相比于不加此修饰的五甲川菁染料，荧光强度降低至60％可成像帧数提高了九倍；溶液测试条件下，640nm激光照射10min-120min内荧光强度保持基本不变，不加修饰的五甲川菁染料荧光强度持续下降。
这类染料在生理条件下进行超分辨成像，可维持细胞内荧光分子浓度及荧光强度稳定，实现长时间超分辨荧光成像。
这类染料对细胞内质子环境、蛋白质及离子等有“关-开”响应，可作为探针用于活细胞超分辨荧光传感。
这类染料在固体、有机溶剂及pH>4.5的水环境中大部分分子为闭环保护状态，可维持环境中荧光分子总体数量的平衡，提高材料荧光性能的稳定性，延长材料的使用寿命。
附图说明
图1：为实施例1中中间体花菁CySA-4C的核磁氢谱；
图2：为实施例1中中间体花菁CySA-4C的核磁碳谱；
图3：为实施例1中目标化合物CyS-4C的核磁氢谱；
图4：为实施例2中目标化合物CyS-3C的核磁氢谱；
图5：为实施例3中中间体花菁CySA-2C的核磁氢谱；
图6：为实施例4中中间体花菁CySA-3C的核磁氢谱；
图7：为实施例4中中间体花菁CySA-3C的核磁碳谱；
图8：为实施例1中目标化合物CyS-4C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱；
图9：为实施例1中目标化合物CyS-4C在不同溶剂中的荧光发射图谱；
图10：为实施例1中目标化合物CyS-4C在水中和表面活性剂溶液中的紫外可见吸收图谱；
图11：为实施例1中目标化合物CyS-4C在水中和表面活性剂溶液中的荧光发射图谱；
图12：为实施例1中目标化合物CyS-4C染色的人宫颈癌细胞(HeLa)线粒体的结构光照明超分辨显微成像(SIM)；
图13：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱；
图14：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同溶剂中的荧光发射图谱；
图15：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的紫外可见吸收图谱；
图16：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的荧光发射图谱；
图17：为实施例2中目标化合物CyS-3C在不同pH环境下的645nm处的紫外可见吸收的强度及拟合曲线；
图18：为实施例2中目标化合物CyS-3C荧光对小牛血清白蛋白的响应；
图19：为实施例2中目标化合物CyS-3C对环境变化所导致的开环的动力学曲线；
图20：为实施例2中目标化合物CyS-3C与已知化合物Cy5在640nm的激光照射下的紫外可见吸收与荧光发射的变化曲线；
图21：为实施例2中目标化合物CyS-3C与已知化合物Cy5染色的细胞在结构光照明超分辨显微成像(SIM) 条件下视野内的荧光强度变化曲线；
图22：为实施例2中目标化合物CyS-2C在不同溶剂中的紫外可见吸收图谱。
具体实施方式
实施例1
染料CyS-4C的合成
中间体半菁的合成路线和产物结构如下：
称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(284mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至90℃搅拌2小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：345.1961，实验值：345.1964。
经检测，其结构如上式示。
中间体N-硫乙酰丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
称取化合物N-(4-溴丁基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0,4mmol)，硫代乙酸钾(46mg，0.4mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺2mL，室温下搅拌12小时，减压蒸去溶剂直接用于下一步。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：290.1573，实验值：290.1576。
经检测，其结构如上式示。
中间体花菁CySA-4C的合成
称取化合物N-硫乙酰丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.41mmol)，步骤一合成的半菁(140mg， 0.41mmol)，乙酸钠(45mg，0.54mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1 小时。减压争取溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体104mg，产率44％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：499.2778，实验值：499.2743。
其核磁氢谱如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(t,J＝12.7小时z,2H),7.29(t,J＝6.5小时z,4H),7.14(t,J＝7.4小时z,2H),7.06(dd,J＝15.0,8.0小时z,2H),6.76(t,J＝12.3小时z,1H),6.24(dd,J＝13.2,10.0小时z,2H), 4.09–4.00(m,2H),3.63(s,3H),2.88(t,J＝6.7小时z,2H),2.24(s,3H),1.81(d,J＝6.9小时z,2H),1.70(s, 6H),1.68(s,6H),1.18(t,J＝7.1小时z,2H).
其核磁碳谱如图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ194.84,172.62,171.88,152.78,141.66,140.94,140.29,140.05,127.63, 125.32,124.24,124.13,121.38,121.24,109.61,109.55,102.98,102.63,59.38,48.46,48.43,42.96,29.75,27.47, 27.23,27.03,25.95,25.24,13.21.
经检测，其结构如上式示。
目标化合物CyS-4C的合成
称取上一步获得的花菁染料(60mg，0.1mmol)，碳酸钾(15mg，0.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌20min。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体10mg，产率17％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：457.2672，实验值：457.2610。
其核磁氢谱见图3，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(t,J＝12.8小时z,2H),7.28(dd,J＝13.8,5.8小时z,4H),7.13(t,J＝7.3小时z,2H),7.05(dd,J＝15.1,7.9小时z,2H),6.79(t,J＝12.2小时z,1H),6.37(dd,J＝16.6,13.9小时 z,2H),4.09(s,2H),3.63(s,3H),2.69(t,J＝6.2小时z,2H),1.84(s,4H),1.70(s,6H),1.66(s,6H).
经检测，其结构如上式示。
将本实施例得到的化合物CyS-4C溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其不同溶剂中的光谱、对离子及pH等的响应，活细胞长时间超分辨成像性质进行检测。
CyS-4C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
CyS-4C对pH响应的测试。取20μL母液置于40mL表面活性剂的水溶液(2mM的曲拉通100)中配制成5μM的荧光探针测试液。用0.1M的盐酸水溶液或0.1M的氢氧化钠水溶液调节测试液的pH在 3-12的范围内均匀变化，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。
CyS-4C对活细胞的结构光照明显微成像(SIM)。取1μL母液置于1mL人宫颈癌细胞(HeLa)培养液中，培养箱中孵育60min，随后用于结构光照明显微成像。
CyS-4C在活细胞内SIM成像条件下的稳定性实验。将染色好的人宫颈癌细胞(HeLa)在SIM拍照条件下，用相同成像模式每隔30S成像一帧，连拍数十张，统计成像时细胞内的荧光强度成像帧数的变化情况。
实施例2
染料CyS-3C的合成
中间体半菁的合成路线和产物结构如下：
称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(312mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至110℃搅拌1小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：345.1961，实验值：345.1964。
经检测，其结构如上式示。
中间体N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
称取化合物N-(3-溴丙基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(300mg，0.8mmol)，硫代乙酸钾(1.14mg，10mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂N,N-二甲基甲酰胺2mL，90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂直接用于下一步。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：276.1417，实验值：276.1422。
经检测，其结构如上式示。
中间体花菁CySA-3C的合成
称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.41mmol)，步骤一合成的半菁(150mg， 0.45mmol)，乙酸钠(45mg，0.54mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至110℃搅拌 1小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体104mg，产率44％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：485.2621，实验值：485.2619。
其核磁氢谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(t,J＝13.1小时z,2H),7.37(d,J＝7.4小时z,4H),7.25–7.21(m, 2H),7.17–7.12(m,2H),6.91(dd,J＝24.4,12.2小时z,1H),6.45(t,J＝12.5小时z,1H),6.39–6.31(m,1H), 4.20(s,2H),3.71(s,3H),3.07(t,J＝7.0小时z,2H),2.36(d,J＝4.4小时z,3H),2.11(d,J＝9.7小时z,2H), 1.77(s,6H),1.75(s,6H).
经检测，其结构如上式所示。
目标化合物CyS-3C的合成
称取上一步获得的花菁染料(50mg，0.09mmol)，碳酸钾(64mg，0.45mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，90℃搅拌0.5h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体5mg，产率13％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：443.2515，实验值：443.2520。
其核磁氢谱数据如图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.13(d,J＝9.1小时z,2H),7.07(dd,J＝16.2,8.4小时z,2H),6.90(ddd,J ＝15.1,9.3,3.7小时z,2H),6.84–6.77(m,2H),6.57(t,J＝7.5小时z,2H),6.25(dd,J＝14.4,10.9小时z, 1H),5.73–5.67(m,1H),5.33(d,J＝11.9小时z,1H),3.70–3.63(m,1H),3.50(dd,J＝10.4,5.0小时z,1H), 3.11(s,3H),3.00(td,J＝13.0,2.4小时z,1H),2.43(d,J＝13.4小时z,1H),1.85–1.71(m,2H),1.60(d,J＝ 2.8小时z,6H),1.37(s,3H),1.30(d,J＝4.1小时z,3H).
经检测，其结构如上式所示。
将本实施例得到的化合物CyS-3C溶解于二甲基亚砜溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，对其光谱、光稳定性，活细胞长时间超分辨成像性质进行检测。
实施例3
染料CyS-2C的合成
中间体半菁的合成路线和产物结构如下：
称取N-甲基-2,3,3-三氢吲哚(300mg，1mmol)与丙二醛衍生物(284mg，1mmol)置于单口瓶中，加入溶剂乙酸酐3mL，升温至110℃搅拌2小时。减压除去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1， V/V)得红棕色固体181mg，产率60％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：345.1961，实验值：345.1964。
经检测，其结构如上式示。
中间体2-硫乙酰基-溴乙烷的合成
取化合物1,2-二溴乙烷(500μL，5.8mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺中配成溶液(S1)，化合物硫代乙酸钾(726mg，6.4mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺中配成溶液(S2)，将溶液S2缓慢滴入S1中，迅速析出大量白色固体，室温下继续搅拌一个小时，旋干反应液，硅胶柱层析(石油醚/二氯甲烷＝3/1，V/V)，得无色透明液体840mg，产率79％。
其核磁氢谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.48–3.41(m,2H),3.34–3.27(m,2H),2.36(s,3H).
中间体N-硫乙酰乙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
取化合物2,3,3-三甲基三氢吲哚(50mg，0.3mmol)，2-硫乙酰基-溴乙烷(170mg，0.9mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙腈2mL，90℃搅拌过夜，减压蒸去溶剂直接用于下一步。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：262.1260，实验值：262.1259。
经检测，其结构如上式示。
中间体花菁CySA-2C的合成
称取化合物N-硫乙酰乙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(26mg，0.1mmol)，步骤一合成的半菁(33mg，0.1 mmol)，乙酸钠(10mg，0.12mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌2小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得蓝色固体21mg，产率50％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：471.2465，实验值：471.2486。
其核磁氢谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(dd,J＝24.9,12.4小时z,2H),7.37(dt,J＝10.7,7.5小时z,4H),7.25 (dd,J＝12.9,5.6小时z,2H),7.22–7.14(m,2H),6.84(t,J＝12.4小时z,1H),6.48(d,J＝13.4小时z,1H), 6.38(d,J＝13.8小时z,1H),4.26–4.18(m,2H),3.75(s,3H),3.33–3.23(m,2H),2.37(s,3H),1.78(d,J＝9.6 小时z,12H).
经检测，其结构如上式所示。
目标化合物CyS-2C的合成
称取上一步获得的花菁染料(20mg，0.04mmol)，碳酸钾(5mg，0.04mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌2h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得浅黄色固体2.6mg，产率15％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：430.2443，实验值：430.2451。
其核磁氢谱如图5所示，其数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17–7.05(m,5H),6.79(dd,J＝13.6,7.4小时z,3H),6.57–6.52(m,2H), 6.09(dd,J＝14.4,10.9小时z,1H),5.70(d,J＝14.9小时z,1H),5.29(d,J＝11.9小时z,1H),4.13(dd,J＝ 12.6,5.6小时z,1H),3.51–3.44(m,1H),3.08(s,3H),2.91(t,J＝7.7小时z,1H),2.69(td,J＝9.6,7.2小时z, 1H),1.62–1.50(m,12H).
经检测，其结构如上式所示。
实施例4
化合物CyDS-3C的合成
中间体花菁CyDSA-4C的合成
称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(390mg，1.1mmol)，丙二醛衍生物(129mg，0.5 mmol)，乙酸钠(90mg，1.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)得蓝色粉末200mg，产率60％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：587.2760，实验值：587.2753。
经验证，其结构如上式所示。
目标化合物CyDS-2C的合成
称取上一步获得的花菁染料(20mg，0.03mmol)，碳酸钾(12mg，0.09mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温下搅拌20min。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V) 得浅黄色固体1.7mg，产率11％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：502.2476，实验值：502.2479。
经验证，其结构如上式所示。
实施例5
化合物CySMito-3C的合成
中间体N-(4-三苯基膦)丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
称取化合物N-(4-溴丙基)-2,3,3-三甲基三氢吲哚(100mg，0.27mmol)，三苯基膦(702mg，2.7mmol) 置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙腈2mL，90℃搅拌过夜。旋干反应液，用正己烷分散残余液，四氢呋喃洗涤，抽滤得肉粉色固体140mg，产率99％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]2+：计算值：446.2842，实验值：223.1419。
其核磁数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.00(s,1H),7.90(d,J＝6.7Hz,3H),7.87–7.73(m,12H),7.62(s,3H), 7.57(s,1H),4.56(s,2H),3.77(s,2H),3.60(s,2H),2.83(s,3H),2.10(s,2H),1.49(s,6H).
经检测，其结构如上式示。
中间体半菁的合成
称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：405.1995，实验值：405.2004.
经检验，其结构如上式所示。
中间体花菁的合成
称取化合物N-(4-三苯基膦)丁基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(97mg，0.20mmol)，上一步制得的半菁(75 mg，0.15mmol)置于圆底烧瓶中，向其中加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌1小时。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得蓝色固体20mg，产率10％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]2+：计算值：788.3918，实验值：394.1953.
经检验，其结构如上式所示。
目标化合物CySMito-3C的合成
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：746.3813，实验值：746.3901.
经检验，其结构如上式所示。
实施例6
化合物CySMB-3C的合成
中间体半菁的合成
称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至110℃搅拌2小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：405.1995，实验值：405.2004.
经检验，其结构如上式所示。
中间体N-十六烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
取化合物2,3,3-三甲基三氢吲哚(550μL，3mmol)，碘十六烷(1.3g，3mmol)置于密封管中，加热至90℃搅拌48小时。充分冷却反应液，将固体分散于正己烷中，抽滤得紫色蜡状固体1.36g，产率38％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：384.3625，实验值：384.3668。
其核磁数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.99–7.95(m,1H),7.84(dd,J＝5.9,2.7Hz,1H),7.63(dd,J＝5.1,3.7 Hz,2H),4.48–4.39(m,2H),2.83(s,3H),1.88–1.77(m,2H),1.53(s,6H),1.45–1.36(m,2H),1.34–1.19(m, 24H),0.85(t,J＝6.8Hz,3H).
经检验，其结构如上式所示。
中间体花菁的合成
称取化合物N-十六烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(97mg，0.20mmol)，上一步制得的半菁(75mg，0.15 mmol)置于圆底烧瓶中，向其中加入溶剂醋酸酐5mL，升温至90℃搅拌2小时。减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得蓝色固体20mg，产率10％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：695.4969，实验值：695.4979
经检验，其结构如上式所示。
目标化合物CySMB-3C的合成
称取上一步获得的花菁染料(60mg，0.1mmol)，碳酸钾(15mg，0.1mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂甲醇2mL，室温搅拌2h。减压蒸去溶剂，碱性氧化铝柱层析(二氯甲烷/甲醇＝15/1，V/V)得浅黄色固体10mg，产率17％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M+H]+：计算值：653.4863，实验值：653.4872.
经检验，其结构如上式所示。
实施例7
化合物CySCB-3C的合成
中间体N-丙酸甲酯基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
取化合物2,3,3,-三甲基三氢吲哚(1.5mL,9mmol)，化合物3-溴丙酸甲酯(1.2mL，11mmol)置于圆底烧瓶中，加热至90℃搅拌过夜。向粘稠的反应液中加入丙酮，充分超声使其分散，抽滤得白色砂质固体1.3g，产率45％。
其核磁数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98(dd,J＝6.1,2.8Hz,1H),7.84(dd,J＝5.8,2.8Hz,1H),7.62(dd,J＝5.8,3.1Hz,2H),4.68(t,J＝7.0Hz,2H),3.61(s,3H),3.07(t,J＝7.0Hz,2H),2.86(s,3H),1.53(s,6H).
中间体半菁的合成
称取化合物N-硫乙酰丙基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(200mg，0.55mmol)，丙二醛衍生物(180mg，0.63 mmol)置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90℃搅拌1小时，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析得红棕色固体60mg，产率20％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]+：计算值：405.1995，实验值：405.2004.
经检验，其结构如上式所示。
中间体花菁的合成
取化合物N-丙酸甲酯基-2,3,3-三甲基三氢吲哚(150mg，0.46mmol)，上一步合成的半菁(200mg，0.41 mmol)，醋酸钠(41mg，0.5mmol)置于圆底烧瓶中，升温至90o搅拌一个小时。减压蒸干反应液，硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝30/1，V/V)得蓝色化合物64mg，产率22％。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]2+：计算值：557.2832，实验值：557.2835
该化合物核磁氢谱如图6，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.42–8.31(m,2H),7.62(dd,J＝12.3,7.4Hz,2H),7.45–7.34(m,4H), 7.26(dt,J＝14.3,5.3Hz,2H),6.58(t,J＝12.4Hz,1H),6.33(dd,J＝20.5,13.9Hz,2H),4.36(t,J＝6.6Hz,2H), 4.18(t,J＝6.4Hz,2H),3.55(s,3H),2.93(t,J＝7.3Hz,2H),2.79(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(s,3H),2.01–1.91(m, 2H),1.69(d,J＝12.0Hz,12H).
该化合物核磁碳谱如图7，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ195.66,173.74,172.93,171.36,155.05,154.67,142.40,142.12,141.65, 141.37,128.94,126.28,125.43,125.09,122.99,122.88,111.57,111.41,104.09,103.67,70.23,56.50,52.17, 49.56,49.28,43.02,31.74,31.05,27.91,27.62,27.52,26.05.
经检验，其结构如上式所示。
目标化合物CySCB-3C的合成
取上一步得到的花菁染料(23mg，0.04mmol)溶于乙醇中，向其中滴入1M氢氧化钠水溶液，室温下搅拌反应30分钟。减压蒸干反应液，色谱柱分离得浅黄色化合物3.6mg。
其高分辨质谱数据如下：
HRMS(ESI)：m/z：[M]2+：计算值：501.2570，实验值：501.2573.
经验证，其结构如上式所述。
实施例8
实施例1中制得的化合物CyS-4C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
如图8、图9所示，在有机溶剂中，该化合物的最大吸收位于645nm左右，荧光位于675nm左右。在水中，该化合物出现明显的H聚集，荧光淬灭。在PBS中，该化合物出现无序聚集，荧光淬灭。
实施例9
CyS-4C对活细胞的结构光照明显微成像(SIM)。取1μL母液置于1mL人宫颈癌细胞(HeLa)培养液中，培养箱中孵育60min，随后用于结构光照明显微成像。
如图10所示，HeLa细胞的线粒体轮廓明确，线粒体嵴清晰可见。化合物CyS-4C可实现活细胞线粒体超分辨成像。
实施例10
实施例2中制得的化合物CyS-3C在多种溶剂中的光谱测试。取3μL母液，加入3mL溶剂中，配制成2μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
如图11所示，化合物CyS-3C在有机溶剂中大部分处于闭环状态，300-400nm之间的闭环吸收峰较强，而位于600-700nm之间的开环吸收峰较弱，开环分子的最大吸收峰位于650nm左右。如图12 所示，该化合物的开环形式在有机溶剂中的最大发射峰位于675nm左右。
实施例11
实施例2制得的化合物CyS-3C对pH响应的测试。取20μL母液置于40mL表面活性剂的水溶液 (2mM的曲拉通100)中配制成5μM的荧光探针测试液。用0.1M的盐酸水溶液或0.1M的氢氧化钠水溶液调节测试液的pH在3至12的范围内均匀变化，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。
如图13、14所示，溶液pH由4变到12的过程中，化合物的最大吸收和最大发射均逐渐降低，而300-400nm之间的宽峰随着碱性增加逐渐增强。说明该化合物在碱性条件下，巯基进攻到吲哚碳上形成闭环结构。
如图15所示，对化合物CyS-3C在不同pH条件下的最大吸收强度进行采集和拟合，判断该化合物的pK-cycle位于5.5。从图中可以看出，在生理pH条件下(pH＝7.4)该化合物基本处于完全闭环状态，可以保证在成像时未与目标结合的分子处于暗态，并能起到对消耗的开环分子实时补充的效果，极大地降低了成像的背景荧光、延长成像时间。
实施例12
实施例2制得的化合物CyS-3C对蛋白质响应的测试。分别取3μL母液，加入3mL磷酸缓冲溶液或4mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲溶液中，迅速混匀检测其荧光随时间的变化。
如图16所示，将化合物与牛血清白蛋白混匀120分钟以后，荧光强度出现了大约11倍的提升。相同条件下与PBS混匀的化合物，荧光强度未发生明显改变。该化合物在正常生理条件下处于闭环状态，与蛋白质靠近或结合后，受蛋白影响会发生由闭环到开环状态的改变。
实施例13
实施例2制得的化合物CyS-3C在活细胞内SIM成像条件下的稳定性实验。将染色好的人宫颈癌细胞(HeLa)在SIM拍照条件下，用相同成像模式每隔30S成像一帧，连拍数十张，统计成像时细胞内的荧光强度随成像帧数的变化情况。
如图17所示，连续成像50帧后视野内荧光强度平均下降至初始值的80％，已知化合物Cy5相同条件下荧光强度下降至初始值的20％。
实施例14
实施例3中制得的化合物CyS-2C在多种溶剂中的光谱测试。取7.5μL母液，加入3mL溶剂中，配制成5μM的荧光探针测试液，并进行紫外和荧光光谱的测试。
如图18所示，化合物CyS-2C在有机溶剂中大部分处于闭环状态，主要吸收峰为位于300-400nm 之间的闭环部分的特征吸收，位于600-700nm之间的开环吸收峰较弱，开环分子的最大吸收峰位于650nm 左右。如图19所示，该化合物的开环形式在有机溶剂中的最大发射峰位于675nm左右。
实施例15
实施例3中制得的化合物CyS-2C对pH响应的测试取7.5μL母液，加入3mL不同pH的缓冲溶液中，配制成5μM的荧光探针测试液，测试不同pH条件下测试液的吸收和荧光光谱。
如图20、21所示，溶液pH由2变到8的过程中，化合物的最大吸收和最大发射均逐渐降低，而 300-400nm之间的宽峰随着碱性增加逐渐增强，即该化合物在碱性条件下形成闭环结构。
如图22所示，对化合物CyS-3C在不同pH条件下的最大吸收强度进行采集和拟合，判断该化合物的pK- cycle位于pH＝4。从图中可以看出，在生理pH条件下(pH＝7.4)该化合物处于完全闭环状态，可以保证在成像时未与目标结合的分子处于暗态，样本内闭环分子数量多，开环分子数量少，极大地降低了成像的背景荧光。同时可通过开关环平衡维持活细胞内开环分子数量和荧光强度总体平衡，适用于超分辨成像。
Claims (5)
1.一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，其特征在于：采用具有分子内开关的荧光染料用于活细胞超分辨荧光传感，荧光染料结构式如下所示，
其中，X、Y为是相同或不同的取代基，具体为H、COOH、SO3H或SO3 -中的任何一种基团；
Z为R1，R1SH，R1OH，R1COOH，R1PPh3 +，R1NHS，R1NH2，R1具体为H、CmH2m+1、CmH2m、CmH2m-1、CmH2m-3中的任一基团，或其带有单个或多个二级取代基团的衍生结构；m是1～20之间的整数。
2.根据权利要求1所述具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，其特征在于：所述具有分子内开关的荧光染料通过以下方法制备得到：
步骤一：半菁的合成
将Y、Z取代基修饰的2,3,3-三甲基三氢吲哚与丙二醛衍生物按摩尔比1:1-1:1.1置于圆底烧瓶中，加入溶剂乙酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到红棕色产物半菁；
步骤二：X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚的合成
将X修饰的N-溴烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚和硫代乙酸钾溶于N,N-二甲基乙酰胺中，25-90℃下搅拌1-12小时；减压除去溶剂，得到产物待用；
步骤三：花菁的合成
将步骤一得到的半菁，步骤二得到的X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚按及醋酸钠置于圆底烧瓶中，加入溶剂醋酸酐，升温至90-110℃反应1-5小时；减压除去溶剂，硅胶柱层析得到蓝色产物花菁；
步骤四：具有分子内开关的五甲川菁染料的合成
将步骤三得到的花菁染料与无水碳酸钾加入圆底烧瓶中，向其中加入溶剂甲醇，室温下搅拌反应0.5-2小时；减压除去溶剂，色谱柱层析得到浅黄色产物即具有分子内开关的五甲川菁染料。
3.根据权利要求2所述具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，其特征在于：所述步骤二中X修饰的N-溴烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚和硫代乙酸钾摩尔比为1:1-10。
4.根据权利要求2所述具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，其特征在于：所述步骤三中半菁、X取代基修饰的N-硫乙酰烷基-2,3,3-三甲基三氢吲哚及醋酸钠摩尔比为1:1-1.1:1-10。
5.根据权利要求2所述具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用，其特征在于：所述步骤四中花菁染料与无水碳酸钾摩尔比为1:1-5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911257422.6A CN112945911A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911257422.6A CN112945911A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112945911A true CN112945911A (zh) | 2021-06-11 |
Family
ID=76225310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911257422.6A Pending CN112945911A (zh) | 2019-12-10 | 2019-12-10 | 一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112945911A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114813689A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-07-29 | 梅晔生物医药股份有限公司 | 一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110122784A (ko) * | 2010-05-05 | 2011-11-11 | 주식회사 디케이씨코포레이션 | 생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 |
| CN106280533A (zh) * | 2016-08-17 | 2017-01-04 | 赣南师范学院 | 一种近红外荧光染料及其合成方法和用于寄生虫荧光标记 |
| CN110396304A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-11-01 | 深圳大学 | 五甲川菁染料及其制备方法 |
-
2019
- 2019-12-10 CN CN201911257422.6A patent/CN112945911A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110122784A (ko) * | 2010-05-05 | 2011-11-11 | 주식회사 디케이씨코포레이션 | 생체 분자 표지를 위한 신규 시아닌 화합물 및 그 제조방법 |
| CN106280533A (zh) * | 2016-08-17 | 2017-01-04 | 赣南师范学院 | 一种近红外荧光染料及其合成方法和用于寄生虫荧光标记 |
| CN110396304A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-11-01 | 深圳大学 | 五甲川菁染料及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MASAHIRO OE等, 《TETRAHEDRON LETTERS》/PH-RESPONSIVE CY5 DYES HAVING NUCLEOPHILIC SUBSTITUENTS FOR MOLECULAR IMAGING, vol. 59, 19 July 2018 (2018-07-19), pages 3318 * |
| YUAN DAN等, 《ORGANOMETALLICS》/TEMPLATE-DIRECTED SYNTHESIS OF PALLADIUM(II) SULFONATE-NHC COMPLEXES AND CATALYTIC STUDIES IN AQUEOUS MIZOROKI–HECK REACTIONS, vol. 33, no. 7, 21 March 2014 (2014-03-21), pages 1798 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114813689A (zh) * | 2022-05-12 | 2022-07-29 | 梅晔生物医药股份有限公司 | 一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法 |
| CN114813689B (zh) * | 2022-05-12 | 2023-12-15 | 梅晔生物医药股份有限公司 | 一种分析透明质酸透细胞膜吸收能力的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2015240774B2 (en) | Azetidine-substituted fluorescent compounds | |
| Belov et al. | Rhodamine spiroamides for multicolor single‐molecule switching fluorescent nanoscopy | |
| CN103087545B (zh) | 一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用 | |
| Zhang et al. | A ratiometric lysosomal pH probe based on the coumarin–rhodamine FRET system | |
| Ke et al. | A strategy of NIR dual‐excitation upconversion for ratiometric intracellular detection | |
| Zhai et al. | Small-molecule fluorogenic probes for mitochondrial nanoscale imaging | |
| Liu et al. | A series of carbazole cationic compounds with large two-photon absorption cross sections for imaging mitochondria in living cells with two-photon fluorescence microscopy | |
| WO2020124688A1 (zh) | 一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用 | |
| CN108069908A (zh) | 荧光探针及其应用 | |
| Yang et al. | BODIPY derivatives bearing borneol moieties: Enhancing cell membrane permeability for living cell imaging | |
| Zhu et al. | A two-photon off-on fluorescence probe for imaging thiols in live cells and tissues | |
| Wang et al. | Design, synthesis, cell imaging, kinetics and thermodynamics of reaction-based turn-on fluorescent probes for the detection of biothiols | |
| Chen et al. | Rhodamine Fluorophores for STED Super‐Resolution Biological Imaging | |
| CN112945911A (zh) | 一种具有分子内开关的荧光染料在超分辨成像中的应用 | |
| Song et al. | Self-Assembled Micellar Nanosensor toward pH with high photo-stability and its application in living cells | |
| CN112940521B (zh) | 一类光稳定的荧光染料及其合成方法与应用 | |
| Xu et al. | Design of a pH-sensitive supramolecular fluorescent probe for selective cancer cell imaging | |
| CN112940520B (zh) | 一类具有细胞器定位性质的荧光染料在细胞器成像中的应用 | |
| CN111334077B (zh) | 一种488nm激发的高亮度、高稳定性荧光染料及其合成方法 | |
| CN111333646B (zh) | 一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用 | |
| Dejouy et al. | Synthetic routes to novel fluorogenic pyronins and silicon analogs with far-red spectral properties and enhanced aqueous stability | |
| CN115960087B (zh) | 黏度响应型双光子荧光化合物及其合成与应用 | |
| Eçik et al. | Dual color triads: synthesis, photophysics and applications in live cell imaging | |
| CN111334074A (zh) | 一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料 | |
| CN111334084B (zh) | 一种高亮度、高稳定性、高渗透性线粒体荧光染料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |