CN111333646B - 一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用 - Google Patents

一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针及其制备方法和应用，该探针为在萘酰亚胺4，5‑位引入环己二胺刚性环设计合成的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP‑tag探针，其结构式如(1)所示。由于聚集诱导荧光淬灭的效应，探针分子在水中荧光亮度极低，而与SNAP‑tag结合后荧光量子产率可达0.80以上，荧光增强约28倍。因此，该探针能够对活细胞内融合有SNAP‑tag的目标蛋白进行特异性标记并实现免洗荧光成像。此外，由于稳定性及亮度的提升，该探针实现了超分辨荧光成像(SIM/STED)，分辨率达到120nm。

Description

一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针及其制备方法及 应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag 探针及其制备方法和应用。
背景技术
SNAP-tag标签法已经成为目前应用最为广泛的蛋白质标记技术，通过其与目标蛋白的融合可以对目标蛋白进行示踪、功能的监测等。因此借助有机小分子染料的合理设计可以实现对目标蛋白的多色荧光标记，在单分子检测及超分辨荧光成像领域对蛋白进行实时监测。这也就要求基于小分子的SNAP-tag荧光探针拥有高稳定性的同时在结合SNAP-tag之后有高的荧光增强倍数，以实现精准成像、高信噪比。
而目前的商业SNAP-tag探针通常连接有罗丹明、花菁染料，与SNAP-tag 结合后荧光增强倍数只有1-2倍。此外，罗丹明与花菁染料的正电性导致此类探针极容易在线粒体聚集，很大程度上增加了荧光成像的背景。因此，科研工作者将环境敏感型荧光染料与苄基鸟嘌呤结合设计合成了诸多荧光增强型 SNAP-tag探针。这类探针通过在水环境荧光量子产率低，非极性环境中荧光量子产率高的特点达到荧光增强的目的。然而，通常从水环境到SNAP-tag疏水空腔中荧光伴有大幅的蓝移。在细胞复杂的环境中很难采用合适的波段捕捉荧光信号，从而导致荧光信号的误差。如何通过环境不敏感型荧光染料的合理设计达到与SNAP-tag结合后高荧光增强倍数的同时实现信号采集的准确性是目前 SNAP-tag探针设计及应用的屏障。
发明内容
本发明提供了一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该探针与 SNAP-tag蛋白结合后荧光强度增加28倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。
本发明提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。
本发明提供一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，通过萘酰亚胺4,5- 位环己二胺的引入达到荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。此外，萘酰亚胺变为环境不敏感型荧光染料，在与 SNAP-tag结合前后荧光峰型及波长不随微环境变化而发生变化，保持了荧光信号的准确性。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，该荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0001910277170000021
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，此荧光探针合成路线如下：
Figure BDA0001910277170000031
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中。将反应液加热至 40-90℃，搅拌1-10h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体 N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24 h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的 N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。
步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为1:0.5-2；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:1-3；
N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。
步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；
N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50-200g/mL。
上述一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针对SNAP-tag蛋白具有高度选择性，能够在活细胞等复杂环境中对SNAP-tag进行特异性识别。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针用于SNAP-tag蛋白的识别与检测。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在单分子检测中的应用。
一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
本发明具有以下特征：
本发明的SNAP-tag探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。
该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后，荧光逐渐恢复，达到较好off-on 的效果，荧光增强倍数可达28倍。
该SNAP-tag探针分子在结合SNAP-tag蛋白后荧光量子产率均大于0.80，亮度高、光稳定性好。
该SNAP-tag探针在结合SNAP-tag蛋白后荧光波长及峰型不随极性变化而改变，能够保持荧光信号的准确性。
该SNAP-tag探针能够对活细胞内SNAP-tag蛋白进行特异性识别，并实现免洗荧光成像。此外，探针可用于SIM，STED等超分辨荧光成像。
附图说明
图1实施例1制备的SNAP-DAC的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的探针BA-DAC在不同溶剂中归一化的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图3实施例1制备的探针SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。
图4实施例1制备的探针SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线图，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为1μM。
图5实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的pSNAPf-Cox8A的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图6实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的pSNAPf-H2B的HEK293细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图7实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的Hela细胞结构光照明(SIM)的显微镜成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图8实施例1制备的探针SNAP-DAC在转染的Hela细胞STED超分辨荧光成像图，荧光探针的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成
Figure BDA0001910277170000061
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(853mg，6.22mmol)。80℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V) 分离得米白色固体480mg，产率35％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(d,J＝8.1Hz,2H),8.50–8.39(m,2H), 7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝7.9Hz,2H),5.23(s,2H),5.13(t,J＝5.8Hz, 1H),4.45(d,J＝5.5Hz,2H).
BA-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000071
将BA-NBr(200mg，0.45mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至110℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体93mg，产率48％。其核磁谱图氢谱碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.6Hz,21H),7.56(s,2H),7.24(d, J＝8.2Hz,2H),7.20(d,J＝8.3Hz,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),5.14(s,2H),5.10 (t,J＝5.7Hz,2H),4.42(d,J＝5.7Hz,2H),3.16(d,J＝9.2Hz,2H),2.19(d,J＝ 12.0Hz,2H),1.72(d,J＝7.3Hz,2H),1.49–1.18(m,4H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ163.39,154.73,141.39,137.45,134.91,133.49,127.79,126.77,110.69, 107.60,106.41,63.16,59.47,42.36,32.06,23.62.
经检测，其结构如上式BA-DAC所示，其光性能如下：
BA-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱测试。每次取20μL BA-DAC母液加入4mL乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱的测试。
BA-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱测试如图2 所示：BA-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在485nm左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
SNAP-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000081
将BA-DAC(40mg，0.09mmol)、BG+(95mg，0.37mmol)、叔丁醇钾(84 mg，0.75mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入3mL干燥DMF。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体28mg，产率53％。实施例1制备的SNAP-DAC的核磁谱图氢谱如图1所示，其核磁谱图氢谱碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.39(s,1H),8.05(d,J＝8.6Hz,2H),7.79(s, 1H),7.56(s,2H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,2H),6.84(d,J＝8.7 Hz,2H),6.27(s,2H),5.41(s,2H),5.17(s,2H),3.16(d,J＝8.5Hz,2H),2.19(d,J＝ 11.3Hz,2H),1.73(d,J＝6.6Hz,2H),1.40–1.25(m,4H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ163.39,160.30,160.09,155.65,154.76,138.94,138.22,135.61,134.96, 133.53,128.86,127.99,113.94,110.71,107.56,106.40,99.99,66.98,59.47,42.38, 32.06,23.62.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C31H29N8O3[M+H]+561.2363, 实际值561.2380.
经检测，其结构如上式SNAP-DAC所示，其光性能如下：
SNAP-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中荧光发射光谱测试。每次取20μLSNAP-DAC母液加入4mL乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水中，配制成10μM的荧光染料测试液，进行荧光发射光谱的测试。SNAP-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在486nm左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
实施例2
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成
Figure BDA0001910277170000091
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(500mg，3.65mmol)。80℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V) 分离得米白色固体480mg，产率35％。
BA-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000101
将BA-NBr(200mg，0.45mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺200mg。将反应液缓慢加热至110℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体90mg，产率46％。
SNAP-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000102
将BA-DAC(40mg，0.09mmol)、BG+(40mg，0.16mmol)、叔丁醇钾(40 mg，0.36mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入2mL干燥DMF。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体26mg，产率51％。
经检测，其结构如上式SNAP-DAC所示，其光性能如下：
SNAP-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在486nm 左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
实施例3
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成
Figure BDA0001910277170000111
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(2g，14.6mmol)。90℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体480mg，产率35％。
BA-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000112
将BA-NBr(200mg，0.45mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺600mg。将反应液缓慢加热至110℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体90mg，产率46％。
SNAP-DAC的合成
Figure BDA0001910277170000121
将BA-DAC(40mg，0.09mmol)、BG+(200mg，0.80mmol)、叔丁醇钾 (200mg，1.80mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入8mL 干燥DMF。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体26mg，产率51％。
经检测，其结构如上式SNAP-DAC所示，其光性能如下：
SNAP-DAC在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在486nm 左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱变化及细胞内荧光成像。
实施例4
SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱测试。取 0.5μL SNAP-DAC母液溶于1mL PBS中进行荧光光谱测试，而后加入等浓度 SNAP-tag蛋白半小时后进行荧光光谱测试。测试温度为37℃。
SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合前后荧光光谱如图3所示：SNAP-DAC在与SNAP-tag蛋白结合后逐渐被分散，荧光强度增加28倍。荧光发射波长及峰型没有明显变化。
实施例5
SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线测试。取 0.5μL SNAP-DAC母液溶于1mL PBS中，而后加入等浓度蛋白后检测485nm 处荧光强度，激发波长为440nm。
SNAP-DAC在PBS中与1μM SNAP-tag蛋白结合的动力学曲线如图4所示：SNAP-DAC在加入SNAP-tag后逐渐与蛋白发生特异性结合，荧光恢复，荧光强度在4分钟内达到稳定。SNAP-DAC与SNAP-tag反应常数大于6000 M-1S-1，t1/2＝30s。
实施例6
探针SNAP-DAC在转染细胞中荧光共聚焦成像及超分辨成像测试。取0.5 μL SNAP-DAC母液溶于1mL培养液中，而后置于37℃下孵育30分钟后进行荧光成像。
探针SNAP-DAC在通过pSNAPf-Cox8A诱导HEK293细胞表达融合有 SNAP-tag的Cox8A转染细胞中荧光共聚焦成像如图5所示：(a)为1μM探针 SNAP-DAC通道染色效果图(采集500-550nm)；(b)为商业化染料Mitotracker Red(采集580-654nm)染色效果图；(c)为(a)与(b)叠加图。探针能够分别对融合有SNAP-tag的Cox8A进行特异性标记，从而达到对线粒体免洗成像，线粒体结构清晰，与商业染料能够有很好的共定位效果。
探针SNAP-DAC在通过pSNAPf-H2B诱导HEK293细胞表达融合有 SNAP-tag的H2B转染细胞中荧光共聚焦成像如图6所示：(a)为1μM探针SNAP -DAC通道染色效果图(采集500-550nm)；(b)为商业化染料细胞核染料 Hochest 33342(采集417-477nm)染色效果图。探针能够对融合有SNAP-tag的 H2B进行特异性标记，从而达到对细胞核免洗成像，细胞核轮廓清晰，与商业染料能够有很好的共定位效果。
探针SNAP-DAC在通过pSNAPf-H2B诱导Hela细胞表达融合有SNAP-tag 的H2B转染细胞中超分辨成像如图7所示：1μM探针SNAP-DAC通道染色效果图(采集500-550nm)探针能够对融合有SNAP-tag的H2B进行特异性标记，染料稳定性的提升使其能够应用于SIM成像。
探针SNAP-DAC在通过通过pSNAPf-H2B诱导Hela细胞表达融合有 SNAP-tag的H2B转染细胞中超分辨成像如图8所示：1μM探针SNAP-DAC 通道染色效果图(采集500-550nm)探针能够对融合有SNAP-tag的H2B进行特异性标记，由于染料稳定性的提升，该探针仍能够在STED 3kW/cm2的强度下完成成像。

Claims (9)

1.一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针，其特征在于该探针的结构如下：
Figure FDA0003370954510000011
2.根据权利要求1所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和4-氨甲基苄醇溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺；
(3)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得免洗SNAP-tag探针。
3.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：4-氨甲基苄醇的质量比为1:0.5-2；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中：N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与环己二胺的质量比为1:1-3；
N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；
N-(4-羟甲基)苄基-4,5-环己二胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:50-200g/mL。
6.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。
7.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针用于SNAP-tag蛋白的识别与检测。
8.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在单分子检测中的应用。
9.一种如权利要求1所述的高亮度、高稳定性免洗SNAP-tag探针在STED及SIM超分辨成像中的应用。
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