CN111334074A - 一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料。该染料为以萘酰亚胺为染料母体，以三苯基膦为定位基团设计合成的一种能够对活细胞线粒体快速、准确标记的荧光染料。通过在供电子一端引入氮杂环丁烷，一定程度上抑制了染料的TICT，使其亮度和稳定性大幅度提高，水中吸光度可达16000M‑1cm‑1，量子产率为0.27，稳定性明显增加，适用于线粒体的超分辨显微成像，在生物成像领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料和成像领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料。
背景技术
线粒体被认为是细胞内最重要的细胞器之一，监测其形态及与多种细胞器的相互作用，对深刻理解复杂的细胞生命活动非常必要。光学显微镜因其原位无损的检测特点，在这类生命科学领域的研究中备受青睐。尤其是近些年来发展起来的超分辨显微成像技术，其高于20nm的分辨率为细胞器水平的研究带来了新机遇。而超分辨显微成像技术所使用的高功率激光器，对细胞器定位荧光染料的亮度和稳定性提出了更高要求。
目前广泛使用的绿色商业线粒体染料为基于花菁染料的MitoTracker Green，花菁染料易被生物体内的单线态氧氧化而淬灭，光稳定性差、量子产率低，极大地限制了超分辨显微成像技术在线粒体相关研究领域应用。因此，开发一种高亮度、高稳定性荧光染料对于活细胞线粒体超分辨荧光成像显得尤为迫切。
发明内容
本发明提供了一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，，该染料克服了商业线粒体荧光染料亮度、光稳定性差的缺点。具体结构以1,8-萘酰亚胺为荧光团，以三苯基膦为靶向基团，借助线粒体自身显负性的膜电位即可实现对线粒体的定位，从而实现对线粒体超分辨显微像。
本发明一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，其结构式如下所示：
一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，合成步骤如下：
合成路线：
具体合成方法如下：
(1)中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将4-溴-1,8-萘酐和6-氨基-1-己醇混合于乙醇中，加热至60-90℃，搅拌24-48h。反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐。
(2)中间体N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐溶于乙酸乙酯中，向其中滴加0.5-1.5g三溴化磷，缓慢升温至50-70℃搅拌6-8h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐。
(3)中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐和三苯基膦混合于乙腈中，密封管中升温至120-140℃搅拌8-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐。
(4)化合物Mito-Aze的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚中，向其中滴加氮杂环丁烷，升温至120-140℃搅拌8-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-Aze。
步骤(1)中：4-溴-1,8-萘酐与6-氨基-1-己醇的质量比为1:0.3-5，4-溴-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:3-20g/mL。
步骤(2)中：N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:0.25-1.5，N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为1:5-10g/mL。
步骤(3)中：N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为1:0.5-3，N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为1:5-20g/mL
步骤(4)中：N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐与氮杂环丁烷的质量比为1-16:1，N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:10-50g/mL。
一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
本发明具有以下特征：
该探针原料廉价易得，合成方法简单等优点。
该探针在水中的量子产率达到0.27，吸光度达到16000M-1cm-1，相比于常规萘酰亚胺染料亮度明显提高，在HeLa、MCF等细胞中都能实现对线粒体的准确定位，适用于线粒体的超分辨显微成像。
附图说明
图1为实施例1制备得到的化合物Mito-Aze的核磁氢谱；
图2为实施例1制备得到的化合物Mito-Aze的核磁碳谱；
图3为实施例1制备得到的化合物Mito-Aze的高分辨质谱；
图4为实施例1制备得到的化合物Mito-Aze在不同溶剂中的归一化荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图5为实施例1制备得到的化合物Mito-Aze在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM；
图6为实施例1制备的探针Mito-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中，经过不同时间激光照射后后其最大荧光发射强度的变化，横坐标为激光照射时间，纵坐标为相对荧光强度，即最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值；
图7为实施例1中制备得到的化合物Mito-Aze标记的宫颈癌细胞(HeLa)线粒体共聚焦成像图；
图8为实施例1中制备得到的化合物Mito-Aze标记的HeLa细胞线粒体结构光照明显微成像图。
具体实施方式
实施例1.
线粒体探针Mito-Aze的合成。
中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
4-溴-1,8-萘酐(0.50g，1.81mmol)和6-氨基-1-己醇(0.64g，5.44mmol)混合于10mL乙醇中，升温至80℃，反应结束8h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得灰白色固体0.58g，产率86％。
其高分辨质谱数据如下：
高分辨质谱C18H18BrNO3 +[M]+计算值：376.0548；实验值：376.0521。
经检测，其产物结构为N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.80mmol)溶于10mL乙酸乙酯中，向其中滴加三溴化磷(0.64g，2.4mmol)，缓慢升温至70℃搅拌6h，减压出去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得灰白色固体0.22g，产率63％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.57(dd,J＝8.5,0.8Hz,1H),8.41(d,J＝7.9Hz,1H),8.04(d,J＝7.9Hz,1H),7.85(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),4.23–4.03(m,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),1.95–1.82(m,2H),1.81–1.66(m,2H),1.58–1.34(m,4H).
其核磁谱图碳谱数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.64,163.62,133.30,132.07,131.26,131.12,130.64,130.29,129.01,128.10,123.09,122.22,40.39,33.83,32.67,29.72,27.87,26.26.
经检测，其产物结构为N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.69mmol)和三苯基膦(0.91g，3.45mmol)混合于5mL乙腈中，密封管中升温至140℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得白色固体0.39g，产率82％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(d,J＝7.3Hz,1H),8.51(d,J＝8.5Hz,1H),8.31(d,J＝7.9Hz,1H),7.99(d,J＝7.9Hz,1H),7.82(ddd,J＝12.8,10.1,7.6Hz,10H),7.71(td,J＝7.6,3.4Hz,6H),4.07(t,J＝7.3Hz,2H),3.78–3.68(m,2H),1.70–1.60(m,4H),1.45–1.36(m,2H).
经检测，其产物结构为N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐。
线粒体探针Mito-Aze的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.1g，0.14mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，向其中滴加氮杂环丁烷(42mg，0.72mmol)，升温至120℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得橙色固体33mg，产率40％。
其核磁谱图氢谱如下图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.48(d,J＝7.2Hz,1H),8.33(d,J＝8.1Hz,1H),8.26(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(dt,J＝14.3,7.3Hz,9H),7.71(dd,J＝7.1,2.7Hz,6H),7.51(t,J＝7.8Hz,1H),6.38(d,J＝8.4Hz,1H),4.51(t,J＝7.4Hz,4H),4.06(t,J＝7.0Hz,2H),3.69(s,2H),2.65–2.54(m,2H),1.80(s,2H),1.67(d,J＝11.6Hz,4H),1.39(s,2H).
其核磁谱图碳谱如下图2所示，具体数据如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.72,164.04,152.58,135.05,133.72,133.62,133.28,131.09,130.60,130.48,130.25,123.74,118.71,117.85,116.16,106.23,55.44,29.70,27.47,26.35,22.29,17.10.
其高分辨质谱谱图如下图3所示，具体数据如下：
高分辨质谱计算值C39H38N2O2P+[M]+：1054.4134；实验值：1054.4212。
经检测，其产物结构如上式Mito-Aze所示，能够准确定位于活细胞线粒体，亮度和稳定性满足长时间荧光成像的需求，其性能如下：
将该探针溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱变化及细胞内线粒体荧光成像。
Mito-Aze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的荧光发射及紫外吸收光谱测试。每次取20μL荧光染料母液，分别加入4mL乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水，配制成10μM的荧光染料测试液，分别进行荧光发射和紫外吸收光谱的测试。
Mito-Aze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化荧光发射谱图如图4所示；Mito-Aze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的归一化紫外吸收谱图如图5所示；其中Mito-Aze的浓度为10μM，该探针在水中的量子产率达到0.27，吸光度达到16000M-1cm-1，相比于常规萘酰亚胺染料亮度明显提高，具有很高的亮度。
Mito-Aze与荧光素在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4)中的光稳定性测试。取20μLMito-Aze、荧光素母液，分别加入4mL PBS缓冲液中，配制成10μM的荧光探针测试液，并在500W钨灯下连续照射。光源距离样品50cm，每次将测试液温度稳定在25℃后进行荧光光谱测试。采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,8,10h为时间点分别测试。
Mito-Aze与荧光素在不同时间激光照射后，最大荧光发射强度与初始最大荧光发射强度的比值如图6所示；其中荧光探针浓度均为10μM，在连续照射10h后，Mito-Aze的荧光发射强度相比初始最大荧光发射强度仅下降了约10％，而荧光素染料的发射强度下降了近90％，证明Mito-Aze有很好的光稳定性。
实施例2.
线粒体探针Mito-Aze的合成。
中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
4-溴-1,8-萘酐(0.50g，1.81mmol)和6-氨基-1-己醇(0.3g，2.72mmol)混合于10mL乙醇中，升温至80℃，反应结束8h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得灰白色固体0.47g，产率67％。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.80mmol)溶于10mL乙酸乙酯中，向其中滴加三溴化磷(0.15g，0.61mmol)，缓慢升温至60℃搅拌6h，减压出去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得灰白色固体0.14g，产率56％。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.69mmol)和三苯基膦(0.15g，0.57mmol)混合于5mL乙腈中，密封管中升温至120℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得白色固体0.26g，产率69％。。
线粒体探针Mito-Aze的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.1g，0.14mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，向其中滴加氮杂环丁烷(6mg，0.12mmol)，升温至120℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得橙色固体21mg，产率30％。
经检测，其产物结构如上式Mito-Aze所示，其在水中荧光发射波长为560nm，紫外吸收为470nm。
实施例3.
线粒体探针Mito-Aze的合成。
中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
4-溴-1,8-萘酐(0.50g，1.81mmol)和6-氨基-1-己醇(2.5g，22mmol)混合于10mL乙醇中，升温至80℃，反应结束8h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)分离得灰白色固体0.64g，产率92％。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.80mmol)溶于10mL乙酸乙酯中，向其中滴加三溴化磷(0.45g，1.83mmol)，缓慢升温至60℃搅拌8h，减压出去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得灰白色固体0.19g，产率67％。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.30g，0.69mmol)和三苯基膦(0.15g，0.57mmol)混合于5mL乙腈中，密封管中升温至120℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)分离得白色固体0.26g，产率69％。
线粒体探针Mito-Aze的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐(0.1g，0.14mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，向其中滴加氮杂环丁烷(0.1g，2mmol)，升温至140℃搅拌10h，反应结束后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)分离得橙色固体38mg，产率45％。
经检测，其产物结构如上式Mito-Aze所示，其在水中荧光发射波长为560nm，紫外吸收为470nm。
实施例4.
Mito-Aze对活细胞染色实验。取0.5μL母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育30分钟后分别进行荧光共聚焦成像及结构光照明显微成像实验。
Mito-Aze终浓度为1μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa细胞)10分钟后共聚焦荧光成像图如图7所示，HeLa细胞内线形的线粒体清晰可见。
Mito-Aze终浓度为1μM的细胞培养液孵育宫颈癌细胞(HeLa细胞)10分钟后结构光照明显微成像图如图8所示，HeLa细胞内线形的线粒体清晰可见，Mito-Aze能够用于活细胞内线粒体标记。
Claims (7)
1.一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料，其特征在于：其结构式如下所示，
2.如权利要求1所述一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：该合成的具体步骤如下：
(1)中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将4-溴-1,8-萘酐和6-氨基-1-己醇混合于乙醇中，加热至60-90℃，搅拌24-48h；反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐；
(2)中间体N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐溶于乙酸乙酯中，向其中滴加0.5-1.5g三溴化磷，缓慢升温至50-70℃搅拌6-8h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐；
(3)中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的合成
将N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐和三苯基膦混合于乙腈中，密封管中升温至120-140℃搅拌8-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐；
(4)化合物Mito-Aze的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚中，向其中滴加氮杂环丁烷，升温至120-140℃搅拌8-16h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到化合物Mito-Aze。
3.如权利要求2中所述的一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐与6-氨基-1-己醇的质量比为1:0.3-5，
4-溴-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:3-20g/mL。
4.如权利要求2中所述的一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:0.25-1.5，
N-(6-羟基己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为1:5-10g/mL。
5.如权利要求2中所述的一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为1:0.5-3，
N-(6-溴己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为1:5-20g/mL。
6.如权利要求2中所述一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料的合成方法，其特征在于：步骤(4)中，N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐与氮杂环丁烷的质量比为1-16:1，
N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:10-50g/mL。
7.如权利要求1所述的一种高亮度、高稳定性线粒体荧光染料在荧光成像、分子探针及荧光传感领域的应用。
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