CN105777637A - 一种水溶性线粒体靶向成像探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性线粒体靶向成像探针及其制备方法。该水溶性线粒体靶向成像探针的结构式可为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示化合物，也可为式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ所示化合物。本发明水溶性线粒体靶向成像探针具备良好的水溶性、耐光漂白性、热稳定性好的特点；具备较低的毒性和较高的灵敏度，以Hela、MCF-7和NIH-3T3细胞为模型通过激光共聚焦考察了该荧光探针在细胞内的分布情况，结果表明该探针主要分布在线粒体内，具有良好的靶向性。证明该探针对癌细胞和非癌细胞都具有较高的线粒体靶向成像的特点，将为从时间和空间上对细胞内超氧自由基进行定量研究提供有效手段，进而为揭示活性氧自由基的病理学与生理学奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种水溶性线粒体靶向成像探针及其制备方法，属于分子成像领域。
背景技术
线粒体从发现到如今已经被研究了150多年了，在长期的研究中人们发现线粒体具备广泛的功能。从最早我们知道的线粒体(mitochondrion)是细胞中制造能量的结构单元，是真核生物进行氧化代谢产生三磷酸腺苷ATP的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。除此之外，在长期的研究中科学家发现线粒体还具备储备和控制细胞中钙离子动态平衡，调节膜电位并控制细胞程序性死亡，以及参与细胞增殖与细胞代谢的调控等功能。
生物体内自由基是来自机体正常生理代谢过程和生存环境诱导产生的不稳定中间产物，它是细胞信号转导的重要信使分子，与生物体内各种生理作用及病理现象密切相关。大量研究表明，动物细胞内的自由基有99％来自线粒体的电子传递链上，线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。
线粒体是直接利用氧气制造能量的部位，人体内吸入的90％以上氧气被线粒体消耗掉。同时，氧气在被线粒体利用的过程中会产生大量的活性氧自由基ROS损伤生物体而产生毒性。活性氧在生物体中处于一个氧化-还原平衡的水平，ROS过多或者过少都会对细胞和生物体造成氧化损伤，这也是生物体衰老的主要原因，线粒体损伤到一定程度细胞就会衰老死亡以及导致一系列的疾病。线粒体疾病是由于线粒体DNA突变引起的功能不正常而导致的一些疾病。广义的线粒体疾病还包括由细胞核编码的线粒体蛋白突变而造成的功能不正常。不同严重程度的线粒体疾病主要影响大脑，心脏和肌肉。根据细胞在体内受到影响，其症状可包括：生长缓慢，失去肌肉的协调性，肌肉无力，发育迟缓，精神发育迟滞，学习障碍，视觉和/或听觉有问题的，心脏，肝脏或肾脏疾病，胃肠功能紊乱，呼吸系统疾病，糖尿病，严重的便秘，增加感染的风险，神经系统的问题，甲状腺功能异常，癫痫发作，痴呆等等。线粒体疾病往往是一大类遗传代谢病，主要包括糖尿病，线粒体肌病，耳聋，进行性眼外肌麻痹，铁粒幼细胞贫血，细胞外基质慢性游走性红斑，肌红蛋白尿电机神经元疾病，孤独症，卢伽雷氏病，肌营养不良症，慢性疲劳、肌阵挛(癫痫)，线粒体脑肌病(中风、帕金森氏症、阿尔默兹疾病等)，婴儿猝死综合征等疾病。因此有关线粒体的研究对疾病的预防、治疗和诊断显得尤为重要，并迅速成为近年来被广泛研究的热点。
在对线粒体的研究中，首先要找到线粒体即对线粒体定位和成像。线粒体是由线粒体外膜(OMM)、线粒体膜间隙、线粒体内膜(IMM)和线粒体基质四个部分组成。其中线粒体外膜包含一种称为“孔蛋白”的整合蛋白，其内部通道宽约2-3nm，分子量小于5000Da的分子可以完全通透。
线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(Mitochondrialmembranepotential，MMP)。正常的MMP是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件,MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。很多探针均是基于MMP的静电吸引将目标分子定向导入到细胞线粒体。
目前常用的对线粒体成像探针中，以MitoTrackerRed、JC-1和MitoTrackerGreenFMProbe等应用最为广泛。但这些探针都因分子量过大而显得水溶性较差，其中MitoTrackerRed和JC-1具有极弱的光漂白作用，长时间照射后荧光淬灭很快，不利于长时间实时追踪线粒体的变化。因此，设计和研究制备水溶性好，毒性低和强耐光漂白的线粒体成像探针成为目前研究的热点和重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种水溶性线粒体靶向成像探针及其制备方法，该线粒体靶向成像探针水溶性好、热稳定高且强耐光漂白。
本发明提供的化合物，其结构式为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ，
式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ中：M+可为R3P+或R3N+，R可为碳原子数可为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
X-可为Cl-、Br-或I-；
m可为2～4的整数，n可为2～8的整数；
Q可为R2N或RNH，R可为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基。
上述式Ⅰ所示化合物中，M+为具体可为R3P+，R为苯基，X-为Br-；m具体可为2，n具体可为4；Q具体可为R2N，R为甲基，即式Ⅰ所示化合物的结构式具体可如下：
本发明进一步提供了上述化合物的制备方法，该制备方法以4-溴-1,8-萘二甲酸酐为原料，利用带正电基团可靶向跨过线粒体膜导入线粒体的特点，将带正电荷的官能团结合到4-溴-1,8-萘二甲酸酐衍生物上，得到上述线粒体靶向成像探针。4-溴-1,8-萘二甲酸酐是一类研究较早、应用较为广泛的荧光化合物之一，具有很高的热稳定性、耐光漂白性以及易于衍生化成水溶性化合物等优良性质。
式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与H2N-(CH2CH2)m-D经缩合(酸酐与氨基)得到中间产物Ⅰ，
中间产物Ⅰ中，m为2～4的整数，D为氨基或羟基；
所述有机溶剂Ⅰ为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(2)惰性气氛下，在有机溶剂Ⅱ中，所述中间产物Ⅰ中的溴被给电子基团Q取代，得中间产物Ⅱ；
中间产物Ⅱ中，m为2～4的整数，D为氨基或羟基；Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
所述有机溶剂Ⅱ为乙腈、乙醇、甲醇和四氢呋喃中的任一种；
(3)在有机溶剂Ⅲ中，R3A+X--(CH2-CH2)n-B与所述中间产物Ⅱ经下述1)、2)或3)，即得式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示化合物；
1)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅱ中D为氨基时，经酰胺缩合(羧基与氨基)得到式Ⅰ所示化合物；
R3A+X--(CH2-CH2)n-COOH中A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数，
式Ⅰ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，X-为Cl-、Br-或I-；
中间产物Ⅱ或式Ⅰ中，Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，n为2～8的整数，m为2～4的整数。
2)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为溴，所述中间产物Ⅱ中D为氨基时，经取
R3A+X--(CH2-CH2)n-Br中A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数；
式Ⅱ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数；
中间产物Ⅱ或式Ⅱ中，Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，m为2～4的整数。
3)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅱ中D为羟基时，经酯化反应得到式Ⅲ所示化合物；
R3A+X--(CH2-CH2)n-COOH中A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数；
式Ⅲ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数；
中间产物Ⅱ或式Ⅲ中，Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，m可为2～4的整数。
R3A+X--(CH2-CH2)n-B中，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数，B为羧基或溴；
所述有机溶剂Ⅲ为乙腈、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳中的任一种。
上述制备方法，步骤(1)中，所述酰胺缩合的温度可为40～120℃，具体可为80℃，所述酰胺缩合的时间为8～40h，具体可为20h；
步骤(2)中，所述惰性气氛具体可为氮气；所述取代的温度为40～100℃，具体可为60℃，所述取代的时间为1～8h，具体可为4h；
步骤(3)中，1)中所述酰胺缩合、2)中所述取代反应或3)中所述酯化反应的温度为10～40℃，具体可为20℃；时间为10～48h，具体可为24h。
本发明提供的化合物，其结构式为式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ，
式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ中：M+可为R3P+或R3N+，R可为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
X-可为Cl-、Br-或I-；
m可为2～4的整数，n可为2～8的整数，p可为2～8的整数。
上述式Ⅳ所示化合物中，M+具体可为为R3P+，R为苯基；X-具体可为Br-，m具体可为2，n具体可为4，p具体可为3，即式Ⅳ所示化合物的结构式具体可如下：
本发明进一步提供了上述式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在缚酸剂存在的条件下，有机溶剂Ⅳ中，H2N-(CH2CH2)p-X与4-溴-1,8-萘二甲酸酐经取代反应得到中间产物Ⅲ，
H2N-(CH2CH2)p-X和中间产物Ⅳ中，p可为2～8的整数，X为Cl、Br或I；
所述缚酸剂可为NaOH、KOH、NaH、LiOH和K2CO3中的任一种；
所述有机溶剂Ⅳ可为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(2)在有机溶剂Ⅴ中，H2N-(CH2CH2)m-D与所述中间产物Ⅲ经缩合(酸酐与氨基)得到中间产物Ⅳ，
H2N-(CH2CH2)m-D和中间产物Ⅳ中，m可为2～4的整数，p可为2～8的整数，D可为氨基或羟基，X为Cl、Br或I；
所述有机溶剂Ⅴ可为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(3)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ先与R3A+X--(CH2-CH2)n-B经下述1)、2)或3)，然后均与R3A+X-发生取代反应，分别得式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ所示化合物；
1)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅳ中D为氨基，发生酰胺缩合(羧基与氨基)；
R3A+X--(CH2-CH2)n-COOH中R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，n为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-；
2)当所述R3 +AX--(CH2-CH2)n-B中B为溴，所述中间产物Ⅳ中D为氨基，发生取代反应(卤代烃与氨基)；
R3A+X--(CH2-CH2)n-Br中R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，n为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-；
3)当所述R3 +AX--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅳ中D为羟基，发生酯化反应(羧基与羟基)；
所述有机溶剂Ⅵ可为乙腈、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳中的任一种。
式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ所示化合物的反应式分别如下：
式Ⅳ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，n为2～8的整数；
中间产物Ⅳ和式Ⅳ中，m为2～4的整数，p为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-。
式Ⅴ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
中间产物Ⅳ和式Ⅴ中，m为2～4的整数，p为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-。
R3A+-(CH2-CH2)n-COOH中R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，n为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-；
式Ⅵ中，M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，n为2～8的整数；
中间产物Ⅳ和式Ⅵ中，m为2～4的整数，p为2～8的整数，X-为Cl-、Br-或I-。
上述式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ所示化合物的制备方法，步骤(1)中，所述取代反应的温度可为-10～0℃，具体可为-10℃，反应时间可为8～20h，具体可为20h；
步骤(2)中，所述酰胺缩合的温度可为40～120℃，具体可为80℃，时间可为8～40h，具体可为20h；
步骤(3)中，1)中所述酰胺缩合、2)中所述取代反应和3)中所述酯化反应的温度为10～40℃，具体可为25℃，时间可为10～48h，具体可为24h；
所述与R3A+X-的取代反应的温度为40～120℃，具体可为80℃，反应时间为8～40h，具体可为24h。
本发明进一步提供了上述式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示化合物和式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ所示化合物在制备线粒体靶向成像探针中的应用。
本发明进一步提供了上述式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ所示化合物和式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ所示化合物在线粒体靶向成像中的应用。
本发明具有如下优点：
(1)本发明水溶性线粒体靶向成像探针具备良好的水溶性、耐光漂白性、热稳定性好的特点。
(2)本发明水溶性线粒体靶向成像探针具备较低的毒性和较高的灵敏度，以Hela、MCF-7和NIH-3T3细胞为模型通过激光共聚焦考察了该荧光探针在细胞内的分布情况，结果表明该探针主要分布在线粒体内，具有良好的靶向性。证明该探针对癌细胞和非癌细胞都具有较高的线粒体靶向成像的特点，将为从时间和空间上对细胞内超氧自由基进行定量研究提供有效手段，进而为揭示活性氧自由基的病理学与生理学奠定基础。
附图说明
图1为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的核磁氢谱。
图2为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的核磁碳谱。
图3为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的高分辨质谱。
图4为细胞外耐光漂白实验中的各荧光探针的荧光强度随时间变化的对比照片。
图5为含有实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的细胞内耐光漂白实验中各荧光探针的荧光强度随时间变化的对比照片。
图6为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP在Hela细胞线粒体中的成像的照片，其中图a为本发明荧光探针NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为NMP-TPP与MitoTrackerRed叠加后的照片，图d明场照片。
图7为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的线虫成像实验中线虫成像的照片，其中，图a为本发明探针NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为本发明探针与线粒体成像探针MitoTrackerRed的叠加后的照片，图d明场照片，图e为本发明探针成像的局部放大照片，图f为线粒体探针MitoTrackerRed成像的局部放大照片，图g为NMP-TPP与MitoTrackerRed的叠加后的局部放大照片，图h为明场局部放大照片。
图8为实施例1中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针NMP-TPP的细胞毒性实验中，不同浓度探针对Hela细胞毒性的柱形图。
图9为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP的细胞毒性实验中，不同浓度探针对MCF-7细胞毒性的柱形图。
图10为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP的细胞实验中，不同浓度探针对NIH-3T3细胞毒性的柱形图。
图11为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP在MCF-7细胞中的成像照片，其中图a为本发明荧光探针TPP-NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为TPP-NMP-TPP与MitoTrackerRed叠加后的照片，图d明场照片。
图12为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP在NIH-3T3细胞中成像的照片，其中图a为本发明荧光探针TPP-NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为TPP-NMP-TPP与MitoTrackerRed叠加后的照片，图d明场照片。
图13为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP在胞内耐光漂白实验中各荧光探针的荧光强度随时间变化的对比照片。
图14为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP细胞摄取机制实验中在MCF-7细胞中成像的照片，其中图a为本发明荧光探针TPP-NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为NMP-TPP与MitoTrackerRed叠加后的照片，图d明场照片。
图15为实施例2中制备得到的水溶性线粒体靶向成像探针TPP-NMP-TPP线虫成像实验中线粒体成像的照片，其中图a为本发明荧光探针TPP-NMP-TPP成像的照片，图b为线粒体探针MitoTrackerRed成像的照片，图c为TPP-NMP-TPP与MitoTrackerRed叠加后的照片，图d明场照片。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、水溶性线粒体靶向成像探针(NMP-TPP)
(1)水溶性线粒体靶向成像探针(NMP-TPP)的制备
1)将H2N-CH2CH2-NH2与4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解甲醇中，在80℃搅拌反应20h，反应结束冷却到15℃，蒸干反应溶剂，过柱和重结晶分离纯化得产物。
结构确证结果如下：Mp:205-206℃.1HNMR(400MHz,CDCl3，TMS):δ8.58-8.56(d,1H,J＝6.4Hz)，8.50-8.45(m,2H,J＝8.4),7.70-7.66(m,1H,J＝8.4Hz),7.12-7.10(1H,d,J＝8.4Hz),3.18(6H,s).13CNMR(400MHz,DMSO),TMS):δ161.9,160.8,157.7,134.7,133.6,132.9,125.4,124.1,119.3,113.1,108.4,44.7.Calcd.M+ForC14H11NO3，m/z(HRMS):241.0739,found:m/z＝241.0743。
2)将CH3-NH-CH3与第一步反应得到的产物溶解在乙腈中，氮气保护下加热到60℃，反应4h，反应结束蒸干反应溶剂，过柱和重结晶分离纯化得产物。
结构确证结果如下：Mp:171-174℃.1HNMR(400MHz,CDCl3，TMS):δ8.51-8.48(m,2H,J＝7.2Hz),8.40-8.37(d,1H,J＝8.4),7.72-7.68(t,1H,J＝7.6),7.19-7.17(d,1H,J＝8.4Hz),6.15-6.05(d,1H),5.68(d,1H),4.12-4.09(t,2H,J＝6.8Hz),3.08(s,6H),2.87-2.84(t,2H,J＝6.8Hz).13CNMR(400MHz,CDCl3,TMS):δ164.2，164.3，157.0，132.7，131.2，130.3，125.2，124.8，122.9，114.8，113.3，44.7，43.0，40.6.Calcd.M+ForC16H17N3O2；m/z(HRMS):283.1321,found:m/z＝283.1324。
3)将4-羧丁基三苯基溴化膦与第二步反应得到的产物溶解在THF中，20℃，反应24h，反应结束蒸干反应溶剂，过柱分离纯化得产物。
结构确证结果如下：1HNMR(400MHz,D2O,TMS):δ8.17-8.15(d,1H,J＝7.2Hz),8.12-8.10(d,1H,J＝8.4Hz)8.00-7.98(d,1H,J＝8.4Hz),7.72-7.68(t,3H,J＝7.6Hz),7.49-7.45(m,6H),7.42-7.38(t,1H,J＝8.0Hz),7.32-7.27(m,6H),6.84-6.82(d,1H,J＝8.0Hz),4.07-4.06(m,2H),3.46-3.45(m,2H),2.73-2.66(m,2H),2.05-2.02(m,2H),1.39-1.36(m,2H),1.09-1.06(m,2H).13CNMR(400MHz,D2O),TMS):δ175.3,165.1,164.1,156.8,135.0,133.4,133.1,132.6,130.0,129.2,124.1,122.6,120.2,118.1,117.2,111.9,111.0,13.9,39.1,37.5,34.0,26.1,21.1,20.5.Calcd.M+ForC39H39N3O3PBr；m/z(HRMS):m/z＝628.2735，found:m/z＝628.29。
由图1(核磁氢谱)、图2(核磁碳谱)中和图3(高分辨质谱)，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
(2)水溶性线粒体靶向成像探针的细胞外光漂白性测试：
取上述制备的水溶性线粒体靶向成像探针溶解在磷酸盐缓冲溶液PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成5μM溶液，用U-3310型荧光分光光度计在490nm激发下持续照射3600s，发现荧光强度几乎不变，如图4所示，而现有技术中的荧光探针Mito-TrackerRed和JC-1的荧光强度在照射3000s后即迅速下降，证明本发明探针在细胞外是耐光漂白的。
(3)水溶性线粒体靶向成像探针的细胞内光漂白实验测试
1)按标准操作法培养好Hela细胞待用。
2)按每皿8万个的密度将Hela细胞种在confocal皿内，加2mL1640培养基贴壁培养12h。
3)取上述(1)中制备得到的线粒体成像探针(NMP-TPP)溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
4)将商业用的线粒体成像探针Mito-TrackerRed探针溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成100nM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
5)将添加有本实施例探针和Mito-TrackerRed探针的细胞在激光共聚焦下用488nm激发持续照射。
由图5可以看出，激发时间在80s内本发明探针的荧光强度几乎不变，而Mito-TrackerRed探针的荧光强度衰减较大，证明本发明的探针在细胞内是耐光漂白的。
(4)细胞共聚焦成像
1)按标准操作法培养好Hela细胞待用。
2)分别按每皿8万个的密度将上述Hela细胞种在confocal皿内，加2mL1640培养基贴壁培养12h。
3)取本实施例制备的探针溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
4)将线粒体成像探针MitoTrackerRed配成30nM培养液，加入到细胞中培养30min。
5)将添加有本实施例探针的细胞在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，如图6所示，本实施例的探针的绿色荧光与线粒体成像探针MitoTrackerRed的红色荧光能够很好的重合叠加，证明本发明探针能选择性地在线粒体成像。
(5)线虫成像测试
1)按标准条件培养好线虫待用，待线虫长到成年且生长状态良好，用M9溶液洗出部分线虫待用。
2)取本实施例制备得到的探针溶解在M9溶液中，配置成10μM溶液，加入到线虫中培养30min。
3)线粒体成像探针MitoTrackerRed配成90nM培养液，加入到线虫中培养30min。
4)将加药的线虫在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，如图7所示，本发明的探针绿色荧光与线粒体成像探针MitoTrackerRed的红色荧光能够很好的重合叠加，证明本发明的探针能选择性地在线粒体成像。
(8)细胞毒性测试
1)接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液(Hela细胞)，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。
2)培养细胞：同一般培养条件，培养24h。
3)加药：将本实施例制备的探针溶解在培养基中，加入96孔板，每孔体积200μL，探针的浓度分别为15.6nM、31.2nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、1000nM、5000nM和10000nM，培养24h。
4)呈色：培养24天后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS<pH＝7.4>配制)20μL，继续孵育4小时，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以探针的浓度为横坐标，490nm处荧光吸收值为纵坐标绘制曲线，如图8所示，证明本发明探针在10μM时几乎没有显示出细胞毒性。
实施例2、水溶性线粒体靶向成像探针(TPP-NMP-TPP)
(1)水溶性线粒体靶向成像探针(TPP-NMP-TPP)的制备
1)将H2N-CH2CH2CH2-Br与4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶解在THF中，加入NaOH,作为附酸剂，-10℃搅拌反应20h，反应结束用冰醋酸中和反应溶液，蒸干反应溶剂，过柱和重结晶分离纯化得产物。
结构确证结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO，TMS):δ8.75-8.70(d,1H,J＝7.8),8.56-8.52(d,1H,J＝8.4),8.51-8.48(m,2H,J＝7.2Hz),8.46-8.42(d,1H,J＝8.4),7.93-7.89(t,1H,J＝7.6),3.51-3.47(t,2H,J＝6.8Hz)，3.35-3.31(t,2H,J＝6.8Hz),2.02(d,2H).13CNMR(400MHz,DMSO,TMS):δ149.4,148.6,129.8,129.5,126.3,125.0,124.8,124.1,122.8,114.5,106.1,81.1,48.6,32.7Calcd.M+ForC15H12BrNO3，m/z(HRMS):m/z＝334.2735，found:m/z＝334.2963。
2)将H2N-CH2CH2-NH2与上述反应产物1溶解在乙腈中，在80℃搅拌反应20h，反应结束冷却到15℃，蒸干反应溶剂，过柱和重结晶分离纯化得产物。
结构确证结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO，TMS):δ8.51(s，1H),8.45-8.40(d,1H,J＝7.8),8.27-8.22(d,1H,J＝8.4),8.17-8.12(d,1H,J＝8.4),7.92-7.88(t,1H,J＝7.6),7.17-7.13(m,1H,J＝7.2Hz),3.51-3.46(t,2H,J＝6.8Hz),3.35-3.31(t,2H,J＝6.8Hz),3.32-3.27(t,2H,J＝7.0Hz),2.80-2.75(t,2H,J＝6.8Hz),2.02(d,2H,J＝7.2Hz),1.5(s,2H).13CNMR(400MHz,DMSO,TMS):δ160.1,159.3,154.5,137.8,137.2,130.6,128.2,125.9,124.2,121.7,116.3,111.4,54.6,43.8,37.8,36.2,32.7,Calcd.M+ForC17H18BrN3O2，m/z(HRMS):m/z＝375.2735，found:m/z＝375.2886。
3)将4-羧丁基三苯基溴化膦与上步反应得到的产物2溶解在THF中，25℃，反应24h，反应结束蒸干反应溶剂，过柱分离纯化得产物。
结构确证结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO，TMS):δ8.51(s，1H),8.42-8.38(d,1H,J＝7.8),8.27-8.22(d,1H,J＝8.4),8.10-8.05(d,1H,J＝8.4),8.01(s,1H),7.92-7.88(t,1H,J＝7.6),7.45-7.40(m,6H),7.38-7.33(m,6H),7.35-7.31(m,12H),7.32-7.27(m，3H),7.22-7.18(m，3H),3.51-3.47(t,2H,J＝6.8Hz),7.17-7.13(m,1H,J＝7.2Hz),3.51-3.46(t,2H,J＝6.8Hz),3.33-3.26(t,2H,J＝6.8Hz),3.22-3.17(t,2H,J＝7.0Hz),2.80-2.75(t,2H,J＝6.8Hz),2.13-1.53(t,2H,J＝7.0Hz),1.98(d,2H,J＝7.2Hz),1.51-1.46(m,2H,J＝7.2Hz),1.45-1.40(t,2H,J＝6.8Hz),1.39-1.34(m,2H,J＝6.8Hz).13CNMR(400MHz,DMSO,TMS):δ160.1,159.3,154.5,137.8,137.2,135.8，135.5,135.2,131.3，131.0，130.8,130.7,130.6,130.4,130.1,128.2,125.9,124.2,121.7,117.9,117.3，116.3,111.4,54.6,43.8,37.8,32.7,31.1,31.1,28.7,22.1,21.2Calcd.M+ForC40H40BrN3O3PBr2，m/z(HRMS):m/z＝721.2735，found:m/z＝721.2886。
将三苯基磷与上步反应产物3溶解在乙腈中，在80℃搅拌反应24h，反应结束冷却到15℃，蒸干反应溶剂，过柱和重结晶分离纯化得产物TPP-NMP-TPP。
结构确证结果如下：1HNMR(400MHz,DMSO，TMS):δ8.51(s，1H),8.42-8.38(d,1H,J＝7.8),8.27-8.22(d,1H,J＝8.4),8.10-8.05(d,1H,J＝8.4),8.01(s,1H),7.92-7.88(t,1H,J＝7.6),7.38(m,6H),7.35(m,6H),7.32(m，3H),3.51-3.47(t,2H,J＝6.8Hz),7.17-7.13(m,1H,J＝7.2Hz),3.51-3.46(t,2H,J＝6.8Hz),3.33-3.26(t,2H,J＝6.8Hz),3.22-3.17(t,2H,J＝7.0Hz),2.80-2.75(t,2H,J＝6.8Hz),2.13-1.53(t,2H,J＝7.0Hz),1.98(d,2H,J＝7.2Hz),1.51-1.46(m,2H,J＝7.2Hz),1.45-1.40(t,2H,J＝6.8Hz),1.39-1.34(m,2H,J＝6.8Hz).13CNMR(400MHz,DMSO,TMS):δ160.1,159.3,154.5,137.8,137.2,135.2,130.8,130.4,130.1,128.2,125.9,124.2,121.7,117.9,116.3,111.4,54.6,43.8,37.8,32.7,31.1,31.1,28.7,22.1,21.2Calcd.M+ForC58H55Br2N3O3P2Br2，m/z(HRMS):m/z＝1061.2746，found:m/z＝1061.2863。
经结构鉴定所合成的化合物结构如下：
(2)细胞毒性测试
1)接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液(分别为MCF-7和NIH-3T3)，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。
2)培养细胞：同一般培养条件，培养24h。
3)加药：将本实施例制备的探针溶解在培养基中，加入96孔板，每孔体积200μL，探针的浓度分别为15.6nM、31.2nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM和1000nM，培养24h。
4)呈色：培养24天后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS<pH＝7.4>配制)20μL，继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
5)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以探针的浓度为横坐标，490nm处荧光吸收值为纵坐标绘制曲线，如图9(MCF-7)和图10(NIH-3T3)所示，证明本发明探针在10μM时几乎没有显示出细胞毒性。
(3)细胞共聚焦成像
1)分别按标准操作法培养好MCF-7细胞和NIH-3T3细胞待用。
2)按每皿8万个的密度分别将上述细胞种在confocal皿内，加2mL1640培养基贴壁培养12h。
3)取本实施例探针溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
4)将线粒体成像探针MitoTrackerRed配成30nM培养液，加入到细胞中培养30min。
5)将添加有探针的细胞在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，发现本发明的探针的绿色荧光与线粒体成像探针MitoTrackerRed的红色荧光能够很好的重合叠加，如图11和图12所示，证明本发明探针能选择性地在线粒体成像。
(4)水溶性线粒体靶向成像探针的细胞内光漂白实验测试
1)按标准操作法培养好MCF-7细胞待用。
2)按每皿8万个的密度将上述三种细胞种在confocal皿内，加2mL1640培养基贴壁培养12h。
3)取本实施例制备的探针(TPP-NMP-TPP)溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
4)取商业用线粒体成像探针Mito-TrackerRed溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
5)将添加有本实施例探针和Mito-TrackerRed探针的细胞在激光共聚焦下用488nm激发持续照射。
由图13可以看出，激发时间在80s内本发明探针的荧光强度几乎不变，而Mito-TrackerRed探针的荧光强度衰减较大，证明本发明的探针在细胞内是耐光漂白的。
(5)细胞摄取机制实验
1)按标准操作法培养好MCF-7细胞待用。
2)按每皿8万个的密度将上述三种细胞种在confocal皿内，加2mL1640培养基贴壁培养12h。
3)将配制好的线粒体解偶联剂CCCP用培养基稀释到100nM，加入confocal皿内孵育培养2h。
4)取本实施例制备的探针(TPP-NMP-TPP)溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)缓冲溶液中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
5)取商业用的线粒体成像探针Mito-TrackerRed溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)中，配置成10μM溶液，稀释成1μM的培养基中，加入到细胞中培养30min。
6)将添加有本实施例探针和Mito-TrackerRed探针的细胞在激光共聚焦下照射。
由图14可以看出，两种探针都分散到整个细胞中，不再具备线粒体靶向性，说明制备探针TPP-NMP-TPP与Mito-TrackerRed一样都是基于线粒体膜电位选择性进入线粒体的。
(6)线虫成像探针实验
1)按标准条件培养好线虫待用，待线虫长到成年且生长状态良好，用线虫PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)缓冲溶液，洗出部分线虫待用。
2)取本实施例制备得到的探针溶解在PBS(浓度0.1M，pH＝7.4)缓冲溶液中，配置成10μM溶液，加入到线虫中培养30min。
3)线粒体成像探针MitoTrackerRed配成90nM培养液，加入到线虫中培养30min。
4)分别将添加有本实施例线粒体荧光探针TPP-NMP-TPP和MitoTrackerRed在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，如图15所示，本发明探针绿色荧光与线粒体成像探针MitoTrackerRed的红色荧光能够很好的重合叠加，证明本发明的探针能选择性地在线粒体成像。
Claims (8)
1.一种化合物，其结构式为式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ，
式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ中：M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
X-为Cl-、Br-或I-；
m为2～4的整数，n为2～8的整数；
Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基。
2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在有机溶剂Ⅰ中，4-溴-1,8-萘二甲酸酐与H2N-(CH2CH2)m-D经酰胺缩合得到中间产物Ⅰ，
H2N-(CH2CH2)m-D和中间产物Ⅰ中，m为2～4的整数，D为氨基或羟基；
所述有机溶剂Ⅰ为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(2)惰性气氛下，在有机溶剂Ⅱ中，所述中间产物Ⅰ中的溴被给电子基团Q取代，得中间产物Ⅱ；
中间产物Ⅱ中，m为2～4的整数，D为氨基或羟基；Q为R2N或RNH，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
所述有机溶剂Ⅱ为乙腈、乙醇、甲醇和四氢呋喃中的任一种；
(3)在有机溶剂Ⅲ中，R3A+X--(CH2-CH2)n-B与所述中间产物Ⅱ经1)、2)或3)即得式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ所示化合物；
1)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅱ中D为氨基时，经酰胺缩合得到式Ⅰ所示化合物；
2)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为溴，所述中间产物Ⅱ中D为氨基时，经取代反应得到式Ⅱ所示化合物；
3)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅱ中D为羟基时，经酯化反应得到式Ⅲ所示化合物；
所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数，B为羧基或溴；
所述有机溶剂Ⅲ为乙腈、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳中的任一种。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酰胺缩合的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(2)中，所述取代的温度为40～100℃，时间为1～8h；
步骤(3)中，1)中所述酰胺缩合、2)中所述取代反应或3)中所述酯化反应的温度为10～40℃，时间为10～48h。
4.一种化合物，其结构式为式Ⅳ、式Ⅴ或式Ⅵ，
式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ中：M+为R3P+或R3N+，R为碳原子数为2～8的链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基；
X-为Cl-、Br-或I-；
m为2～4的整数，n为2～8的整数，p为2～8的整数。
5.权利要求4所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在缚酸剂存在的条件下，有机溶剂Ⅳ中，H2N-(CH2CH2)p-Br与4-溴-1,8-萘二甲酸酐经酰胺缩合得到中间产物Ⅲ，
H2N-(CH2CH2)p-Br和中间产物Ⅲ中，p为2～8的整数；
所述缚酸剂为NaOH、KOH、NaH、LiOH和K2CO3中的任一种；
所述有机溶剂Ⅳ为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(2)在有机溶剂Ⅴ中，H2N-(CH2CH2)m-D与所述中间产物Ⅲ经取代反应得到中间产物Ⅳ，
H2N-(CH2CH2)m-D和中间产物Ⅳ中，m为2～4的整数，D为氨基或羟基；
所述有机溶剂Ⅴ为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈、乙醇和甲醇中的任一种；
(3)在有机溶剂Ⅵ中，所述中间产物Ⅳ先与R3A+X--(CH2-CH2)n-B经下述1)、2)或3)，然后均与R3A+X-发生取代反应后，分别得式Ⅳ、式Ⅴ和式Ⅵ所示化合物；
1)当所述R3A+X--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅳ中D为氨基，发生酰胺缩合；
2)当所述R3 +AX--(CH2-CH2)n-B中B为溴，所述中间产物Ⅳ中D为氨基，发生取代反应；
3)当所述R3 +AX--(CH2-CH2)n-B中B为羧基，所述中间产物Ⅳ中D为羟基，发生酯化反应；
R3A+X--(CH2-CH2)n-B中，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-，n为2～8的整数，B为羧基或溴；
R3A+X-中，R为碳原子数为2～8链状烷基、苯基或碳原子数为2～8的烷基取代的苯基，A为氮或磷，X-为Cl-、Br-或I-；
所述有机溶剂Ⅵ为乙腈、乙醇、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳中的任一种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述酰胺缩合的温度为-10～0℃，时间为8～20h；
步骤(2)中，所述取代反应的温度为40～120℃，时间为8～40h；
步骤(3)中，1)中所述酰胺缩合、2)中所述取代反应或3)中所述酯化反应的温度为10～40℃，时间为10～48h；
所述与R3A+X-的取代反应的温度为40～120℃，时间为8～40h。
7.权利要求1所述化合物和权利要求4所述化合物在制备线粒体靶向成像探针中的应用。
8.权利要求1所述化合物和权利要求4所述化合物在线粒体靶向成像中的应用。
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2014
- 2014-12-22 CN CN201410806133.8A patent/CN105777637B/zh active Active
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