KR101440534B1

KR101440534B1 - 미토콘드리아 티오레독신 활성을 가시화하는 프로브 복합체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101440534B1
Application number: KR1020120094516A
Authority: KR
Inventors: 김종승; 이민희; 강철훈
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20140028388A

Abstract

본 발명은 특정 효소의 활성 가시화를 목적하는 프로브 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자 및 미토콘드리아 표적화분자를 포함하는 프로브 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미토콘드리아 티오레독신 활성을 효과적으로 관찰할 수 있게 되어 암과 관련된 세포기능의 연구에 있어 매우 유의한 정보를 얻을 수 있으며, 이는 곧 신약 개발과도 연관된다.

Description

미토콘드리아 티오레독신 활성을 가시화하는 프로브 복합체 및 그 제조방법 {Probe complex visualizing mitochondrial thioredoxin activity and method for preparing the same}

본 발명은 특정 효소의 활성 가시화를 목적하는 프로브 복합체에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 미토콘드리아 티오레독신 활성을 가시화하는 프로브 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

티오레독신-티오레독신 환원효소 시스템 (Trx-TrxR 시스템)은 세포의 성장, 세포사멸의 억제, DNA 합성 및 혈관신생의 조절에 있어 중요한 역할을 한다. ((a) Holmgren, A. Thioredoxin. Annu . Rev . Biochem . 54, 237-271 (1985). (b) Papp, L. V., Lu, J., Holmgren, A. & Khanna, K. K. From selenium to selenoproteins: synthesis, identity, and their role in human health. Antioxid . Redox Signal. 9, 775-805 (2007). (c) Gruber, C. W., Cemazar, M., Heras, B., Martin, J. L. & Craik, D. J. Protein disulphide isomerase: the structure of oxidative folding. Trends Biochem . Sci . 31, 455-464 (2006). (d) Holmgren, A. et al. Thiol redox control via thioredoxin and glutaredoxin systems. Biochem . Soc . Trans. 33, 1375-1377 (2005). (e) Haendeler, J. et al. Redox regulatory and anti-apoptotic functions of thioredoxin depend on S-nitrosylation at cysteine 69. Nat . Cell Biol . 4, 743-749 (2002).)

실제로, 상기 시스템의 활성 변화는 심부전이나 심근증과 같은 심혈관질환, 복부 대동맥류, 천식과 같은 호흡기질환, 인체 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 류머티즘성 관절염, 쇼그렌 증후군, 제II형 당뇨병, 패혈증 및 기타 여러 악성질환을 포함하는 인간의 여러 질병과 관련이 있다. ((a) Kishimoto, C. et al. Serum thioredoxin (TRX) levels in patients with heart failure. Jpn . Circ . J. 65, 491-494 (2001). (b) Martinez-Pinna, R. et al. Increased levels of thioredoxin in patients with abdominal aortic aneurysms (AAAs). A potential link of oxidative stress with AAA evolution. Atherosclerosis . 212, 333-338 (2010). (c) Yamada, Y. et al. Elevated serum levels of thioredoxin in patients with acute exacerbation of asthma. Immunol . Lett . 86, 199-205 (2003). (d) Nakamura, H. et al. Elevation of plasma thioredoxin levels in HIV-infected individuals. Int . Immunol . 8, 603-611 (1996). (e) Yoshida, S. et al. Involvement of thioredoxin in rheumatoid arthritis: its costimulatory roles in the TNF-alpha-induced production of IL-6 and IL-8 from cultured synovial fibroblasts. J. Immunol . 163, 351-358 (1999). (f) Kumagai, S. ADF/thioredoxin as an indicator of oxidative stress. Rinsho Byori . 46, 574-580 (1998). (g) Kakisaka, Y. et al. Elevation of serum thioredoxin levels in patients with type 2 diabetes. Horm . Metab . Res . 34, 160-164 (2002). (h) Leaver, S. K. et al. Increased plasma thioredoxin levels in patients with sepsis: positive association with macrophage migration inhibitory factor. Intensive Care . Med . 36, 336-341 (2010). (i) Lincoln, D. T., Ali Emadi, E. M., Tonissen, K. F. & Clarke, F. M. The thioredoxin-thioredoxin reductase system: over-expression in human cancer. Anticancer Res . 23, 2425-2433 (2003). (j) Valdman, A. et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal . Quant . Cytol. Histol . 31, 367-374 (2009). (k) Lincoln, D. T. et al. Thioredoxin and thioredoxin reductase expression in thyroid cancer depends on tumour aggressiveness. Anticancer Res . 30, 767-775 (2010).)

티오레독신 (이하 Trx)은 미토콘드리아에도 존재하는데, 이 경우 Trx는 호흡연쇄에 의해 생성되는 활성 산소종 (ROS)의 소거, 미토콘드리아의 투과성 조절, 그리고 세포사멸 신호경로에 있어 핵심적인 역할을 한다. 또한, 미토콘드리아 내 Trx의 비정상적인 발현수준이 여러 기능장애 및 암질환과 직접적으로 연관된다는 것이 최근 보고된 바 있다. ((a) Patenaude, A., Ven Murthy, M. R. & Mirault, M.-E. Mitochondrial thioredoxin system: effects of TrxR2 overexpression on redox balance, cell growth, and apoptosis. J. Biol. Chem . 279, 27302-27314 (2004). (b) He, M. et al. Identification of thioredoxin-2 as a regulator of the mitochondrial permeability transition. Toxicol. Sci . 105, 44-50 (2008). (c) Wang, D. et al. Control of mitochondrial outer membrane permeabilization and Bcl-xL levels by Thioredoxin 2 in DT40 cells. J. Biol . Chem . 281, 7384-7391 (2006). (d) Damdimopoulos, A. E., Miranda-Vizuete, A., Pelto-Huikko, M., Gustafsson, J. A. & Spyrou, G. Human mitochondrial thioredoxin. Involvement in mitochondrial membrane potential and cell death. J. Biol . Chem . 277, 33249-33249 (2002). (e) Saitoh, M. et al. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1. EMBO J. 17, 2596-2606 (1998). (f) Tanaka, T. et al. Thioredoxin-2 (TRX-2) is an essential gene regulating mitochondria-dependent apoptosis. EMBO J. 21, 1695-1703 (2002). (g) Saxena, G., Chen, J. & Shalev, A. Intracellular shuttling and mitochondrial function of thioredoxin-interacting protein. J. Biol . Chem . 285, 3997-4005 (2009). (h) Nonn, L., Williams, R. R., Erickson, R. P. & Powis, G. The absence of mitochondrial thioredoxin 2 causes massive apoptosis, exencephaly, and early embryonic lethality in homozygous mice. Mol . Cell . Biol . 23, 916-922 (2003). (i) Zhou, R., Tardivel, A., Thorens, B., Choi, I. & Tschopp, J. Thioredoxin-interacting protein links oxidative stress to inflammasome activation. Nat . Immunol . 11, 136-140 (2010). (j) Karlenius, T. C. & Tonissen, K. F. Thioredoxin and cancer: a role for thioredoxin in all states of tumor oxygenation. Cancers 2, 209-232 (2010). (k) Behl, C., Davis, J. B., Lesley, R. & Schubert, D. Hydrogen peroxide mediates amyloid β protein toxicity. Cell 77, 817-827 (1994). (l) Huber, K. et al. 2-[(1-Methylpropyl)dithio]-1H-imidazole inhibits tubulin polymerization through cysteine oxidation. Mol . Cancer Ther . 7, 143-151 (2008).)

티오레독신 (Trx)의 활성부위는 2 개의 시스테인 잔기를 가지는데, 이들은 산화에 의해 손상된 단백질과의 산화반응을 통하여 분자 내 이황화결합 (Trx-S₂)을 형성할 수 있다. 산화 상태의 Trx는 NADPH와 TrxR에 의해 다시 Trx-(SH)₂로 환원될 수도 있다.

이러한 Trx의 특성을 반영하여 응용한 종래기술로서, Trx 활성을 분광학적으로 측정하기 위한 인슐린-Trx 정량분석법이 알려져 있다. Trx에 의해 인슐린의 이황화결합이 환원되고, 환원된 인슐린의 양에 비례하여 용액이 혼탁해져 650 nm의 파장에서 이를 관찰할 수 있다. (Holmgren, A. Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol . Chem . 254, 9627-9632 (1979).) 그러나 미토콘드리아 내에서 Trx의 활성을 관찰하는 방법은 아직까지 보고된 바 없고, 전술된 미토콘드리아 Trx의 중요성에 따라 이에 대한 개발이 요구되고 있다. 미토콘드리아 Trx 활성을 효과적으로 관찰할 수 있게 되면 암과 관련된 세포기능의 연구에 있어 매우 유의한 정보를 얻을 수 있을 것이며, 이는 곧 신약 개발과도 연관될 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 요구를 충족시키기 위해서, 미토콘드리아 내부로 효과적으로 유도될 뿐만 아니라, 미토콘드리아 티오레독신과 반응하여 형광 발광함으로써 티오레독신 활성을 가시화하는 프로브 복합체 및 그 제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,

이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자 및 미토콘드리아 표적화분자를 포함하는 프로브 복합체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 미토콘드리아 표적화분자는 트리페닐포스포늄 화합물이고, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 나프탈이미드 유도체는 나프탈렌, 파이렌 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 프로브 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 복합체일 수 있다.

<화학식 1>

또한 본 발명은 상기 두 번째 과제를 해결하기 위해서,

형광표지자에 미토콘드리아 표적화분자를 반응시킴으로써 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및

상기 중간체 화합물에 이황화결합 잔기를 결합시키는 단계

를 포함하는 프로브 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체이며, 상기 미토콘드리아 표적화분자는 트리페닐포스포늄 화합물일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 중간체 화합물은 하기 화학식 2의 화합물에 트리페닐포스포늄 화합물을 반응시킴으로써 제조되는 하기 화학식 3의 화합물일 수 있다.

<화학식 2>

<화학식 3>

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 프로브 복합체는 하기 화학식 3의 화합물과 디티오디에탄올을 반응시킴으로써 제조되는 하기 화학식 1의 화합물일 수 있다.

<화학식 3>

<화학식 1>

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 3의 화합물은 상기 디티오디에탄올과 반응시키기 이전에, 포스진과 반응시킬 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 미토콘드리아 티오레독신 활성을 효과적으로 관찰할 수 있게 되어 암과 관련된 세포기능의 연구에 있어 매우 유의한 정보를 얻을 수 있으며, 이는 곧 신약 개발과도 연관된다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체가, 티오레독신과 반응함에 따라 광흡수 스펙트럼이 변화하는 양상을 관찰하여 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체가, 티오레독신과 반응함으로써 광흡수 스펙트럼 변화를 보이는 현상의 메커니즘을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체가 티오레독신과 반응함을 확인하기 위해, 금속이온 및 과산화수소의 유무를 변인으로 설정하여 이에 따른 광스펙트럼 차이를 조사하여 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체의 티오레독신 선택성을 확인하기 위하여, 티오레독신 및 또 다른 티올과의 초기반응속도를 측정하고 이를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체의 메커니즘을 규명하기 위하여, 티오레독신과 반응한 후의 용액을, MALDI-TOF 질량분석법을 통해 관찰하여 도시한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체의 메커니즘을 규명하기 위하여, 반응 전의 티오레독신 용액을 MALDI-TOF 질량분석법을 통해 관찰하여 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체의 반응에 있어서, 형광 발광 변화와 관련된 티오레독신의 역할을 조사하기 위하여, 선택적인 티오레독신 억제제인 PX-12를 추가로 첨가하고 용량을 조절하며, 이에 따른 세포의 양상을 관찰하여 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체의 반응에 있어서, 반응이 일어나는 위치를 규명하기 위해, 통상적인 미토콘드리아 트래커인 Mitotracker Red^TM 을 사용한 예와 비교하여 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 프로브 복합체가 미토콘드리아로 전달되는 것을 증명하기 위하여, 비교예로 트리페닐포스포늄 부위가 없는 화합물의 반응을 관찰하여 나타낸 사진이다.

이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 프로브 복합체는 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자, 미토콘드리아 표적화분자를 포함한다.

본 발명에 따른 프로브 복합체는 세포에 투입되면, 미토콘드리아까지 도달한 뒤 티오레독신에 의해 형광표지자의 이황화결합이 절단됨으로써 온-오프 (on-off)되는 형광 변화 특성을 갖는다. 본 발명에 따른 프로브 복합체는 미토콘드리아 표적화분자를 포함함으로써 세포 내 미토콘드리아에 효과적으로 도달될 뿐만 아니라, 티오레독신에 특이적으로 반응하여 형광 특성을 나타내는 형광표지자를 포함함으로써 미토콘드리아 내의 티오레독신 활성을 직접 모니터링할 수도 있게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 미토콘드리아 표적화분자는, 미토콘드리아로 타겟팅되어 복합체를 전달할 수 있는 트리페닐포스포늄 화합물일 수 있다.

또한, 상기 형광표지자는 이황화결합 잔기를 포함함으로써 상기 이황화결합이 절단될 때 형광 특성의 변화가 나타나는 형광표지자가 사용될 수 있으며, 예를 들면 이황화결합이 절단될 때 적색편이 형광 특성을 나타내는 나프탈이미드 유도체가 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 나프탈이미드 유도체는 나프탈렌, 파이렌 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.

하기 화학식 1에는 본 발명에 따른 프로브 복합체의 구체적인 예로서, 미토콘드리아 표적화분자로서 트리페닐포스포늄 화합물을, 또한 형광표지자로서 나프탈이미드 유도체를 포함하는 복합체가 표시되어 있다 :

<화학식 1>

본 발명은 또한, 형광표지자와 미토콘드리아 표적화분자를 반응시킴으로써 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 중간체 화합물에 이황화결합 잔기를 결합시키는 단계를 포함하는 프로브 복합체의 제조방법을 제공한다.

하기 반응식 1에는 예를 들어, 형광표지자로서 나프탈이미드 유도체를, 미토콘드리아 표적화분자로서 트리페닐포스포늄 화합물을, 이황화결합 잔기를 도입하기 위한 반응물로써 디티오디에탄올을 사용하여 본 발명에 따른 약물전달 복합체를 제조하는 반응을 개략적으로 나타내었다.

<반응식 1>

상기 반응식 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 먼저 형광표지자 (상기 반응식 1에서는 하기 화학식 2의 화합물)에 트리페닐포스포늄 화합물을 반응시킴으로써 중간체 화합물 (상기 반응식 1에서는 하기 화학식 3의 화합물)을 제조하게 된다 :

<화학식 2>

<화학식 3>

또한, 상기 반응식 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조된 중간체 화합물, 즉 상기 화학식 3의 화합물을 디티오디에탄올과 반응시킴으로써 본 발명에 따른 프로브 복합체를 제조할 수 있게 된다.

이때, 상기 화학식 3의 화합물은 디티오디에탄올과의 화학결합을 위해서, 포스진과 반응시킴으로써 -NH₂기를 이소시아네이트기로 치환해줄 수 있으며, 이어서 치환된 이소시아네이트기에 디티오디에탄올이 결합된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예

종래 문헌에서 보고된 바에 따라, 먼저 화학식 4로 표기되는 화합물을 합성한 뒤 (Patrick, L. G. F. & Whiting, A. Synthesis of some polymerisable fluorescent dyes. Dyes Pigments 55, 123-132 (2002).), 이를 DMF 용매와 팔라듐 촉매 하에 수소와 반응시켜 하기 화학식 2로 표기되는 나프탈이미드 유도체를 합성하였다 (Yuan, D., Brown, R. G., Hepworth, J. D., Alexiou, M. S. & Tyman, J. H. P. The synthesis and fluorescence of novel N-substituted-1,8-naphthylimides. J. Heterocyclic Chem . 45, 397-404 (2008).).

<화학식 4>

<화학식 2>

또한 미토콘드리아 표적화분자로서, 하기 화학식 5로 표기되는 아미노에틸트리페닐포스포늄을 종래 문헌에 보고된 바에 따라 합성하였다 (Maryanoff, B. E., Reitz, A. B. & Duhl-Emswiler, B. A. Stereochemistry of the Wittig reaction. Effect of nucleophilic groups in the phosphonium ylide. J. Am . Chem . Soc . 107, 217-226 (1985).).

<화학식 5>

이어서 상기 미토콘드리아 표적화분자와 상기 나프탈이미드 유도체의 결합 중간체로서, 하기 화학식 3으로 표기되는 화합물을 아래에 서술된 방법에 의해서 합성하였다.

<화학식 3>

화학식 3 화합물의 합성

무수 DMF 내의 화학식 2 화합물 (1.1 g, 3.8 mmol), EDCI (0.74 g, 3.8 mmol) 및 DMAP (0.47 g, 3.8 mmol)의 혼합물을 질소 하에서 30 분 동안 실온에서 교반하였다. 이어, 혼합물에 화학식 5 아미노에틸트리페닐포스포늄 (1.49 g, 3.8 mmol)을 가하고 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고, 얻어진 조생성물을 CH₂Cl₂/MeOH (v/v, 8:2)를 용리액으로 사용하여 실리카겔 상에서 정제하여 주황색 고체의 화학식 3 화합물을 얻었다 (1.0 g, 68%). ESI-MS m/z (M+) 계산값 572.2, 측정값 572.3 (M+). ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) : δ 8.36 (d, 1H, J = 7.3 Hz); 8.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 8.10 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 7.85-7.68 (m, 15H); 7.46 (t, 1H, J = 8.0 Hz); 6.74 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 4.36 (t, 2H, J = 7.0 Hz); 3.72-3.55 (m, 4H); 2.59 (t, 2H, J = 7.0 Hz). ¹³C NMR (CD₃OD, 100 MHz): 173.1, 164.9, 164.2, 153.3, 136.4, 135.4, 134.9, 134.8, 132.4, 131.6, 131.5, 130.3, 125.1, 123.1, 121.0, 119.9, 119.0, 109.6, 109.2, 37.8, 35.7, 34.4, 23.2, 22.7 ppm.

또한, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 하기 화학식 1의 화합물을 아래와 같은 반응을 통하여 합성하였다.

<화학식 1>

화학식 1 화합물의 합성

20 mL CH₂Cl₂ 내의 화학식 3 화합물 (0.75 g, 1.3 mmol)과 포스진 (2.85 mL, 6.5 mmol)의 혼합물에 DIPEA (1.4 mL, 9.1 mmol)를 적가하였다. 얻어진 용액을 질소기체 하에서 3 시간 동안 교반하였다. 이어, 반응혼합물을 질소기체로 플러싱하고, 미반응 포스진 기체를 제거한 다음 NaOH를 사용하여 중화한 후, CH₂Cl₂/THF (v/v = 1:1) 내의 디티오디에탄올 (0.88 g, 6.5 mmol) 용액을 혼합물에 가하고 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 얻어진 조생성물을 CH₂Cl₂/MeOH (v/v, 9:1)를 용리액으로 하여 실리카겔 상에서 정제하여 노란색 고체인 화학식 1 화합물을 얻었다 (0.6 g, 63%). ESI-MS m/z (M+) 계산값 752.2, 측정값 753.5 (M+H+). ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 9.46 (s,1H); 9.23 (br t, 1H); 8.47 (d, 1H, J = 7.3 Hz); 8.10 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 7.96 (d, 1H, J = 8.0 Hz); 7.83-7.66 (m, 15H); 7.25 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 4.65 (t, 1H, J = 6.0 Hz); 4.47 (t, 2H, J = 6.1 Hz); 4.32 (t, 2H, J = 6.5 Hz); 4.32 (t, 2H, J = 6.5 Hz); 3.90-3.85 (m, 2H); 3.79-3.63 (m, 4H); 3.07 (t, 2H, J = 6.2 Hz); 2.96 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 2.68 (t, 2H, J = 7.1 Hz). ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): 172.6, 163.9, 163.5, 154.0, 140.4, 135.3, 133.3, 131.7, 130.4, 128.6, 128.3, 125.8, 123.2, 121.9, 118.3, 117.3, 116.8, 63.4, 60.4, 41.5, 37.8, 36.9, 34.2, 33.2, 22.5, 22.1 ppm.

실험 장비와 시약

모든 형광 스펙트럼과 UV/Vis 흡수 스펙트럼은 각각 RF-5301PC와 S-3100 분광광도계를 사용하여 기록하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 Varian 장비 (400 MHz 및 300 MHz)를 사용하여 기록하였다. 컬럼 크로마토그래피에는 실리카겔 60 (Merck, 0.063~0.2 mm)을 사용하였다. 분석용 박층 크로마토그래피는 Merck 60 F254 실리카겔 (0.25 mm 두께로 코팅된 얇은 시트)을 사용하여 수행하였다. 티오레독신 (Escherichia coli 유래), 아미노산, 금속이온, 티올 및 합성용 화학약품을 포함한 모든 시약은 Aldrich에서 구입하였으며 별도의 정제 없이 그대로 사용하였다. 사용한 용매는 모두 HPLC 시약등급이었으며, 분석실험에는 3차 탈이온수를 사용하였다.

UV / Vis 및 형광 분광분석

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 화학식 1의 화합물과, 티오레독신 (이하 Trx), GSH, Cys, Hcy, Val, Tyr, Thr, Tau, Ser, Pro, Phe, Met, Lys, Leu, Ile, His, Gly, Gluc, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg, Ala, Na(I), K(I), Zn(II), Mg(II), Fe(III), Fe(II), Cu(II) 및 Ca(II)를 포함하는 생물학적 분석물의 저장용액은 3차 증류수를 사용하여 제조하였다. 여기파장은 428 nm이었으며, 여기용 슬릿과 발산용 슬릿의 폭은 모두 3 nm이었다. 모든 분광학적 측정은 생리적 조건 (37 °C, PBS 완충액, pH 7.4)에서 수행하였다.

반응속도 데이터

반응속도는 Shimadzu RF-5301PC 분광계를 사용하여, 반응물을 단일혼합 모드에서 혼합하여 측정하였다. 티올 (GSH, Trx, Cys, Hcy 및 DTT)에 대한 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 화학식 1의 화합물 (1.0 μM)의 응답 시간 의존성은 540 nm에서 0.16 초 간격으로 측정하였다. 환원 상태의 Trx는 50 μM Trx를 250 μM DTT와 37 °C에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 제조하였다. 여기파장은 428 nm이었으며, 여기용 슬릿과 발산용 슬릿의 폭은 모두 3 nm이었다. 모든 반응속도 측정은 생리적 조건 (37 °C, PBS 완충액, pH 7.4)에서 수행하였다.

세포 배양

인체 간암세포주 (HepG2)와 근육모세포주 (C6)를 10 % 우태아혈청, 1 % 페니실린 및 10,000 Unit/mL의 스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM)을 사용하여, 5 % CO₂를 포함하는 가습공기 조건에서 37 °C에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에서, 1 × 105 cells per well의 세포농도로 배양되었다. 1 mL의 매질 내에 혼합된 화학식 1의 화합물 또는 Mitotracker Red^TM (최종농도 1 μM)를 상기 플레이트에 인큐베이션하고, 관찰은 공초점 현미경 (LSM 510 META 모델, Carl Zeiss)을 통해 수행하였다.

면역침전

세포를 균질화 완충액 (0.32 M 수크로스, 4.0 mM HEPES, 1.0 mM EDTA, 100 mM DTT, pH 7.4) 내에서 균질화하고, 얻어진 균질액을 4 °C에서 10 분 동안 10,000 × g로 원심분리하였다. 펠릿을 제거한 다음, 시토졸을 수거하였다. 수거한 조 시토졸을 4 °C에서 항-Trx 항체 (Abcam, UK)로 밤새 처리하고, 항-항체 Protein G PLUS-Agarose (Santa Cruz, USA)를 사용하여 밤새 인큐베이션하였다. 아가로스층을 원심분리 (1,000 × g, 5 분) 하여 펠릿화하고, Trx가 제거된 상층액을 수거하여 바로 Trx 활성분석에 사용하였다.

웨스턴블롯

단백질의 양이 웰 당 30 μg이 되도록 샘플을 12 % 폴리아크릴아미드 젤에 로드하였다. 전기영동을 수행한 후, 분리된 단백질을 이동완충액 (39 mM glycine, 48 mM Tris 염기, pH 8.3, 0.37 % (w/v) SDS, 20 % (v/v) 메탄올) 내에서 니트로셀룰로스막 (Bio-Rad, Hercules, CA)으로 이동시켰다. 막을 TBS-T 완충액 (20 mM Trix 염기, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween-20) 내의 5 % 탈지유로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 이어, 막을 항-Trx 항체 (Abcam, UK)로 4 °C에서 밤새 인큐베이션하고 HRP와 컨주게이션된 항-항체 (Santa Cruz, USA)로 1 시간 동안 더 인큐베이션하였다. 항-β-액틴 (Sigma-Aldrich, USA)을 내부표준으로 사용하였다. 얻어진 블롯을 TBS-T 완충액으로 3회 세척하고, 면역활성을 띠는 단백질 밴드를 ECL 기질용액 (iNTRON Biotechnology, Korea)을 사용하여 가시화하였다.

결과

화학식 1의 화합물은 티오레독신 (이하 Trx)에 의해 절단되는 이황화결합 잔기, 이에 연결되어 이황화결합이 절단될 때 강한, 적색 편이된 형광을 발하는 나프탈이미드 부분, 그리고 미토콘드리아 표적화분자인 트리페닐포스포늄 화합물로 구성된다.

Trx 와의 반응에 따른 화학식 1 화합물의 광물리학적 변화

상기 적색 편이를 관찰하기 위해서, Trx와의 반응에 따른 화학식 1 화합물의 스펙트럼 변화를 관찰하여 도 1에 나타내었다. Trx와 반응하기 전의 화학식 1 화합물은 376 nm와 472 nm에서 각각 최대 흡수피크 및 최대 형광피크를 보인다. 화학식 1 화합물을 생리적 조건 (37°C, pH 7.4인 PBS 완충액) 하에서 Trx를 포함하는 용액에 가하자, 428 nm (황색)를 중심으로 새로운 흡수밴드가 나타나고, 동시에 540 nm에서 녹색 발광밴드가 함께 나타났다 (도 1 a 및 b).

또한, Trx 농도에 따른 화학식 1 화합물-Trx 혼합 용액의 형광 스펙트럼을 도 1 c에 도시하였다. Trx의 농도가 증가함에 따라 (0 μM 내지 5.0 μM), 472 nm에서의 형광 강도가 감소하고 540 nm에서 새로운 발광밴드가 나타났다. 이러한 스펙트럼의 변화는 Trx에 의한 화학식 1 화합물 이황화결합의 절단으로부터 시작되며, 그 결과 방출된 티올레이트가 분자 내의 아마이드 카보닐 탄소를 공격하여 5각 카바메이트 고리와 반응함으로써 화학식 3의 형광성 물질을 생성한다는 가능성을 시사한다 (도 2). 또한, 540 nm에서의 형광 강도와 Trx의 농도는 선형적인 상관관계를 가지는 것이 확인되었다 (도 1 d). 따라서, 화학식 1 화합물을 이용하면 살아있는 세포 내의 생리적 농도보다 낮은 나노몰 범위 (최소 50 nM)에서 Trx를 검출할 수 있다.

화학식 1 화합물의 Trx 와의 반응에 대한 선택성

세포 내에서 화학식 1 화합물로 Trx를 검출하기에 앞서, 유사한 생리적 조건 (37°C, pH 7.4의 PBS 완충액)에서 다른 생물학적 분석물에 의한 간섭의 여부를 조사하였다. 아미노산, 필수 금속이온 또는 과산화수소 존재 하에 화학식 1 화합물의 형광 강도를 측정한 결과를 도 3에 제시하였다. 화학식 1 화합물이 Trx와 반응하는 경우 540 nm에서의 형광 발광이 크게 증가하였으나, 다른 분석물과 반응하는 경우에는 발광 강도의 증가가 미미하였다. 또한, Trx가 존재하는 경우에만 흡수 스펙트럼의 428 nm에서 새로운 밴드가 관찰되었다. 도 1에 제시한 데이터와 함께 종합해 볼 때, 이러한 결과는 화학식 1 화합물과 Trx의 반응이 매우 선택적이며 그로 인한 형광 발광의 증가가 다른 생물학적 분석물에 의한 간섭 없이 세포 내 Trx의 검출이 가능할 정도로 충분히 크다는 것을 명확히 보여준다.

화학식 1 화합물의 이황화결합의 절단반응에 대한 Trx 선택성을 확인하기 위하여, GSH, Cys 및 Hcy와 같은 또 다른 생물학적 티올을 이용한 형광실험을 수행하였다. 도 4에서 보듯이, GSH (1.0 mM)의 농도가 Trx (1.0 μM)의 농도보다 높음에도 (1,000 배) 불구하고 GSH와의 초기반응의 속도는 Trx와의 반응에 비해 명백히 느리다. 또한, 100 μM의 Cys 또는 Hcy의 경우, 형광의 변화가 약하거나 없었다. 따라서, 화학식 1 화합물은 다른 티올에 비해 Trx에 대해 매우 높은 선택성을 가짐을 알 수 있다.

다른 티올에 비해 높은 Trx에 대한 선택성을 좀 더 자세히 알아보기 위하여, 화학식 1 화합물과 티올 (Trx, GSH, Cys, Hcy 및 DTT)의 반응의 반응속도를 분석하여 반응속도상수를 측정하고, 그 결과를 하기 표 1에 요약하였다. 반응속도 분석 결과, Trx의 속도상수는 k = (4.04 ± 0.26) * 10³ M^-1s^-1로 GSH의 약 5,000 배에 달하였다. 한편, 강한 환원제인 DTT의 경우에도 k 값은 Trx에 비해 훨씬 낮았다 (k = 2.28 ± 0.07). 따라서, 화학식 1 화합물이 다른 티올에 비해 Trx와 선택적으로 반응하여 형광 발광을 증가시키는 것이 확인되었다.

티올	k (M^-1s^-1)	k/k_GSH
GSH	0.79 ± 0.06	1.00
Trx	(4.04 ± 0.26) * 10³ M^-1s^-1	5.12 * 10³
Cys	1.06 ± 0.06	1.06
Hcy	0.58 ± 0.02	0.73
DTT	2.28 ± 0.07	2.88

표 1에 나타난 화학식 1 화합물의 Trx에 대한 매우 높은 선택성은 특이하게 생각된다. 이황화결합 절단반응은 GSH 또는 Cys나 Hcy와 같은 티올 대사생성물에 의해 일어나는 것으로 생각되기 때문이다. 또한, Trx에 의해 매개되는 이황화결합의 절단이 생물학적 센서로서 응용되는 바에 대해서는 아직 보고된 바 없다. 따라서, 본 발명은 Trx의 이황화결합 절단을 이용한 신규한 생물학적 프로브로 이용될 수 있다.

화학식 1 화합물과 Trx 의 반응 메커니즘 분석

반응 후 Trx의 Cys 잔기를 확인하기 위하여, 생성물을 MALDI-TOF 질량분석에 의해 분석하였다. 도 5에서 보듯이, Trx와의 반응 후에 화학식 3 화합물에 해당하는 피크는 m/z 572.0에서 주로 관찰되었다. 또한, 반응 전과 후에 각각 m/z 값 11,611.7 (Trx)과 11,610.3 (Trx-S₂)에 해당하는 피크가 관찰되었다 (도 5 및 도 6). 이러한 결과는 화학식 1 화합물과의 반응에 의해 Trx가 산화되어 Trx-S₂와 화학식 3의 화합물이 함께 생성된다는 것을 확인시켜 준다 (도 2). 산화 상태의 Trx-S₂는 세포 내에서 Trx 환원효소에 의해 다시 환원될 수도 있다.

화학식 1 화합물에 의한 Trx 의 세포 내 이미징

세포 내에서 화학식 1 화합물과의 반응에 따른 형광 발광의 변화와 관련된 Trx의 역할을 조사하기 위하여, 선택적인 Trx 억제제로 잘 알려진 PX-12 존재 하에 공초점 현미경을 통한 세포의 관찰을 수행하였다. 결과를 도 7 a 내지 c에 도시하였는데, 형광 강도는 PX-12의 용량에 반비례하는 것으로 확인되었다. 이 결과 역시 세포 내에서의 형광 발광이 GSH 또는 다른 티올계 대사산물이 아닌, Trx에 의해 주도적으로 매개되는 반응이라는 가설을 뒷받침한다. 또한, HepG2 세포의 시토졸 단백질 내에서 화학식 1 화합물의 형광 강도 역시 PX-12 농도에 의존하였다 (도 7 d) 흥미롭게도, 면역침전에 의해 Trx를 제거하자 형광 강도가 크게 감소하였다(도 7 e). 이러한 결과로부터, 세포 내에서 화학식 1 화합물의 이황화결합 절단반응이 주로 Trx에 의해 조절된다고 확실히 결론짓게 되었다.

또한 형광 발광위치를 확인하기 위하여, 화학식 1 화합물과 통상적인 미토콘드리아 표적자인 Mitotracker Red^TM을 사용하여 동일위치 분석실험을 수행하였다. 도 8 a에서 보듯이, 화학식 1 화합물의 형광 이미지와 Mitotracker의 형광 이미지가 거의 일치하므로, 화학식 1 화합물은 미토콘드리아 내에 위치함을 알 수 있다. Mitotracker만을 사용하였을 때에는 458 nm에서 여기한 후에도 형광이 전혀 발광되지 않았으나, 화학식 1 화합물이 함께 존재하는 경우에는 형광이 관찰되었다 (도 8 b). 이것은 형광공명 에너지 전달 (FRET)의 전형적인 예로서, 화학식 1 화합물과 Mitotracker가 세포 내의 동일한 위치에 존재하기 때문이다.

또 다른 비교예로서, 미토콘드리아 표적화부인 트리페닐포스포늄이 없는 화합물을 사용하였을 경우에는 이러한 현상이 관찰되지 않았다 (도 9). 그러므로, 화학식 1 화합물은 세포의 미토콘드리아 내에서 Trx와만 반응하여 형광을 방출하는 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명은 미토콘드리아 티오레독신 활성을 효과적으로 관찰할 수 있게 함으로써 암과 관련된 세포기능의 연구에 있어 새로운 장을 열 수 있을 것이며, 이는 곧 신약 개발과도 연관된다는 점에서 큰 의의가 있다 하겠다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 프로브 복합체:
<화학식 1>

.
삭제
삭제
삭제
하기 화학식 2의 화합물에 트리페닐포스포늄 화합물을 반응시켜 하기 화학식 3의 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및
상기 화학식 3의 중간체 화합물과 디티오디에탄올을 반응시키는 단계
를 포함하는, 제1항에 따른 프로브 복합체의 제조방법.
<화학식 2>

<화학식 3>

.
삭제
삭제
삭제
제5항에 있어서, 상기 화학식 3의 중간체 화합물은 상기 디티오디에탄올과 반응시키기 이전에, 포스진과 반응시키는 것을 특징으로 하는 프로브 복합체의 제조방법.