KR20120085100A - 이광자 형광 프로브를 이용한 미토콘드리아 내 아연 활성의 영상화 방법 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이광자 형광 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 하나 이상의 이광자 형광 프로브, 그 제조 방법 및 이를 이용한 미토콘드리아 내 아연 이온을 이미징 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 한 분자 내에 두 개의 탐침을 도입시킴으로서 미토콘드리아에 선택적으로 염색됨과 동시에 아연 이온과 반응하여 강한 형광을 나타내며, 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 미토콘드리아 내부의 아연 이온의 분포 및 활성을 이미징할 수 있다.
상기 화학식 1 및 2에서, X는 S 또는 O이다.
상기 화학식 1 및 2에서, X는 S 또는 O이다.
Description
본 발명은 세포 내부의 활성 소기관인 미토콘드리아에 선택적으로 위치하는 형광 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 높은 감도와 선택성으로 미토콘드리아 내부에 존재하는 아연 이온의 활동성을 이광자 현미경을 통해 실시간으로 영상화 할 수 있게 해주는 핵심 소재인 이광자 형광 프로브에 관한 것이다.
세포 내 아연 이온 분포의 변화는 생리, 병리적인 활성 연구에서 매우 중요하다. 특히 아연 이온은 중추 신경계인 뇌의 감수성을 조절하고 시냅스 가소성에서 중요한 역할을 수행한다. 적절한 뇌의 기능수행을 위해서 세포 내 아연 이온 농도의 항상성 유지는 필수적이다. 최근 연구에 따르면 세포 내 미토콘드리아는 아연 이온의 농도가 높아졌을 때 이를 흡수함으로써 아연 이온의 항상성을 유지하는데 도움을 주는 것으로 밝혀졌다. 만약 세포 내 아연 이온의 농도가 균형을 잃게 되면 알츠하이머와 파킨슨 질병과 같은 신경학적 질병을 야기하게 된다.
아연의 생물학적 역할을 이해하기 위하여, 퀴놀린(TSQ, Zinquin, 및 TFLZn) 및 형광체(FluZn-3, Znpyr, ZnAF 등)로부터 유도된 여러 종류의 단일광자 형광 프로브가 개발되어 왔으나, 이들 단일광자 형광 프로브의 경우 미토콘드리아에 선택적이지 못하며, 아연 이온에 대한 선택성이 부족하다.
또한 단일광자 형광 프로브를 사용하는 경우 발생하는 공통적인 문제점으로는 짧은 여기 파장(<500 ㎚) 사용에 있다. 짧은 여기 파장은 얕은 투과 깊이(<100 ㎛), 광표백(photo bleaching) 및 세포 자가 형광 등의 문제를 야기함으로써 조직 이미징(imaging)에 대한 적용을 제한한다. 이러한 문제에 대한 해결책으로 제시된 것이 낮은 여기 에너지를 갖는 이광자를 활용하는 이광자 현미경(TPM)을 이용하는 것이었다. 이광자 현미경의 경우 여기를 위해 낮은 에너지를 필요로 하며, 온전한(intact) 세포에서 아연 이온을 탐지할 수 있을 뿐만 아니라, 보다 깊은 조직에서 생물학적 현상들을 관찰할 수 있게 해주는 장점이 있다.
하지만 현재 세포 내 미토콘드리아 내부에 존재하는 아연 이온을 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 형광 프로브는 개발되어 있지 않은 상황이다.
이에 본 발명자는 기존의 단일광자 형광 프로브가 가지는 짧은 여기 파장에 따른 문제점을 해결하고, 미토콘드리아 내 아연 이온을 선택적으로 감지할 수 있는 형광 표지자를 개발하고자 연구, 노력한 결과, 미토콘드리아 내부에 존재하는 아연 이온을 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 세포 내부의 대표적인 활성 소기관인 미토콘드리아의 내부에 존재하는 아연 이온을 선택적으로 감지할 수 있는 이광자 형광 프로브(SZn-Mito), 그 제조방법 및 이를 이용한 미토콘드리아 내 자유 아연 이온의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)를 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1 및 2에서, X는 S 또는 O이다.
또한 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물을 질소 분위기 하에서 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 1 및 4에서, X는 S 또는 O이다.
또한 본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 화합물을 질소 분위기 하에서 반응시켜 하기 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 2]
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 화학식 2 및 6에서, X는 S 또는 O이다.
마지막으로 본 발명은
(a) 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아의 아연 이온과 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 아연 이온의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 한 분자 내에 두 개의 탐침을 도입시킴으로서 미토콘드리아에 선택적으로 염색됨과 동시에 아연 이온과 반응하여 강한 형광을 나타낸다. 또한 물에 대한 용해도와 적은 분자량으로 인하여 세포에 쉽게 로딩될 수 있다. 또한 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 60 분 이상의 장시간 동안 미토콘드리아 내부의 아연 이온을 탐지할 수 있으므로 생체 세포 또는 온건한 생체 조직에서 미토콘드리아 내부의 아연 이온의 분포 및 활성을 이미징할 수 있다.
도 1은 0.5 의 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)로 표지화된(labeled) HeLa 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지이다. (a) 표지화(labeled)되기 전 모습, (b) 이미징 용액(imaging solution)에 150 의 DTDP이 표지화된 후 모습, (c) 상기 (b)에 10 의 CCCP를 첨가한 후의 모습, (d) 시간의 함수에 따른 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)-표지화된 HeLa 세포의 상대적인 TPEF 세기. TPEF 이미지는 425 - 575 nm 범위에서 수집되었다(fs 펄스, 760 nm 여기(excitation) 조건).
도 2는 (a) 단일광자 흡수, (b) 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 존재 하에서 SZn-Mito의 방출 스펙트라(30mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH 7.2), (c) SZn-Mito와 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 복합을 위한 단일(■) 및 이광자(□) 형광 적정 곡선 및 (d) SZn-Mito와 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 복합을 위한 힐 플롯(Hill plots)이다. 단일 및 이광자 과정을 위한 여기 파장은 각각 385와 760 nm이다.
도 3은 (a) 자유 Zn2 +(0-120 nM)의 존재 하에 1 SZn-Mito의 이광자 형광 스펙트라이다. 여기 파장은 760 nm이다. (b) 47 nM의 자유 Zn2 + 존재 하에 SZn-Mito의 이광자 액션 스펙트라이다.
도 4는 (a) 미존재(○) 및 MOPS 버퍼에서 1.0 의 자유 Zn2 + 존재 하(■)에서(30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.2) 1 의 SZn-Mito 단일광자 형광 세기에 pH가 미치는 효과이다. 여기 파장은 380 nM이다. (b) MOPS 버퍼에서 1.0 mM의 Na+, K+, Ca2 +, Mg2 +; 1.0 μM의 Mn2 +, Fe2 +, Co2 +, Ni2 +, Cu2 +, Cd2 + 존재 하에서 형광의 세기이며(빈 막대로 표시), 1.0 μM의 Zn2 + 를 첨가한 후(속이 찬 막대로 표시)의 1.0 μM SZn-Mito의 상대적인 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 5는 (a) 밝은 필드 이미지, (b-c) SZn-Mito(5 ) 및 마이토트랙커(MitoTracker) 5 로 37 ℃에서 30 분 동안 표지화된 HeLa 셀의 (b) TPM 및 (c) OPM 이미지이다. (d) Colocalized 이미지이다. 단일광자 및 이광자 여기 파장은 각각 514 및 760 nm이었으며, 방출(emission)은 500-650 및 425-575 nm에서 수집되었다. 스케일바는 20 이다. 나타난 셀은 반복적인 실험에 의한 대표 이미지이다.
도 6은 10 SZn-Mito로 30 분간 염색된 쥐의 해마절편 이미지이다. (a) 치아 이랑(dentate gyrus, DG) 영역과 CA1-CA3 구역의 밝은-필드(bright-field) 이미지이다(10x 배율). (b) 약 100-200 μm 정도의 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상이다. (c-d) 약 ~100 μm의 깊이에서 이미징 용액에 150 의 DTDP를 넣기 전과 후의 DG 구역((b)의 붉은 박스) 영상이다(40x 배율). (e) 상기 (d)에 10 의 CCCP를 첨가한 후의 영상이다(스케일 바:300 (a) 및 75 (e) mm).
도 2는 (a) 단일광자 흡수, (b) 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 존재 하에서 SZn-Mito의 방출 스펙트라(30mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH 7.2), (c) SZn-Mito와 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 복합을 위한 단일(■) 및 이광자(□) 형광 적정 곡선 및 (d) SZn-Mito와 자유 Zn2 +(0-127 nM)의 복합을 위한 힐 플롯(Hill plots)이다. 단일 및 이광자 과정을 위한 여기 파장은 각각 385와 760 nm이다.
도 3은 (a) 자유 Zn2 +(0-120 nM)의 존재 하에 1 SZn-Mito의 이광자 형광 스펙트라이다. 여기 파장은 760 nm이다. (b) 47 nM의 자유 Zn2 + 존재 하에 SZn-Mito의 이광자 액션 스펙트라이다.
도 4는 (a) 미존재(○) 및 MOPS 버퍼에서 1.0 의 자유 Zn2 + 존재 하(■)에서(30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.2) 1 의 SZn-Mito 단일광자 형광 세기에 pH가 미치는 효과이다. 여기 파장은 380 nM이다. (b) MOPS 버퍼에서 1.0 mM의 Na+, K+, Ca2 +, Mg2 +; 1.0 μM의 Mn2 +, Fe2 +, Co2 +, Ni2 +, Cu2 +, Cd2 + 존재 하에서 형광의 세기이며(빈 막대로 표시), 1.0 μM의 Zn2 + 를 첨가한 후(속이 찬 막대로 표시)의 1.0 μM SZn-Mito의 상대적인 형광 세기를 나타낸 그래프이다.
도 5는 (a) 밝은 필드 이미지, (b-c) SZn-Mito(5 ) 및 마이토트랙커(MitoTracker) 5 로 37 ℃에서 30 분 동안 표지화된 HeLa 셀의 (b) TPM 및 (c) OPM 이미지이다. (d) Colocalized 이미지이다. 단일광자 및 이광자 여기 파장은 각각 514 및 760 nm이었으며, 방출(emission)은 500-650 및 425-575 nm에서 수집되었다. 스케일바는 20 이다. 나타난 셀은 반복적인 실험에 의한 대표 이미지이다.
도 6은 10 SZn-Mito로 30 분간 염색된 쥐의 해마절편 이미지이다. (a) 치아 이랑(dentate gyrus, DG) 영역과 CA1-CA3 구역의 밝은-필드(bright-field) 이미지이다(10x 배율). (b) 약 100-200 μm 정도의 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상이다. (c-d) 약 ~100 μm의 깊이에서 이미징 용액에 150 의 DTDP를 넣기 전과 후의 DG 구역((b)의 붉은 박스) 영상이다(40x 배율). (e) 상기 (d)에 10 의 CCCP를 첨가한 후의 영상이다(스케일 바:300 (a) 및 75 (e) mm).
본 발명은 세포 내부의 대표적인 활성 소기관인 미토콘드리아에 선택적으로 위치하는 형광 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 미토콘드리아 내부에 존재하는 아연 이온의 활동성을 이광자 현미경(TPM)을 통해 실시간으로 영상화하는데 필요한 핵심 소재인 이광자 형광 프로브(SZn-Mito), 그 제조 방법 및 이를 이용한 미토콘드리아 내 자유 아연 이온의 이미징(imaging) 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1 및 2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)를 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1 및 2에서, X는 S 또는 O이다.
본 발명의 상기 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)는 트리페닐포스포늄염(triphenylphosphonium salt, TPP)을 미토콘드리아 탐침으로, N,N-디-(2-피코릴)에틸렌디아민(N,N-di-(2-picolyl)ethylenediamine, DPEN)을 아연 이온 수용체로 하여 각각 이광자 형광체인 6-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌 (6-(benzo[d]thiazol-2-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene, BTDAN) 또는 6-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌 (6-(benzo[d]oxazol-2-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene, BODAN)에 도입시킨 것을 특징으로 한다. 또한 상기 화합물에서 트리페닐포스포늄염(TPP)과 N,N-디-(2-피코릴)에틸렌디아민(DPEN)은 상호간의 작용을 최소화하기 위해 가능한 한 멀리 위치한다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내 소기관 중 미토콘드리아에 선택적으로 염색되며, 아연 이온과 반응하여 400 ~ 650 nm 범위의 가시광선 형광을 나타낸다. 따라서, 아연 이온에 대한 선택성과 활동성을 영상화시키기에 적합한 형광 프로브로써 이용될 수 있다.
본 발명의 이광자 형광 프로브는 기존 사용되던 단일광자 형광 프로브와는 달리 100 ~ 200 ㎛ 범위의 깊은 투과 깊이를 가져, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 미토콘드리아 내부의 아연 이온을 탐지할 수 있다. 또한 본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부에서 광안정성의 특징으로 인해 60 분 이상 지속적인 아연 이온 탐지가 가능하며, 보다 바람직하게는 30 분 ~ 90 분 동안 탐지가 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물을 질소 분위기 하에서 반응시킨 후 정제하여 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 화학식 4에서, X는 S 또는 O이다.
예를 들어, 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조는 질소분위기 하에서 화학식 4로 표시되는 화합물을 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 클로로포름 혼합 용액에 촉매량의 p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트(p-toluenesulfonic acid monohydrate)를 적가하여 환류시키고, 이후 용매를 증발시킨 후 컬럼크로마토그래피 등의 방법을 통해 정제함으로써 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물 및 화학식 6으로 표시되는 화합물을 질소 분위기 하에서 반응시킨 후 정제하여 상기 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제조하는 방법을 제공한다.
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 화학식 6에서, X는 S 또는 O이다.
상기 화학식 2로 표시되는 이광자 형광 프로브의 제조는 질소분위기 하에서, 화학식 5로 표시되는 화합물을 화학식 6으로 표시되는 화합물과 디클로로메탄 혼합 용액에 디사이클로헥실 카보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide)를 적가하여 환류시키고, 이후 용매를 증발시킨 후 컬럼크로마토그래피 등의 방법으로 정제함으로써 제조할 수 있다.
마지막으로 본 발명은 (a) 상기 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계; (b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아의 아연 이온과 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및 (c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 아연 이온의 이미징(imaging) 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 (a)단계에서 0.5 x 10-6 M의 매우 낮은 이광자 형광 프로브의 농도로 세포에 30 분 동안 주입시킴으로써 세포 내 미토콘드리아에 선택적으로 위치시킬 수 있다. 세포에 주입 후 이광자 현미경의 여기원은 760 nm에 해당하는 근적외선 빛을 사용하고, 형광의 범위는 400 ~ 650 nm 범위인 것을 특징으로 한다. 아연과 반응하면 같은 형광 범위에서 이광자 여기 형광의 세기가 7 배 정도 증가되어 고해상도의 이광자 현미경 영상을 얻는 효과를 나타낸다.
낮은 여기 에너지를 갖는 2 개의 근적외선 광자들을 여기원으로 사용하는 이광자 현미경(TPM)은 일광자 현미경에 비해서 증가된 투과 깊이 및 국소화된 여기를 가지며, 장시간 이미징이 가능하다는 장점이 있다. 본 발명은 상기와 같은 이미징 방법을 통해 생체 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 내부의 아연 이온의 분포 및 활동성을 효과적으로 이미징할 수 있다.
이하 본 발명을 아래 실시예에서 상세히 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 이광자 형광
프로브(SZn-Mito)의
합성 (화학식 1로 표시되는 화합물의 합성)
Zn
-
Mito
의 합성
6-포르밀-N-메틸-2-나프틸아민(6-Formyl-N-methyl-2-naphthylamine), (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄브로마이드[(2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide] 및 6-아미노벤조티아졸(6-aminobenzothiazole)은 각각 [J. Am . Chem . Soc . 2008, 130, 4246-4247.], [J Am . Chem . Soc . 1985, 107, 217-226.] 및 [Bioorg . Med . Chem . 2009, 17, 7002-7007.] 등에 공지된 방법에 의해 합성되었다. 다른 화합물의 합성의 경우 아래 반응식 1에 기술된 바와 같다.
[반응식 1]
(a) i:메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate), 양성자-스펀지(proton-sponge), CH3CN; ii:LiOH,THF-water; (b)(2-아미노에틸)포스포늄브로마이드[(2-aminoethyl)phosphonium bromide], DCC, HOBt; (c) i:4-니트로벤젠설포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride), 피리딘(pyridine), DCM; ii:1,2-디브로모에탄(1,2-dibromoethane), Cs2CO3, DMF; iii:2,2′-디피코릴아민(2,2′-dipicolylamine), K2CO3, KI, CH3CN; (d) i:싸이오페놀(thiophenol), K2CO3, DMF; ii:히드라진(hydrazine), EtOH; (e) p-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid), CHCl3.
상기 화합물의 합성을 이하에서 보다 상세하게 설명하기로 한다.
(1) 화합물 1의 합성
6-포르밀-N-메틸-2-나프틸아민(6-formyl-N-methyl-2-naphthylamine) (0.2 g, 1.1 mmol) 및 건조된 CH3CN (20 mL)의 양성자-스펀지(proton-sponge) (0.44 g, 2.1 mmol) 교반 용액에 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoactate) (0.30 mL, 3.3 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 16 시간 동안 환류하면서 교반하여, 용매를 증발시키고, 생성물은 CH2Cl2 (50 mL)에 용해하였다. 상기 생성물이 용해된 CH2Cl2 층을 물로 추출하고, 묽은 황산(H2SO4)으로 수회 세척하여 분리한 후 MgSO4로 건조시켰다. 용액을 감압 조건 하에서 제거하고, 조(crude) 생성물은 헥산/에틸아세테이트(hexane/ethyl acetate) (5 : 1)를 이동상(eluent)으로 하여 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여, 노란색 고체를 얻었다 (수득량: 0.23 g (82 %); m.p. 60 ℃).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 9.99 (s, 1H), 8.17 (d,J=2.0Hz, 1H),7.81 (dd, J=8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J=8.8Hz, 1H),7.65 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.08 (dd, J=8.6, 2.4 Hz, 1H), 6.87 (d, J=2.4Hz, 1H), 4.21 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.19 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d191.9, 170.9, 149.3, 138.6, 134.7, 131.2, 131.1, 127.3, 125.8, 123.6, 115.9, 106.2, 54.4, 52.5, 40.1.
이후 상기 중간체(0.20 g, 0.78 mmol)를 3.0 mL의 THF에 용해시켰다. 상기 용액에 LiOH (0.20 g, 8.4 mmol)의 수용액(3.0 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 6 시간 동안 교반시켰다. 혼합물에서 용매를 증발시키고 물(4.0 mL)을 첨가하였다. 수용성 부분을 5 ℃ 보다 낮은 조건에서 37 % HCl로 pH가 3이 될 때까지 산성화시켰다. 생성된 침전물을 여과를 통해 모은 후, 물로 세척한 후 디에틸 에테르(diethyl ether)로 세척하였다(수득량: 0.17 g (90 %); m.p. 182 ℃).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 10.02 (s, 1H), 8.17 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.86 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.85 (dd, J=8.8, 2.0Hz, 1H), 7.70 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.13 (dd, J=8.8, 2.4Hz, 1H), 6.93 (d, J=2.4Hz, 1H), 4.28 (s, 2H), 3.24 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, d 6-DMSO): d192.4, 172.1, 150.3, 138.7, 135.3, 131.3, 130.8, 127.3, 125.4, 123.4, 116.8, 105.8, 53.9, 40.9.
(2) 화합물 A의 합성
상기 화합물 1 (0.10 g, 0.40 mmol), 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide) (DCC, 0.094 g, 0.45 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole) (0.061 g, 0.45 mmol)을 CH2Cl2 (10 mL)에 용해하였다. 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 상기 교반된 혼합물에 (2-아미노에틸)트리페닐포스포늄 브로마이드[(2-aminoethyl)triphenylphosphonium bromide] (0.14 g, 0.37 mmol)를 첨가하고 16 시간 동안 교반하였다. 이를 통해 용매는 증발되고 생성물은 CH3CN에 용해된다. 부산물인 우레아(urea)를 여과를 통해 제거되고 여과액은 감압 조건 하에서 농축하였다. 조(crude) 생성물을 CHCl3의 8 % 메탄올을 이동상으로 한 컬럼크로마토그래피를 통해 여과함으로써, 노란색을 띄며, 거품 형태의 고체인 화합물 A를 얻었다(수득량: 0.14 g (64 %)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d 9.97 (s, 1H), 9.07 (t, J=1.6Hz, 1H, amide-NH), 8.10 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.82-7.72 (m, 11H), 7.70-7.64 (m, 7H), 7.15 (dd, J=8.8, 2.4Hz, 1H), 6.91 (d, J=2.4Hz, 1H), 4.17 (s, 2H), 3.86-3.79 (m, 2H), 3.73-3.67 (m, 2H), 3.29 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d191.9, 171.1, 149.7, 138.6, 135.4 (d, J=3.0Hz), 134.9, 133.7 (d, J=9.9Hz), 130.9, 130.8, 130.7 (d, J=12.9Hz), 127.2, 125.7, 123.3, 117.3 (d, J=85.7Hz), 116.6, 106.2, 56.9, 41.1, 33.7, 23.2 (d, J=48.6Hz).
31P NMR (162 MHz, CDCl3): d21.6 ppm.
(3) 화합물 2의 합성
5 mL의 CH2Cl2에 용해된 6-아미노벤조티아졸(6-aminobenzothiazole) (1.6 g, 11 mmol) 용액을 4-니트로벤젠서포닐 클로라이드(4-nitrobenzenesulfonyl chloride) (2.8 g, 13 mmol) 및 CH2Cl2 (30 mL)에 녹인 피리딘(pyridine) (1.7 mL, 21 mmol)의 교반된 용액에 적가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고 나머지는 에틸아세테이트(ethyl acetate)에 용해시킨 후 물을 이용하여 추출하였다. 유기층은 포화된 수용성 NaHCO3 용액으로 세척한 후 분리하여, 무수 황산마그네슘(MgSO4)을 이용하여 건조시켰다. 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 증발시킨 후 조(crude) 생성물을 CHCl3로 처리하고 얻어진 침전물을 여과한 후 CHCl3로 세척하고, 건조시켜 갈색 고체인 화합물 2를 얻었다(수득량: 2.4 g (67 %); m.p. 232 ℃).
1H NMR (400 MHz, d 6 -DMSO): d10.87 (br s, 1H), 9.27 (s, 1H), 8.34 (d, J=6.8Hz, 2H), 8.01 (d, J=6.8Hz, 2H), 7.96 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.91 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.25 (dd, J=8.8,2.0Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz, d 6 -DMSO): d156.5, 150.8, 150.4, 145.2, 135.2, 135.0, 128.9, 125.3, 124.2, 120.9, 114.7.
(4) 화합물 3의 합성
DMF (25 mL)에 녹인 화합물 2(2.2 g, 6.6 mmol), 1,2-디브로모에탄(1,2-dibromoethane) (5.7 mL, 66 mmol) 및 Cs2CO3 (2.6 g, 8.0 mmol)혼합물을 80 ℃에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 생성된 혼합물을 50 mL CH2Cl2로 희석시키고, 희석시킨 유기층을 물로 세척하고, 이후 소금물(brine)로 세척하였다. 이를 통해 유기상이 분리되며, 이를 무수 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조시킨 후 증발시켰다. 조(crude) 생성물을 헥산/에틸아세테이트(hexane/ethyl acetate) (4 : 1)를 이동상으로 한 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여, 하얀색 고체인 화합물 3을 얻었다(수득량: 1.3 g (42 %); m.p. 145 ℃).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d9.11 (s, 1H), 8.32 (d, J=8.0Hz, 2H), 8.08 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.88 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.81 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.08 (dd, J=8.8, 2.0Hz, 1H), 4.04 (t, J=6.8Hz, 2H), 3.43 (t, J=6.8Hz, 2H).
13C NMR (100MHz, CDCl3): d156.4, 153.2, 150.4, 143.8, 135.2, 134.9, 129.0, 126.3, 124.6, 124.5, 123.8, 53.4, 28.9.
(5) 화합물 4의 합성
CH3CN (40 mL)에 녹인 화합물 3(1.2 g, 2.7 mmol), 2,2′-디피코릴아민(2,2′-dipicolylamine) (0.45 mL, 2.5 mmol), K2CO3 (0.94 g,6.8 mmol) 및 KI (1.1 g, 6.7 mmol)의 혼합물을 질소 분위기 하에서 3 시간 동안 환류시켰다. 용매를 증발시켜 제거하고 잔여물을 2 NNa2CO3 (30 mL)로 희석하여 CH2Cl2로 추출하였다. 유기층을 소금물(brine)로 세척하고, 분리한 후 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조한 후 증발시켰다. 조(crude) 생성물을 CHCl3의 3 % 메탄올을 이동상으로 하여 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하고, 밝은 노란색 거품 형태의 화합물 4를 얻었다(수득량: 1.4 g (93 %)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d9.07 (s, 1H), 8.43-8.41 (m, 2H), 8.26 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.94 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.74 (d, J=8.8,2H), 7.64 (d, J=2.4Hz, 1H), 7.58 (td, J=8.0, 2.0Hz, 2H), 7.40 (d, J=8.8Hz, 2H), 7.11 (td, J=5.0, 1.2Hz, 2H), 6.96 (dd, J=8.8, 2.4Hz, 1H),3.84 (t, J=6.2Hz, 2H), 3.81 (s, 4H), 2.76 (t, J=6.2Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d158.7, 155.9, 152.6, 150.0, 148.9, 143.7, 136.5, 135.6, 134.4, 128.8, 126.0, 124.3, 123.9, 123.5, 123.1, 122.2, 60.5, 52.2, 49.9.
(6) 화합물 5의 합성
DMF (10 mL)에 녹인 화합물 4 (1.0 g, 1.8 mmol) 및 K2CO3(0.74 g, 5.4 mmol)의 현탁액에 티오페놀(thiophenol) (0.55 mL, 5.4 mmol)을 첨가하고 상온에서 16 시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 CH2Cl2 (40 mL)로 희석시키고, 결합된 유기층을 물로 추출하였다. 유기층을 소금물(brine)로 세척하고, 분리한 후 무수 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조시킨 후 증발시켰다. 조(crude) 생성물을 CHCl3의 5 % 메탄올을 이동상으로 한 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여, 점착성인 화합물 5를 얻었다(수득량: 0.55 g (82 %)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d8.61 (s, 1H), 8.56-8.54 (m, 2H), 7.84 (d, J=8.8Hz, 1H), 7.59 (td, J=8.0,2.0Hz, 2H), 7.38 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.12 (td, J=5.2, 1.2Hz, 2H), 6.94 (d, J=2.4Hz, 1H), 6.82 (dd, J=8.8, 2.4Hz, 1H), 5.22 (brs, 1H), 3.89 (s, 4H), 3.19 (t, J=6.0Hz, 2H), 2.91 (t, J=6.0Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d159.1, 149.2, 148.6, 147.3, 145.7, 136.6, 135.9, 123.7, 123.3, 122.3, 115.1, 101.9, 60.6, 52.8, 42.0.
(7) 화합물 B의 합성
에탄올 (20 mL) 에 화합물 5 (0.50 g, 1.3 mmol) 및 히드라진 모노하이드레이트(hydrazine monohydrate) (1.0 mL, 21 mmol)을 넣고 80 ℃로 3 시간 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 증발시키고 물(20 mL)을 나머지에 첨가한 후 용액의 pH가 5가 되도록 HCl( aq )로 조정하였다. 생성된 혼합물을 CH2Cl2로 추출하여 유기층을 분리한 후 황산마그네슘(MgSO4)으로 건조시키고, 증발시켜 점성을 갖는 화합물 B를 얻었다(수득량: 0.25 g (52 %)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d8.53-8.51 (m, 2H), 7.60 (td, J=8.0, 2.0Hz, 2H), 7.39 (d, J=7.6Hz, 2H), 7.12 (td, J=5.2, 1.2Hz, 2H), 6.63 (d, J=2.4Hz, 1H), 6.58 (d, J=8.4Hz, 1H), 6.42 (dd, J=8.4, 2.4Hz, 1H), 3.85 (s, 4H), 3.72 (brs, 1H), 3.08 (t, J=6.0Hz, 2H), 2.91 (t, J=6.0Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d159.2, 149.2, 142.0, 137.9, 136.5, 123.2, 122.2, 118.6, 117.2, 114.9, 114.4, 60.6, 53.2, 42.8.
(8)
SZn
-
Mito
의 합성
질소 분위기 하에서, CHCl3 (5.0 mL)에 화합물 B(0.070 g, 0.19 mmol)를 넣은 용액을 화합물 A(0.11 g, 0.18 mmol) 및 p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트(p-toluenesulfonic acid monohydrate) (0.012 g, 0.063 mmol)를 넣은 CHCl3 (15 mL)의 교반 용액에 적가하였다. 이후 상기 혼합물을 16 시간 동안 환류시켰다. 용매를 증발시키고 조(crude) 생성물을 CHCl3의 10 % 메탄올을 이동상으로 한 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여, 노란색의 거품 형태의 고체인 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)를 얻었다(수득량: 0.070 g (40 %), mp: 64 ℃).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): d8.97 (t, J=5.6Hz, 1H, amide-NH), 8.56-8.54 (m, 2H), 8.24 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.95 (dd, J=8.8, 2.0Hz, 1H), 7.77-7.72 (m, 9H), 7.70-7.59 (m, 11H), 7.42 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.15-7.10 (m, 3H), 6.92-6.90 (m, 2H), 6.79 (dd, J=7.6, 2.0Hz, 1H), 4.77 (brs, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.95 (s, 4H), 3.85-3.78 (m, 2H), 3.72-3.67 (m, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.23 (t, J=5.6Hz, 2H), 2.95 (t, J=5.6Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): d171.4, 163.5, 158.7, 149.1, 148.1, 146.7, 146.6, 136.9, 136.7, 135.9, 135.4 (d, J=3Hz), 133.7 (d, J=10.6Hz), 130.7 (d, J=12.9Hz), 129.8, 127.7, 127.0, 126.6, 126.4, 124.6, 123.5, 123.1, 122.4, 117.3 (d, J=85.7Hz), 116.8, 114.7, 106.5, 102.3, 60.5, 57.1, 52.8, 41.9, 41.1, 33.7, 23.2 (d, J=48.6Hz).
31P NMR (162 MHz, CDCl3): d21.7 ppm; HRMS(FAB+): m/z calcdfor[C54H51N7OPS]+ : 876.3613, found: 876.3617.
실시예
2: 이광자 형광
프로브(SZn-Mito)의
합성 (화학식 2로 표시되는 화합물)
질소 분위기 하에서, CH2Cl2 (5.0 mL)에 화합물 C(0.150 g, 0.41 mmol)와 화합물 D(0.37 g, 0.50 mmol) 및 DCC (0.11 g, 0.53 mmol)를 넣은 용액을 10 시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시키고 조(crude) 생성물을 CHCl3의 10 % 메탄올을 이동상으로 한 컬럼크로마토그래피를 통해 정제하여 이광자 형광 프로브(SZn-Mito1)를 얻었다(수득량: 0.18 g (40 %)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 9.59 (s, 1H), 8.65 (s, 1H), 8.50 (m, 3H), 8.12 (m, 4H), 8.05 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.84 (m, 7H), 7.76 (m, 4H), 7.68(m, 6H), 7.62 (td, 2H, J =8 Hz, J =2 Hz), 7.50(d, 2H, J = 8 Hz), 7.12 (m, 2H), 6.71 (dd, 1H, J = 8, J =2 Hz), 6.38 (d, 1H, J = 8 Hz,), 4.11 (s, 2H), 4.02 (m, 4H), 3.89 (s, 4H), 3.85 (s, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.16 (t, 2H, J = 6 Hz), 2.86(t, 2H, J = 6 Hz).
실시예
3: 이광자 형광
프로브의
광물리학적
특성
이광자 형광 프로브(SZn-Mito)의 광물리적 특성을 측정하기 위해 MOPS(3-(N-morpholino)propane sulfonic acid) 버퍼 용액에서 본 실험을 실시하였다.
소량의 아연 이온(Zn2 +)을 MOPS 버퍼 내의 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)에 가하였을 때, 형광 세기가 금속 이온 농도의 함수에 따라 점차적으로(흡수 스펙트럼에는 영향이 없이) 증가하였다(도 2 참조). 이는 금속 이온과의 복합에 의해 광유발된 전자 전이 과정(photo induced electron transfer(PeT) process)이 블록킹됨에 따른 결과로 예측된다. 거의 동일한 결과가 TP 과정에서도 관찰됨이 실험 결과 나타났다(도 3(a) 참고).
단일광자 및 이광자 과정(one- and two-photon processes)에 의해 측정된 이광자 형광 프로브(SZn-Mito) 형광 증가 펙터(FEF=(F-F min)/F min) 값은 과량의 아연 이온의 존재 하에서 7의 값을 나타내었다(표 1).
이광자 형광 프로브의 광물리학적 데이터 | ||||||||
Compd[a] | [b] | [c] | F[d] | [e] | FEF [f] | [g] | d[h] | Fd[i] |
SZn - Mito | 388 (1.87) | 500 | 0.15 | - | - | |||
SZn - Mito+Zn2 + | 375 (2.31) | 493 | 0.92 | 3.1/3.1 | 7(7) | 760 | 96 | 75 |
[a] 모든 데이터는 아연 이온(Zn2 +)의 비존재 또는 존재(120 nM) 조건 하에서 측정되었으며, 버퍼로는 MOPS가 사용되었다(30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH 7.2).
[b] 단일광자 흡수 스펙트라 lmax의 단위는 nm이다. 괄호 안의 숫자는 몰 흡광 계수로 M-1cm-1 단위이다.
[c] 단일광자 방출 스펙트라 lmax의 단위는 nm이다.
[d] 형광 양자 수득률(Fluorescence quantum yield), ± 15 %.
[f] 단일광자 과정에 의해 측정된 형광 증가 펙터(Fluorescence enhancement factor) (FF mim)/F min. 괄호 안의 숫자는 이광자 과정에 의해 측정된 값을 나타낸다.
[g] 이광자 여기 스펙트라의 lmax 값으로 단위는 nm이다.
[h] 이광자 흡수 효율로 단위는 GM이다. ± 15%.
[i] 이광자 형광의 효율로 단위는 GM이다. ± 15%.
실시예
4: 이광자 형광
프로브의
미토콘드리아 선택성
본 발명의 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아에 특이한 선택성을 나타내는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 하였다. 도 5a에 나타난 이광자 형광 프로브의 강한 녹색 형광 이미지가 실제 미토콘드리아를 영상화하는 지를 확인하기 위하여, HeLa세포를 종래의 알려진 단일광자 현미경 표지자인 마이토트랙커(Mito Tracker. Invitrogen 사 제품)로 염색한 후, 단일광자 적색 형광 이미지를 얻은 후(도 5b), 얻어진 두 이미지(도 5a, 5b)를 함께 중첩시켰다. 중첩된 이미지는 도 5c에 나타나는데, 도 5c를 참조하면 두 염료로 염색한 후 얻어진 이미지(도 5a, 5b)는 서로 일치하는 것을 알 수 있으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 이광자 브로브가 미토콘드리아를 정확하게 영상화하는 것을 나타낸다.
실시예
5: 이광자 형광
프로브의
아연 이온
해리상수
및 선택성
본 발명의 이광자 형광 프로브는 세포 내부의 아연 이온을 검출하기 적합한 해리상수와 아연 이온에 대해 높은 선택성을 가지며, 이를 확인하기 위해 본 실험을 실시하였다.
다양한 양의 ZnSO4및 10 mM의 EGTA(에틸렌글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산)을 함유하는 MOPS(4-모르폴린프로판술폰산) 완충용액(30mM, pH 7.2, 0.1M KCl)을 준비하였다.
[수학식 1]
여기에서,
따라서,
이후 EGTA( )의 Zn2 + 착물의 안정성 상수를 공지된 방법에 따라 얻었으며, 따라서 EGTA(pH 7.2, 0.1M KCl, 25℃)에 대하여, pK1=9.40, pK2=8.79, pK3=2.70, log =12.6이 얻어진다.
0.1M 이온 강도에서 워크 아웃될 때, 모든 양성자화 상수는 0.11만큼 위쪽으로 보정되며, [EGTA]total은 10 mM에서 고정되고, [Zn2 +]total은 0 내지 9.5 mM의 범위이다.
각 용액에 대한 계산된 [Zn2 +]free 농도는 하기 표 2와 같다.
이광자 염료에 대한 명확한 해리 상수를 결정하기 위하여, 도 2b로부터 하기 수학식 2을 이용하여 형광 적정 곡선인 도 2c를 구하였다.
[수학식 2]
여기에서, F는 형광 강도, Fmax는 최고 형광 강도이며, Fo는 Zn2 +가 없는 조건에서의 형광 강도, [Zn2+]free는 자유 Zn2 + 농도를 나타낸다.
수학식 2에 따른 적정 곡선 (도 2c)에 가장 잘 부합되는 Kd 수치를 상용 오리진 프로그램을 사용하여 계산하였다. 또한, 이광자 과정에서의 Kd 수치를 결정하기 위해서, 760 nm의 파장 및 1180 mW의 출력에 세팅되고(초점 평면에서 대략 10 mW에 해당), 모드-락된 티타늄-사파이어 레이저 광원(Coherent Chameleon, 90 MHz, 200 fs)에 의해서 여기되는 이광자 형광을 CCD 카메라로 수집하여 이광자 여기 형광 스펙트럼을 얻었다. 이광자 여기 형광 적정 곡선을 얻었으며, 이를 상기 수학식 2에 피팅시켰다(도 2c 및 2d).
도 2c를 참조하면, 일광자 형광 적정 곡선 및 이광자 형광 적정 곡선으로부터 계산된 SZn-Mito의 해리 상수는 각각 3.1 nM이다(상기 표 1 참조). 이때 이광자 프로브의 검출 한계는 nM 범위 영역이다.
금속 양이온들에 대한 선택성은 이광자 브로브의 MOPS 완충용액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH 7.2)에서 실시하였다. 도 4에서 보는 바와 같이, 이광자 형광 프로브는 Na+, K+, Ca2 +, Mg2+, Mn2 +, Fe2 +, Fe3 +에 비해 1 의 Zn2 +에서 높은 선택성을 보여주며, 1 의 Cd2 +에서도 어느 정도 높은 선택성을 보여준다(도 4(b) 참조). 1 의 Co2 +, Ni2 + 및 Cu2 +의 존재 하에서는 여기에 의한 금속-리간드 전자 전이(metal-to-ligand electron transfer)에 의해서 형광이 감소되는 결과를 보여준다. 하지만 세포 내에는 Co2 +, Ni2 + 및 Cu2 +와 같은 이온들이 거의 존재하지 않기 때문에 본 발명의 이광자 형광 프로브는 다른 경쟁 금속 이온의 간섭을 거의 받지 않으면서 아연 이온을(Zn2 +) 탐지할 수 있다는 장점이 있다. 게다가 본 발명의 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)는 생체와 관련된 pH 범위에서 pH-미반응인 특성을 가지고 있다(도 4(a) 참조).
실시예
6: 이광자 형광
프로브
및 이광자 현미경을 통한 미토콘드리아 내 아연 이온의 활성
이미징
본 발명의 이광자 형광 프로브가 세포 내에서 아연 이온을 탐지할 수 있는지 확인하기 위하여 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)가 세포에 미치는 독성 테스트를 실시하였다. CCK-8 kit을 사용하여 측정한 결과 독성이 무시해도 좋을 만큼 낮은 수준임이 확인되었다. 또한, 일정한 부위에서 SZn-Mito-표지화된 HeLa 셀의 TPEF 강도는 60 분간 지속적인 fs-펄스(fs-pulse) 방사에도 전혀 감소되지 않아, 높은 광안정성을 확인시켜 주었다.
이후 실제 살아있는 세포에서 본 발명의 이광자 형광 프로브가 아연 이온의 변화를 모니터할 수 있는지 확인하기 위해 테스트하였다.
Zn2 +-결합 단백질(Zn2 +-binding proteins)로부터 Zn2 +의 해리를 도와주는 시약인 DTDP(2,2′-dithiodipyridine; 150 mM)를 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)로 표지화된 HeLa 세포에 첨가하였을 때 TPEF 세기가 증가하였으며, 미토콘드리아의 막 전위차를 붕괴시킴으로써 내부 미토콘드리아 양이온의 방출을 증가시키는 화합물인 CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone;10 mM) 화합물 첨가하였을 때 TPEF 세기가 감소하는 결과를 나타내었다. 또한, Zn2 +를 세포질로 이동시켜주는 시약인 100 mM Zn2 + 및 100 mM pyrithione(2-mercaptopyridine N-oxide)으로 세포가 처리되었을 때 TPEF의 세기가 증가하였으며, CCCP로 처리하였을 때 TPEF의 세기가 감소하는 결과를 나타내었다(도 1).
이러한 결과는 본 발명의 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)가 살아있는 세포 내에서 장시간 동안 경쟁 금속 이온, pH, 세포독성 및 광안정화로부터 최소한의 간섭을 받으면서 아연 이온(Zn2 +)을 탐지할 수 있음을 명확하게 뒷받침해 준다.
실시예
7: 이광자 형광
프로브
및 이광자 현미경을 통한 쥐의
해마절편
내부영상
조직 내 세포의 영상화에 있어서 본 발명의 이광자 형광 프로브가 갖는 유용성을 증명하기 위하여, 마우스 해마상 돌기의 미세박편을 모니터링하였는데, 본 실험예에서는 10 μM의 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)로 30 분간 37 ℃에서 인큐베이션된 마우스 해마상 돌기의 미세박편에 대한 이광자 현미경 영상를 얻었다. 생후 14 일의 쥐의 박편은 너무 커서 하나의 영상만을 나타내기 어려우므로, 약 100-200 μm 깊이의 두께로 동일 평면에서 얻어진 복수의 TPM 영상을 얻고, 이를 결합하였다.
도 6는 본 실험예에 따른 영상이며, 이를 보다 상세히 설명하면, (a) 치아 이랑(dentate gyrus, DG) 영역과 CA1-CA3 구역의 밝은-필드(bright-field) 이미지(10x 배율), (b) 약 100-200 μm 깊이에서 z축 방향에 따른 25 TPM 이미지를 결합한 영상, (c, d) 약 ~100 μm의 깊이에서 이미징 용액에 150 의 DTDP를 넣기 전과 후의 DG 구역((b)의 붉은 박스) 영상(40x 배율), (e) 상기 (d)에 10 의 CCCP를 첨가한 후의 영상이다.
도 6(a)를 참조하면, CA3의 투명층(stratum lucidum) 및 치아 이랑(dentate gyrus)의 폐문(hilus)에서 강한 형광 강도를 나타내었다. 보다 높은 배율에서 얻어진 영상은 명확하게 [Zn2 +]m이 CA3 영역의 피라미드 신경의 말단부의 이끼섬유 축색(mossy fiber axon)에 농축된 것을 명확하게 보여준다(도 6(b) 참조). 또한 [Zn2 +]m의 증가를 유발하는 시약인 DTDP 첨가 시 이광자 형광의 세기가 급격히 증가하고, 미토콘드리아 내부의 양성자 활성 억제제인 CCCP 처리 시 TPEF가 감소하는 것은 상기 관찰 결과를 명확하게 증명한다(도 6(d),(e) 참조).
게다가, 100-200 μm의 깊이에서 얻어진 TPM(이광자 현미경) 영상은 z축 깊이(즉, 두께)에 따라 폐문 근처에 위치하는 치아 이랑 신경의 이끼섬유에 존재하는 [Zn2 +]m의 분포를 명확하게 보여준다.
이상의 실험 결과들은 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브(SZn-Mito)가 TPM을 이용하여 생체 조직 내부, 특히 미토콘드리아 내에 존재하는 자유 Zn2 +를 100 내지 200 μm의 두께까지 매우 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
Claims (9)
- 제 1 항에 있어서, 트리페닐포스포늄염과 N,N-디-(2-피코릴)에틸렌디아민이 6-(벤조[d]티아졸-2-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌 또는 6-(벤조[d]옥사졸-2-일)-2-(N,N-디메틸아미노)나프탈렌에 도입되어 형성된 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 제 1 항에 있어서, 미토콘드리아에 선택적으로 염색되는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 제 1 항에 있어서, 아연 이온과 반응하여 400 ~ 650 nm 범위의 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 제 1 항에 있어서, 생체 세포 및 100 ~ 200 ㎛ 깊이의 생체 조직에서 미토콘드리아 내 아연 이온 탐지가 가능한 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- (a) 제 1 항의 이광자 형광 프로브를 세포에 주입하는 단계;
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 미토콘드리아의 아연 이온과 반응하여 형광을 나타내는 단계; 및
(c) 상기 형광을 이광자 현미경으로 통해 관측하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 아연 이온의 이미징(imaging) 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 (b)단계에서 나타내는 형광은 400 ~ 650 nm 범위인 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내 아연 이온의 이미징(imaging) 방법.
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