KR101908442B1 - 서로 다른 스토크스 이동을 기반으로 하는 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 간 조직 내 칼슘 이온의 영상화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료로부터 유래된 가변색 이광자 형광 프로브(SCa1-IREF)에 관한 것으로, 상기 가변색 이광자 형광 프로브는 칼슘(Ca2 +)에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 가짐으로써, 살아있는 뉴런 및 다양한 조직에서 Ca2 +을 직접적 및 정량적으로 평가할 수 있으며, in-situ [Ca2 +]i 영상화 및 효과적인 가변색 프로브 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 서로 다른 스토크스 이동을 기반으로 하는 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 간 조직 내 칼슘 이온의 영상화 방법에 관한 것이다.
살아있는 표본에서 화학적 사건의 정확한 영상화는 생리학 및 병리학을 이해하는 데 중요하다. 소분자를 기반으로 하는 가변색 프로브(ratiometric probe)는 분석물을 정량적으로 검출하는 강력한 도구이다. 소분자 가변색 프로브는 분자 내 전하 전달(intramolecular charge transfer, ICT) 기반 및 포스터 공명 에너지 전달(Forster Resonance Energy Transfer, FRET) 기반 프로브로 구성된다. 이러한 시스템은 자유(free) 및 결합 형태 사이 두 개의 방출 강도 비율을 이용한다. 비율은 프로브 분배 및 기구 가변성과 같은 실험적 인공물(artifacts)로부터의 간섭을 최소화하여 분석물(analyte)을 위해 보정될 수 있다. 그러나 이러한 프로브의 대부분은 돌이킬 수 없는 반응을 기반으로 하며, 분석물의 동적 농도 변화를 시각화하는데 한계가 있다. ICT 기반 프로브는 종종 방출 비율 측정법(emission ratiometry)이 아닌 여기 비율 측정법(excitation ratiometry)을 보여주는데, 이는 두 개의 여기 파장을 필요로 하고 실시간 모니터링을 방해할 수 있다. 따라서, 가변색 프로브를 설계하는 간단한 방법은 여전히 중요한 과제이다.
최근, 내부 레퍼런스(internal reference, IREF) 기반 프로브가 비율 분석을 위해 보고된 바 있다. 원칙적으로, 턴-온(turn-on) 프로브는 IREF로서 서로 다른 색의 방출 염료를 연결함으로써 가변색 프로브로 쉽게 변형될 수 있다. 이 시스템은 턴-온 신호가 감지 창(sensing window)으로 작용하고, IREF 신호가 다른 신호로부터의 최소 상호 작용으로 일정하게 유지하는 것을 요구한다. 그러나 IREF에서 프로브로의 FRET 효율이 너무 높으면 IREF 신호는 무시될 수 있어 비율 분석을 어렵게 만든다.
이 문제를 해결하기 위해, 본 발명에서는 서로 다른 스토크스 이동(stokes shift)을 가지는 이중 염료를 이용하여 IREF 기반 가변색 프로브를 설계하였다. 감지 염료 및 IREF의 흡수 스펙트럼이 유사한 영역에 있다면 FRET 간섭은 제외될 수 있으나 그들의 스토크스 이동이 다르므로, 두 부분은 고유한 형광 특성을 가지고 비율 민감도를 향상시킨다.
세포 내 Ca2 +([Ca2 +]i)는 다양한 세포 기능을 조절하는 중요한 신호 메신저이다. [Ca2 +]i의 파괴는 신경 변성, 심장병, 골격근 결손과 같은 인간의 질병과 직접적으로 관련되어 있다. 가변색 [Ca2 +]i 분석을 위해, Fura-2와 같은 ICT 기반 프로브가 널리 사용되고 있다. 그러나 이러한 프로브는 여기(excitation) 가변색을 기반으로 하며, UV 영역 여기 광을 이용하므로 광 손상을 야기할 수 있고, 제한된 조직 영상화 깊이를 가지는 단점이 있다. 따라서 상기 문제를 해결하기 위한 대안은 이광자 현미경(two-photon microscopy, TPM)을 이용한 방출(emission) 가변색 기반 프로브의 사용이다. 상기 방출 가변색 기반 프로브는 여기원(excitation source)으로서 두 개의 근적외선 광자(near-infrared photon)를 이용한다. TPM은 우수한 조직 침투 깊이, 여기의 현지화(localization), 낮은 광 손상 및 긴 관측 시간을 포함하는 이점을 가지므로, 살아있는 시스템에서 영상화 연구를 위한 가장 강력한 기술 중 하나로 주목받고 있다. 따라서, 세포 내 [Ca2 +]i의 영상화를 위한 가변색 이광자 형광 프로브의 개발이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 세포 또는 조직 내 칼슘 이온을 영상화 하기 위한 신규 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 함유하는 이광자 형광프로브를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 이광자 형광 프로브를 이용한 세포 또는 조직 내 칼슘의 영상화 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 세포 또는 조직에 주입하는 제 1단계, 상기 세포에 여기원을 조사하는 제 2단계, 상기 이광자 형광 프로브가 생체 내 칼슘과 반응하여 형광을 나타내는 제 3단계 및 상기 형광을 측정하는 제 4단계를 포함하는 칼슘의 영상화 방법을 제공한다.
본 발명은 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료로부터 유래된 가변색 이광자 형광 프로브(SCa1-IREF)에 관한 것으로, 상기 가변색 이광자 형광 프로브는 칼슘(Ca2 +)에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 가짐으로써, 살아있는 뉴런 및 다양한 조직에서 Ca2 +을 직접적 및 정량적으로 평가할 수 있으며, in-situ [Ca2 +]i 영상화 및 효과적인 가변색 프로브 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 가변색 이광자 형광 프로브 SCa1-IREF의 합성 반응식을 나타낸 것이다. (a) DCC, HOBt, DMF, 상온(r.t.), (b) p-TSA, DMF, 90℃, (c) 1M KOH, MeOH:디옥산(1:1), 상온, (d) 터트-부틸 피페라진-1-카복실레이트, DCC, HOBt, DMF, 상온, (e) TFA, DCM, 0℃.
도 2 (a)는 일반적인 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 시스템 및 (b) 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료 시스템의 개념적인 흡수(점선) 및 방출 스펙트럼(실선) 결과를 나타낸 것이며, (c)는 SCa1, IREF 및 SCa1-IREF의 화학 구조를 나타낸 것이며, (d)는 SCa1-IREF의 센싱 모티프(sensing motif)를 나타낸 것이다.
도 3 (a)는 IREF 및 SCa1의 단광자 흡수(점선) 및 방출 스펙트럼(실선) 결과를 나타낸 것이며, (b)는 자유 Ca2 + 이온의 부재 및 존재 하에서 IREF 및 SCa1의 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (c)는 자유 Ca2 + 이온(39 μM)의 부재 및 존재 하에서 SCa1-IREF의 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (d)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)과 SCa1-IREF의 착물화에 대한 형광 적정 곡선을 나타낸 것이다. 모든 데이터는 MOPS 완충액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH = 7.2)에서 측정하였으며, OP 및 TP 공정을 위한 여기 파장은 각각 380 nm 및 750 nm였다.
도 4 (a)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)의 존재 하에서 SCa1의 단광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (b)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)과 SCa1의 착물화에 대한 단광자 형광 적정 곡선을 나타낸 것이며, (c)는 IREF, SCa1 및 SCa1-IREF의 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (d)는 IREF, SCa1 및 SCa1-IREF의 단광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (e)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)의 존재 하에서 SCa1-IREF의 이광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (f)는 자유 Ca2 +(0 내지 200 μM)과 SCa1-IREF의 착화물에 대한 힐 플롯(hill plot)을 나타낸 것이다. 상기 데이터는 MOPS 완충액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, EGTA 10 mM, pH = 7.2)에서 측정하였다. (g)는 Ca2 +(0 내지 1.0 μM), 이오노마이신(1 μM) 및 EGTA(1 mM) 첨가 후, 일차 대뇌 피질 뉴런 세포에서 SCa1-IREF의 이광자 여기 형광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다. OP 및 TP 공정의 여기 파장은 각각 380 nm 및 750 nm였다.
도 5는 Mg2 +(1 mM) 존재 하에서 SCa1-IREF(1 μM)의 Ch2/Ch1 비율 및 MOPS 버퍼(30 mM MOPS, 100 mM KCl, EGTA 10 mM, pH = 7.2)에서 Ca2 +(39 μM) (검은색 막대) 첨가에 따른 다른 양이온(500 μM) (백색 막대)들을 나타낸 것이며, (b)는 MOPS 버퍼에서 0 μM(○) 및 39 μM(■)의 Ca2 + 존재 하에서 SCa1-IREF(1 μM)의 형광 강도 비율(Ch2/Ch1)에 대한 pH의 영향을 나타낸 것이다. 여기 파장은 380 nm였다.
도 6은 Ca2 + 이온(39 μM)의 부재 및 존재 하에서 SCa1-IREF의 이광자 작용 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 SCa1-IREF의 존재 하에서 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 생존율을 MTS 분석으로 측정한 결과이다.
도 8 (a)는 SCa1-IREF(1 μM)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 TPM 이미지를 나타낸 것이며, (b)는 시간 함수로서 패널 (a)의 A 내지 E로부터의 상대적인 TPEF 강도를 나타낸 것이다. 디지털화된 강도는 xyt 모드를 이용하여 1시간 동안 2.00초 간격으로 기록되었다.
도 9 (a)는 25, 70, 160 및 300초에서 SCa1-IREF(1 μM)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지를 나타낸 것이다. Ca2 +(0.23 μM), 이오노마이신(ionomycin, 1 μM) 및 EGTA(1 mM)는 50초 후에 첨가하였다. TPM 이미지는 펨토 초 펄스로 750 nm 여기에서 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서의 이광자 여기 형광(TPEF)을 수집하여 획득하였다. (b)는 시간 함수로서 이미지 (a)로부터 수집된 Ch1 및 Ch2에서의 TPEF 강도를 나타낸 것이며, (c)는 Ca2+(0 내지 1.0 μM), 이오노마이신(1 μM) 및 EGTA(1 mM) 첨가 후, 일차 대뇌 피질 뉴런 세포에서 SCa1-IREF의 적정 곡선을 나타낸 것이다.
도 10 (a) 내지 (d)는 10 μM의 히스타민 첨가 전(a, 0초) 및 후(b, 60초), SCa1-IREF(1 μm)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 TPM 가변색 이미지를 나타낸 것으로, (c) 및 (d)는 패널 (a)에서 흰색 원형 B를 확대한 이미지이며, (e)는 시간 함수로서 상대적 Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPM 이미지는 펨토 초 펄스로 750 nm 여기에서 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서의 TPEF를 수집하여 획득하였다.
도 11 (a) 내지 (c)는 SCa1-IREF(10 μM)로 염색된 랫드 해마 절편의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것으로, (a)는 10x 배율로 90 내지 180 μm의 깊이에서 z 방향을 따라 축적된 30개의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것이며, (b)는 100x 배율로 약 120 μm의 깊이에서 패널 (a)의 흰 상자를 확대한 이미지이며, (c)는 패널 (b)의 흰 상자를 확대한 이미지이며, (d)는 패널 (c)의 흰색 점선으로부터 유도된 Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPEF는 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 750 ㎚ 여기 및 방출 창을 이용하여 수집하였다.
도 12 (a) 내지 (c)는 랫드 기관의 (a) 간, (b) 심장 및 (c) 근육 조직의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것으로, 모든 조직은 SCa1-IREF(10 μM)로 표지하였으며, 40x 배율로 80 내지 160 μm의 깊이에서 z 방향을 따라 축적된 80개의 TPM 이미지이다. (d) 및 (e)는 각 기관 조직에서 (d) 상대적인 TPEF 강도 비율(Ch2/Ch1) 및 (e) Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPEF는 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 750 ㎚ 여기 및 방출 창을 이용하여 수집하였다.
도 13은 10x 배율로 Ch1 및 Ch2에서 수집된 SCa1-IREF 표지 랫드 해마 절편의 3차원 TPM 이미지를 나타낸 것으로 (a) 병합된 이미지 및 (b) 180 내지 180 μm 깊이에서 획득한 단면 TPM 이미지이다.
도 2 (a)는 일반적인 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 시스템 및 (b) 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료 시스템의 개념적인 흡수(점선) 및 방출 스펙트럼(실선) 결과를 나타낸 것이며, (c)는 SCa1, IREF 및 SCa1-IREF의 화학 구조를 나타낸 것이며, (d)는 SCa1-IREF의 센싱 모티프(sensing motif)를 나타낸 것이다.
도 3 (a)는 IREF 및 SCa1의 단광자 흡수(점선) 및 방출 스펙트럼(실선) 결과를 나타낸 것이며, (b)는 자유 Ca2 + 이온의 부재 및 존재 하에서 IREF 및 SCa1의 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (c)는 자유 Ca2 + 이온(39 μM)의 부재 및 존재 하에서 SCa1-IREF의 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (d)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)과 SCa1-IREF의 착물화에 대한 형광 적정 곡선을 나타낸 것이다. 모든 데이터는 MOPS 완충액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA, pH = 7.2)에서 측정하였으며, OP 및 TP 공정을 위한 여기 파장은 각각 380 nm 및 750 nm였다.
도 4 (a)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)의 존재 하에서 SCa1의 단광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (b)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)과 SCa1의 착물화에 대한 단광자 형광 적정 곡선을 나타낸 것이며, (c)는 IREF, SCa1 및 SCa1-IREF의 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (d)는 IREF, SCa1 및 SCa1-IREF의 단광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (e)는 자유 Ca2 + 이온(0 내지 39 μM)의 존재 하에서 SCa1-IREF의 이광자 방출 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며, (f)는 자유 Ca2 +(0 내지 200 μM)과 SCa1-IREF의 착화물에 대한 힐 플롯(hill plot)을 나타낸 것이다. 상기 데이터는 MOPS 완충액(30 mM MOPS, 100 mM KCl, EGTA 10 mM, pH = 7.2)에서 측정하였다. (g)는 Ca2 +(0 내지 1.0 μM), 이오노마이신(1 μM) 및 EGTA(1 mM) 첨가 후, 일차 대뇌 피질 뉴런 세포에서 SCa1-IREF의 이광자 여기 형광 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다. OP 및 TP 공정의 여기 파장은 각각 380 nm 및 750 nm였다.
도 5는 Mg2 +(1 mM) 존재 하에서 SCa1-IREF(1 μM)의 Ch2/Ch1 비율 및 MOPS 버퍼(30 mM MOPS, 100 mM KCl, EGTA 10 mM, pH = 7.2)에서 Ca2 +(39 μM) (검은색 막대) 첨가에 따른 다른 양이온(500 μM) (백색 막대)들을 나타낸 것이며, (b)는 MOPS 버퍼에서 0 μM(○) 및 39 μM(■)의 Ca2 + 존재 하에서 SCa1-IREF(1 μM)의 형광 강도 비율(Ch2/Ch1)에 대한 pH의 영향을 나타낸 것이다. 여기 파장은 380 nm였다.
도 6은 Ca2 + 이온(39 μM)의 부재 및 존재 하에서 SCa1-IREF의 이광자 작용 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 SCa1-IREF의 존재 하에서 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 생존율을 MTS 분석으로 측정한 결과이다.
도 8 (a)는 SCa1-IREF(1 μM)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 TPM 이미지를 나타낸 것이며, (b)는 시간 함수로서 패널 (a)의 A 내지 E로부터의 상대적인 TPEF 강도를 나타낸 것이다. 디지털화된 강도는 xyt 모드를 이용하여 1시간 동안 2.00초 간격으로 기록되었다.
도 9 (a)는 25, 70, 160 및 300초에서 SCa1-IREF(1 μM)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 이광자 현미경(TPM) 이미지를 나타낸 것이다. Ca2 +(0.23 μM), 이오노마이신(ionomycin, 1 μM) 및 EGTA(1 mM)는 50초 후에 첨가하였다. TPM 이미지는 펨토 초 펄스로 750 nm 여기에서 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서의 이광자 여기 형광(TPEF)을 수집하여 획득하였다. (b)는 시간 함수로서 이미지 (a)로부터 수집된 Ch1 및 Ch2에서의 TPEF 강도를 나타낸 것이며, (c)는 Ca2+(0 내지 1.0 μM), 이오노마이신(1 μM) 및 EGTA(1 mM) 첨가 후, 일차 대뇌 피질 뉴런 세포에서 SCa1-IREF의 적정 곡선을 나타낸 것이다.
도 10 (a) 내지 (d)는 10 μM의 히스타민 첨가 전(a, 0초) 및 후(b, 60초), SCa1-IREF(1 μm)로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 TPM 가변색 이미지를 나타낸 것으로, (c) 및 (d)는 패널 (a)에서 흰색 원형 B를 확대한 이미지이며, (e)는 시간 함수로서 상대적 Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPM 이미지는 펨토 초 펄스로 750 nm 여기에서 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서의 TPEF를 수집하여 획득하였다.
도 11 (a) 내지 (c)는 SCa1-IREF(10 μM)로 염색된 랫드 해마 절편의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것으로, (a)는 10x 배율로 90 내지 180 μm의 깊이에서 z 방향을 따라 축적된 30개의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것이며, (b)는 100x 배율로 약 120 μm의 깊이에서 패널 (a)의 흰 상자를 확대한 이미지이며, (c)는 패널 (b)의 흰 상자를 확대한 이미지이며, (d)는 패널 (c)의 흰색 점선으로부터 유도된 Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPEF는 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 750 ㎚ 여기 및 방출 창을 이용하여 수집하였다.
도 12 (a) 내지 (c)는 랫드 기관의 (a) 간, (b) 심장 및 (c) 근육 조직의 가변색 TPM 이미지를 나타낸 것으로, 모든 조직은 SCa1-IREF(10 μM)로 표지하였으며, 40x 배율로 80 내지 160 μm의 깊이에서 z 방향을 따라 축적된 80개의 TPM 이미지이다. (d) 및 (e)는 각 기관 조직에서 (d) 상대적인 TPEF 강도 비율(Ch2/Ch1) 및 (e) Ca2 + 농도를 나타낸 것이다. TPEF는 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 750 ㎚ 여기 및 방출 창을 이용하여 수집하였다.
도 13은 10x 배율로 Ch1 및 Ch2에서 수집된 SCa1-IREF 표지 랫드 해마 절편의 3차원 TPM 이미지를 나타낸 것으로 (a) 병합된 이미지 및 (b) 180 내지 180 μm 깊이에서 획득한 단면 TPM 이미지이다.
본 발명의 발명자들은 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료로부터 유래된 가변색 이광자 형광 프로브(SCa1-IREF)를 제조하였으며, 상기 이광자 형광 프로브가 칼슘(Ca2 +)에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 가지며, 뉴런 및 다양한 조직에서 Ca2 +을 직접적 및 정량적으로 평가하는 것을 확인하며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
바람직하게는, 상기 염은 화합물의 합성, 분리 또는 정제 과정에서 그 자체로 제조될 수 있거나 또는 특수하게 제조될 수 있다. 이와 같은 방법으로 제조된 염의 예로는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염기성 염일 수 있으며, 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 산성 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
또한, 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 제공한다.:
[화학식 1]
바람직하게는, 상기 이광자 형광 프로브는 생체 내 칼슘과 선택적으로 감응하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 이광자 형광 프로브는 칼슘에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 세포 또는 조직에 주입하는 제 1단계, 상기 세포에 여기원을 조사하는 제 2단계, 상기 이광자 형광 프로브가 생체 내 칼슘과 반응하여 형광을 나타내는 제 3단계 및 상기 형광을 측정하는 제 4단계를 포함하는 칼슘의 영상화 방법을 제공한다:
[화학식 1]
바람직하게는, 상기 제 1단계의 조직은 해마(hippocampal) 조직, 심장 조직, 간 조직 또는 근육 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 제 2단계의 여기원은 700 내지 800 nm 범위의 파장을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 칼슘은 80 내지 220 μm 평균 깊이에서 탐지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1 : 재료 및 방법
모든 시약은 공급 회사에서 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 합성에 사용된 용매는 표준 방법을 이용하여 합성을 위해 미리 정제하였다. 순상 컬럼 크로마토그래피(normal phase column chromatography)는 MERCK 실리카 겔 60(silica gel 60)을 이용하여 화합물 정제를 위해 사용하였다. 반응 과정은 실리카 겔 60을 이용하여 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)로 모니터링하였다. 프로브와 중간체에 대한 합성방법은 하기 실시예 2에 기재하였다. 합성 결과는 1H NMR, 13C NMR 및 ESI 질량 분석으로 분석하였다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker 400 MHz 분광계(spectrometer)를 이용하여 기록하였다. 흡수 스펙트럼 및 형광 스펙트럼은 각각 S-3100 UV-Vis 분광광도계(spectrophotometer) 및 1 cm 표준 석영 셀(standard quartz cell)을 갖는 FluoroMate FS-2 형광 분광 광도계를 이용하여 분석하였다. 형광 양자 수율(fluorescence quantum yield)은 쿠마린(coumarin) 307(MeOH에서 Φ = 0.95)을 이용하여 측정하였다.
실시예
2 :
가변색
이광자 형광
프로브
(
SCa1
-
I
REF
) 합성
화합물 A(J Am Chem Soc 133 (2011) 5698-5700.), B( Angew Chem Int Ed 46 (2007) 7445-7448.), D(J Med Chem 52 (2009) 1428-1437.) 및 IREF(J Org Chem 76 (2011) 8113-8116.)는 이전 논문을 참고하여 제조하였다. 가변색 이광자 형광 프로브(SCa1-IREF)의 합성 반응식은 도 1에 나타내었다.
2-1. 화합물 C 합성
무수 DMF(dimethylformamide, 5 mL)에 화합물 A(0.01 g, 0.41 mmol), 1,3-디사이클로헥실 카르보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide, DCC) (0.13 g, 0.61 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBt) (0.082 g, 0.61 mmol)을 용해시켰다. 반응 혼합물은 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반 하였다. 상기 혼합물에 아민 B(0.27 g, 0.49 mmol)를 첨가하고, 16시간 동안 교반 하였다. 용매를 증발시키고, 혼합물은 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN)에 용해시켰다. 부산물 우레아는 여과에 의해 제거하고 여액을 감압 하에 농축시켰다. 조 생성물(crude product)은 용리제로서 80% 에틸 아세테이트를 함유하는 헥산을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였으며, 목적하는 커플링된 화합물 C(68% 수율)를 수득하였다.
m.p. 189-191℃. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.00 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.87 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.83 (dd, 1H, J1 = 8.4 Hz, J2 = 1.6 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.16 (dd, 1H, J1 = 9.2 Hz, J2 = 2.4 Hz), 7.04 (d, 1H, J1 = 2.4 Hz), 6.95-6.79 (m, 6H), 6.75 (d, 1H, 8.4 Hz), 4.24 (s, 4H), 4.11 (s, 8H), 4.09 (s, 2H), 3.56 (s, 6H), 3.54 (s, 6H), 3.24 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 191.67, 171.89, 171.70, 167.56, 150.51, 150.24, 149.45, 139.17, 138.08, 136.17, 134.43, 132.04, 131.70, 131.30, 127.38, 126.39, 123.83, 122.35, 121.55, 119.31, 119.13, 116.49, 113.26, 112.81, 107.57, 106.16, 67.43, 67.08, 59.16, 53.56, 51.83, 51.79, 40.36 ppm.
2-2. 화합물 E 합성
DMF(10 mL)에 화합물 C(0.180 g, 0.23 mmol), 화합물 D(0.12 g, 0.35 mmol) 및 p-톨루엔술폰산 1수화물(p-toluenesulfonic acid monohydrate, p-TSA) (0.004 g, 0.023 mmol)을 용해시켰다. 반응 혼합물은 질소 대기 하에 90℃에서 18시간 동안 가열 하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 증류수를 첨가하였다. 생성물은 여과에 의해 수집하였으며, 물로 세척하고 에탄올로부터 결정화로 정제하여 화합물 E(69% 수율)를 수득하였다.
m.p.: 195-197℃. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.54 (s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.08 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.03 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.80 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.69 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.11 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 6.98 (s, 1H), 6.87-6.66 (m, 7H), 4.18 (s, 4H), 4.06-4.03 (m, 10H), 3.47 (d, 12H, J = 10.8 Hz), 3.45 (s, 6H), 3.18 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.21, 171.62, 171.23, 167.20, 156.64, 150.98, 150.37, 149.34, 140.05, 138.34, 135.80, 134.87, 131.95, 131.24, 130.46, 128.11, 127.62, 127.24, 126.63, 125.54, 124.66, 123.94, 122.48, 122.25, 121.46, 119.82, 119.30, 115.71, 113.68, 113.06, 107.35, 105.17, 68.24, 67.36, 59.32, 53.78, 51.62, 50.86, 40.66 ppm.
2-3.
SCa1
합성
1:1의 MeOH:디옥산(10 mL)의 화합물 E(0.100 g, 0.11 mmol) 용액을 1M KOH (0.09 g, 1.6 mmol) 1.6 mL에 적가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반 하였다. 용매는 진공 하에서 제거하고, 생성물을 물에 용해시켰다. 0℃에서 pH가 2가 될 때까지 2M HCl(aq.)을 상기 용액에 적가 하였다. 담갈색의 고체가 형성되면, 이를 여과하고 물로 세척한 다음 진공 하에 건조시켜 목적하는 생성물 SCa1을 정량적 수율로 수득하였다.
m.p.: 202-205℃. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.46 (d, 1H, J = 0.8 Hz), 8.28 (s, 1H), 8.01 (dd, 1H, J1 = 8.8 Hz, J2 = 1.6 Hz), 7.93-7.86 (m, 2H), 7.73 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.63 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.19 (s, 1H), 7.06 (d, J = 9.2 Hz), 6.89 (s, 1H), 6.85-6.71 (m, 6 H), 4.16 (s, 4H), 4.05 (s, 2H), 3.87 (d, 8H, J = 5.6 Hz), 3.12 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.84, 171.42, 170.75, 167.64, 155.32, 151.22, 150.67, 149.85, 141.28, 137.94, 135.62, 134.30 132.25, 130.96, 130.68, 129.24, 127.95, 127.40, 125.86, 125.32, 124.81, 123.60, 123.14, 122.69, 121.63, 119.42, 118.65, 115.34, 113.93, 113.68, 106.74, 104.62, 67.85, 67.26, 58.44, 57.21, 41.75 ppm
2-4. 화합물 F 합성
DMF(5 mL)에 화합물 IREF(0.10 g, 0.37 mmol), 1,3-디사이클로헥실 카르보디이미드(DCC) (0.095 g, 0.46 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) (0.062 g, 0.46 mmol)을 용해시켰다. 반응 혼합물은 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반 하였다. 상기 혼합물에 터트-부틸 피페라진-1-카복실레이트(0.186 g, 0.46 mmol)를 첨가하고 16시간 동안 교반 하였다. 용매를 증발시키고, 혼합물을 아세토니트릴에 용해시켰다. 부산물 우레아를 여과에 의해 제거하고 여액을 감압 하에 농축시켰다. 80% 에틸 아세테이트를 함유하는 헥산을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제하였으며, 목적하는 커플링된 생성물 F(68% 수율)를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.41 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.06 (s, 1H), 7.58 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.28 (dd, 1H, J1 = 9.2 Hz, J2 = 2.4 Hz), 7.17 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3.96 (s, 3H), 3.76 (s, 2H), 3.57-3.51 (m, 4H), 3.40 (s, 2H), 1.47 (s, 9H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 164.16, 160.55, 158.15, 154.50, 152.29, 145.24, 137.49, 124.49, 124.32, 124.00, 122.16, 119.82, 117.62, 112.31, 106.72. 80.51, 77.47, 76.84, 55.73, 47.38, 42.48, 28.62 ppm.
2-5. 화합물 G 합성
무수 디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2)의 화합물 F(0.100 g, 0.22 mmol) 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 0℃ 온도를 유지하면서 디클로로메탄의 1M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 상기 혼합물에 적가 하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 12시간 동안 실온에서 교반 하였다. 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시키고 포화 중탄산 나트륨(saturated sodium bicarbonate) 용액으로 중화시켰다. 유기층을 분리하고, 염수(brine)로 세척하였으며, 황산 나트륨(Na2SO4) 상에서 건조 및 농축시켜 화합물 G를 정량적 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.43 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 8.04 (s, 1H), 7.59 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.44 (d, 1H, 8.8 Hz), 7.29 (dd, 1H, J1 = 9.2 Hz, J2 = 2.4 Hz), 7.17 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 3.96 (s, 3H), 3.78 (s, 2H), 3.42 (s, 2H), 3.00-2.93 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ 162.75, 159.41, 157.41, 150.73, 143.10, 136.57, 124.90, 123.29, 123.07, 122.60, 119.36, 116.60, 112.24, 106.93, 55.51, 47.49, 45.63, 45.04, 42.24 ppm.
2-6. 화합물 H 합성
DMF(10 mL)에 화합물 E(0.97 g, 0.11 mmol), 아민 G(0.044 g, 0.13 mmol) 및 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt) (0.024 g, 0.18 mmol)을 용해시켰다. 디-이소프로필 에틸아민(di-isopropyl ethyl amine, DIPEA) (0.043 g, 0.33 mmol)을 적가하고 반응 혼합물을 질소 대기 하에 실온에서 1시간 동안 교반 하였다. 이 혼합물에 커플링제 PyBOP(0.17 g, 0.33 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 추가로 16시간 더 교반 하였다. 용매를 증발시키고 혼합물을 물로 희석시켰다. 생성물은 디클로로메탄으로 추출하고, 물 및 염수로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 황산 나트륨 상에서 건조 및 농축시켜 미정제물을 수득하였다. 용리액으로서 5% 메탄올을 함유하는 클로로포름(chloroform ,CHCl3)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 커플링된 화합물 H(76% 수율)를 수득하였다.
m.p.: 190-192℃. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.43 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 8.07 (d, 1H, J = 12.0 Hz), 8.02 (s, 1H), 7.86 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.58 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.52 (d, 1H, 8.4 Hz), 7.44 (d, 1H, 8.8 Hz), 7.29 (s, 2H), 7.17 (dd, 2H, J1 = 6.4 Hz, J2 = 2.0 Hz), 7.07 (s, 1H), 6.92-6.78 (m, 6H), 6.75 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.52 (s, 4H), 4.25 (s, 2H), 4.15-4.11 (m, 8H), 3.95 (s, 3H), 3.70-3.49 (m, 20H), 3.23 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 173.08, 172.09, 172.01, 171.98, 171.93, 170.19, 164.31, 164.26, 164.21, 160.77, 160.71, 160.67, 158.46, 158.41, 152.55, 152.48, 150.63, 145.65, 141.77, 138.31, 137.74, 137.67, 136.37, 134.77, 131.68, 128.20, 127.57, 127.35, 124.97, 124.65, 124.50, 124.26, 124.19, 122.23, 121.98, 121.96, 121.35, 120.09, 120.04, 119.13, 117.73, 112.49, 106.84, 96.25, 85.97, 74.62, 67.15, 60.31, 55.90, 53.68, 52.04, 51.98, 47.39, 47.01, 46.67, 46.61, 44.97, 42.45, 30.11, 26.88, 26.79 ppm.
2-7.
SCal
-
I
REF
합성
1:1의 MeOH:디옥산(10 mL)의 화합물 H(0.100 g, 0.08 mmol) 용액을 1M KOH(0.09 g, 1.6 mmol) 1.6 mL에 적가하고, 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반 하였다. 용매를 진공 하에서 제거하고, 생성물을 물에 용해시켰다. 0℃에서 pH가 2가 될 때까지 2M HCl(aq.)을 상기 용액에 적가 하였다. 황색의 고체가 형성되면,이를 여과하고 물로 세척한 다음 진공 하에 건조시켜 목적하는 생성물 SCal-IREF을 정량적 수율로 수득하였다.
m.p.: 223-225℃. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 10.05 (s, 1H), 8.81 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 8.46 (s, 1H), 8.24 (d, 2H, J = 6.8 Hz), 8.02 (quin, 2H, J = 8.4 Hz), 7.93 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.78-7.71 (m, 3H), 7.58 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.47 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.24 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.07 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.00 (s, 1H), 6.93 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 6.77 (t, 5H, J = 6.4 Hz), 6.68 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.31 (s, 2H), 4.23 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.97 (d, 8H, J = 10.0 Hz), 3.79 (s, 2H), 3.59-3.52 (m, 4H), 3.45 (s, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.17 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO): δ 173.10, 170.22, 169.22, 167.24, 164.69, 160.93, 158.23, 157.95, 157.40, 155.30, 155.11, 154.88, 151.92, 150.19, 150.01, 149.56, 145.79, 143.25, 139.80, 138.45, 137.91, 136.95, 135.45, 134.81, 133.66, 132.75, 131.81, 130.58, 128.12, 127.45, 126.40, 126.09, 124.79, 124.15, 122.75, 122.08, 121.65, 121.11, 120.30, 119.41, 118.90, 117.22, 116.16, 115.53, 112.77, 110.98, 107.96, 106.64, 106.19, 105.79, 74.08, 73.56, 68.01, 67.75, 57.19, 56.44, 55.84, 54.62, 29.87 ppm.; HRMS (FAB+): m/z calcd for [C62H56O16N7S]: 1186.20, found: 1186.3499.
실시예
3 : 해리 상수(dissociation constant) 결정
다양한 [Ca2 +]을 함유하는 일련의 보정 용액은 다양한 비율로 두 가지 용액 (10 mM K2EGTA를 함유하는 용액 A 및 10 mM CaEGTA를 함유하는 용액 B)을 혼합함으로써 제조하였다. 두 용액 모두 1 μM SCa1 및 SCa1-IREF, 100 mM KCl, 30 mM MOPS을 함유하며, pH 7.2로 조절되었다.
Ca2 +-SCa1 및 SCa1-IREF에 대한 Kd를 결정하기 위해, 20℃에서 2.0 mL의 용액 A(0 μM 자유 Ca2 +)로 형광 스펙트럼을 기록하였다. 그 다음, 상기 용액 203 μL를 버리고 용액 B(39 μM의 자유 Ca2 +) 203 μL로 대체하여, 스펙트럼을 기록하였다. 이는 프로브 농도 또는 총 EGTA 농도는 변화없이, CaEGTA 농도를 1.00 mM로, [Ca2+]free 농도를 약 0.017 μM로 만든다. [Ca2 +]free는 계산식 1을 이용하여 Ca2+(150.5 nM)에 대한 EGTA의 Kd로부터 계산하였다.
[계산식 1]
용액 A의 223, 251, 285, 327, 421, 479, 667, 420, 350, 412, 905, 1028, 926, 및 992 μL을 연속적으로 버리고, 동량의 용액 B로 대체함으로써 0.038, 0.065, 0.101, 0.150, 0.230, 0.350, 0.601, 0.800, 1.00, 1.30, 2.50, 5.30, 10.0 및 20.0 μM의 자유 Ca2+을 획득하였다.
1:1 금속-리간드 복합체가 프로브 및 Ca2 + 사이에 형성되면 다음과 같이 평형을 기술할 수 있으며, L과 M은 각각 프로브 및 Ca2+을 의미한다.
총 프로브 및 금속 이온 농도는 각각 [L]0 = [L] + [LM] 및 [M]0 = [M] + [LM]로 정의된다. [L]0과 [M]0을 가지고, Kd의 값은 다음과 같이 주어진다:
[계산식 2]
[계산식 3]
여기서, F는 관찰된 형광 강도이고, Fmin은 최소 형광 강도이고, Fmax는 최대 형광 강도이다. 계산식 3과 함께 적정 곡선(도 3(d) 및 도 10(b))에 가장 잘 맞는 Kd 값은 엑셀 프로그램을 이용하여 계산하였다.
이광자 공정에 대한 Kd TP를 결정하기 위해, 750 nm 파장 및 2690 mW 출력 전력, 초점면에서 약 2.2 mW 평균 전력으로 셋팅된 모드-잠김 티타늄 사파이어 레이저 소스(Mai Tai HP; Spectra Physics, 80 MHz 펄스 주파수, 100 fs 펄스 폭)에 의해 여기된 DM IRE2 현미경(Leica)으로 TPEF 스펙트럼을 획득하였다. TPEF 적정 곡선(도 3(d) 및 도 10(b))을 획득하였으며, 계산식 3에 적용시켰다.
실시예
4 : 이광자 단면적(two-photon cross section area; TPA) 분석
이광자 단면적(δ)은 펨토 초 형광 측정 기술(femto second(fs) fluorescence measurement technique)을 이용하여 측정하였다. IREF, SCa1 및 SCa1-IREF(2.0 × 10-6 M)를 MOPS 버퍼(30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.2)에 용해시켰으며, 이광자 유도 형광 강도는 레퍼런스(reference)로서 로다민 6G(rhodamine 6G)를 이용하여 720 내지 900 nm에서 측정하였다. 동일한 여기 파장(excitation wavelength)에서 방출되는 레퍼런스 및 샘플의 이광자 유도 형광 스펙트럼의 강도를 측정하였다.
TPA 단면적은 하기 계산식 4를 이용하여 계산하였다. 하기 계산식 4에서 첨자 s 및 r은 샘플 및 레퍼런스 분자를 의미한다. CCD(charge coupled device) 검출기에 의해 수집된 신호의 강도는 S로 표시하였다. Φ는 형광 양자 수율을 나타내며, φ는 실험 장치의 전체 형광 수집 효율을 나타낸다. C는 용액 내 분자의 수 밀도를 나타내며, δ r은 레퍼런스 분자의 TPA 단면적을 나타낸다.
[계산식 4]
δ = δ r(S sФr φ r C r)/(S rФs φ s C s)
실시예
5 : 이광자 형광 현미경 분석
SCa1-IREF 표지 세포 및 조직의 이광자 형광 현미경 이미지는 개구수(numerical aperture; NA) 0.40 및 1.30으로 x10 dry 렌즈, x40 oil 렌즈로 스펙트럼 공초점 및 다광자 현미경(Leica TCS SP8 MP)을 이용하여 획득하였다.
이광자 형광 현미경 이미지는 현미경(Leica, DMI6000B)을 이용하여 모드 잠금 티타늄-사파이어 레이저 소스(mode-locked titanium-sapphire laser source) (Mai Tai HP; Spectra Physics, 초당 80 MHz, 100 fs 펄스 폭)에 750 nm 파장, 2673 mW 출력 전력, 초점면에서 약 2.2 mW의 평균 전력으로 프로브를 여기시켜 획득하였다. 살아있는 세포 영상화는 안정적인 세포 환경을 위해 장시간 동안 적절한 온도, 습도 및 pH를 유지시켜 주는 배양 시스템(Chamlide IC, Live Cell Instrument)을 이용하여 수행하였다.
400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2) 범위에서 이미지를 얻기 위해, 내부 PMT를 사용하여 400 Hz 스캔 속도에서 각각 8 비트 unsigned 512 x 512 및 1024 x 1024 픽셀에서의 신호를 수집하였다.
실시예
6 :
세포
배양 및 영상화
대뇌 피질 뉴런(cortical neuron)은 1일령의 렛드(Sprague-Dawley; SD)의 대뇌 피질로부터 준비하였다. 대뇌 피질은 파파인(1.5 단위/mL; Worthington Biochemical Corporation, NJ, USA)을 함유하는 HBSS 용액(Hank’s balanced salt solution, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에 해리시켰다. 대뇌 피질 세포는 큰 구멍이 있는 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)을 이용하여 3 내지 4회 연마하고, 작은 구멍 파스퇴르 피펫을 이용하여 각각의 세포로 해리시켰다. 단일 대뇌 피질 뉴런은 폴리-D-라이신(poly-D lysine, 100 μg/mL) 및 라미닌(laminin, 4 μg/ML)으로 코팅된 35 nm 직경의 플라스틱 페트리 접시(petri dish)에 접종하였다. 배양 배지는 B27 보충제(supplement, Gibco), 2 mM 글루타민(Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 neurobasalTM 배지(Gibco)를 이용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 성장 배지는 일주일에 두 번 교체하였다. 일차(primary) 대뇌 피질 뉴런 세포는 1 μM의 SCa1-IREF로 표지하고, 영상화하였다.
실시예
7 : 세포 보정(calibration)
Ca2 + 보정 곡선은 ionophore 처리 및 SCa1-IREF 표지 대뇌 피질 뉴런 세포의 Ch2/Ch1에 의해 생성되었다. 세포는 1 mM의 SCa1-IREF 1.0 μL가 함유되어 있는 DMSO 저장 용액(stock solution, 1.0 μM SCa1-IREF)과 37℃, 5% CO2 조건에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 세포외 배지를 1 mL의 보정 버퍼(calibration buffer, 1 μM 이오노마이신(ionomycin), 1 mM EGTA 및 0 내지 1.0 μM CaCl2)로 대체한 후, 15 내지 20분 동안 반응시켰다. SCa1-IREF의 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 이광자 여기 형광(TPEF) 강도는 Ca2 + 이온의 첨가(0 내지 1.0 mM)에 따라 변화된다. 세포 내 Ca2 + 이온([Ca2 +]i)은 하기 계산식 5를 이용하여 계산하였다. (Ch2/Ch1)min, (Ch2/Ch1)max 및 Ch2/Ch1은 과잉 Ca2 +의 존재 및 부재 하에서 TPEF 강도 및 관찰된 TPEF 강도의 비율이고, 세포에서의 명백한 해리 상수의 값(Kd i)은 0.24 ± 0.3 μM였다.
[계산식 5]
[Ca2 +]i= Kd i[((Ch2/Ch1)-(Ch2/Ch1)min)/((Ch2/Ch1)max-(Ch2/Ch1))]
실시예
8 : 세포 생존율
일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 생존율에 있어서 SCa1-IREF의 세포 독성을 평가하기 위해, MTS(Cell Titer 96H, Promega, Maidson, WI, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예
9 :
랫드의
해마(
hippocampal
), 심장, 간 및 근육의 준비 및 염색
본 동물실험은 아주대학교 의과대학의 실험동물 연구센터의 승인을 받았으며, 동물실험 윤리위원회 규정을 준수하여 실험을 수행하였다. 2주령의 노화 Sprague-Daweley(SD) 랫드(rat)의 해마, 간, 심장 및 근육으로부터 조직 절편(slice)을 준비하였다.
1) 관상(coronal) 절편은 인공 뇌 척수액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF; 138.6 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 21 mM NaHCO3, 0.6 mM NaH2PO4, 9.9 mM D-glucose, 1 mM CaCl2, 및 3 mM MgCl2)에 진동 블레이드 마이크로톰(vibrating-blade microtome)을 이용하여 400 μm 두께로 제조하였다. 2) 특수 장비인 심장 매트릭스(alto)를 이용하여 획득한 심장 절편은 블레이드(Dorco)를 이용하여 1 mm 간격의 수평 단면으로 절단한 다음 차가운 인산완충식염수(dulbecco 's phosphate buffered solution, D-PBS; 200 mM KCl, 200 mM KH2PO4, 8 M NaCl, 2.16 M Na2HPO4·7H2O, 0℃)에 넣었다. 3) 간엽(liver lobe) 조직은 몇 개의 중첩된 간엽으로부터 분리하였다. 분리된 간엽 절편은 수술용 메스(scalpel)를 이용하여 0.5 cm2 단편으로 절단한 다음 차가운 인산완충식염수(D-PBS)에 넣었다. 4) 근육 절편은 랫드의 중간 허벅지 피부로부터 획득하였으며, 수술용 메스를 이용하여 1cm 길이의 단편으로 절단한 다음 차가운 인산완충식염수(D-PBS)에 넣었다.
각 기관 절편은 10 μM의 SCa1-IREF가 함유된 인산완충식염수(D-PBS)와 함께 95% O2, 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 인산완충식염수(D-PBS)로 3회 세척하고, 유리 바닥 접시(glass-bottomed dish, MatTek)로 옮긴 다음 스펙트럼 공초점 이광자 현미경으로 관찰하였다. 10 μM의 SCa1-IREF로 표지된 랫드 절편의 TPM 이미지는 약 90 내지 190 μm 깊이에서 획득하였다.
실험예
: 실험결과
도 2(a) 및 2(b)를 참조하여 보면, 일반적인 포스터 공명 에너지 전달(FRET) 시스템 및 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료 시스템의 개념적인 흡수(점선) 및 방출 스펙트럼(실선) 결과를 나타낸 것이다.
도 2(c)를 참조하여 보면, SCa-IREF는 6-(벤조[d]티아졸-2'-일)-2-(N-메틸아미노)나프탈렌(6-(benzo[d]thiazol-2’-yl)-2-(N-methylamino)naphthalene) (BTDAN, 감지 부분) 및 크로멘 유도체(chromene derivative, IREF 부분)의 두 형광 부분으로 구성되며, SCa1은 피페라진 스페이서(piperazine spacer)를 통해 IREF와 연결되어 SCa-IREF를 생성하는 것을 확인할 수 있다.
도 2(d)를 참조하여 보면, 턴-온 Ca2 + 감지 부분(SCa1)을 제조하기 위해, BTDAN은 Ca2 + 킬레이터(chelator)로 잘 알려진 O, O'- 비스(2-아미노페닐)에틸렌글리콜-N, N, N ', N'- 테트라아세트산( O,O ’-bis(2-aminophenyl)ethyleneglycol-N,N,N ’,N’-tetraacetic acid) (BAPTA)과 글라이신아미드 스페이서(glycinamide spacer)로 연결하였다.
도 3(a) 및 하기 표 1을 참조하여 보면, 상기 염료는 유사한 흡수 파장 최대치(IREF 및 BTDAN의 λabs = 각각 372 및 385 nm) 및 서로 다른 스토크스 이동(각각 86 및 127 nm)을 가지는 상이한 방출 색깔(λem = 458 및 512 nm)을 가지는 것을 확인할 수 있다. 이 조합은 단일 여기원(single excitation source, 380 nm) 및 최소 FRET 효율을 가지는 이중 채널 감지를 가능하게 한다.
도 3(b)를 참조하여 보면, SCa1-Ca2 +의 동일한 반응은 IREF의 존재 하에서 관찰되었으나 IREF의 강도의 변화는 관찰되지 않았다.
또한, 도 3(c)를 참조하여 보면, MOPS 버퍼의 SCa1-IREF에 Ca2 +의 첨가는 SCa1 영역의 형광 강도를 증가시켰고, 이는 IREF 및 SCa1의 개별 스펙트럼의 합과 거의 동일한 것을 확인하였다. 적정 스펙트럼(titration spectra)은 형광 세기가 400 내지 450 nm(Ch1)에서 변화되지 않은 강도로 500 내지 600 nm(Ch2)에서 점차적으로 증가하는 것을 보여주었다.
도 3(d)를 참조하여 보면, 단광자 및 이광자 공정에 대한 SCa1-IREF의 Kd 값은 각각 SCa1 값과 동일한 Kd OP = 0.17 ± 0.02 μM 및 Kd TP = 0.18 ± 0.03 μM인 것을 확인하였다.
a) 모든 데이터는 MOPS 버퍼(30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7.4)에서 측정하였음. b) nm 단위의 단광자 흡수 스펙트럼의 λmax, c) nm 단위의 단광자 방출 스펙트럼의 λmax, d) 형광 양자 수율, 15%. e) 단광자 공정으로 측정한 μM 단위의 Ca2 +에 대한 해리 상수, 불확도는 ± 12% 임. f) nm 단위의 이광자 여기 스펙트럼의 λmax, g) 10 내지 50 cm4s/photon (GM)에서 최대 이광자 단면적, 15%. h) 이광자 작용 단면적.
도 4(a) 및 4(b)를 참조하여 보면, SCa1-함유 버퍼에 Ca2 + 이온의 첨가는 해리 상수 Kd = 0.17 ± 0.02 μM의 유의한 턴-온 반응을 나타내었다.
도 4(c)를 참조하여 보면, SCa1-IREF의 흡수 스펙트럼은 IREF 및 SCa1의 흡수 스펙트럼보다 더 넓었으며, 도 3(c) 및 도 4(d)를 참조하여 보면, Ca2 +이 없는 버퍼에서 SCa1의 방출 강도는 무시할만한 수준으로 SCa1-IREF의 방출 스펙트럼은 IREF의 방출 스펙트럼과 유사하였다.
다음으로 비율(Ch2/Ch1) 분석을 위해, Ca2 + 감지 창(Ch2) 및 IREF 창(Ch1)을 측정하였다. 도 4(e)를 참조하여 보면, 유사한 결과가 750 nm 펨토 초 펄스에 의해 여기된 이광자 여기 형광 공정에서 관찰되었다.
도 4(f)를 참조하여 보면, 강도 비율(Ch2/Ch1)의 힐 플롯(hill plot)은 1.0의 기울기를 가지는 선형이었으며, 이는 프로브 및 Ca2 +의 1:1 착물화(complexation)를 의미한다.
도 4(g) 및 4(e)를 참조하여 보면, Ca2 + 첨가 후, SCa1-IREF로 표지된 뉴런의 TPEF 스펙트럼은 TPEF 강도의 유의한 증가를 나타내었으며, 이는 버퍼에서 얻은 것과 거의 유사한 것을 확인하였다. 이 결과는 400 내지 430 nm(Ch1) 및 500 내지 600 nm(Ch2)에서 감지 창을 이용하는 가변색 분석(Ch2/Ch1)을 가능하게 한다.
도 5(a)를 참조하여 보면, SCa1-IREF는 Ca 2+에 대해서만 높은 선택성을 나타내었고, Ch2/Ch1 비율에서 밝혀진 바와 같이 SCa1-IREF는 Mg2 +, Zn2 +, Mn2 +, Fe2 +, Cu2+, 및 Co2+에 대해서는 무시할만한 수준의 낮은 반응을 나타내었다.
또한, 도 5(b)를 참조하여 보면, SCa1-IREF의 Ch2/Ch1 비율은 생물학적으로 적절한 pH 범위에서 pH에 민감성을 가지지 않는 것을 확인하였다. 따라서, SCa1-IREF는 pH 및 다른 금속 이온으로부터의 간섭을 최소화하면서 [Ca2 +]i를 검출할 수 있다.
MOPS 버퍼에서 SCa1-IREF의 이광자 작용 단면적(Φδ)은 레퍼런스로서 로다민 6G를 이용하여 이광자 여기 형광법으로 측정하였다. 도 6 및 상기 표 1을 참조하여 보면, 과량의 Ca2 +이 없을 때와 있을 때의 Φδ 값은 750 nm에서 각각 50 GM 및 140 GM이었으며, 이는 저분자 이광자 프로브와 유사한 값임을 확인할 수 있었다.
다음으로 이광자 현미경(TPM)을 이용하여 살아있는 뉴런에서 [Ca2 +]i를 평가하기 위해 가변색 이광자 프로브로서 SCa1-IREF를 이용하였다.
도 8(a)를 참조하여 보면, SCa1-IREF의 배양 후, SCa1-IREF로 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런 세포의 밝은 TPM 이미지를 획득하였으며, 8(b)는 시간 함수로서 패널 (a)의 A 내지 E로부터의 상대적인 TPEF 강도를 나타낸 것이다. 이는 세포 로딩 능력과 유의한 Φδ 값 때문으로 사료된다. 또한, 도 7 및 도 8을 참조하여 보면, MTS 분석을 수행한 결과, SCa1-IREF는 낮은 세포 독성을 가지는 것을 확인하였으며, TPM 이미지 조건 하에서 높은 광안정성(photostability)을 나타내었다.
다음으로 이오노마이신 및 EGTA로 처리된 일차 대뇌 피질 뉴런을 SCA1-IREF로 표지하여하여 세포 적정을 수행하였다.
도 9(a) 및 9(b)를 참조하여 보면, 영상화 용액에 CaCl2의 첨가되었을 때, Ch2에서의 TPEF 강도가 증가하기 시작하다가 기저 수준(basal level)으로 감소하는 반면, Ch1에서의 TPEF 강도는 변함없이 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 도 9(c)를 참조하여 보면, 비율(Ch2/Ch1) 적정으로부터 세포에서 Kd(Kd i)를 계산하였으며, Kd i는 0.24 ± 0.3 μM이었다. 이러한 결과는 가변색 영상화로 [Ca2 +]i의 정량적 측정을 가능하게 한다.
다음으로 비율 이광자 현미경 영상화를 이용하여 일차 대뇌 피질 뉴런 세포에서 [Ca2 +]i의 레스팅 수준(resting level) 및 변화를 모니터링 하였다.
도 10을 참조하여 보면, 영상화는 온도(37℃), 습도(90%), CO2 농도(5%)를 유지하는 챔버(chamber)에서 수행되었다. 레스팅 세포에서 Ch2/Ch1 비율은 세포체(soma, A 영역) 및 가지돌기(dendrite, B 영역)의 위치에서 5.2 ± 0.7 및 4.5 ± 0.6이었고, 이로부터 [Ca2+]i는 각각 60 ± 3 nM 및 41 ± 4 nM로 계산되었다.
도 10(a) 내지 10(d)는 히스타민 유도 [Ca2 +]i 반응을 관찰한 결과이다. 히스타민은 소포체와 같은 세포 내 저장소에서 [Ca2 +]i를 방출하도록 세포를 자극하는 작용제(agonist)이다.
도 10(e)를 참조하여 보면, 10 μM의 히스타민이 첨가되었을 때, 강도 비율(Ch2/Ch1)이 즉각적으로 증가하기 시작하여 최고치에 도달한 다음 300초 이내에 기저 수준으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, SCa1-IREF 표지된 일차 대뇌 피질 뉴런의 다른 부분도 동시에 분석되었다. 10 μM의 히스타민이 첨가되었을 때, [Ca2 +]i은 각 영역에서 225 ± 4 nM 및 140 ± 4 nM로 증가한 다음 기저 수준으로 감소하였다. 상기 결과는 SCa1-IREF가 살아있는 뉴런에서 [Ca2 +]i를 정량적으로 영상화할 수 있음을 확인시켜 주었다.
다음으로 살아있는 조직 영상화에 있어서 SCa1-IREF의 능력을 더 조사하였다. 2주령 노화 랫드로부터 분리한 해마 세포 절편을 10 μM의 SCa1-IREF와 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 염색하였다. 도 13을 참조하여 보면, 전체 Ca2 + 분포를 시각화하기 위해, 90 내지 180 μm의 깊이, Ch1 및 Ch2에서 30개의 TPM 이미지를 획득하고, 비율 이미지를 구축하였다.
도 11(a)를 참조하여 보면, CA1, CA3 및 DG 영역에서 높은 수준의 [Ca2 +]i 관찰을 통해 뉴런 층에서 이종(heterogeneous) Ca2 +의 분포를 나타내었다. 또한, 도11(b) 및 11(c)를 참조하여 보면, 더 높은 배율(100x)에서의 이미지는 25 내지 200 nM의 범위, 120 μm의 깊이에서 CA3 영역의 각 세포의 [Ca2 +]i 분포의 명확한 차이를 보여주었다. 도 11(d)는 (c)의 흰색 점선으로부터 유도된 Ca2 +의 농도를 나타낸 것이다. 상기 결과는 SCa1-IREF가 100 μm 이상의 깊이에서 생체 조직의 [Ca2 +]i을 정량적으로 측정할 수 있는 능력을 확인시켜 주었다.
마지막으로 2주령 노화 랫드에서 분리한 간, 심장 및 근육 조직에서 [Ca2 +]i을 모니터링 하였다. 도 12를 참조하여 보면, SCa1-IREF로 표지된 조직의 비율 이미지를 축적하고 그 비율을 분석하였다. 간, 심장 및 근육 조직에서 [Ca2 +]i의 평균 수준은 각각 91 ± 9.4, 180 ± 13 및 207 ± 12 nM였으며, 기관 조직에서 [Ca2 +]i 은 큰 차이를 나타냈다. 상기 결과는 SCa1-IREF가 이광자 현미경을 이용한 비율 이미지에 의해 살아있는 조직에서 [Ca2 +]i을 직접적 및 정량적으로 측정할 수 있는 능력을 확인시켜 주었다.
결론적으로, 서로 다른 스토크스 이동을 가지는 이중 염료로부터 유래된 [Ca2+]i에 대한 방출 가변색 이광자 형광 프로브(SCa1-IREF)를 개발하였으며, 상기 이광자 형광 프로브는 FRET 간섭이 없는 Ca2 + 감지 창 및 내부 레퍼런스 창을 가지며, 상기 두 개의 창을 이용하여 민감한 비율 분석을 가능하게 한다. SCa1-IREF는 칼슘(Ca2+)에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 보여 주었다. 비율 이광자 현미경 이미지는 상기 이광자 형광 프로브가 살아있는 세포 및 다양한 조직에서 [Ca2 +]i을 직접적으로 그리고 정량적으로 평가할 수 있음을 보여 주었다. 상기 결과는 in-situ [Ca2 +]i 영상화 및 효과적인 가변색 프로브 개발을 위해 유용하게 활용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
[화학식 1]
- 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브:
[화학식 1]
- 제 2항에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브는 생체 내 칼슘과 선택적으로 감응하는 것을 특징으로 하는 이광자 형광 프로브.
- 제 2항에 있어서, 상기 이광자 형광 프로브는 칼슘에 대한 우수한 선택성, 강한 이광자 능력, pH 독립성, 낮은 세포 독성 및 높은 세포 로딩 능력을 가지는 것을 특징으로 이광자 형광 프로브.
- 하기 화학식 1로 표시되는 이광자 형광 프로브를 인간으로부터 분리된 세포 또는 조직에 주입하는 제 1단계;
상기 세포 또는 조직에 여기원을 조사하는 제 2단계;
상기 이광자 형광 프로브가 생체 내 칼슘과 반응하여 형광을 나타내는 제 3단계; 및
상기 형광을 측정하는 제 4단계;를 포함하는 칼슘의 영상화 방법:
[화학식 1]
- 제 5항에 있어서, 상기 제 1단계의 조직은 해마(hippocampal) 조직, 심장 조직, 간 조직 또는 근육 조직인 것을 특징으로 하는 칼슘의 영상화 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 제 2단계의 여기원은 700 내지 800 nm 범위의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는 칼슘의 영상화 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 칼슘은 80 내지 220 μm 평균 깊이에서 탐지되는 것을 특징으로 하는 칼슘의 영상화 방법.
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| KR101962044B1 (ko) * | 2017-12-26 | 2019-03-25 | 아주대학교산학협력단 | 효소 활성 검출용 가변색 이광자 형광 프로브 및 이를 이용한 암질환 진단방법 |
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| KR20110018200A (ko) | 2009-08-17 | 2011-02-23 | 고려대학교 산학협력단 | 칼슘 이온에 대해 선택성을 갖는 이광자 형광 표지자, 이의제조방법 및 이를 이용한 칼슘 이온의 영상화 방법 |
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